CN111418822B - 一种去壁灵芝孢子粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去壁灵芝孢子粉的制备方法。本发明根据灵芝孢子壁壳成分的理化特性，通过在发酵阶段先接入乳酸克鲁维酵母发酵，再配合交变磁场短时发酵，然后再接入罗伊氏乳杆菌发酵，利用特定的发酵过程在降解灵芝孢子壁壳的同时将壁壳中的几丁质等成分进行发酵转化，又能很好地使孢子粉内的三萜和多糖类有效成分释放出来，制得的去壁灵芝孢子粉无壁壳残留，壁壳成分全部生物转化，生物活性得到显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种去壁灵芝孢子粉的制备方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma Lucidum Karst)，又称为瑞草、神芝、仙草、瑶草、还阳草、林中灵、菌灵芝、万年蕈、灵草、赤芝、丹芝、琼珍等，是一种多孔菌科真菌灵芝的子实体，其外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形。灵芝是中国传统的食药两用的名贵药材，具有扶正固本等功效，在明代大医学家李时珍编著的《本草纲目》中有灵芝的记载。
灵芝孢子是灵芝在生长成熟期从灵芝菌盖中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。大量现代药理学研究及临床案例证实灵芝孢子粉对免疫系统、神经系统、内分泌和代谢系统以及心血管系统等都具有很好的调节作用。灵芝孢子凝聚了灵芝的精华，含有大量的灵芝多糖、三萜类、灵芝孢子油等活性成分，具有灵芝的全部遗传物质和保健作用。
从细胞结构上看，灵芝孢子具有双层壁结构，双层壁由几丁质和葡聚糖构成，质地较为坚韧，占比达50％-70％。几丁质为广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子。实验表明，灵芝孢子壁阻碍有效成分的溶出，影响体内吸收，因此目前绝大部分产品都采用不同的破壁工艺粉碎孢子壁，以期提高活性成分体内生物利用度，增强治疗效果。未破壁的灵芝孢子只有约12％的有效成分能被人体吸收，而破壁后其吸收率可达95％以上，其抗肿瘤、抗氧化和免疫调节作用更加显著。
目前灵芝孢子粉的破壁方法有物理、化学及生物法。物理破壁的方法如机械粉碎对孢子粉进行物理破壁得到破壁灵芝孢子粉，该方法虽然操作简单易行，破壁率较高，但其破壁时间长、能耗高，破壁过程中大量产热，会导致部分热敏物质失活，易导致有效物质的流失及破坏，同时破壁产品中容易混入机械杂质，易造成重金属污染等。化学法也易导致有效物质的流失及破坏。生物法是采用酶解、微生物发酵等温和手段，能有效地保存灵芝孢子功效成分，同时具有能量消耗小、破壁效果好等优点。但是现有的生物酶解法采用微生物发酵使灵芝孢子粉破壁普遍存在发酵周期长、壁壳去除率低、有效成分含量低等问题。现有灵芝孢子粉的破壁方法，破壁后双层壁中的几丁质等仍然存在，与壁内有效成分混合在一起，难以去除，孢子中活性成分含量低的问题仍没有得到根本解决。
中国专利CN 104013652B公开了一种灵芝孢子粉的精制工艺与综合利用方法及其用途，精制工艺为：在破壁后对破壁的灵芝孢子粉进行去壁精制，用体积分数为20％-95％的乙醇溶液和水浸泡后，分离壁壳，得到去壁灵芝孢子粉滤液和灵芝孢子粉壁壳，壁灵芝孢子粉滤液经浓缩得到浓缩液，浓缩液经干燥得到精制灵芝孢子粉，或浓缩液采用一步制粒法直接制得精制灵芝孢子粉制剂或制剂中间体；灵芝孢子粉壁壳经过化学提取的综合回收利用工艺，制得二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、正丁醇提取固体粉末、壁壳水提物固体粉末和壳聚糖。该工艺操作复杂，有机溶剂使用较多，工业化生产成本高。
发明内容
本发明的目的在于针对现有破壁灵芝孢子粉制备工艺的不足，提供一种高效、快速、安全、可控的去壁灵芝孢子粉的制备方法，以提高灵芝孢子粉产品的品质和附加值，为产业发展提供可行的思路和方法。
本发明根据灵芝孢子壁壳成分的理化特性，通过在发酵阶段先接入乳酸克鲁维酵母发酵，再配合交变磁场短时发酵，然后再接入罗伊氏乳杆菌发酵，利用特定的发酵过程在降解灵芝孢子壁壳的同时将壁壳中的几丁质等成分进行发酵转化，又能很好地使孢子粉内的三萜和多糖类有效成分释放出来，制得的去壁灵芝孢子粉无壁壳残留，且壁壳成分全部生物转化，生物活性得到显著提高。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：
