CN102040520B

CN102040520B - 一种从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法

Info

Publication number: CN102040520B
Application number: CN 201010542548
Authority: CN
Inventors: 邵平; 洪台; 孙培龙; 刘青梅
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2010-11-15
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2030-11-15
Also published as: CN102040520A

Abstract

本发明公开了一种从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，所述方法为：以杜仲植物叶为原料，以体积分数为20％～80％的强极性有机溶剂水溶液为提取剂，在功率为300～800W的微波辅助下，40～70℃浸提15～40min，将提取液过滤，干燥，制得杜仲叶黄酮粗品，所述原料与提取剂的料液比为1g∶10～50mL；所述杜仲叶黄酮粗品以体积比为3～4∶1∶4～5的乙酸乙酯/正丁醇/水作为溶剂体系进行高速逆流色谱分离纯化，制得绿原酸；本发明有益效果主要体现在：本发明操作步骤简单、设备种类单一、生产周期短、产物纯度高，具有广泛的应用价值及良好的社会经济效益。

Description

一种从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法

(一)技术领域

本发明涉及以植物为原料提取制备有效成分的方法，具体涉及从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法。

(二)背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)，古称“曼榆”，又名“木棉”，属杜仲科落叶乔木，为我国特有的经济树种，已有2000多年的栽培历史，产地分布全国，总量占世界90％以上。杜仲植物的干燥树皮具有补肝肾、强筋骨、降血压、抗肿瘤、抗菌等诸多功效，但杜仲皮一般需生长15～20年，周期长、资源相对紧缺且昂贵。杜仲叶的资源相对丰富、易得，全国约有杜仲林28万公顷，每年可产落叶达400万吨，而其利用率仅占可采集叶的10％～20％，这些丰富的杜仲叶资源一直被人们所忽视。近年来大量研究表明杜仲叶中绿原酸等黄酮类物质含量丰富，其主要化学成分与杜仲皮的化学成分基本一致，有一定的互补性，因此利用杜仲叶提取具有多种药理活性物质，充分利用我国的植物资源具有重要的经济意义和现实意义。

绿原酸为咖啡酸奎尼酸衍生物，具有利胆、抗菌、抗病毒、减压、增高白血球及调节中枢神经系统等多种药理作用，作为重要原料广泛用于保健品，药品、化妆品等工业。绿原酸多从植物中提取获得，目前国内外主要从生咖啡豆和金银花中提取绿原酸。杜仲叶中绿原酸含量为1％～5.5％，该含量在植物叶子中属于较高者，因此从杜仲叶中分离提取绿原酸具有广阔的开发前景。

微波是利用分子极化或离子导电效应而直接对物质进行加热的一种处理技术，因此微波辅助提取有效成分，能对不同组分进行选择性加热，使目标组分更容易从提取物中分离出来，且热效率高，能有效地提高提取效率。因此，微波辅助提取在原有单纯溶剂提取的基础上，可以有效地提高目标物的分离提取率，是物质分离提取中一种有效的辅助手段。

高速逆流色谱技术(High-Speed Counter-current Chroma-tography，HSCCC)是当前国际上较新型无固体载体的液-液分配技术。HSCCC依靠缠绕在自传轴上的聚四氟乙烯(PTFE)蛇形管在共转轴上进行特殊的同步行星式运动模式而产生的离心场作用，使互不相溶的两液体相的其中一相因离心力保留在柱中，另一相作为流动相，并使流动相单向、低速通过固定相，在短时间内实现样品在互不相溶的两相溶剂系统中高速分配，继而达到连续逆流萃取分离目的，被分离的各组分依据其在两相中分配系数的差异得到分离。HSCCC因其无固体支持物作固定相，所以避免了固体支持物或载体带来的样品吸附、变性、损失、污染、峰形拖尾等缺点，对颗粒或沉淀物质进行分离而不会造成色谱柱的堵塞；同时具有预处理简单，可直接进样粗制样品或合成混合物，且分离纯化制备可同步完成，洗脱组分可达到相当高的纯度，组分回收简单等优点。

