CN102229754A - 一种从银耳栽培废料中提取黑色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤：（1）将银耳栽培废料粉碎过筛；采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，得到银耳栽培废料的干粉备用；（2）将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；（3）将提取液酸化，使黑色素沉淀；用盐酸调节提取液的pH值；（4）离心、干燥后得到黑色素粗品；（5）将黑色素粗品进行纯化：在黑色素粗品中加入体积的HCl于水浴，离心收集沉淀，沉淀用蒸馏水漂洗，离心收集上层液体，离心收集沉淀，沉淀用无水乙醇，再离心收集沉淀，沉淀用去离子水漂洗，冷冻干燥后冰箱备用。方法易行，操作简便，黑色素安全无毒、着色力强、稳定性好、纯度高，得率高。
Description
技术领域
本发明涉及黑色素的生产技术领域，更具体涉及一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，它适用于银耳栽培废料。
背景技术
银耳的袋料栽培是银耳的主要栽培方法，具有原料广泛、成本低、周期短、产量高、销路好、经济效益高等特点，每百公斤培养料干耳产量为8～15公斤。我国银耳资源丰富，银耳的产量居于世界领先地位，而随之产生大量的银耳栽培废料，对这些废料的有效处理成为亟待解决的一个课题。一方面，如将产后栽培废料在环境中自然堆弃，会滋生多种危害银耳生产的生物，如各种霉菌、蚊类、螨类等。另一方面，这些废料中含有大量可再利用的物质，是具有应用价值的再生生物资源。为了达到生物资源的高效利用，减少环境污染，国内近年开展了很多食用菌栽培废料的利用研究。综合其利用情况，可以分为二次种菇、无土栽培基质、菌糠饲料、生物有机肥、燃料和生物提取6种利用途径。其中生物提取经济效益较好，可提高银耳栽培的附加值，具有非常重要的市场价值和社会效益。
银耳袋料栽培废料的主要成分有银耳伴生菌香灰菌、40％左右的棉仔壳、10％左右的麦皮，大豆秆、花生秆(壳)、玉米芯以及石膏、尿素、硫酸镁、麸皮、白糖和黄豆粉等物质。
黑色素是一类由酚或吲哚化合物聚合氧化而成的高分子聚合物。天然黑色素作为一种食用色素，已广泛应用于食品工业。近年来的科学研究还表明，天然黑色素能清除自由基，阻止心磷脂脂质体的氧化，具有抗氧化、抗辐射和延缓衰老等功能，因此它还可以用于生物、医药、化妆品、保健品等行业和领域。银耳的袋料栽培是银耳的主要栽培技术，目前国内80％以上的银耳出于袋料栽培。香灰菌作为银耳的“伴生菌”，可分解木质素和纤维素为银耳生长提供营养，而它自身在生长过程会产生并分泌大量的黑色素。因此从银耳栽培废料中提取黑色素，既达到了生物资源的高效利用，减少了环境污染，又具有较好的经济效益和广阔的应用前景。
目前，黑色素的制备方法主要有3种：
1)从动植物组织中提取黑色素：黑色素广泛存在于动植物组织中，以动植物组织为原料，根据黑色素的溶解特性，进行黑色素的提取。如专利CN100999616从鱿鱼墨中提取黑色素，CN101157805从阴香果皮中提取黑色素，相同类型的还有CN101643589和CN1939979。
2)微生物发酵生产黑色素：产黑色素的微生物种类主要有细菌(链球菌、蜡状芽孢杆菌、嗜麦芽假单孢菌)、固氮菌、霉菌(黑曲霉、链格孢霉、构巢曲霉、米曲霉等)、放线菌(链霉菌)以及真菌(出芽短梗霉)。在适宜培养条件下，利用一种高产黑色素的菌株发酵生产黑色素。
3)酶法合成黑色素：酪氨酸是合成黑色素的前体物，酪氨酸在酪氨酸氧化酶的催化作用下氧化生成二羟苯丙氨酸(Dopa)，继续氧化生成多巴醌，再进一步氧化闭环生成5，6-二羟吲哚，再转化生成5，6-吲哚二醌，在酶的作用下，最后氧化聚合而形成黑色素。专利CN101003817以酪氨酸、二元酚、三元酚及其衍生物为底物，在反应器中建立酶促反应系统，酶促合成黑色素。
上述各种方法中，第一种方法提取工艺条件简单，具有一定的开发、应用价值，但是产品的纯度与质量不高，并可能存在原料来源的问题。第二种方法具有资源丰富、潜力大、生产周期短，效率高的优点，但对微生物大规模发酵生产黑色素的工艺研究还处于初级阶段，相关技术不够成熟，且设备复杂，投资巨大。第三种制备方法时间短，工艺简单，反应参数可控，但底物或酶制剂成本高或制备较为繁琐，妨碍了其产业化进程。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术之不足，为开发新的天然黑色素和银耳栽培废料的综合利用提供一条新的途径。在于提供了一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，方法易行，操作简便，黑色素安全无毒、着色力强、稳定性好、纯度高，得率高。
一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
(1)将银耳栽培废料粉碎过筛；
