CN102175790B - 一种同时检测苹果中五种多酚并进行品种识别的hplc方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测苹果中五种多酚并进行品种识别的HPLC方法。它首先将苹果去核,加入抗坏血酸,粉碎后采用超声、氮气保护或加热方法防止褐变,然后加入甲醇-水溶液或乙酸乙酯超声提取,收集上清液后重复提取一次,合并上清液,进行HPLC检测。根据不同品种不同地区所测五种多酚含量分析,采用绿原酸和芦丁作为目标化合物对七个不同苹果品种进行识别。本发明采用HPLC同时快速分离测定五种多酚,并达到对不同品种的苹果识别的目的,此方法样品前处理简单,成本低,可同时测定,实现了对不同品种苹果的识别。
Description
技术领域
本发明涉及一种苹果中五种多酚的检测方法,特别涉及利用多酚检测含量进行不同品种的识别方法的建立。
背景技术
多酚类物质是具有苯环并结合有多个羟基化学结构的物质总称,包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等。一般作为生长代谢中的次生产物,广泛存在于植物的组织中,对植物的生长发育和调节,基因的诱导表达,信号转导,紫外辐射的吸收,生物固氮以及果蔬加工过程中风味的形成,颜色变化(如褐变),果蔬饮料的混浊与沉淀,等都有一定的影响。其中,没食子酸,绿原酸,咖啡酸,原儿茶酸和芦丁是植物中广泛存在的五种多酚,以其抗病毒,抗癌症等药理特性越来越受到中外学者的关注。这五种化合物的结构式如下所示:
现存的检测苹果中多酚的方法有以下几种。
国内外的关于苹果中多酚的检测方法主要是以多酚的各种化学反应为基础,使用各种仪器进行分析。食品分析中常用的酚类测定方法有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法及毛细管电泳法。紫外分光光度法和薄层色谱法只能测定总酚或某一种多酚含量,不能确定具体种类和含量。高效液相色谱法操作简便、准确度高、重复性好,可同时测定多种多酚化合物的含量。
近年来,国外很多研究致力于通过生物活性物质的含量对不同品种的水果进行识别,如Miguel A.Pedroza,Amaya Zalacain,Jose Felix Lara,M.Rosario Salinas等用柠檬精油,沉香醇等对不同品种的葡萄进行了识别。而国内的地区品种识别主要集中于直接点喷雾离子阱质谱法对烟叶等的快速表征(刘巍等,2008)或者利用指纹图谱对不同品种或不同地区的中药材进行识别表征,而对苹果的品种识别研究,尤其是用多酚含量进行品种识别的研究少见报道。
发明内容
本发明旨在用HPLC同时快速分离测定五种多酚,并达到对不同品种的苹果识别的目的。此方法样品前处理简单,成本低,可同时测定,实现了对不同品种苹果的识别。
本发明的技术方案是:利用HPLC对五种多酚进行分离测定,通过对其各自的含量分析,得出不同品种苹果的识别图谱。
本发明的具体步骤如下:
(1)苹果的前处理
将苹果去核,加入足量(至没过样品)的抗坏血酸水溶液,用榨汁机粉碎后采用超声、氮气保护或加热方法防止褐变(防止褐变措施维持到样品称量时)。
(2)多酚物质的提取
可以采用甲醇-水溶液或乙酸乙酯提取,提取方法如下:
甲醇-水溶液提取:称取粉碎好的苹果样品,加入甲醇-水溶液,涡旋震荡后超声;离心,将上清液过滤至烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液;取上清液过0.45μm的滤膜,然后用HPLC检测。
乙酸乙酯提取:称取粉碎好的苹果样品,加入乙酸乙酯,涡旋震荡后超声;离心,将上清液过滤至烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液;旋转蒸干后用乙腈定容,然后用HPLC检测。
(3)五种多酚的同时检测
HPLC-DAD检测:色谱柱:Atlantis C18(5μm,250mm×4.5mm),选择柱温,选择流动相梯度洗脱,选择测定波长后检测。
(4)多酚含量测定方法的建立
用甲醇-水溶液逐级稀释五种多酚标准品,配制成一组混合工作标准溶液,以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标(Y),标准溶液的浓度为横坐标(X),分别建立标准校正曲线,在检测实际样品时,根据样品所得的相对响应值,然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量。
(5)苹果品种和产地识别
将不同品种不同地区的苹果按照以上方法进行处理,并对其五种多酚含量数据进行比较,选择含量差距较大的两种多酚作为分布图的横纵坐标做出分布图,然后利用测定的待测苹果的多酚含量数据,通过分布图找出待测苹果所对应的品种和产地。如七个苹果品种:如嘎啦,红富士,蛇果,美国八号,青苹果,黄金帅,红玫瑰的区分以及对红富士,美国八号,嘎啦三个品种不同产地的区分如烟台,沂源,福建,新西兰,美国。
