CN114839234B - 一种植物激素原位微区电化学传感分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于先进农业传感分析领域，具体涉及一种植物激素原位微区电化学传感分析方法。步骤主要包括半固态电解质、功能化MOFs和电化学传感器的制备，以及构建电化学检测装置和植物激素的原位微区检测；半固态电解质的制备，解决了感知器件与感知界面形成的固相界面处植物激素难以有效传质的问题，其能够自粘附在被测植物表面，扩散性能好、电化学性能优异，不仅实现了与感知界面的微观有效接触，同时解决了固相界面植物激素原位感知的瓶颈问题，为植物激素原位感知创造了条件；电化学传感器以金属有机框架材料(MOFs)作为仿生酶，稳定性高、催化活性强，并结合抗体特异结合达到了精确检测的目的；实现了多种植物激素的同时、快速检测。
Description
技术领域
本发明属于先进农业传感分析领域，具体涉及一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，用于多种植物激素原位微区的灵敏、准确检测。
背景技术
植物激素是植物体内合成的微量小分子有机物，在极低浓度就能调控植物生长发育而直接影响农作物产量，是推动现代集约化农业实现作物高产优质的重要因素。为了深入研究与植物激素有关的合成、代谢和分子作用机理等问题，对植物体内激素水平进行精准定量分析是必要的前提条件。由于植物体内的激素含量极低，且植物激素对光、温度、氧化剂等外界条件敏感，易受植物组织中复杂代谢物背景的干扰，因此，发展高敏、特异的分析方法用于脱落酸、赤霉素、生长素等多组分植物激素的超微量测定尤为重要。
现有的植物激素测定方法如高效液相色谱法、气相色谱法等，该类方法灵敏度高、选择性好，但前处理过程破坏了植物激素在样品中的原始赋存状态。随着纳米技术、微机电加工技术的发展及各种新技术、新方法的兴起和融合，基于仿生催化材料的电化学传感器呈现出微型化、集成化、智能化的发展趋势。然而，在实际检测分析中，电化学反应必须在缓冲溶液中进行，即待测物和感知器件形成的是固-液界面。由于含植物激素的待测植物和感知器件之间形成的是固相界面，需要将植物激素提取出来才能进行定量，导致无法实时掌握待测植物的激素水平和生理状态，这严重限制了电化学检测在植物激素原位、动态分析中的应用。
发明内容
针对以上存在的问题，本发明构建了一种基于半固态电解质的电化学传感分析方法，并结合金属有机框架材料(MOFs)作为仿生酶用于多种植物激素的原位微区定量检测。
为了实现以上技术目的，本发明的具体步骤如下：
步骤一：半固态电解质的制备：
将葡萄糖和电解质盐用去离子水溶解，待溶解后，利用盐酸或氢氧化钾调节溶液的pH，得到混合溶液A；然后称取一定量的凝胶剂，添加到混合溶液A中，加热搅拌直至完全溶解，得到混合溶液B；将混合溶液B置于一定温度下冷却一段时间后，形成的凝胶即为半固态电解质；
步骤二：功能化MOFs的制备：
过程一：称取一定量硝酸钴分散在甲醇和乙醇的混合液中得到混合溶液C；
过程二：称取一定量二甲基咪唑分散于甲醇和乙醇的混合液中得到混合溶液D；
过程三：在磁力搅拌的条件下，将混合溶液C与混合溶液D混合，室温下孵育一段时间后，经离心、清洗、真空干燥，即可得到仿生酶紫色固体，将仿生酶紫色固体分散到甲醇溶液中得到仿生酶溶液；然后取制得的仿生酶溶液与胶体金溶液混合，搅拌、离心、清洗后，将其分散到甲醇溶液中得到功能化MOFs溶液。
步骤三：电化学传感器的制备：
将丝网印刷电极浸入H2SO4溶液中，采用循环伏安法对电极进行活化，活化完成后在丝网印刷电极的工作电极表面滴加一定量的胶体金溶液，室温下干燥，得到丝网印刷电极A；然后取步骤二制备的功能化MOFs溶液滴在丝网印刷电极A的工作电极表面，反应一段时间后用Tris-HCl缓冲溶液清洗，得到丝网印刷电极B；最后取植物激素抗体滴加在丝网印刷电极B的工作电极表面，静置一段时间后，加入牛血清白蛋白(BSA)封闭一段时间，得到电化学传感器；