一种去壁灵芝孢子粉的制备方法，包括步骤：
(1)前处理：灵芝孢子粉原料经去杂质和干燥，得到干燥的灵芝孢子粉；
(2)乳酸克鲁维酵母种子液的制备：将活化后的乳酸克鲁维酵母菌种接种于液体种子培养基A中培养5h-24h，得到乳酸克鲁维酵母种子液；
(3)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：将活化后的罗伊氏乳杆菌菌种接种于液体种子培养基B中培养5h-24h，得到罗伊氏乳杆菌种子液；
(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉和水混合配制成灵芝孢子粉浓度为5g/L-20g/L的液体发酵培养基，灭菌冷却后，在液体发酵培养基中接入乳酸克鲁维酵母种子液，培养10h-60h，然后置于交变磁场环境中再培养1h-10h，灭菌冷却后再接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养10h-60h，所得发酵液经干燥，得到去壁灵芝孢子粉。
由于本发明主要是利用乳酸克鲁维酵母发酵配合交变磁场短时发酵以及罗伊氏乳杆菌发酵来实现灵芝孢子壁壳成分全部生物转化，灵芝孢子壁壳完全降解完全，从而使壁壳内的灵芝三萜、多糖等有效成分释放出来，得到完全没有壁壳残留的灵芝孢子粉。因此，本发明所述制备方法中参数在所述范围内变化并不影响去壁灵芝孢子粉的制备及其发明效果，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现去壁灵芝孢子粉的制备并达到本发明的效果。本发明所使用的原料均为现有，在所述范围内任意替换对发明效果无明显影响。为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
步骤(1)中，灵芝孢子粉原料经过筛除去杂质，再经水洗离心除去杂质后得到湿灵芝孢子粉，烘干后得到干燥的灵芝孢子粉。
所述灵芝孢子粉原料选用现有的灵芝孢子粉(含有灵芝孢子壁壳)，含有灵芝孢子壁壳的灵芝孢子粉原料可采用本发明方法进行去壁，可直接采用市售产品也可按现有方法制备，例如可选用未破壁的灵芝孢子粉、现有的破壁灵芝孢子粉(如市售的破壁灵芝孢子粉)、灵芝孢子粉经提取后的残余物等中的一种或两种以上。所述灵芝孢子粉原料选用两种以上时用量比例没有特别的限制，可为任意比例。
步骤(2)中，所述菌种可采用任意一种乳酸克鲁维酵母菌种(Kluyveromyceslactis)，均可达到本发明的效果；可采用市售产品，例如：乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)ACCC20054，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
步骤(3)中，所述罗伊氏乳杆菌菌种可采用任意一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌种，均可达到本发明的效果；可采用市售产品，例如：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ACCC00652，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
所述活化后的乳酸克鲁维酵母菌种、活化后的罗伊氏乳杆菌菌种在液体种子培养基中培养的温度均为自然环境温度，优选为20℃-37℃，进一步优选乳酸克鲁维酵母菌种的培养温度为20℃-35℃、罗伊氏乳杆菌菌种的培养温度为25℃-37℃。一般1L液体种子培养基中接入1cm2-4cm2大小活化后的乳酸克鲁维酵母菌种菌块或者1cm2-4cm2大小活化后的罗伊氏乳杆菌菌种菌块。
乳酸克鲁维酵母菌种的活化方法、罗伊氏乳杆菌菌种的活化方法均为本领域常规的菌种活化方法，一般包括：将斜面保藏的菌种接种到PDA平板培养基上，在22℃-30℃活化培养3天-10天，得到活化后的菌种。
所述PDA平板培养基采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。
所述液体种子培养基A以1升计由2g-8g葡萄糖、2g-10g灵芝孢子粉和余量的水组成。所述液体种子培养基B以1升计由2g-8g葡萄糖、2g-10g灵芝孢子粉和余量的水组成。1升液体种子培养基A或1升液体种子培养基B可按照以下方法配制：2g-8g葡萄糖和2g-10g灵芝孢子粉用水定容至1000mL。所述液体种子培养基A与液体种子培养基B可以相同也可以不同。所述灵芝孢子粉优选采用步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉。
