CN110156654B

CN110156654B - 一种高纯度食用菌维生素d2提取物的制备工艺

Info

Publication number: CN110156654B
Application number: CN201810244359.1A
Authority: CN
Inventors: 杨开; 李坤; 叶帮伟
Original assignee: Zhejiang Huihe Health Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huihe Health Technology Co ltd
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2038-03-23
Also published as: CN110156654A

Abstract

本发明公开了一种高纯度食用菌维生素D₂提取物的制备工艺，前期通过超临界萃取、皂化和分子蒸馏前处理富集得到食用菌麦角甾醇萃取物，然后通过脉冲强光短时照射处理，充分利用脉冲强光的多种紫外线及其他波长光源能量，快速高效转化生成VD₂，得到高纯度食用菌VD₂产品，有利于相关医药保健食品、特医食品或膳食补充剂的开发，促进食药用菌资源的增值。

Description

一种高纯度食用菌维生素D2提取物的制备工艺

技术领域

本发明涉及食用菌中麦角甾醇的萃取分离、脉冲强光照射转化高纯度天然维生素D₂的制备工艺，具体是一种高纯度食用菌维生素D₂提取物的制备工艺。

背景技术

维生素D (vitamin D，VD)是一组脂溶性类固醇衍生物，共有五种化合物，包括维生素D₂（麦角骨化醇）和维生素D₃（胆骨化醇）两种活性结构，其中VD₂人体内不能合成，主要通过摄入蔬菜和膳食补充。

VD不仅在骨骼疾病（包括营养性佝偻病、软骨病、骨质疏松等）发挥重要作用。近年来随着临床研究的深入，VD在非骨骼疾病中也起到十分重要的作用。基础研究证实维生素D受体（VDR）广泛分布于体内的骨骼系统、胰岛β细胞、甲状旁腺、大脑、皮肤、前列腺、睾丸、心脏、骨骼肌、乳腺、肝脏、肺、大肠、肾脏及活化了的T、B细胞等各种组织细胞中，所以VD具有多种功能及组织细胞特异性，VD 缺乏将会导致 291 种基因产物的减少。越来越多的研究发现补充VD在预防和治疗全因死亡率、心血管疾病及心血管病死亡率、代谢综合征（肥胖、糖耐量减低/糖尿病、脂代谢紊乱、高血压）、恶性肿瘤、感染、过敏性疾病及哮喘、生殖疾病、肠道疾病、精神及神经疾病、自身免疫性疾病、慢性肾病等诸多疾病均起到重要作用。

VD缺乏已成为全世界的公共健康问题，目前全球人群VD不足的发生率为 30%～50%，数十亿人口，且呈逐年上升趋势，影响着人们生活质量。提高VD水平主要有3个途径：增加阳光照射，增加富含VD食物的摄入量，摄入VD营养素补充剂。

虽然化学合成的VD价格低廉，但随着人们对天然健康食品消费的持续喜好，天然VD不仅价格高，而且市场份额不断增大。其中天然VD₂仅存在于真菌界，植物界和动物界中几乎没有麦角甾醇和VD₂。在大多数食用菌中，麦角甾醇的含量都较高，相对于海洋生物中的VD₃，食用菌更为大多数素食者接受。Mattila等研究发现，野生食用菌中有不同含量的VD_2（2.91~29.82μg/100g 鲜重，4.7-194μg/100g干重），而栽培食用菌中则VD₂含量较少，这主要是由于栽培食用菌一般生长在黑暗环境中。但是无论是栽培还是野生食用菌中麦角甾醇的含量都很高，且栽培食用菌高于野生食用菌，麦角甾醇是食用菌中含量最高的甾醇，含量最高达到食用菌干重的0.6~0.7%，是其他甾醇含量的10~40倍，占食用菌中所有甾醇含量的83–89%。Phillips等分别用高效液相色谱（HPLC）法和气象色谱（GC）法检测了美国市售10种食用菌中 VD₂和麦角甾醇的含量发现，这10种食用菌都含有丰富的麦角甾醇（26.3~84.9mg/100g鲜重），VD₂含量呈不同水平（0.06~28.1mg/100g 鲜重），这可能与它们的生长环境(栽培或野生，是否受光照等)有关。可见，不管是野生还是栽培食用菌都富含麦角甾醇，其经紫外光照射发生一系列变化后转化为VD2，是很好的VD2来源。