采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，20～50目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用。
(2)将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；(所述的废料是：银耳袋料栽培废料的主要成分有银耳伴生菌香灰菌、40％左右的棉仔壳、10％左右的麦皮，大豆秆、花生秆(壳)、玉米芯以及石膏、尿素、硫酸镁、麸皮、白糖和黄豆粉等物质)
称取干燥粉碎的银耳栽培废料样品，按料液重量体积比为1∶20～1∶50加入相应体积的浓度为0.75～1.75mol/L的氢氧化钠溶液，也可用体积浓度为10～20％的氨水，或0.75～1.75mol/L的氢氧化钾，或1.5～3.5mol/L的碳酸钠等作为提取剂。利用超声波辅助提取，超声功率40～80W，提取时间40～80min；用2～8层纱布过滤、1～2层定量滤纸过滤或者3000～10000rpm高速离心将将固液分离，使得银耳栽培废料及其它杂质分离出去，得到提取液。
(3)将提取液酸化，使黑色素沉淀；
用1～3mol/L盐酸调节提取液的pH值至1.0～3.0，然后60～80℃水浴10～18h，使黑色素以沉淀形式析出。也可用体积浓度为20～30％的醋酸，或体积浓度为20～30％的磷酸调节提取液的pH值到1.0～3.0。
(4)离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为7000～10000rpm，(高速冷冻离心机J-E美国Beckman公司)时间为10～15min；冷冻干燥时的真空度为10～30Pa，温度低于-30℃，干燥时间20～24h。也可将离心后的黑色素沉淀置于60～80℃的烘箱中干燥。
(5)将黑色素粗品进行纯化。
在0.1～3.0g黑色素粗品中加入10～30mL体积的5～7mol/L的HCl(前面写明中文，于100℃水浴2～6h，4000～6000rpm离心收集沉淀，沉淀用蒸馏水漂洗1～3次，溶于pH7.5～8.5的KOH中。加入一倍体积的氯仿∶异戊醇(1∶5)，上下颠倒10～20次离心收集上层液体。重复三次操作。将所收集液体用1～3mol/L HCl调pH至1.0～3.0，离心收集沉淀。沉淀用无水乙醇、浓度为95％乙醇、浓度为70％乙醇梯度洗涤，再离心收集沉淀。沉淀用去离子水漂洗1～3次，冷冻干燥后存于-20℃冰箱备用，得到黑色素。
本发明通过单因素和正交试验分析了影响银耳栽培废料中黑色素得率的工艺条件，确定银耳栽培废料中黑色素适宜于用1.25mol/L的氢氧化钠溶液、超声功率80W、超声时间80min、料液比1∶30提取。在此参数条件下黑色素粗品得率为15.436％。
本发明与现有方法相比，具有以下的优点：
1)本发明采用超声处理银耳栽培废料，破碎香灰菌细胞，可缩短提取时间，大大提高黑色素的得率，黑色素粗品得率达到15.436％
黑色素粗品得率D(％)的计算公式如下：
D(％)＝黑色素粗品的质量/袋料质量×100％
经对比实验(表1)发现，银耳栽培废料经超声处理，黑色素的得率明显提高，因此选用超声波辅助提取黑色素。
经对比实验(表2、表3和表4)还发现，在选用超声波辅助提取银耳栽培废料中黑色素的前提下，超声功率60W、超声处理时间40min、氢氧化钠浓度1mol/L三个工艺参数中，变动其中一个工艺参数都会对黑色素粗品的得率有较大影响。
表1不同处理对黑色素粗品得率的影响
表2不同超声功率对黑色素粗品得率的影响
表3不同超声处理时间对黑色素粗品得率的影响
表4不同氢氧化钠浓度对黑色素粗品得率的影响
2)本发明提取的黑色素安全无毒、着色力强、稳定性好、纯度高，可作为食品色素应用于饮料、糖果、糕点、巧克力、果酱等，也可用作工业着色剂、染色剂等；抗氧化研究表明，此种黑色素抗氧化能力强于Vc，稍低于合成黑色素，因此也可应用于生物、化妆品、保健品等行业和领域；近年来的科学研究还表明，黑色素可以作为新型的天然药物载体，用来治疗某些与黑色素缺乏相关的神经性疾病，一些可溶性黑色素在体外还具有抑制艾滋病病毒感染宿主细胞的作用，有可能成为一种有效的药物。
附图说明
图1为一种从银耳栽培废料中提取的黑色素粗品的紫外图谱。
其最大吸收峰在209nm处，而从最大吸收峰位置开始，随着波长增加，吸光值呈现下降的变化趋势，与黑色素标样的紫外吸收特征基本一致。
图2为一种从银耳栽培废料中提取的黑色素粗品的傅里叶红外变换扫描图谱。
它具有经典的黑色素红外吸收特征，即在3μm和6μm处各有一个吸收峰。其中3410cm-1的处有宽而强的吸收峰，而在860～650cm-1范围内的吸收带很弱，与合成黑色素的红外光谱图谱相似，也存在一定的区别。
具体实施方式
实施例1：
一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
(1)将银耳栽培废料粉碎过筛；
采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，20或30或40或50目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用。
