CN1255424C - 注射用人胎盘核糖核酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种注射用人胎盘核糖核酸的制备方法。该制备方法包括从人体胎盘提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盘核糖核酸的方法，从人体胎盘提取核糖核酸的方法包含以下步骤：配制试剂步骤；破碎粗提步骤；精提分离步骤和纯化步骤。本发明克服了现有技术存在的缺陷，具有制备的核糖核酸RNA活性高、纯度高、毒性小、更容易被人体吸收；制备方法操作简便，不需消耗大量的有机溶剂，制备周期短等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种核糖核酸的制备方法，特别是涉及一种注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，包括从人体胎盘提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盘核糖核酸的方法。
背景技术
核糖核酸RNA具有很高的生物活性作用，它能激活T淋巴细胞，产生大量淋巴因子和杀伤细胞，以增强人体细胞免疫功能，还能激活B淋巴细胞，以增强人体体液免疫水平。可用于治疗免疫功能低下有关的疾病；对慢性支气管炎有显著的疗效，并可作为治疗恶性肿瘤的辅助用药。同时核糖核酸RNA能增进肝细胞蛋白质合成，调节氨基酸代谢，促进病变肝细胞恢复正常，降低血清谷丙转氨酶水平，改善肝炎患者血清蛋白电泳。临床用于慢性迁延性肝炎、慢性活动性肝炎及肝硬变的治疗。
长期以来，核糖核酸RNA从人体的健康脾脏提取，由于脾脏为人体重要器官，而被禁止。因此人类开始从动物的淋巴结、脾脏、肝脏、胎盘等器官中或从植物中提取核糖核酸RNA，近年来还开始利用微生物、酵母发酵法生产核糖核酸。从动物的器官或从植物中提取核糖核酸RNA的方法，一般是先将组织匀浆、离心后分离出的细胞核经裂解后用酚、氯仿、异戊醇除蛋白、钝化，乙醇沉淀最后制得的。这种提取方法普遍存在收率较低且RNA纯品的活性较低；提取设备较复杂；使用的试剂苯酚、氯仿、异戊醇等毒性较大；需消耗大量的有机溶剂等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的缺陷，提供一种注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，制备的核糖核酸RNA活性高、纯度高、毒性小，更容易被人体吸收。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，其特点是：所述的制备方法包括从人体胎盘提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盘核糖核酸的方法，从人体胎盘提取核糖核酸的方法包含以下步骤：
A、配制试剂步骤：
a、配置0.1mol/l醋酸盐缓冲液，在0.1mol/l醋酸盐溶液中包含重量比0.4％～0.6％的十二烷基硫酸钠、0.1％～0.3％的聚乙烯硫酸酯、0.1％～0.3％的乙二胺四乙酸二钠，用醋酸调节其PH值，达到PH 5.0；
b、配置酚饱和缓冲液，将0.1％的分析纯8-羟基喹啉苯酚与“a”操作中配置的0.1mol/l醋酸盐缓冲液等体积混合在分液漏斗中，振摇200～400次，避光静置8～14小时，取其上层液体；
c、配置缓冲液饱和酚，取“b”操作中的下层液体；
d、配置0.3mol/l醋酸盐缓冲液，在0.3mol/l醋酸盐溶液中包含重量比6％～8％的醋酸钾，用醋酸调节其PH值，达到PH 5.0；
e、配置0.1mol/l醋酸盐洗液，在0.1mol/l醋酸盐溶液中包含重量比2％～4％醋酸钾、0.1％～0.3％聚乙烯硫酸酯、75％乙醇，用醋酸调节其PH值，达到PH5.0；
f、配置生理盐水，用双蒸水配置含0.9％NaCl生理盐水；
B、破碎粗提步骤：
a、取新鲜或冰冻人体胎盘，用去离子水洗净，去除羊膜、脐带、大血管；
b、将清洗后的胎盘组织剪碎，加4～6倍重量的酚饱和缓冲液和4～6倍重量的缓冲液饱和酚后，破碎得胎盘组织匀浆液；
c、进行热酚处理，将匀浆液置于50～80℃水浴中搅拌10～20分钟后，迅速移入-20～-10℃盐水浴中速冷至0～10℃；
C、精提分离步骤：
a、将经热酚处理后的匀浆液进行离心分离，吸取上清液放入冰箱0～10℃保存，并收集离心分离出来的酚和蛋白层；
b、加入酚和蛋白层重量的1/2～2/3倍量的酚饱和缓冲液，搅拌10～15分钟后，进行离心分离，吸取上清液与前“a”操作的清液合并存放，并收集分离出来的酚和蛋白层；