食用菌中含有丰富的VD₂原（麦角甾醇），在紫外光的照射下可转化为 VD₂，然而不同的转化条件VD₂的产率有显著差异。麦角甾醇经紫外光照射可以转化为VD₂。但是在转化过程中，除生成有活性的VD₂前体和VD₂外，还会生成多种无效价的同分异构体，如图1所示，光甾醇和速甾醇等无效副产物。VD₂前体在自发热重排后转化为VD₂，但过度照射，还会生成超甾醇等物质。

在现有研究方面，2010年白晨等人（香菇中麦角甾醇生成维生素D₂的光化反应实验设计，实验室研究与探索），采用香菇样品加入焦性没食子酸的无水乙醇溶液，经光反应及热反应处理生成VD₂。2012年，胡彬彬等人（紫外辐照对鸡腿菇中维生素D₂含量的影响，湖北农业科学）以紫外线分别辐照菇蕾期、成熟前期和成熟期的鸡腿菇，发现紫外线辐照可以提高鸡腿菇中维生素 D₂的含量。2014年，孙梦姣等人，采用紫外照射对2 个双孢蘑菇菌株新鲜子实体进行处理，发现紫外照射对双孢蘑菇不同菌株子实体中麦角甾醇和VD₂含量均有影响。2016年，魏伟等人（中波紫外照射对茶树菇维生素D和钙元素的影响，照明工程），采用中波紫外线照射茶树菇两个小时处理，发现中波紫外线照射处理和未处理的茶树菇检测到VD₂含量分别为9.2μg/g 和0.1μg/g。

在相关专利方面，天津商业大学的关文强等人发明的“利用废弃菌柄制备富含维生素D₂食用菌干粉的方法”（申请公布号CN 106307482），发明公开了一种利用废弃菌柄制备富含维生素D₂食用菌干粉的方法，步骤包括废弃菌柄的选择、清洗、护色、晾干、紫外线照射、干燥、紫外线二次照射、磨粉、灭菌包装，案例所制食用菌干粉中维生素D₂的含量为2.0~2.4mg/100g干重。另外关文强等“利用废弃菌柄制备富含维生素双孢菇酱的方法”（申请公布号CN 106262719 A），发明公开了一种利用废弃菌柄制备富含维生素D₂双孢菇酱的方法。步骤包括双孢菇废弃菌柄的选择、清洗、沥干、紫外线照射、切丁、制酱、熬酱、炒酱、灭菌装罐。

脉冲强光是是一种利用瞬间放电的脉冲工程技术和特殊的惰性气体灯管，能在极短时间内（数十至数百微秒），以光辐射形式释放出高能量，光谱分布近似太阳光，含有相当强度的UVA、UVB、UVC和UVD等全波段紫外线，光强度相当于到达地球表面太阳光强度的数千乃至数万倍的一种世界领先的光源技术。脉冲强光具有高穿透性、低温、能效高和作用时间短等特点。目前它主要用在杀菌方面，利用瞬时、高强度的脉冲光能量杀灭各类微生物，从而弥补了传统热杀菌、化学杀菌的缺点。而且经脉冲光处理的食品中与未处理的相比，化学成分和营养特性没有显著的变化，不影响其口感。