优选地,步骤(1)前处理方法:所述防褐变溶液为足量(至没过样品)质量百分浓度为1%抗坏血酸水溶液,同时采用超声控制褐变直至样品称量。
优选地,步骤(2)处理方式为:称取5g粉碎好的苹果样品,加入20mL甲醇-水(体积比1∶1)溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液;取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测。
优选地,步骤(3)五种多酚的同时测定方法为:色谱柱:Atlantis C18(5μm,250mm×4.5mm),流动相A:2%乙酸-水溶液;B:乙腈。梯度洗脱:流速为1ml/min,初始比例为流动相比例95∶5(A∶B体积比),到18min时流动相比例变为65∶35,到19min时恢复为95∶5,柱温35℃,检测波长为270nm,检测时间20min。
优选地,步骤(4)标准溶液的配制为:首先称取五种多酚标准品各10mg,分别用甲醇-水溶液(体积比1∶1)溶解为1mg/mL的标准储备液于-20℃保存,然后用甲醇-水溶液(体积比1∶1)继续稀释到10ug/mL的中间液,密封保存于4℃。配制混合标准溶液,用甲醇-水溶液(体积比1∶1)逐级稀释使绿原酸含量为1-100μg/mL,其他四种多酚含量为0.5-50μg/mL。以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标(Y),标准溶液的浓度为横坐标(X),分别建立标准校正曲线,在检测实际样品时,根据样品所得的相对响应值,然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量。
优选地,步骤(5)不同品种不同地区苹果的测定方法为:称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL甲醇-水(1∶1)溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液。取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测。根据其含量,选择绿原酸和芦丁含量作为分布图的横纵坐标。
本发明的有益效果为:
(1)在苹果样品的前处理过程,以抗坏血酸作为防褐变溶液并超声控制褐变,可以减少在实验过程中苹果中多酚的氧化,使实验结果更可靠。
(2)采用了甲醇-水溶液作为多酚的提取溶液,可以充分的提取苹果中的多酚。
(3)采用色谱柱:Atlantis C18(5μm,250mm×4.5mm),流动相A:2%乙酸-水溶液;B:乙腈。梯度洗脱:0~18min内流动相比例从A∶B(95∶5)变为65∶35,到19min时变为95∶5,柱温35℃,检测波长为270nm,检测时间20min。对五种多酚达到了较好的分离结果。
(4)通过对五种多酚含量的分析得出了不同品种苹果的识别图谱。
附图说明
图1为五种多酚标准品(1μg/ml)的HPLC-DAD分离图谱。图1中1为没食子酸;2为原儿茶酸;3为绿原酸;4为咖啡酸;5为芦丁。
图2为不同提取溶液提取的五种多酚的含量分布图。
图3为通过绿原酸以及芦丁含量的不同对七个品种的苹果的识别分布图,图中1、红玫瑰,2、红富士,3、嘎啦,4、蛇果,5、美国八号,6、青苹果,7、金元帅。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
1、仪器与样品
11、仪器:色谱柱:Atlantis C18(5μm,250mm×4.5mm)
1.2、样品:七个苹果品种为红富士、嘎啦、蛇果、美国八号、金元帅、青苹果、红玫瑰;对同一品种的红富士、嘎啦和美国八号分别测试不同产地,如烟台、沂源、福建、新西兰、美国的差异做了对比。
2、方法与结果
在样品前处理和提取方法的优化中,选取时令的嘎啦苹果为实验样品。
2.1、样品的前处理优化,影响褐变的因素主要有氧气和温度等,为了有效防止实验过程中苹果中多酚的褐变反应,实验采取了三种方案来控制褐变。
方法一
将苹果切成小块,加入足量的1%抗坏血酸水溶液,粉碎后超声。称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL甲醇-水(1∶1)溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液。取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测。
方法二