c、加入合并清液重量的1/2～2/3倍量的缓冲液饱和酚，搅拌10～15分钟后，进行离心分离，吸取上清液，重复此操作，直至上清液和酚层之间无蛋白或极小量蛋白，收集上清液；
d、取收集的上清液，按上清液重量的5％～8％的量加入醋酸钾，待醋酸钾溶解后加其重量的2～3倍量的-10～-20℃无水乙醇，静置于-20℃环境下8～14小时；
e、进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀即核糖核酸RNA粗制品；
D、纯化步骤：
a、将RNA粗制品按每100克加50～80ml的0.3mol/l醋酸盐缓冲液，使其溶解，进行离心分离，弃去沉淀物，收集上清RNA溶液，加上清RNA溶液重量的2～3倍量的-10～-20℃无水乙醇，置于-20℃环境中1～2小时；
b、进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅成糊状后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅匀；
c、再次进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅成糊状后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅匀，进行离心分离，弃去上清液，得RNA纯品后加等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液保存在-20℃环境中；
d、将保存的RNA进行离心分离，弃上清液，收集沉淀物即RNA纯品，吹干后，保存-20℃环境中。
本发明所述的配制注射用人胎盘核糖核酸的方法包含以下步骤：
a、先将保存在-20℃环境中的RNA纯品用生理盐水溶解，检测并调整好浓度，按核糖核酸10mg～50mg、甘露醇100mg～400mg、右旋糖苷0mg～50mg组分配制注射用人胎盘核糖核酸；
b、再将配制好的人胎盘核糖核酸经无菌过滤后分装于西林瓶内，进行真空冷冻干燥；
c、将真空冷冻干燥后的人胎盘核糖核酸进行封装。
本发明所述的破碎粗提步骤的“b”操作中的捣碎采用胶磨机磨浆方式，选用200目粒度进料进行捣碎。
本发明所述的破碎粗提步骤的“b”操作中的捣碎采用电动组织捣碎机，转速10000～12000转/分钟，按捣碎1～2分钟、停2～5分钟的周期进行2～3次捣碎。
本发明所述的精提分离步骤的“a”操作的离心分离转速4000转/分、分离30分钟，“b”操作和“c”操作的离心分离转速4000转/分、分离20分钟，“e”操作和纯化步骤的“b”操作、“c”操作的离心分离转速3000转/分、分离10分钟，纯化步骤的“d”操作的离心分离转速2000转/分、分离10分钟。
本发明所述的破碎粗提步骤的“c”操作为冷酚处理，将匀浆液置于室温下搅拌30～40分钟。
本发明与现有技术相比具有以下效果和优点：1、人体胎盘具有很高的营养价值，核糖核酸含量高。本发明的核糖核酸从健康产妇的胎盘提取，具有健康母亲体内的一些免疫功能，对受用者来言无特异性，相比从其它的动物、植物提取的核糖核酸，更易被人体吸收，产生效果。2、该提取方法使用十二烷基硫酸钠、8-羟基喹啉苯酚等试剂，不同于现有技术所用的胍类、氯仿等毒性小，使用安全可靠。3、该制备方法制备的RNA活性高，其玫瑰花结细胞形成试验即E.RF证明生物活性在38％左右，而现有技术所制备的RNA生物活性只有15％左右。4、该制备方法制备的RNA含量高、杂质少，经测试其蛋白含量、脱氧核糖核酸DNA含量均不超过RNA含量的10％。5、该制备方法操作简便，不需消耗大量的有机溶剂，制备周期短。
具体实施方式
实施例1：
该注射用人胎盘核糖核酸的制备方法包括从人体胎盘提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盘核糖核酸的方法。本实施例从人体胎盘提取核糖核酸的方法采用热酚法。该制备方法含有以下步骤：
1、配置试剂步骤：
a、配置0.1mol/l醋酸盐缓冲液，在0.1mol/l醋酸盐溶液中包含重量比0.5％的十二烷基硫酸钠、0.2％的聚乙烯硫酸酯、0.2％的乙二胺四乙酸二钠，用醋酸调节其PH值到PH 5.0。
b、配置酚饱和缓冲液，将0.1％的分析纯8-羟基喹啉苯酚与“a”操作中配置的0.1mol/l醋酸盐缓冲液等体积混合在分液漏斗中，振摇300次，避光静置11小时，取其上层液体。
c、配置缓冲液饱和酚，取“b”操作中的下层液体。
d、配置0.3mol/l醋酸盐缓冲液，在0.3mol/l醋酸盐溶液中包含重量比7％的醋酸钾，用醋酸调节其PH值到PH 5.0。