目前已有的专利文献中，普遍采用紫外对食用菌子实体的切片或粉末进行直接照射处理，所需时间较长（一般需要几个小时），而麦角甾醇转化为VD₂的效率较低。

近几十年，超临界和分子蒸馏是脂溶性活性成分萃取和分离的新兴技术，具有食用安全性高（操作过程无有毒有害有机溶剂添加）、处理温度低、活性物质不易破坏等优点。

发明内容

本发明主要针对上述技术问题，提供一种高纯度食用菌维生素D₂提取物的制备工艺，前期通过超临界萃取、皂化和分子蒸馏前处理富集得到食用菌麦角甾醇萃取物，然后通过脉冲强光短时照射处理，充分利用脉冲强光的多种紫外线及其他波长光源能量，快速高效转化生成VD₂，得到高纯度食用菌VD₂产品，有利于相关医药保健食品、特医食品或膳食补充剂的开发，促进食药用菌资源的增值。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种高纯度食用菌维生素D₂提取物的制备工艺，包括以下步骤：

（1）将食用菌干燥子实体粉碎20~40目过筛；

（2）过筛后在40℃~60℃进行真空干燥1~2h；

（3）干燥后放入萃取釜，实现超临界CO₂萃取；

（4）收集分离釜中油状萃取物；

（5）对收集油状萃取物进行皂化处理，皂化处理的温度控制在70℃~90℃，皂化时间控制在20~40min；

（6）皂化后再正己烷萃取；

（7）正己烷萃取完成后再真空蒸馏；

（8）真空蒸馏后再分子蒸馏，得到食用菌高纯度麦角甾醇提取物；

（9）对食用菌高纯度麦角甾醇提取物进行脉冲强光照射处理，得到高纯度维生素D₂萃取物；

（10）对麦角甾醇和维生素D₂分析检测；

（11）检测合格后包装。

本发明的有益效果：解决了常规紫外照射转化效率低、副产物多、耗时长等问题，提高了转化效率，减少了副产物。

附图说明

图1：麦角甾醇光转化反应原理示意图。

图2：本发明工艺流程图。

图3：VD₂与麦角甾醇标准品HPLC谱图。

图4：灰树花未照射处理高纯度麦角甾醇提取物示意图。

图5：灰树花脉冲强光照射处理提取物示意图。

图6：灰树花紫外照射处理提取物示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施列对本发明进行详细说明。

如图2所示，本发明首先对食用菌脂溶性麦角甾醇物质进行超临界CO₂萃取，收集分离釜中油膏状萃取物，将提取物进行皂化处理后进行分子蒸馏分离得到高纯度甾醇，最后用脉冲强光短时照射转化维生素D₂。建立了一种以食用菌为原料制备高纯度甾醇及维生素D₂的加工工艺，具体工艺包括以下步骤：

实施例一：

S1：将猴头菇干燥子实体粉碎后40目过筛。

S2：过筛后在60℃真空下干燥1h。干燥设备采用德国宾德binder VD23真空干燥箱。

S3：干燥1h后称取150g放入萃取釜，超临界CO₂萃取。萃取设备采用美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，设置萃取压力为35MPa，时间3h，温度50℃，CO₂流速为20g/min。

S4：收集分离釜中油状萃取物。

S5：对收集油状萃取物进行皂化处理，皂化温度为85℃，皂化时间为30min。

S6：皂化后再150mL正己烷萃取3次后合并萃取液。

S7：正己烷萃取完成后再在45℃真空旋转蒸发，采用上海申生科技有限公司的旋转蒸发仪，型号为R2002B，配循环水泵，真空度0.05Mpa。

S8：真空旋转蒸发后再分子蒸馏，采用美国POPE公司的2#刮膜式分子蒸馏仪，配置冷却水循环系统及石墨刮板，分子蒸馏时设置进料温度50℃，蒸发面温度 150℃，系统压力5Pa，刮膜器转速为220 r/min，进料速度5mL/min。得到猴头菇高纯度麦角甾醇提取物，试验结果测试得率为0.72%，甾醇纯度78.3%。

S9：对猴头菇高纯度麦角甾醇提取物进行脉冲强光照射处理，具体是将猴头菇高纯度麦角甾醇提取物置于石英表面皿中，厚度0.5cm，脉冲强光照射50s，脉冲光源距离10cm，得到猴头菇高纯度VD₂提取物，试验结果测试得率为0.72%。