步骤四：电化学检测装置的构建：
过程一：将步骤一所制备的半固态电解质加在步骤三所制备的电化学传感器的电极传感区域，使其在电极传感区域表面形成一定厚度的均匀凝胶，即制得传感芯片；
过程二：电化学检测装置的构建：电化学检测装置由传感芯片、电池、稳压模块和微控制器组成，其中传感芯片与电池电性相连，电池与稳压模块电性相连，稳压模块与微控制器电性相连，微控制器内嵌有模数(AD)转换器和输入输出(IO)接口的蓝牙模块，蓝牙模块与智能终端无线相连；
电化学检测装置利用蓝牙连接智能终端的电化学检测软件，在软件上设置控制传感芯片的起止电压，通过AD转换器将数字信号转变为模拟信号，由微控制器将信号施加在传感芯片上；随后传感芯片获得该起止电压而产生电流响应值，通过AD转换器将模拟信号转变为数字信号并利用蓝牙传回智能终端储存；
步骤五：植物激素的原位微区检测：
过程一：首先配制一系列浓度的植物激素标准溶液，浓度分别为Q1、Q2、Q3、……、Qn-1、Qn，共n个浓度梯度，n为正整数；然后将这n个溶液分别喷洒在统一尺寸的聚酯薄膜(PET)上，干燥后将其贴在传感芯片表面的半固态电解质上，静置一段时间后进行电化学检测；
过程二：打开智能终端的电化学检测软件，通过蓝牙连接电化学检测装置，在软件上设置控制传感芯片的起止电压，收集并储存传感芯片产生的电流响应值；根据植物激素浓度和响应电流之间的相关关系建立线性回归模型，回归方程为y＝ax+b，其中x代表植物激素浓度的对数，y代表响应电流值，a和b为常数；
过程三：将植物表面划开，将传感芯片置于其表面，使得半固态电解质与创面相贴合，静置一段时间后进行电化学检测，将得到的电流值带入过程二的线性回归方程，计算出植物激素的浓度。
进一步的，步骤一中所述葡萄糖、电解质盐和去离子水的用量比为1～10mg：100～1000mg：5～50mL；所述电解质盐包括KCl和KH2PO4；所述盐酸或氢氧化钾的浓度均为1M，所述调节溶液的pH至8～13。
进一步的，步骤一中所述凝胶剂与混合溶液A的用量关系为0.1～1g：5～10ml；所述凝胶剂包括琼脂糖、黄原胶或明胶；所述加热搅拌时加热的温度为80～100℃；所述一定温度为18～25℃；所述冷却一段时间为8～14h。
进一步的，步骤二的过程一中所述硝酸钴、甲醇、乙醇的用量比为1～3g：10～50mL：10～50mL；所述硝酸钴的浓度为0.1～0.5mM。
进一步的，步骤二的过程二中所述二甲基咪唑、甲醇、乙醇的用量比为1～5g：10～50mL：10～50mL；所述二甲基咪唑的浓度为1～5mM。
进一步的，步骤二的过程三中所述混合溶液C与混合溶液D混合时的体积比为1:1；所述孵育一段时间为10～60h；所述真空干燥的温度为50～100℃；所述仿生酶溶液的浓度为1mg/mL；所述胶体金溶液、仿生酶溶液的用量比为5～10mL：1～5mL；所述胶体金溶液的浓度为0.01～0.1mg/mL；所述搅拌时间为1～5h；所述功能化MOFs溶液的浓度为2mg/mL。
进一步的，步骤三中所述丝网印刷电极为单通道丝网印刷电极或多通道丝网印刷电极；所述H2SO4溶液的浓度为1mol/L；所述胶体金溶液的用量为1～10μL，浓度为0.01～0.1mg/mL；所述功能化MOFs溶液的用量为10～50μL，浓度为2mg/mL；所述反应时间为1～5h；所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM。
进一步的，步骤三中所述植物激素抗体的浓度为1～5μg/mL，用量为5～10μL；所述静置时间为1～5h；所述BSA的质量分数为1％，用量为50～100μL；所述封闭时间为0.5～3h；所述植物激素抗体包括脱落酸抗体、赤霉素抗体或生长素抗体。