(2)将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；
准确称取干燥粉碎的银耳栽培废料5.000g，加入150mL浓度为1.5mol/L的氢氧化钠溶液，超声波辅助提取(60W，60min)，用2或3或4或5或6或7或8层纱布过滤，得到提取液。
(3)将提取液酸化，使黑色素沉淀；
用3mol/L盐酸酸化至pH值为2.0，80℃下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。
(4)离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为10000rpm，时间为15min；冷冻干燥时的真空度为30Pa，温度低于-30℃，干燥时间24h。
沉淀经真空冷冻干燥，可得固体粉末状的黑色素粗品，再将黑色素粗品进行纯化。黑色素粗品的得率为11.580％。
实施例2：
一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
(1)将银耳栽培废料粉碎过筛；
采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，40目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用。
(2)将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；
准确称取干燥粉碎的银耳栽培废料5.000g，加入150mL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，超声波辅助提取(80W，60min)，用2或3或4或5或6或7或8层纱布过滤，得到提取液。
(3)将提取液酸化，使黑色素沉淀；
用3mol/L盐酸酸化至pH值为2.0，80℃下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。
(4)离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为10000rpm，时间为15min；冷冻干燥时的真空度为30Pa，温度低于-30℃，干燥时间24h。
沉淀经真空冷冻干燥，可得固体粉末状的黑色素粗品，再将黑色素粗品进行纯化。黑色素粗品的得率为14.320％。
实施例3：
一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
(1)将银耳栽培废料粉碎过筛；
采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，40目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用。
(2)将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；
准确称取干燥粉碎的银耳栽培废料5.000g，加入150mL浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，超声波辅助提取(60W，80min)，用2或3或4或5或6或7或8层纱布过滤，得到提取液。
(3)将提取液酸化，使黑色素沉淀；
用3mol/L盐酸酸化至pH值为2.0，80℃下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。
(4)离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为10000rpm，时间为15min；冷冻干燥时的真空度为30Pa，温度低于-30℃，干燥时间24h。
沉淀经真空冷冻干燥，可得固体粉末状的黑色素粗品，再将黑色素粗品进行纯化。黑色素粗品的得率为14.352％。
实施例4：
一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
(1)将银耳栽培废料粉碎过筛；
采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，40目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用。
(2)将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；
准确称取干燥粉碎的银耳栽培废料5.000g，加入150mL浓度为1.25mol/L的氢氧化钠溶液，超声波辅助提取(80W，80min)，用2或3或4或5或6或7或8层纱布过滤，得到提取液。
(3)将提取液酸化，使黑色素沉淀；
用3mol/L盐酸酸化至pH值为2.0，80℃下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。