S10：对麦角甾醇和维生素D₂分析检测。

S11：洁净环境下铝箔袋包装。

本实施例检测结果表明：猴头菇高VD₂纯度提取物中麦角甾醇纯度为11.7%，VD₂纯度为42.9%。

实施例二：

S1：将香菇子实粉碎后30目过筛。

S2：过筛后在50℃真空下干燥1h。干燥设备采用德国宾德binder VD23真空干燥箱。

S3：干燥1h后称取160g放入萃取釜，超临界CO₂萃取。萃取设备采用美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，设置萃取压力为25MPa，时间1h，温度45℃，CO₂流速为10g/min。

S4：收集分离釜中油状萃取物。

S5：对收集油状萃取物进行皂化处理，皂化温度为70℃，皂化时间为20min。

S6：皂化后再100mL正己烷萃取3次后合并萃取液。

S8：真空旋转蒸发后再分子蒸馏，采用美国POPE公司的2#刮膜式分子蒸馏仪，配置冷却水循环系统及石墨刮板，分子蒸馏时设置进料温度50℃，蒸发面温度 160℃，系统压力20Pa，刮膜器转速为200 r/min，进料速度3mL/min。得到香菇高纯度麦角甾醇提取物，试验结果测试得率为0.51%，甾醇纯度63.8%。

S9：对香菇高纯度麦角甾醇提取物进行脉冲强光照射处理，具体是将香菇高纯度麦角甾醇提取物置于石英表面皿中，厚度0.6cm，脉冲强光照射30s，脉冲光源距离15cm，得到香菇高纯度VD₂提取物，试验结果测试得率为0.51%。

S10：对麦角甾醇和维生素D₂分析检测。

S11：洁净环境下铝箔袋包装。

本实施例检测结果表明：香菇高VD₂纯度提取物中麦角甾醇纯度为16.0%，VD₂纯度为28.7%。

申请人按照上述实施例进行了实验，具体实验工艺及结果如下：

1. 实验原料：香菇、灰树花、猴头等食用菌干燥子实体。

2. 实验方法

2.1 超临界CO₂流体萃取

称取150~200g食用菌粉末放入萃取釜，CO₂超临界萃取（超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司），萃取压力为25~35MPa，时间1~3h，温度40~70℃，CO₂流速为10~20g/min。收集分离釜中油膏状萃取物，称重，重复几次制备样品，备后续皂化和分子蒸馏处理。

2.2食用菌麦角甾醇分离纯化

2.2.1 皂化工艺

取20.0g样品与5%~10%氢氧化钠乙醇溶液（m/V）100~200mL加入到2L的三角瓶中，在70~90℃水浴中回流加热20~40min后，加入500~1000mL饱和NaCl溶液，转入5L分液漏斗中，用500~1000mL正己烷在萃取3次（除去羧酸盐、醇和水），合并萃取液，水洗至pH中性后以无水硫酸钠脱水，于旋转蒸发器上40℃蒸干（进一步除去乙醇、水和正己烷等溶剂），待分子蒸馏纯化用。

2.2.2 分子蒸馏纯化

在进料温度40~60℃，蒸发面温度80~200℃，系统压力5~20Pa，刮膜器转速为150~250 r/min，进料速度2~6mL/min的条件下进行分离纯化。此时冷凝管通入冷凝水，冷阱充满液氮，在旋转蒸发时未完全脱除的小分子烃类物质和部分轻脂肪酸在冷阱壁面上冷凝下来，靠重力作用逐渐从馏出物口流出，而麦角甾醇类较重分子从残余液出口收集。

2.3 麦角甾醇光照转化VD₂

2.3.1脉冲强光照射：使用功率27W的脉冲强光对样品照射20~60s。

2.3.2 常规紫外照射对照：使用同样功率的紫外灯管进行同时间照射。

23.3 石英表面皿：有利于照射光线的无阻隔穿透。

2.4 麦角甾醇和VD₂分析

麦角甾醇和VD₂采用HPLC同时分析。分别将未照射样品、脉冲强光照射和常规紫外灯管照射样品用无水乙醇溶解后，0.45μm滤膜过滤，进行HPLC检测。

HPLC检测条件：流动相配比溶剂A(甲醇/水,80:20v/v)和溶剂B(甲醇/二氯甲烷,75:25,v/v)，采用程序设定：梯度洗脱，0-5min，50％-80％B;5-15min，80-100％B;15-20.5min,50％B。流速为0.8mL/min，进样体积10μL，254nm和280nm波长同时检测。