进一步的，步骤四的过程一中所述一定厚度为0.2～0.8mm；所述电极传感区域为工作电极、辅助电极、对电极所组成的区域。
进一步的，步骤五的过程一中所述植物激素标准溶液的浓度范围为0～3×10-4M；所述PET膜的尺寸为(长×宽)1～5cm×1～5cm；所述静置一段时间为20～90min；所述植物激素包括脱落酸、赤霉素或生长素；过程二中所述电化学检测软件包括PSTouch、CHI和GPES；过程三中所述静置一段时间为30～60min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所述的半固态电解质，将催化底物和电解质融合在一起，无需逐步滴加溶液，简化了操作过程。
(2)本发明所述的电化学传感分析方法采用半固态电解质获取电化学信号，与液态电解质相比，实现了检测区域自由，在很大程度上提高了电化学传感体系的便携性和应用性。
(3)本发明借助半固体电解质实现植物激素的传质与检测，不需对待测植物进行复杂的预处理，有效实现了植物激素的原位、动态检测。
(4)本发明利用稳定性高、催化活性强的仿生酶催化底物产生电信号，实现了低含量植物激素的灵敏检测。
(5)本发明利用多通道丝网印刷电极与传感技术相结合，灵敏度高、选择性好，实现了多种植物激素的同时、快速检测。
附图说明
图1为实施例1中仿生酶的扫描电镜图。
图2为实施例1中仿生酶的透射电镜图。
图3为传感芯片的结构示意图，其中1-辅助电极，2-工作电极，3-参比电极，4-半固态电解质，5-胶体金，6-功能化MOFs，7-植物激素抗体。
图4为电化学检测装置示意图，其中1-传感芯片，2-电池，3-稳压模块，4-微控制器，5-蓝牙模块，AD-模数转换器，IO-输入输出接口。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。本实施例所用的绿豆芽为欧尚超市购买；所述胶体金溶液、丝网印刷电极购自苏州长三角系统生物交叉科学研究院有限公司。
实施例1：
步骤一：所述的半固态电解质的制备包含以下过程：
过程一：称取5mg葡萄糖、150mg KCl和270mg KH2PO4于烧杯中，用30mL去离子水溶解，待完全溶解后，利用1M盐酸或氢氧化钾调节溶液的pH为12，得到混合溶液A；
过程二：称取0.5g明胶，添加到混合溶液A中，加热搅拌直至完全溶解，得到混合溶液B；
过程三：将混合溶液B转移至5mL注射器中，置于20℃下冷却11h后，形成的凝胶即为半固态电解质。
步骤二：所述的功能化MOFs的制备包含以下过程：
过程一：称取1.5g硝酸钴分散在40mL甲醇和40mL乙醇的混合液中得到混合溶液C；
过程二：称取1.6g二甲基咪唑分散于40mL甲醇和40mL乙醇的混合液中得到混合溶液D；
过程三：在磁力搅拌的条件下，将混合溶液C与混合溶液D混合，在室温下孵育24h后离心，然后用甲醇清洗3次，经80℃真空干燥即可得到仿生酶紫色固体，将仿生酶紫色固体分散到甲醇溶液中得到浓度为1mg/mL的仿生酶溶液。
图1为仿生酶的扫描电镜图。从图中可以看出，仿生酶的直径约为200nM左右，表面比较规整、光滑、分散性较好、大小分布也比较均匀而且无其他背景杂质，其晶体呈现出完整的菱形十二面体结构。图2为仿生酶的透射电镜图。从图中可以看出，仿生酶呈现出完整的菱形十二面体结构。
过程四：取过程三的仿生酶溶液2mL与6mL浓度为0.03mg/mL的胶体金溶液混合，搅拌3h，离心后，用甲醇清洗得到功能化MOFs，并将其分散到甲醇溶液中得到浓度为2mg/mL的功能化MOFs溶液。
步骤三：所述的电化学传感器的制备包含以下过程：
过程一：将丝网印刷电极浸在1mol/L的H2SO4溶液中，采用循环伏安法对电极进行活化，活化完成后在丝网印刷电极的工作电极表面滴加5μL的AuNPs，室温下干燥，得到丝网印刷电极A；
过程二：取40μL功能化MOFs溶液滴在丝网印刷电极A的工作电极表面，反应2h后，用10mM的Tris-HCl缓冲溶液清洗，得到丝网印刷电极B；