目前，专利CN1400199A公开了一种从杜仲叶中连续提取活性物质的方法，该法以水、甲醇或乙醇为提取剂，通过大孔树脂分离、乙酸乙酯萃取和混合溶剂重结晶等工序提取绿原酸和杜仲总黄酮。该方法使用的是非极性树脂，对绿原酸的吸附率不高；采取的乙酸乙酯萃取、乙酸乙酯-氯仿重结晶，操作麻烦、溶剂复杂、母液回收设备要求高。专利CN1687435A公开了一种高纯度绿原酸工业化生产工艺，主要步骤为原料经石油醚预处理、生物复合酶提取、提取液调酸、乙酸乙酯萃取、碱中和萃取液后水相酸沉、沉淀重结晶。专利CN1273964A公开了一种杜仲叶制备绿原酸工艺，主要步骤如下：超声预处理、高温提取、超滤、乙酸乙酯萃取、D-140树脂分离等。目前已公开的相关杜仲叶中有效成分的分离制备专利，几乎都是涉及溶剂反复萃取、大孔树脂或硅胶柱分离、重溶与结晶等，存在操作复杂繁琐、周期长、所用溶剂复杂、组分的回收率不高等缺陷。

随着市场上对绿原酸的需求不断上涨，如何利用简便、快速的先进技术与设备从杜仲叶中得到质量稳定、纯度高、溶剂回收率较高的绿原酸将成为研究的热点，针对该类提取方法的研究十分必要。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种从杜仲叶中分离提取绿原酸的方法，该方法克服了溶剂提取杜仲叶中绿原酸的提取率低、分离纯化效果差、目标组分回收率低及纯度不高等缺陷。

本发明采用的技术方案如下：

一种从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，所述方法按照以下步骤进行：以杜仲植物叶为原料，以体积分数为20％～80％的强极性有机溶剂水溶液为提取剂，在功率为300～800W的微波辅助下，40～70℃浸提15～40min，将提取液过滤，干燥，制得杜仲叶黄酮粗品，所述原料与提取剂的料液比为1g∶10～50mL；所述的杜仲叶黄酮粗品再以高速逆流色谱分离纯化：以体积比为3～4∶1∶4～5的乙酸乙酯/正丁醇/水作为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，流速为1～2mL/min，在800～900r/min的转速下，25～35℃，高速逆流色谱分离纯化200min，紫外254nm检测收集液的吸收峰，根据逆流色谱出峰时间在86～142min之间的收集液作为目标组分，再将目标组分45～60℃真空旋转蒸发干燥，得绿原酸。

所述的原料为落叶前采摘的杜仲叶阴干后，碾碎成杜仲叶粉末，通常碾成过80目筛的粉末。

所述强极性有机溶剂为乙醇、丙酮或甲醇，优选为丙酮。

所述有机溶剂水溶液中有机溶剂体积分数为40％～60％，更优选为50％。

所述原料与提取剂的料液比优选为1g∶16～40mL，更优选为1g∶30mL。

所述的微波辅助提取温度优选为45～60℃，更优选为50～60℃。

所述的微波功率优选为400～700W，更优选为600W。

所述的微波辅助浸提时间优选为20～35min，更优选为25min。

所述的高速逆流色谱分离纯化流速优选为1.5～2.0mL/min，更优选为1.8～2.0mL/min。

所述的高速逆流色谱分离纯化转速优选为850～900r/min，更优选为900r/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明采用微波辅助提取及高速逆流色谱分离纯化相结合的方法从杜仲叶中分离纯化绿原酸，该方法具有操作步骤简单、设备种类单一、生产周期短、产物纯度高等优点，克服了采用树脂柱、硅胶柱等分离方法的分离效果不明显、目标组分难回收、提取率低等缺陷，具有广泛的应用价值及良好的社会经济效益。

(四)附图说明

图1为实施例1所得杜仲叶黄酮粗品在254nm下的高速逆流色谱分离图；

图2、3分别为实施例1所得杜仲叶黄酮粗品在254nm、350nm下的HPLC谱图；

图4为对比例1中单纯丙酮浸提所得杜仲叶黄酮粗品在350nm下的HPLC谱图；

图5为对比例1中单纯甲醇浸提所得杜仲叶黄酮粗品在350nm处的HPLC谱图；

图6为对比例1中单纯乙醇浸提所得杜仲叶黄酮粗品在350nm处的HPLC谱图；

图7、8分别为实施例10和实施例11高速逆流色谱分离所得绿原酸样品在350nm处的HPLC谱图；

图9为实施例10所得绿原酸样品与绿原酸标品的薄层色谱对照图，A点为绿原酸样品点，B点为绿原酸标品点；

图10为实施例11所得绿原酸样品与绿原酸标品的紫外光谱对照图；

图11为实施例11所得绿原酸样品的电喷雾电离源-质谱图；

图12为实施例12所得绿原酸样品的¹HNMR谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品30.0g，以900mL 50％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶30投料，50℃下提取25min，微波功率为600W。提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，得3.8432g干燥物，即为杜仲叶黄酮粗品，得率为12.81％。