步骤(4)中，所述乳酸克鲁维酵母种子液的用量优选为液体发酵培养基体积的1％-15％。所述乳酸克鲁维酵母种子液在液体发酵培养基中培养温度优选为20℃-35℃。
所述罗伊氏乳杆菌种子液的用量优选为液体发酵培养基体积的1％-10％。所述罗伊氏乳杆菌种子液在液体发酵培养基中培养温度优选为25℃-37℃。
所述交变磁场的条件优选为：磁场强度为3mT-10mT，磁场频率为20Hz-50Hz。
本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
所述去壁灵芝孢子粉的制备方法制备得到的去壁灵芝孢子粉，完全没有壁壳残留，壁壳成分全部生物转化，实现了孢子粉无效成分(壁壳)的生物转化和有效成分(多糖及三萜等)的富集，该去壁灵芝孢子粉有效成分含量显著提高，活性明显增强。可应用于保健食品或医药制品等中。
本发明与现有技术相比有如下优点：
1、本发明去壁灵芝孢子粉的制备方法环保，可操作性强，产量高，实现了孢子粉无效成分(壁壳)的生物转化和有效成分(多糖及三萜等)的富集，产出的去壁灵芝孢子粉有效成分含量显著提高，活性明显增强，提高了灵芝孢子粉产品的品质及附加值。
2、本发明发现对灵芝孢子壁有专一性降解作用的乳酸克鲁维酵母和罗伊氏乳杆菌，通过科学设计的分阶段发酵，结合交变磁场作用，使灵芝孢子壁壳完全降解完全，从而使壁壳内的灵芝三萜、多糖等有效成分释放出来，得到的孢子粉完全没有壁壳残留。
3、本发明所采用的微生物发酵方法制备高品质的去壁灵芝孢子粉，发酵周期短，效率高，整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业化生产和应用推广。
附图说明
图1为现有技术处理得到的破壁灵芝孢子粉的电镜扫描图片；
图2为本发明方法得到的去壁灵芝孢子粉的电镜扫描图片。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)ACCC20054，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)ACCC00652，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
一、材料准备
灵芝孢子粉原料选用未破壁的灵芝孢子粉。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的乳酸克鲁维酵母菌种接种到PDA平板培养基上在22℃活化培养10天，得到活化后的乳酸克鲁维酵母菌种。
将斜面保藏的罗伊氏乳杆菌菌种接种到PDA平板培养基上在22℃活化培养10天，得到活化后的罗伊氏乳杆菌菌种。
二、去壁灵芝孢子粉的制备：
(1)前处理：灵芝孢子粉原料经过筛除去杂质，再经水洗离心除去泥沙等杂质后得到湿灵芝孢子粉，烘干后得到干燥的灵芝孢子粉；
(2)乳酸克鲁维酵母种子液的制备：将2cm2大小活化后的乳酸克鲁维酵母菌种接种于1L液体种子培养基A中，35℃培养24h，得到乳酸克鲁维酵母种子液；液体种子培养基A：葡萄糖5g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉3g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(3)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：将2cm2大小活化后的罗伊氏乳杆菌菌种接种于1L液体种子培养基B中，25℃培养24h，得到罗伊氏乳杆菌种子液；液体种子培养基B：葡萄糖3g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉4g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(2)中乳酸克鲁维酵母种子液按占液体发酵培养基体积1％的量接种于1L液体发酵培养基中，35℃培养15h，然后置于磁场强度为3mT、磁场频率为25Hz的交变磁场环境中再培养3h，121℃下灭菌30min，冷却后在28℃再按占液体发酵培养基体积1％的量接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养20h，发酵液经喷雾干燥，得到去壁灵芝孢子粉；液体发酵培养基：步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉15g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