过程三：取8μL浓度为2μg/mL的生长素抗体滴加在丝网印刷电极B的工作电极表面，静置2h后加入90μL牛血清白蛋白(BSA)封闭1h，得到电化学传感器。
步骤四：所述的电化学检测装置的构建包含以下过程：
过程一：将步骤一所述的半固态电解质用针管注射在步骤三所述的电化学传感器的电极传感区域，使其在电极传感区域表面形成0.5mm厚的均匀凝胶，即制得传感芯片(图3)；
过程二：电化学检测装置的构建：电化学检测装置由传感芯片、电池、稳压模块和微控制器组成，其中传感芯片与电池电性相连，电池与稳压模块电性相连，稳压模块与微控制器电性相连，微控制器内嵌有模数(AD)转换器和输入输出(IO)接口的蓝牙模块，蓝牙模块与智能终端无线相连(图4)；
电化学检测装置利用蓝牙(图4中标记5)连接智能终端的电化学检测软件，在软件上设置控制传感芯片(图4中标记1)的起止电压，通过AD转换器将数字信号转变为模拟信号，由微控制器(图4中标记4)将信号施加在传感芯片上；随后传感芯片获得该起止电压而产生电流响应值，通过AD转换器将模拟信号转变为数字信号并利用蓝牙传回智能终端储存。
步骤五：所述的植物激素的原位微区检测包含以下过程：
过程一：首先配制一系列浓度的生长素标准溶液，浓度分别为1×10-16M、1×10- 15M、1×10-14M、1×10-13M、1×10-12M、1×10-11M、1×10-10M、1×10-9M、1×10-8M、1×10-7M；然后将这10个溶液分别喷洒在1cm×1cm的PET膜上，干燥后将其贴在传感芯片的半固态电解质上，静置30min后进行电化学检测；
过程二：打开电脑的CHI软件，通过蓝牙连接电化学检测装置，在软件上设置控制传感芯片的起止电压，收集并储存传感芯片产生的电流响应值。根据生长素浓度和响应电流之间的相关关系建立线性回归模型，回归方程为y＝1.7814x+13.6588(R2＝0.9957)；
过程三：用刀片将绿豆芽表面划开，将传感芯片置于其表面，使得半固态电解质与创面相贴合，静置30min后采用示差脉冲伏安法进行电化学检测，将测得的电流值10μA代入过程二的线性回归方程，得出生长素的浓度为21.5nM。
实施例2：
步骤一：所述的半固态电解质的制备包含以下过程：
过程一：称取5mg葡萄糖、150mg KCl和270mg KH2PO4于烧杯中，用30mL去离子水溶解，待完全溶解后，利用1M盐酸或氢氧化钾调节溶液的pH为12，得到混合溶液A；
过程二：称取0.5g明胶，添加到混合溶液A中，加热搅拌直至完全溶解，得到混合溶液B；
过程三：将混合溶液B转移至5mL注射器中，置于20℃下冷却11h后，形成的凝胶即为半固态电解质。
步骤二：所述的功能化MOFs的制备包含以下过程：
过程一：称取1.5g硝酸钴分散在40mL甲醇和40mL乙醇的混合液中得到混合溶液C；
过程二：称取1.6g二甲基咪唑分散于40mL甲醇和40mL乙醇的混合液中得到混合溶液D；
过程三：在磁力搅拌的条件下，将混合溶液C与混合溶液D混合，在室温下孵育24h后离心，然后用甲醇清洗3次，经80℃真空干燥即可得到仿生酶紫色固体，将仿生酶紫色固体分散到甲醇溶液中得到浓度为1mg/mL的仿生酶溶液。
过程四：取过程三的仿生酶溶液2mL与6mL浓度为0.03mg/mL的胶体金(AuNPs)溶液混合，搅拌3h，离心后，用甲醇清洗得到功能化MOFs，并将其分散到甲醇溶液中得到浓度为2mg/mL的功能化MOFs溶液。
步骤三：所述的电化学传感器的制备包含以下过程：
过程一：将双通道丝网印刷电极浸在1mol/L的H2SO4溶液中，采用循环伏安法对电极进行活化，活化完成后在双通道丝网印刷电极的工作电极表面分别滴加5μL的AuNPs，室温下干燥，得到双通道丝网印刷电极A；
过程二：分别取40μL功能化MOFs溶液分别滴在双通道丝网印刷电极A的工作电极表面反应2h后用10mM的Tris-HCl缓冲溶液清洗，得到双通道丝网印刷电极B；