将苹果切成小块,加入足量的1%抗坏血酸水溶液,粉碎后氮气保护。称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL甲醇-水(1∶1)溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液。取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测。
方法三
将苹果切成小块,加入足量的1%抗坏血酸水溶液,粉碎后80℃水浴20min。称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL甲醇-水(1∶1)溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液。取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测。
本实验采用测定回收率。利用回收率来评价不同方法的抗褐变能力,见表1。
表1不同的防褐变方法对苹果中五种多酚回收率的影响
发现三种方法均可行。但为了减少实验时间和减少实验成本,实验采用了方法一,即加入抗坏血酸然后超声的方法。
2.2、苹果中多酚提取方法的优化。目前多酚的提取溶液有甲醇、乙醇、丙酮以及乙酸乙酯等,实验中就甲醇-水(1∶1)溶液和乙酸乙酯两种提取方法进行了优化。
方法一:
称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL甲醇-水(1∶1)溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液。取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测。
方法二:
称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL乙酸乙酯,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液。40℃旋转蒸干后用乙腈定容至2.0ml,用HPLC检测。
实验采用五种多酚的提取量来评价萃取方法,如分布图2。由图可以看出只有在对咖啡酸的提取中两种方法的提取量差不多,而在其他四种多酚的提取中,甲醇-水的提取效果比乙酸乙酯的要好。原因可能是甲醇-水的极性比乙酸乙酯的强,因此选择甲醇-水(1∶1)为提取液。
2.3、高效液相色谱分析
色谱柱:Atlantis C18(5μm,250mm×4.5mm),流动相A:2%乙酸-水溶液;B:乙腈。梯度洗脱:0~18min内流动相比例从A∶B=95∶5变为65∶35,到19min时变为95∶5,柱温35℃,检测波长为270nm,检测时间20min。
2.4、准确称取没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸和芦丁的标准品10mg,分别用甲醇-水(1∶1)溶解为1mg/mL的标准储备液于-20℃保存,然后用甲醇-水(1∶1)继续稀释到10ug/mL的中间液,密封保存于4℃,备用。配制混合标准溶液,用甲醇-水(1∶1)逐级稀释使绿原酸含量为1-100μg/mL,其他四种多酚含量为0.5-50μg/mL。以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标(Y),标准溶液的浓度为横坐标(X),分别建立标准校正曲线,在检测实际样品时,根据样品所得的相对响应值,然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量。
2.5、分析所得五种多酚的含量对不同品种、不同地区的苹果进行识别。见表2、3。
表2不同苹果品种中的多酚含量(μg/g)
表3不同地区苹果中多酚含量(μg/g)
由上述两个表可以看出不同品种的苹果所处地区差异是导致这五种化合物含量不同的主要原因。含量从高到低分别是绿原酸、咖啡酸、芦丁、原儿茶酸和没食子酸。其中绿原酸和芦丁在同一品种的苹果中的含量差距较大,因此选择这两种化合物的含量来做分布图,从而做出不同品种苹果的分布图。如图3所述。
然后将待测苹果采用下述方法进行处理:称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL甲醇-水(1∶1)溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液。取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测。根据样品所得的相对响应值,分别从绿原酸和芦丁的标准曲线中读出样品中绿原酸和芦丁的含量。然后通过分布图中找出待测苹果所对应的品种和产地。
Claims (7)