所得去壁灵芝孢子粉的电镜扫描图片见图2，图2显示通过本发明提供的方法处理的去壁灵芝孢子粉，孢子粉壁壳已经完全降解，孢子粉中没有残留的孢子粉壁壳残渣，达到了真正去壁的效果。
实施例2
一、材料准备
灵芝孢子粉原料选用破壁的灵芝孢子粉(来源于浙江龙泉佳宝生物科技有限公司)。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的乳酸克鲁维酵母菌种接种到PDA平板培养基上在22℃活化培养10天，得到活化后的乳酸克鲁维酵母菌种。
将斜面保藏的罗伊氏乳杆菌菌种接种到PDA平板培养基上在22℃活化培养10天，得到活化后的罗伊氏乳杆菌菌种。
二、去壁灵芝孢子粉的制备：
(1)前处理：灵芝孢子粉原料经过筛除去杂质，再经水洗离心除去泥沙等杂质后得到湿灵芝孢子粉，烘干后得到干燥的灵芝孢子粉；
(2)乳酸克鲁维酵母种子液的制备：将2cm2大小活化后的乳酸克鲁维酵母菌种接种于1L液体种子培养基A中，35℃培养18h，得到乳酸克鲁维酵母种子液；液体种子培养基A：葡萄糖2g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉2g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(3)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：将2cm2大小活化后的罗伊氏乳杆菌菌种接种于1L液体种子培养基B中，25℃培养16h，得到罗伊氏乳杆菌种子液；液体种子培养基B：葡萄糖4g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉5g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(2)中乳酸克鲁维酵母种子液按占液体发酵培养基体积1％的量接种于1L液体发酵培养基中，35℃培养10h，然后置于磁场强度为4mT、磁场频率为20Hz的交变磁场环境中再培养1h，121℃下灭菌30min，冷却后在26℃再按占液体发酵培养基体积1％的量接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养12h，发酵液经喷雾干燥，得到去壁灵芝孢子粉；液体发酵培养基：步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉20g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
实施例3
一、材料准备
灵芝孢子粉原料选用灵芝孢子粉经提取后的残余物(来源于浙江寿仙谷药业有限公司)。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的乳酸克鲁维酵母菌种接种到PDA平板培养基上在30℃活化培养3天，得到活化后的乳酸克鲁维酵母菌种。
将斜面保藏的罗伊氏乳杆菌菌种接种到PDA平板培养基上在30℃活化培养3天，得到活化后的罗伊氏乳杆菌菌种。
二、去壁灵芝孢子粉的制备：
(1)前处理：灵芝孢子粉原料经过筛除去杂质，再经水洗离心除去泥沙等杂质后得到湿灵芝孢子粉，烘干后得到干燥的灵芝孢子粉；
(2)乳酸克鲁维酵母种子液的制备：将1cm2大小活化后的乳酸克鲁维酵母菌种接种于1L液体种子培养基A中，30℃培养10h，得到乳酸克鲁维酵母种子液；液体种子培养基A：葡萄糖8g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉10g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(3)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：将1cm2大小活化后的罗伊氏乳杆菌菌种接种于1L液体种子培养基B中，30℃培养15h，得到罗伊氏乳杆菌种子液；液体种子培养基B：葡萄糖2g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉10g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