过程三：取双通道丝网印刷电极B，两个通道分别记为通道一和通道二；取8μL浓度为2μg/mL的生长素抗体滴加在双通道丝网印刷电极B通道一的工作电极表面；然后再取8μL浓度为2μg/mL的脱落酸抗体滴加在双通道丝网印刷电极B通道二的工作电极表面；静置2h后分别加入90μL牛血清白蛋白(BSA)封闭1h，得到电化学传感器。
步骤四：所述的电化学检测装置的构建包含以下过程：
过程一：将步骤一所述的半固态电解质用针管注射在步骤三所述的电化学传感器的电极传感区域，使其在电极传感区域表面形成0.5mm厚的均匀凝胶，即制得传感芯片，此传感芯片的第一通道为测定生长素的通道，第二通道为测定脱落酸的通道；
过程二：电化学检测装置的构建：电化学检测装置由传感芯片、电池、稳压模块和微控制器组成，其中传感芯片与电池电性相连，电池与稳压模块电性相连，稳压模块与微控制器电性相连，微控制器内嵌有模数(AD)转换器和输入输出(IO)接口的蓝牙模块，蓝牙模块与智能终端无线相连(图4)；
电化学检测装置利用蓝牙(图4中标记5)连接智能终端的电化学检测软件，在软件上设置控制传感芯片(图4中标记1)的起止电压，通过AD转换器将数字信号转变为模拟信号，由微控制器(图4中标记4)将信号施加在传感芯片上；随后传感芯片获得该起止电压而产生电流响应值，通过AD转换器将模拟信号转变为数字信号并利用蓝牙传回智能终端储存。
步骤五：所述的植物激素的原位微区检测包含以下过程：
过程一：首先配制一系列浓度的植物激素标准溶液(包括生长素和脱落酸，根据所添加的抗体对应选择植物激素)，浓度分别为1×10-16M、1×10-15M、1×10-14M、1×10-13M、1×10-12M、1×10-11M、1×10-10M、1×10-9M、1×10-8M、1×10-7M；然后将这10个溶液分别喷洒在1cm×2cm的PET膜上，干燥后将其贴在传感芯片的半固态电解质上，静置30min后进行检测；
过程二：打开电脑的CHI软件，通过蓝牙连接电化学检测装置，在软件上设置控制传感芯片通道一的起止电压，收集并储存其产生的电流响应值，根据生长素浓度和响应电流之间的相关关系建立线性回归模型，回归方程为y＝1.7884x+13.6813(R2＝0.9954)；相同的步骤测定传感芯片通道二，得到脱落酸浓度和响应电流之间的方程为y＝1.2158x+10.0059(R2＝0.9912)
过程三：用刀片将绿豆芽表面划开，将传感芯片置于其表面，使得半固态电解质与创面相贴合，静置30min后采用示差脉冲伏安法进行电化学检测，将得到的双通道电流值10.56μA、9.02μA分别带入过程二的线性回归方程，得出生长素的浓度为22.1nM，脱落酸的浓度为5.89nM。
实施例3：
步骤一：所述的半固态电解质的制备包含以下过程：
过程一：称取5mg葡萄糖、150mg KCl和270mg KH2PO4于烧杯中，用30mL去离子水溶解，待完全溶解后，利用1M盐酸或氢氧化钾调节溶液的pH为12，得到混合溶液A；
过程二：称取0.5g明胶，添加到混合溶液A中，加热搅拌直至完全溶解，得到混合溶液B；
过程三：将混合溶液B转移至5mL注射器中，置于20℃下冷却11h后，形成的凝胶即为半固态电解质。
步骤二：所述的功能化MOFs的制备包含以下过程：
过程一：称取1.5g硝酸钴分散在40mL甲醇和40mL乙醇的混合液中得到混合溶液C；
过程二：称取1.6g二甲基咪唑分散于40mL甲醇和40mL乙醇的混合液中得到混合溶液D；
过程三：在磁力搅拌的条件下，将混合溶液C与混合溶液D混合，在室温下孵育24h后离心，然后用甲醇清洗3次，经80℃真空干燥即可得到仿生酶紫色固体，将仿生酶紫色固体分散到甲醇溶液中得到浓度为1mg/mL的仿生酶溶液。
过程四：取过程三的仿生酶溶液2mL与6mL浓度为0.03mg/mL的胶体金(AuNPs)溶液混合，搅拌3h，离心后，用甲醇清洗得到功能化MOFs，并将其分散到甲醇溶液中得到浓度为2mg/mL的功能化MOFs溶液。