(4)离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为10000rpm，时间为15min；冷冻干燥时的真空度为30Pa，温度低于-30℃，干燥时间24h。
沉淀经真空冷冻干燥，可得固体粉末状的黑色素粗品，再将黑色素粗品进行纯化。黑色素粗品的得率为15.436％。
实施例5：
一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
(1)将银耳栽培废料粉碎过筛；
采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，40目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用。
(2)将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；
准确称取干燥粉碎的银耳栽培废料5.000g，加入150mL浓度为1.25mol/L的氢氧化钠溶液，超声波辅助提取(60W，40min)，用2或3或4或5或6或7或8层纱布过滤，得到提取液。
(3)将提取液酸化，使黑色素沉淀；
用3mol/L盐酸酸化至pH值为2.0，80℃下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。
(4)离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为10000rpm，时间为15min；冷冻干燥时的真空度为30Pa，温度低于-30℃，干燥时间24h。
沉淀经真空冷冻干燥，可得固体粉末状的黑色素粗品，再将黑色素粗品进行纯化。黑色素粗品的得率为13.478％。
实施例6：
一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
(1)将银耳栽培废料粉碎过筛；
采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，40目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用。
(2)将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；
准确称取干燥粉碎的银耳栽培废料5.000g，加入150mL浓度为1.50mol/L的氢氧化钠溶液，超声波辅助提取(80W，40min)，用2或3或4或5或6或7或8层纱布过滤，得到提取液。
(3)将提取液酸化，使黑色素沉淀；
用3mol/L盐酸酸化至pH值为2.0，80℃下水浴10h，使黑色素以沉淀形式析出。
(4)离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为10000rpm，时间为15min；冷冻干燥时的真空度为30Pa，温度低于-30℃，干燥时间24h。
沉淀经真空冷冻干燥，可得固体粉末状的黑色素粗品，再将黑色素粗品进行纯化。黑色素粗品的得率为13.116％。
Claims (1)
1.一种从银耳栽培废料中提取天然黑色素的方法，其步骤如下：
（1）将银耳栽培废料粉碎过筛；采用粉碎机将干燥的银耳栽培废料粉碎，20～50目过筛，得到银耳栽培废料的干粉备用；
（2）将粉碎的银耳栽培废料用碱溶液提取，过滤除渣，得到提取液；称取干燥粉碎的银耳栽培废料样品，按料液重量体积比为1：20～1：50加入相应体积的浓度为0.75～1.75 mol/L的氢氧化钠溶液，用体积浓度为10～20%的氨水，或0.75～1.75 mol/L的氢氧化钾，或1.5～3.5 mol/L的碳酸钠作为提取剂，利用超声波辅助提取，超声功率40～80 W，提取时间40～80 min；将固液分离，用2～8层纱布或滤纸将银耳栽培废料及其它杂质分离出去，得到提取液；
（3）将提取液酸化，使黑色素沉淀；用1～3 mol/L盐酸调节提取液的pH值至1.0～3.0，然后60～80℃水浴10～18 h，使黑色素以沉淀形式析出，用体积浓度为20～30%的醋酸，或体积浓度为20～30%的磷酸调节提取液的pH值；
（4）离心、干燥后得到黑色素粗品；
离心的速率为7000～10000 rpm，时间为10～15 min；冷冻干燥时的真空度为10~30 Pa，温度低于-30℃，干燥时间20～24 h，将离心后的黑色素沉淀置于60～80℃的烘箱中干燥；
（5）将黑色素粗品进行纯化：在黑色素粗品中加入体积的5～7 mol/L的HCl于100℃水浴2～6 h，4000～6000 rpm离心收集沉淀，沉淀用蒸馏水漂洗1～3次，溶于pH7.5～8.5的KOH中，加入一倍体积的氯仿：异戊醇1：5，上下颠倒10～20次离心收集上层液体，重复三次操作，将所收集液体用l～3 mol/L HCl调pH至1.0～3.0，离心收集沉淀，沉淀用无水乙醇、浓度为95%乙醇、浓度为70%乙醇梯度洗涤，再离心收集沉淀，沉淀用去离子水漂洗1～3次，冷冻干燥后存于-20℃冰箱备用，得到黑色素。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111102 |