(2)中乳酸克鲁维酵母种子液按占液体发酵培养基体积15％的量接种于1L液体发酵培养基中，30℃培养25h，然后置于磁场强度为10mT、磁场频率为50Hz的交变磁场环境中再培养1h，121℃下灭菌30min，冷却后在25℃再按占液体发酵培养基体积5％的量接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养10h，发酵液经喷雾干燥，得到去壁灵芝孢子粉；液体发酵培养基：步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉5g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
实施例4
一、材料准备
灵芝孢子粉原料选用未破壁的灵芝孢子粉、破壁的灵芝孢子粉(来源于浙江龙泉佳宝生物科技有限公司)、灵芝孢子粉经提取后的残余物(来源于浙江寿仙谷药业有限公司)质量比为1:1:1。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的乳酸克鲁维酵母菌种接种到PDA平板培养基上在30℃活化培养3天，得到活化后的乳酸克鲁维酵母菌种。
将斜面保藏的罗伊氏乳杆菌菌种接种到PDA平板培养基上在30℃活化培养3天，得到活化后的罗伊氏乳杆菌菌种。
二、去壁灵芝孢子粉的制备：
(1)前处理：灵芝孢子粉原料经过筛除去杂质，再经水洗离心除去泥沙等杂质后得到湿灵芝孢子粉，烘干后得到干燥的灵芝孢子粉；
(2)乳酸克鲁维酵母种子液的制备：将4cm2大小活化后的乳酸克鲁维酵母菌种接种于1L液体种子培养基A中，20℃培养5h，得到乳酸克鲁维酵母种子液；液体种子培养基A：葡萄糖5g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉7g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(3)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：将3cm2大小活化后的罗伊氏乳杆菌菌种接种于1L液体种子培养基B中，37℃培养5h，得到罗伊氏乳杆菌种子液；液体种子培养基B：葡萄糖8g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉2g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(2)中乳酸克鲁维酵母种子液按占液体发酵培养基体积6％的量接种于1L液体发酵培养基中，20℃培养60h，然后置于磁场强度为7mT、磁场频率为40Hz的交变磁场环境中再培养10h，121℃下灭菌30min，冷却后在37℃再按占液体发酵培养基体积10％的量接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养60h，发酵液经喷雾干燥，得到去壁灵芝孢子粉；液体发酵培养基：步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉10g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
实施例5
一、材料准备
灵芝孢子粉原料选用未破壁的灵芝孢子粉、破壁的灵芝孢子粉(来源于浙江龙泉佳宝生物科技有限公司)质量比为1:3。
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的乳酸克鲁维酵母菌种接种到PDA平板培养基上在25℃活化培养5天，得到活化后的乳酸克鲁维酵母菌种。
将斜面保藏的罗伊氏乳杆菌菌种接种到PDA平板培养基上在25℃活化培养5天，得到活化后的罗伊氏乳杆菌菌种。
二、去壁灵芝孢子粉的制备：
(1)前处理：灵芝孢子粉原料经过筛除去杂质，再经水洗离心除去泥沙等杂质后得到湿灵芝孢子粉，烘干后得到干燥的灵芝孢子粉；