步骤三：所述的电化学传感器的制备包含以下过程：
过程一：将三通道丝网印刷电极浸在1mol/L的H2SO4溶液中，采用循环伏安法对电极进行活化，活化完成后在三通道丝网印刷电极的工作电极表面分别滴加5μL的AuNPs，室温下干燥，得到三通道丝网印刷电极A；
过程二：分别取40μL功能化MOFs溶液分别滴在三通道丝网印刷电极A的工作电极表面反应2h后用10mM的Tris-HCl缓冲溶液清洗，得到三通道丝网印刷电极B；
过程三：取三通道丝网印刷电极B，三个通道分别记为通道一、通道二和通道三；取8μL浓度为2μg/mL的生长素抗体滴加在三通道丝网印刷电极B通道一的工作电极表面，取8μL浓度为2μg/mL的脱落酸抗体滴加在三通道丝网印刷电极B通道二的工作电极表面，取8μL浓度为2μg/mL的赤霉素抗体滴加在三通道丝网印刷电极B通道三的工作电极表面，静置2h后分别加入90μL牛血清白蛋白(BSA)封闭1h，得到电化学传感器。
步骤四：所述的电化学检测装置的构建包含以下过程：
过程一：将步骤一所述的半固态电解质用针管注射在步骤三所述的电化学传感器的电极传感区域，使其在电极传感区域表面形成0.5mm厚的均匀凝胶，即制得传感芯片，此传感芯片的通道一为测定生长素的通道，通道二为测定脱落酸的通道，通道三为测定赤霉素的通道；
过程二：电化学检测装置的构建：电化学检测装置由传感芯片、电池、稳压模块和微控制器组成，其中传感芯片与电池电性相连，电池与稳压模块电性相连，稳压模块与微控制器电性相连，微控制器内嵌有模数(AD)转换器和输入输出(IO)接口的蓝牙模块，蓝牙模块与智能终端无线相连(图4)；
电化学检测装置利用蓝牙(图4中标记5)连接智能终端的电化学检测软件，在软件上设置控制传感芯片(图4中标记1)的起止电压，通过AD转换器将数字信号转变为模拟信号，由微控制器(图4中标记4)将信号施加在传感芯片上；随后传感芯片获得该起止电压而产生电流响应值，通过AD转换器将模拟信号转变为数字信号并利用蓝牙传回智能终端储存。
步骤五：所述的植物激素的原位微区检测包含以下过程：
过程一：首先配制一系列浓度的植物激素标准溶液(包括生长素、脱落酸和赤霉素，根据所添加的抗体对应选择植物激素)，浓度分别为1×10-16M、1×10-15M、1×10-14M、1×10-13M、1×10-12M、1×10-11M、1×10-10M、1×10-9M、1×10-8M、1×10-7M；然后将这10个溶液分别喷洒在1cm×3cm的PET膜上，干燥后将其贴在传感芯片的半固态电解质上，静置30min后进行检测；
过程二：打开电脑的CHI软件，通过蓝牙连接电化学检测装置，在软件上设置控制传感芯片通道一的起止电压，收集并储存其产生的电流响应值；根据生长素浓度和响应电流之间的相关关系建立线性回归模型，回归方程为y＝1.7874x+13.7307(R2＝0.9954)；相同的步骤测定传感芯片通道二和通道三，得到脱落酸浓度和响应电流之间的方程为y＝1.2158x+9.9901(R2＝0.9912)，赤霉素浓度和响应电流之间的方程为y＝1.3152x+10.2571(R2＝0.9963)；
过程三：用刀片将绿豆芽表面划开，将传感芯片置于其表面，使得半固态电解质与创面相贴合，静置30min后采用示差脉冲伏安法进行电化学检测，将得到的三通道电流值11.23μA、8.76μA、8.23μA分别带入过程二的线性回归方程，得出生长素的浓度为20.8nM，脱落酸的浓度为6.08nM，赤霉素的浓度为15.89nM。