e、配置0.1mol/l醋酸盐洗液，在0.1mol/l醋酸盐溶液中包含重量比3％醋酸钾、0.2％聚乙烯硫酸酯、75％乙醇，用醋酸调节其PH值到PH 5.0。
f、配置生理盐水，用双蒸水配置含0.9％NaCl生理盐水。
2、破碎粗提步骤：
a、取新鲜或冰冻人体胎盘，用去离子水洗净，去除羊膜、脐带、大血管。
b、将清洗后的胎盘组织剪碎，加5倍重量的酚饱和缓冲液和5倍重量的缓冲液饱和酚后，破碎得胎盘组织匀浆液。工业生产中捣碎采用胶磨机磨浆方式，选用200目粒度进料进行捣碎。实验室试验采用电动组织捣碎机，转速11000转/分钟，按捣碎1.5分钟、停3.5分钟的周期进行2次捣碎。
c、进行热酚处理，将匀浆液置于65℃水浴中搅拌15分钟后，迅速移入-15℃盐水浴中速冷至5℃。
3、精提分离步骤：
a、将经热酚处理后的匀浆液进行离心分离，转速4000转/分、分离30分钟。吸取上清液放入冰箱5℃保存，并收集离心分离出来的酚和蛋白层。
b、加入酚和蛋白层重量的3/5倍量的酚饱和缓冲液，搅拌13分钟后，进行离心分离，转速4000转/分、分离20分钟，吸取上清液与前“a”操作的清液合并存放，并收集分离出来的酚和蛋白层。
c、加入合并清液重量的3/5倍量的缓冲液饱和酚，搅拌13分钟后，进行离心分离，转速4000转/分、分离20分钟，吸取上清液，重复此操作，直至上清液和酚层之间无蛋白或极小量蛋白，收集上清液。
d、取收集的上清液，按上清液重量的6.5％的量加入分析纯醋酸钾，待醋酸钾溶解后加其重量的2.5倍量的-15℃无水乙醇，静置于-20℃环境下11小时。
e、进行离心分离，转速3000转/分、分离10分钟，弃去上清液，收集沉淀即核糖核酸RNA粗制品。
4、纯化步骤：
a、将RNA粗制品按每100克加65ml的0.3mol/l醋酸盐缓冲液，使其溶解，进行离心分离，弃去沉淀物，收集上清RNA溶液，加上清RNA溶液重量的2.5倍量的-15℃无水乙醇，置于-20℃环境中1.5小时。
b、进行离心分离，转速3000转/分、分离10分钟，弃去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅成糊状后，再加入沉淀物重量的7倍量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅匀。
c、再次进行离心分离，转速3000转/分、分离10分钟，弃去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅成糊状后，再加入沉淀物重量的7倍量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅匀，进行离心分离，弃去上清液，得RNA纯品后加等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液保存在-20℃环境中。
d、将保存的RNA进行离心分离，转速2000转/分、分离10分钟，弃上清液，收集沉淀物即RNA纯品，用风扇吹干后，保存-20℃环境中。
5、配制注射用人胎盘核糖核酸的步骤：
a、先将保存在-20℃环境中的RNA纯品用生理盐水溶解，检测并调整好浓度，按核糖核酸30mg、甘露醇250mg、右旋糖苷25mg组分配制注射用人胎盘核糖核酸。
b、再将配制好的人胎盘核糖核酸经无菌过滤后分装于西林瓶内，进行真空冷冻干燥。
c、将真空冷冻干燥后的人胎盘核糖核酸进行封装。
实施例2：
本实施例从人体胎盘提取核糖核酸的方法采用冷酚法，该方法的破碎粗提步骤的“c”操作为冷酚处理，即将匀浆液置于室温下搅拌30～40分钟。
该制备方法的其它操作步骤同实施例1。
以下所列也是本发明的实施例：
| 名称 | 参数 | ||||
| 配置试剂步骤 | |||||
| a操作中 | 十二烷基硫酸钠(重量比) | 0.4％ | 0.45％ | 0.55％ | 0.6％ |
| 聚乙烯硫酸酯(重量比) | 0.1％ | 0.15％ | 0.25％ | 0.3％ | |
| 乙二胺四乙酸二钠(重量比) | 0.1％ | 0.15％ | 0.25％ | 0.3％ | |
| b操作中 | 振摇(次) | 200 | 250 | 350 | 400 |
| 避光静置(小时) | 8 | 10 | 13 | 14 | |
| d操作中 | 醋酸钾(重量比) | 6％ | 6.5％ | 7.5％ | 8％ |
| e操作中 | 醋酸钾(重量比) | 2％ | 2.5％ | 3.5％ | 4％ |
| 聚乙烯硫酸酯(重量比) | 0.1％ | 0.15％ | 0.25％ | 0.3％ | |
| 破碎粗提步骤 | |||||