(2)乳酸克鲁维酵母种子液的制备：将3cm2大小活化后的乳酸克鲁维酵母菌种接种于1L液体种子培养基A中，28℃培养10h，得到乳酸克鲁维酵母种子液；液体种子培养基A：葡萄糖5g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉5g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(3)罗伊氏乳杆菌种子液的制备：将4cm2大小活化后的罗伊氏乳杆菌菌种接种于1L液体种子培养基B中，20℃培养15h，得到罗伊氏乳杆菌种子液；液体种子培养基B：葡萄糖5g和步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉6g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(2)中乳酸克鲁维酵母种子液按占液体发酵培养基体积10％的量接种于1L液体发酵培养基中，30℃培养20h，然后置于磁场强度为5mT、磁场频率为30Hz的交变磁场环境中再培养3h，121℃下灭菌30min，冷却后在28℃再按占液体发酵培养基体积8％的量接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养15h，发酵液经喷雾干燥，得到去壁灵芝孢子粉；液体发酵培养基：步骤(1)中干燥的灵芝孢子粉15g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。
实施例2-5所得去壁灵芝孢子粉的电镜扫描图片显示：通过本发明提供的方法处理的去壁灵芝孢子粉，孢子粉壁壳已经完全降解，孢子粉中没有残留的孢子粉壁壳残渣，达到了真正去壁的效果，与图2显示的结果相同。
对比例1传统的破壁孢子粉
灵芝孢子粉原料选用未破壁的灵芝孢子粉。
(1)灵芝孢子粉前处理：灵芝孢子原料，过筛除去杂质，得到过筛的灵芝孢子，加入蒸馏水水洗离心，除去泥沙等杂质后得到湿灵芝孢子，烘干后得到干燥的灵芝孢子粉。
(2)破壁：对干燥的灵芝孢子进行破壁处理，使破壁率达到80％-100％，得到破壁的灵芝孢子粉；破壁的方法包括但不限于物理、化学等，如振动磨破壁、超音速气流破壁、流化床式气流粉碎机破壁。图1为采用流化床式气流粉碎机破壁得到的破壁灵芝孢子粉的电镜扫描图片。
对比图1和图2可以看出，图1中常规的破壁灵芝孢子粉通过显微镜观察，虽然孢子粉壁壳已经破碎，但仍然残留在孢子粉中。通过本发明提供的方法处理的去壁灵芝孢子粉，孢子粉壁壳已经完全降解，孢子粉中没有残留的孢子粉壁壳残渣，达到了真正去壁的效果。采用振动磨破壁或超音速气流破壁得到的破壁灵芝孢子粉的电镜扫描图片显示：虽然孢子粉壁壳已经破碎，但仍然残留在孢子粉中，与图1显示的结果相同。
对比例2无交变磁场
除了“(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(2)中乳酸克鲁维酵母种子液按占液体发酵培养基体积1％的量接种于1L液体发酵培养基中，35℃培养18h，121℃下灭菌30min，冷却后在28℃再按占液体发酵培养基体积1％的量接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养20h，发酵液经喷雾干燥”，其余操作同实施例1，得到处理后的灵芝孢子粉。
对比例3单一乳酸克鲁维酵母菌发酵
除了“(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(2)中乳酸克鲁维酵母种子液按占液体发酵培养基体积1％的量接种于1L液体发酵培养基中，35℃培养35h，然后置于磁场强度为3mT、磁场频率为25Hz的交变磁场环境中再培养3h，发酵液经喷雾干燥”，其余操作同实施例1，得到处理后的灵芝孢子粉。
对比例4单一罗伊氏乳杆菌发酵
除了“(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤(3)中罗伊氏乳杆菌种子液按占液体发酵培养基体积1％的量接种于1L液体发酵培养基中，28℃培养35h，然后置于磁场强度为3mT、磁场频率为25Hz的交变磁场环境中再培养3h，发酵液经喷雾干燥”，其余操作同实施例1，得到处理后的灵芝孢子粉。
对比例5
除了“液体种子培养基A：葡萄糖5g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。液体种子培养基B：葡萄糖3g用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌25min。”，其余操作同实施例1，得到处理后的灵芝孢子粉。
对比例6采用几丁质酶
除了“(4)灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将几丁质酶按占液体发酵培养基体积1％的量接入于1L液体发酵培养基中，35℃培养15h，然后置于磁场强度为3mT、磁场频率为25Hz的交变磁场环境中再培养3h，121℃下灭菌30min，冷却后在28℃再按占液体发酵培养基体积1％的量接入几丁质酶，培养20h，发酵液经喷雾干燥”，其余操作同实施例1，得到处理后的灵芝孢子粉。