实施例2

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品5.0g，以80mL 50％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶16投料，微波功率400W，40℃下浸提20min，提取结束后真空抽滤，滤液经旋转蒸发干燥，得5.7452g干燥物，即为杜仲叶黄酮粗品，得率为11.49％。

实施例3

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品5.0g，以100mL 50％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶20投料，50℃下提取30min，微波功率为500W。提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲叶黄酮粗品0.6270g，得率为12.54％。

实施例4

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品5.0g，以200mL 50％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶40投料，60℃下提取35min，微波功率为700W。提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲叶黄酮粗品0.6464g，得率为12.93％。

实施例5

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品5.0g，以50mL 60％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶10投料，70℃下提取35min，微波功率为300W。提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲叶黄酮粗品0.4088g，得率为8.19％。

实施例6

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品5.0g，以250mL 20％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶50投料，70℃提取40min，微波功率为800W。提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲叶黄酮粗品0.6014g，得率为12.03％。

实施例7

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品5.0g，以100mL 40％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶20投料，45℃下提取25min，微波功率为700W。提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲叶黄酮粗品0.5009g，得率为10.02％。

实施例8

准确称取过80目筛的杜仲叶粉末样品5.0g，以150mL 80％的丙酮水溶液为提取剂，按照料液比(g/mL)为1∶30投料，40℃下提取15min，微波功率为600W。提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲叶黄酮粗品0.6346g，得率为12.69％。

实施例9：HPLC检测

HPLC检测的分离柱采用Symmetry shield RP18(4.6×250mm，5μm)；柱温为35℃；流动相：A为甲醇，B为0.5％的磷酸水溶液，线性梯度洗脱程序：0-10min：A＝30％，10-30min：A：30％-50％，30-40min：A＝50％-60％，40-50min：A＝60％-30％；流速：0.6mL/min；样品均采用全自动进样，进样量为10μL；200nm-400nm紫外全波长扫描检测。

准确称取1.005g实施例1制得的杜仲叶黄酮粗品，用进口色谱级甲醇溶解并定溶至100mL，在254nm和350nm对其进行HPLC分析，结果如图2和图3所示。

从图2、3中可以看出：杜仲叶的丙酮水提物有3个主要组分，且组分1的含量较大。

实施例10：高速逆流色谱分离纯化及纯度检测

准确称取实施例1制得的杜仲叶黄酮粗品424.7mg，溶于20mL上下相混合溶液(上、下相溶液各10mL)中，进行高速逆流色谱分离纯化(HSCCC)。高速逆流色谱条件为：乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶1∶4)作为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相；转速900r/min；温度30℃；流速2mL/min，分离时间为200min；在254nm处紫外检测，收集出峰时间在98～104min的流出液，如图1中黑色部分所示，旋转蒸发至干，得绿原酸样品28.9mg。将该样品溶于进口色谱级甲醇，在350nm处进行HPLC分析，纯度为98.7％，结果如图7所示。

实施例11高速逆流色谱分离纯化及纯度检测

准确称取实施例1制得的杜仲叶黄酮粗品407.3mg，溶于20mL上下相混合溶液(上、下相溶液各10mL)中，进行高速逆流色谱分离纯化。高速逆流色谱条件为：乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5)作为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相；转速850r/min；温度30℃；流速1.5mL/min，分离时间为200min；紫外254nm检测，收集出峰时间在101～107min的流出液，旋转蒸发至干，得绿原酸样品27.7mg，将该样品溶于进口色谱级甲醇，在350nm处进行HPLC分析，纯度为98.3％，结果如图8所示。

实施例12高速逆流色谱分离纯化及纯度检测

准确称取实施例1制得的杜仲叶黄酮粗品453.4mg，溶于20mL上下相混合溶液(上、下相溶液各10mL)中，进行高速逆流色谱分离纯化。高速逆流色谱条件为：乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5)作为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相；转速900r/min；温度35℃；流速1.8mL/min，分离时间为200min；紫外254nm检测，收集出峰时间在86～97min的流出液，旋转蒸发至干，得绿原酸样品29.4mg，将该样品溶于进口色谱级甲醇，在350nm处进行HPLC分析，纯度为98.0％。

实施例13高速逆流色谱分离纯化及纯度检测

准确称取实施例1制得的杜仲叶黄酮粗品442.8mg，溶于20mL上下相混合溶液(上、下相溶液各10mL)中，进行高速逆流色谱分离纯化。高速逆流色谱条件为：乙酸乙酯-正丁醇-水(3∶1∶4)作为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相；转速800r/min；温度25℃；流速1.0mL/min，分离时间为200min；紫外254nm检测，收集出峰时间在128～142min的流出液，旋转蒸发至干，得绿原酸样品28.2mg，将该样品溶于进口色谱级甲醇，在350nm处进行HPLC分析，纯度为97.9％。