| b操作中 | 酚饱和缓冲液(重量倍) | 4 | 4.5 | 5.5 | 6 |
| 缓冲液饱和酚(重量倍) | 4 | 4.5 | 5.5 | 6 | |
| 转速(转/分钟) | 10000 | 10500 | 11500 | 12000 | |
| 捣碎(分钟) | 1 | 1.25 | 1.75 | 2 | |
| 停(分钟) | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 捣碎、停(次) | 3 | 3 | 2 | 2 | |
| c操作中 | 水浴温度(℃) | 50 | 60 | 70 | 80 |
| 搅拌(分钟) | 10 | 12 | 18 | 20 | |
| 盐水浴温度(℃) | -20 | -18 | -12 | -10 | |
| 速冷至温度(℃) | 0 | 3 | 8 | 10 | |
| 精提分离步骤 | |||||
| a操作中 | 冰箱温度(℃) | 0 | 3 | 8 | 10 |
| b操作中 | 酚饱和缓冲液(重量倍) | 1/2 | 4/7 | 5/8 | 2/3 |
| 搅拌(分钟) | 10 | 12 | 14 | 15 | |
| c操作中 | 缓冲液饱和酚(重量倍) | 1/2 | 4/7 | 5/8 | 2/3 |
| 搅拌(分钟) | 10 | 12 | 14 | 15 | |
| d操作中 | 醋酸钾(重量比) | 5％ | 6％ | 7％ | 8％ |
| 无水乙醇(重量倍) | 2 | 2.25 | 2.75 | 3 | |
| 无水乙醇温度(℃) | -10 | -12 | -18 | -20 | |
| 静置(小时) | 8 | 10 | 12 | 14 | |
| 纯化步骤 | |||||
| a操作中 | 0.3mol/l醋酸盐缓冲液(ml) | 50 | 60 | 70 | 80 |
| 无水乙醇(重量倍) | 2 | 2.25 | 2.75 | 3 | |
| 无水乙醇温度(℃) | -10 | -12 | -18 | -20 | |
| 静置(小时) | 1 | 1.25 | 1.75 | 2 |
| b操作中0.1mol/l醋酸盐洗液(重量倍) | 6 | 6.5 | 7.5 | 8 |
| c操作中0.1mol/l醋酸盐洗液(重量倍) | 6 | 6.5 | 7.5 | 8 |
| 配制注射用人胎盘核糖核酸的步骤 | ||||
| 核糖核酸(mg) | 10 | 20 | 40 | 50 |
| 甘露醇(mg) | 100 | 200 | 300 | 400 |
| 右旋糖苷(mg) | 0 | 15 | 35 | 50 |
以上实施例的操作步骤同实施例1。
用本发明所述的从人体胎盘提取的核糖核酸RNA二批样品按质量指标测定结果如下；
| 序号 | 指标名称 | 热酚法提取的RNA | 冷酚法提取的RNA |
| 1 | 性状 | 无色透明液体 | 无色透明液体 |
| 2 | PH值 | 6.2 | 6.4 |
| 3 | 地衣酚试验 | 兰绿色 | 兰绿色 |
| 4 | 紫外分光光度计测定(样品100倍稀释) | ||
| OD260/OD230 | 1.690 | 1.625 | |
| OD260/OD280 | 2.51 | 2.24 | |
| 5 | RNA含量(mg/ml) | 10.0 | 7.5 |
| 6 | 蛋白含量(mg/ml) | 0.02375 | 0.01650 |
| 7 | 生物活性测定(E.RFC试验) | 40.0％ | 38.0％ |
Claims (6)
1、一种注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，其特征是：所述的制备方法包括从人体胎盘提取核糖核酸的方法和配制注射用人胎盘核糖核酸的方法，从人体胎盘提取核糖核酸的方法包含以下步骤：
A、配制试剂步骤：
a、配置0.1mol/l醋酸盐缓冲液，在0.1mol/l醋酸盐溶液中包含重量比0.4％～0.6％的十二烷基硫酸钠、0.1％～0.3％的聚乙烯硫酸酯、0.1％～0.3％的乙二胺四乙酸二钠，用醋酸调节其PH值，达到PH5.0；
b、配置酚饱和缓冲液，将0.1％的分析纯8-羟基喹啉苯酚与“a”操作中配置的0.1mol/l醋酸盐缓冲液等体积混合在分液漏斗中，振摇200～400次，避光静置8～14小时，取其上层液体；
c、配置缓冲液饱和酚，取“b”操作中的下层液体；
d、配置0.3mol/l醋酸盐缓冲液，在0.3mol/l醋酸盐溶液中包含重量比6％～8％的醋酸钾，用醋酸调节其PH值，达到PH5.0；