1.一种同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法,其特征是,所述五种多酚为:没食子酸,绿原酸,咖啡酸,原儿茶酸和芦丁,该方法包括以下步骤:
(1)苹果的前处理
将苹果去核,加入足量的抗坏血酸水溶液,用榨汁机粉碎后采用超声、氮气保护或加热方法防止褐变;
(2)多酚物质的提取
采用甲醇-水溶液或乙酸乙酯提取,所述甲醇-水溶液提取为:称取粉碎好的苹果样品,加入甲醇-水溶液,涡旋震荡后超声;离心,将上清液过滤至烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液;取上清液过0.45μm的滤膜,然后用HPLC检测;所述乙酸乙酯提取为:称取粉碎好的苹果样品,加入乙酸乙酯,涡旋震荡后超声;离心,将上清液过滤至烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液;旋转蒸干后用乙腈定容,然后用HPLC检测;
(3)五种多酚的同时检测
HPLC-DAD检测:色谱柱:Atlantis C18,规格为:5μm,250mm × 4.5mm,流动相为A:2%乙酸-水溶液,B:乙腈;所述梯度洗脱为:流速为1ml/min,初始比例为流动相A:B体积比95:5,到18min时流动相A:B体积比变为65:35,到19min时恢复为95:5,柱温35℃,检测波长为270nm,检测时间20min;
(4)多酚含量测定方法的建立
用甲醇-水溶液逐级稀释五种多酚标准品,配制成一组混合工作标准溶液,以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标,标准溶液的浓度为横坐标,分别建立标准校正曲线,在检测样品时,根据样品所得的相对响应值,然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量。
2.如权利要求1所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法,其特征是,所述步骤(1)采用超声方法防止褐变,所述抗坏血酸溶液的质量百分浓度为1%。
3.如权利要求1所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法,其特征是,所述步骤(2)多酚物质的提取为:称取5g粉碎好的苹果样品,加入20mL甲醇-水溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液;取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测,所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1:1。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法,其特征是,所述骤(4)多酚含量测定方法的建立为:首先称取五种多酚标准品各10mg,分别用甲醇-水溶液溶解为1mg/mL的标准储备液于-20℃ 保存,然后用甲醇-水溶液继续稀释到10ug/mL的中间液,密封保存于4℃;配制混合标准溶液,用甲醇-水溶液逐级稀释使绿原酸含量为1-100μg/mL,其他四种多酚含量为0.5-50μg/mL;然后以每个浓度下的标准溶液所得的相对响应值为纵坐标,标准溶液的浓度为横坐标,分别建立标准校正曲线,在检测样品时,根据样品所得的相对响应值,然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量,所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为1:1。
5.利用苹果中五种多酚的含量进行品种识别的方法,其特征是,将不同品种不同地区的苹果按照权利要求1所述的同时检测苹果中五种多酚的HPLC方法进行处理,并对其五种多酚含量数据进行比较,选择含量差距较大的两种多酚作为分布图的横纵坐标做出分布图,然后利用测定的待测苹果的多酚含量数据,通过分布图找出待测苹果所对应的品种和产地。
6.如权利要求5所述的利用苹果中五种多酚的含量进行品种识别的方法,其特征是,选择绿原酸和芦丁含量作为分布图的横纵坐标做分布图。
7.如权利要求5或6所述的利用苹果中五种多酚的含量进行品种识别的方法,其特征是,所述不同品种不同地区苹果的处理方法为:称取5g匀质好的苹果样品,加入20mL体积比1:1的甲醇-水溶液,涡旋震荡10s后超声30min,以4000rpm离心5min,将上清液过滤至150ml烧瓶,然后重复萃取一次,合并上清液;取2.0ml上清液过0.45μm滤膜后,取40μL用HPLC检测;根据样品所得的相对响应值,然后分别从标准曲线中读出样品中各种多酚含量。
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