实施例14：绿原酸样品的定性分析

将实施例10所得绿原酸样品以三氯化铝乙醇溶液为显色剂，与绿原酸标品进行薄层层析色谱分析，A点为绿原酸样品点，B点为绿原酸标品点，结果如图9所示，绿原酸样品与绿原酸标品的Rf值一致，为0.263。

称取实施例11制得的绿原酸样品0.0027g，溶于无水甲醇，定容至10mL，摇匀；以无水甲醇为参比，在200～400nm进行紫外扫描，结果绿原酸样品的紫外吸收峰与绿原酸标品基本一致，如图10所示。

实施例15：电喷雾电离源-质谱分析(ESI-MS)

将实施例11所得绿原酸样品配成1.7mg/mL样品甲醇溶液，在电离源：电喷雾(ESI)；电离模式：+ESI；实验参数：气体温度(Gas Temp)：300℃，裂解电压(Fragmentor)：175V，干燥气流速(Drying Gas)：10L/min，扫描电压(Skimmer)：65V，雾化压力(Nebulizer)：50psig；m/z为60～800全离子扫描的质谱条件下进行电喷雾电离源-质谱分析，结果与绿原酸的分子质量一致，如图11所示。

实施例16：核磁共振氢谱分析

精确称取实施例12所得绿原酸样品14.7mg溶于氘代试剂(甲醇)，进行氢谱分析，结果如图12所示。

对比例1单纯溶剂提取与微波辅助提取效果的比较

乙醇/丙酮/甲醇水溶液浸提：准确称取杜仲叶样品5.0g，以50％乙醇水溶液或50％丙酮水溶液或50％甲醇水溶液为提取剂，按照料液比为1∶30，提取时间为2h，提取温度为50℃，置于恒温水浴锅中浸提，反应结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲黄酮粗品。

微波辅助有机溶剂浸提：准确称取杜仲叶样品5.0g，以50％的丙酮水溶液为溶剂，按照料液比为1∶30，提取时间为25min，提取温度为50℃，提取功率为600W，提取结束后真空抽滤，滤液旋转蒸发干燥，即得杜仲黄酮粗品，与单纯有机溶剂浸提效果比较，如表1所示。

表1 单纯溶剂浸提与微波辅助浸提绿原酸效果的比较

从表1中可以看出，微波辅助浸提绿原酸的效果明显高于单纯溶剂提取，其中绿原酸比例为绿原酸占粗黄酮样品的峰面积百分比，高效液相图谱见图4、5、6。从图4、5、6中可以看出，丙酮、甲醇、乙醇这三种溶剂均可以有效地提取杜仲叶中的绿原酸，相比之下，丙酮提取的成分较单一，更利于分离纯化。

Claims

1.一种从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述方法按照以下步骤进行：以杜仲植物叶为原料，以体积分数为20%~80%的强极性有机溶剂水溶液为提取剂，在功率为300~800W的微波辅助下，40~70℃浸提15~40min，将提取液过滤，干燥，制得杜仲叶黄酮粗品，所述原料与提取剂的料液比为1g：10~50 mL；所述的杜仲叶黄酮粗品再以高速逆流色谱分离纯化：以体积比为3~4∶1∶4~5的乙酸乙酯/正丁醇/水作为溶剂体系，上相为固定相，下相为流动相，流速为1~2mL/min，在800~900r/min的转速下，25~35℃，高速逆流色谱分离纯化200min，紫外254nm检测收集液的吸收峰，根据逆流色谱出峰时间在86~142min之间的收集液作为目标组分，再将目标组分45~60℃真空旋转蒸发干燥，得绿原酸；所述强极性有机溶剂为丙酮。

2.如权利要求1所述的从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述的原料为落叶前采摘的杜仲叶阴干后，碾碎成杜仲叶粉末。

3.如权利要求1所述的从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述有机溶剂水溶液中有机溶剂的体积分数为40%~60%。

4.如权利要求1所述的从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述原料与提取剂的料液比为1 g:16~40 mL。

5.如权利要求1所述的从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述的微波辅助提取温度为45~60℃。

6.如权利要求1所述的从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述的微波功率为400~700W。

7.如权利要求1所述的从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述的微波辅助浸提时间为20~35min。

8.如权利要求1所述的从杜仲叶中分离纯化绿原酸的方法，其特征在于所述的高速逆流色谱分离纯化流速为1.5~2.0 mL/min。