e、配置0.1mol/l醋酸盐洗液，在0.1mol/l醋酸盐溶液中包含重量比2％～4％醋酸钾、0.1％～0.3％聚乙烯硫酸酯、75％乙醇，用醋酸调节其PH值，达到PH5.0；
f、配置生理盐水，用双蒸水配置含0.9％NaCl生理盐水；
B、破碎粗提步骤：
a、取新鲜或冰冻人体胎盘，用去离子水洗净，去除羊膜、脐带、大血管；
b、将清洗后的胎盘组织剪碎，加4～6倍重量的酚饱和缓冲液和4～6倍重量的缓冲液饱和酚后，破碎得胎盘组织匀浆液；
c、进行热酚处理，将匀浆液置于50～80℃水浴中搅拌10～20分钟后，迅速移入-20～-10℃盐水浴中速冷至0～10℃；
C、精提分离步骤：
a、将经热酚处理后的匀浆液进行离心分离，吸取上清液放入冰箱0～10℃保存，并收集离心分离出来的酚和蛋白层；
b、加入酚和蛋白层重量的1/2～2/3倍量的酚饱和缓冲液，搅拌10～15分钟后，进行离心分离，吸取上清液与前“a”操作的清液合并存放，并收集分离出来的酚和蛋白层；
c、加入合并清液重量的1/2～2/3倍量的缓冲液饱和酚，搅拌10～15分钟后，进行离心分离，吸取上清液，重复此操作，直至上清液和酚层之间无蛋白或极小量蛋白，收集上清液；
d、取收集的上清液，按上清液重量的5％～8％的量加入醋酸钾，待醋酸钾溶解后加其重量的2～3倍量的-10～-20℃无水乙醇，静置于-20℃环境下8～14小时；
e、进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀即核糖核酸RNA粗制品；
D、纯化步骤：
a、将RNA粗制品按每100克加50～80ml的0.3mol/l醋酸盐缓冲液，使其溶解，进行离心分离，弃去沉淀物，收集上清RNA溶液，加上清RNA溶液重量的2～3倍量的-10～-20℃无水乙醇，置于-20℃环境中1～2小时；
b、进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅成糊状后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅匀；
c、再次进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀物，先加入等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅成糊状后，再加入沉淀物重量的6～8倍量的0.1mol/l醋酸盐洗液搅匀，进行离心分离，弃去上清液，得RNA纯品后加等重量的0.1mol/l醋酸盐洗液保存在-20℃环境中；
d、将保存的RNA进行离心分离，弃上清液，收集沉淀物即RNA纯品，吹干后，保存-20℃环境中。
2、根据权利要求1所述的注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，其特征是：所述的配制注射用人胎盘核糖核酸的方法包含以下步骤：
a、先将保存在-20℃环境中的RNA纯品用生理盐水溶解，检测并调整好浓度，按核糖核酸10mg～50mg、甘露醇100mg～400mg、右旋糖苷0mg～50mg组分配制注射用人胎盘核糖核酸；
b、再将配制好的人胎盘核糖核酸经无菌过滤后分装于西林瓶内，进行真空冷冻干燥；
c、将真空冷冻干燥后的人胎盘核糖核酸进行封装。
3、根据权利要求1所述的注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，其特征是：所述的破碎粗提步骤的“b”操作中的捣碎采用胶磨机磨浆方式，选用200目粒度进料进行捣碎。
4、根据权利要求1所述的注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，其特征是：所述的破碎粗提步骤的“b”操作中的捣碎采用电动组织捣碎机，转速10000～12000转/分钟，按捣碎1～2分钟、停2～5分钟的周期进行2～3次捣碎。
5、根据权利要求1所述的注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，其特征是：所述的精提分离步骤的“a”操作的离心分离转速4000转/分、分离30分钟，“b”操作和“c”操作的离心分离转速4000转/分、分离20分钟，“e”操作和纯化步骤的“b”操作、“c”操作的离心分离转速3000转/分、分离10分钟，纯化步骤的“d”操作的离心分离转速2000转/分、分离10分钟。
6、根据权利要求1所述的注射用人胎盘核糖核酸的制备方法，其特征是：所述的破碎粗提步骤的“c”操作为冷酚处理，将匀浆液置于室温下搅拌30～40分钟。
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