如图3所示，以进样质量(μg)对相应的峰面积(Y)进行线性回归，麦角甾醇标准曲线的方程为：Y1=13995X-35925, r=0.99961；VD2标准曲线方程为:Y2=18391X-8573, r=0.99986。

麦角甾醇纯度=（测定的麦角甾醇含量/提取物质量）*100%

麦角甾醇提取物得率=（提取物质量/食用菌原料干重）*100%

VD₂纯度=（测定的VD2含量/提取物质量）*100%

采用本专利的方法分别对灰树花、猴头菇、香菇子实体干品进行实验，结果如下：

灰树花干燥子实体→粉碎后30目过筛→50℃真空干燥1h→称取180g→放入萃取釜，CO₂超临界萃取（萃取压力为30MPa，时间2h，温度40℃，CO₂流速为15g/min）→收集分离釜中油状萃取物→80℃皂化30min→150mL正己烷萃取3次合并萃取液→真空旋转蒸发，40~60℃，真空度0.05Mpa→分子蒸馏（进料温度50℃，蒸发面温度120℃，系统压力10Pa，刮膜器转速为200 r/min，进料速度4mL/min）→灰树花高纯度麦角甾醇提取物（得率为0.46%，甾醇纯度75.3%）→置于石英表面皿中，厚度0.8cm，脉冲强光照射40s，脉冲光源距离15cm（设同样条件紫外对照：照射距离、功率一致，紫外波长280nm）→灰树花高纯度VD2提取物（得率同前，为0.46%）→麦角甾醇和维生素D₂分析检测→洁净环境下铝箔袋包装。

检测结果：如图4-6所示，灰树花高VD₂含量提取物中麦角甾醇纯度为15.8%，VD₂纯度为32.1%。

对照组（同样强度紫外照射处理）：灰树花提取物中麦角甾醇纯度为28.4%，VD₂纯度为11.5%。

未处理样品（灰树花高纯度麦角甾醇提取物）：甾醇纯度75.3%，VD₂纯度为0.26%。

由以上结果可发现，相比空白对照，脉冲强光照射与常规紫外灯管照射都能有效使灰树花中的麦角甾醇转化成VD₂，脉冲强光照射与常规紫外照射后提取物VD₂的纯度分别为32.1%和11.5%，脉冲强光是同等条件紫外处理效果的2.79倍，是未处理样品0.26%的123倍。另外从HPLC谱图对照也可以发现脉冲强光生成的副产物少。而且脉冲照射光源相比紫外光源更加稳定，可以更长时间维持在较高的照射功率。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种食用菌维生素D₂提取物的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将食用菌干燥子实体粉碎20～40目过筛；

(2)过筛后在40℃～60℃进行真空干燥1～2h；

(3)干燥后放入萃取釜，实现超临界CO₂萃取；

(4)收集分离釜中油状萃取物；

(5)对收集油状萃取物进行皂化处理，皂化处理的温度控制在70℃～90℃，皂化时间控制在20～40min；

(6)皂化后再正己烷萃取；

(7)正己烷萃取完成后再真空蒸馏；

(8)真空蒸馏后再分子蒸馏，得到食用菌麦角甾醇提取物；

(9)对食用菌麦角甾醇提取物进行脉冲强光照射处理，得到维生素D₂萃取物。

2.根据权利要求1所述的食用菌维生素D₂提取物的制备工艺，其特征在于，还包括步骤(10)：对维生素D₂萃取物进行分析检测。

3.根据权利要求1所述的食用菌维生素D₂提取物的制备工艺，其特征在于，还包括步骤(11)：对分析检测合格的维生素D₂萃取物包装。