对比例2-6得到的处理后的灵芝孢子粉的电镜扫描图片显示：虽然孢子粉壁壳已经破碎，但仅有极少量壁壳降解，大量壁壳仍然残留在孢子粉中。
表1灵芝孢子粉含量检测结果
注：分别与对比例1-6比较，*：P<0.05；**：P<0.01；表明差异具有显著性；
表1数据显示，与对比例1-6相比，采用本发明方法制得的去壁孢子粉中三萜含量提高了57.8％-87.3％，多糖含量提高了49.9％-65.8％。通过本发明方法制备的去壁孢子粉，与对比例1中传统的破壁孢子粉相比，与对比例2-6中处理后的灵芝孢子粉相比，其有效成分三萜和多糖含量均得到有效提高。
检测实施例1-5中去壁灵芝孢子粉、对比例1中破壁灵芝孢子粉、对比例2-6中处理后的灵芝孢子粉和Vc(维生素C)的抗氧化活性，检测结果见表2：
表2抗氧化检测结果
注：分别与对比例1-6比较，*：P<0.05；**：P<0.01；表明差异具有显著性。
表2数据显示，本发明制得的去壁灵芝孢子粉的抗氧化性能与Vc相当或略弱于Vc，本发明制得的去壁灵芝孢子粉比对比例1中传统的破壁灵芝孢子粉具有更优异的抗氧化性能，比对比例2-6中处理后的灵芝孢子粉亦具有更优异的抗氧化性能，表明其生物活性更高。
采用其它现有乳酸克鲁维酵母菌种(Kluyveromyces lactis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)均可以达到上述效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
本发明制备方法中参数的变化并不影响去壁灵芝孢子粉的制备，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现去壁灵芝孢子粉的制备。在此不再赘述。
Claims (5)
1.一种去壁灵芝孢子粉的制备方法，其特征在于，包括步骤：
（1）前处理：灵芝孢子粉原料经去杂质和干燥，得到干燥的灵芝孢子粉；
（2）乳酸克鲁维酵母种子液的制备：将活化后的乳酸克鲁维酵母菌种接种于液体种子培养基A中培养5h-24h，得到乳酸克鲁维酵母种子液；所述液体种子培养基A以1升计由2g-8g葡萄糖、2g-10g灵芝孢子粉和余量的水组成；所述乳酸克鲁维酵母菌种的活化为在22℃-30℃活化培养3天-10天；活化后的乳酸克鲁维酵母菌种的培养温度为20℃-35℃；
（3）罗伊氏乳杆菌种子液的制备：将活化后的罗伊氏乳杆菌菌种接种于液体种子培养基B中培养5h-24h，得到罗伊氏乳杆菌种子液；所述液体种子培养基B以1升计由2g-8g葡萄糖、2g-10g灵芝孢子粉和余量的水组成；所述罗伊氏乳杆菌菌种的活化为在30℃活化培养3天；活化后的罗伊氏乳杆菌菌种的培养温度为25℃-37℃；
（4）灵芝孢子粉壁壳的生物降解：将步骤（1）中干燥的灵芝孢子粉和水混合配制成灵芝孢子粉浓度为5g/L-20g/L的液体发酵培养基，灭菌冷却后，在液体发酵培养基中接入乳酸克鲁维酵母种子液，培养10h-60h，然后置于交变磁场环境中再培养1h-10h，灭菌冷却后再接入罗伊氏乳杆菌种子液，培养10h-60h，所得发酵液经干燥，得到去壁灵芝孢子粉；
步骤（4）中，所述交变磁场的条件为：磁场强度为3mT-10mT，磁场频率为20Hz-50Hz；
乳酸克鲁维酵母种子液在液体发酵培养基中培养温度为20℃-35℃；
罗伊氏乳杆菌种子液在液体发酵培养基中培养温度为25℃-37℃。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述乳酸克鲁维酵母种子液的用量为液体发酵培养基体积的1%-15%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述罗伊氏乳杆菌种子液的用量为液体发酵培养基体积的1%-10%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述灵芝孢子粉原料选用未破壁的灵芝孢子粉、破壁灵芝孢子粉、灵芝孢子粉经提取后的残余物中的一种或两种以上。
5.一种去壁灵芝孢子粉，其特征在于，所述去壁灵芝孢子粉是根据权利要求1-4任一项所述的制备方法制备得到。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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