综上所述，本实验基于半固态电解质并结合金属有机框架材料(MOFs)作为仿生酶设计了一种灵敏度高、能够同时原位检测多种植物激素的电化学方法。该电化学检测方法克服了植物激素传统检测技术的缺陷与不足，利用稳定性高、催化活性强的仿生酶催化底物，实现了低含量植物激素的灵敏检测。此外，半固态电解质解决了感知器件与感知界面形成的固相界面处植物激素难以有效传质的问题，其能够自粘附在被测植物表面，扩散性能好、电化学性能优异，不仅实现了与感知界面的微观有效接触，同时解决了固相界面植物激素原位感知的瓶颈问题，为植物激素原位感知创造了条件。我们借助半固体电解质和便携式电化学检测装置，可以及时对植物体内的激素进行微区监测，为开发各种植物生长调节剂以及现代农业的发展提供了一种新的检测方法。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将葡萄糖和电解质盐用去离子水溶解，待溶解后，利用盐酸或氢氧化钾调节溶液的pH，得到混合溶液A；所述葡萄糖、电解质盐和去离子水的用量比为1~10 mg：100~1000mg：5~50 mL；然后称取凝胶剂，添加到混合溶液A中，加热搅拌直至完全溶解，得到混合溶液B；其中凝胶剂与混合溶液A的用量关系为0.1~1 g：5~10ml；将混合溶液B置于18~25 ℃温度下冷却8~14 h，形成的凝胶即为半固态电解质；
步骤二：功能化MOFs的制备：
过程一：称取硝酸钴分散在甲醇和乙醇的混合液中得到混合溶液C；所述硝酸钴、甲醇、乙醇的用量比为1~3 g：10~50 mL：10~50 mL；
过程二：称取二甲基咪唑分散于甲醇和乙醇的混合液中得到混合溶液D；所述二甲基咪唑、甲醇、乙醇的用量比为1~5 g：10~50 mL：10~50 mL；
过程三：在磁力搅拌的条件下，将混合溶液C与混合溶液D混合，室温下孵育10~60 h后，经离心、清洗、真空干燥，即可得到仿生酶紫色固体，将仿生酶紫色固体分散到甲醇溶液中得到仿生酶溶液；然后取制得的仿生酶溶液与胶体金溶液混合，搅拌、离心、清洗后，将其分散到甲醇溶液中得到功能化MOFs溶液；
步骤三：将丝网印刷电极浸入H2SO4溶液中，采用循环伏安法对电极进行活化，活化完成后在丝网印刷电极的工作电极表面滴加1~10 µL的胶体金溶液，室温下干燥，得到丝网印刷电极A；然后取步骤二制备的功能化MOFs溶液滴在丝网印刷电极A的工作电极表面，反应一段时间后用Tris-HCl缓冲溶液清洗，得到丝网印刷电极B；最后取植物激素抗体滴加在丝网印刷电极B的工作电极表面，静置一段时间后，加入牛血清白蛋白（BSA）封闭一段时间，得到电化学传感器；
步骤四：电化学检测装置的构建：
过程一：将步骤一所制备的半固态电解质加在步骤三所制备的电化学传感器的电极传感区域，使其在电极传感区域表面形成0.2~0.8 mm厚度的均匀凝胶，即制得传感芯片；
过程二：电化学检测装置的构建：电化学检测装置由传感芯片、电池、稳压模块和微控制器组成，其中传感芯片与电池电性相连，电池与稳压模块电性相连，稳压模块与微控制器电性相连，微控制器内嵌有模数转换器和输入输出接口的蓝牙模块，蓝牙模块与智能终端无线相连；
电化学检测装置利用蓝牙连接智能终端的电化学检测软件，在软件上设置控制传感芯片的起止电压，通过AD转换器将数字信号转变为模拟信号，由微控制器将信号施加在传感芯片上；随后传感芯片获得该起止电压而产生电流响应值，通过AD转换器将模拟信号转变为数字信号并利用蓝牙传回智能终端储存；
步骤五：植物激素的原位微区检测：
过程一：首先配制一系列浓度的植物激素标准溶液，浓度分别为Q1、Q2、Q3、……、Qn-1、Qn，共n个浓度梯度，n为正整数；然后将这n个溶液分别喷洒在统一尺寸的聚酯薄膜上，干燥后将其贴在传感芯片表面的半固态电解质上，静置一段时间后进行电化学检测；
过程二：打开智能终端的电化学检测软件，通过蓝牙连接电化学检测装置，在软件上设置控制传感芯片的起止电压，收集并储存传感芯片产生的电流响应值；根据植物激素浓度和响应电流之间的相关关系建立线性回归模型，回归方程为y=ax+b，其中x代表植物激素浓度的对数，y代表响应电流值，a和b为常数；
过程三：将植物表面划开，将传感芯片置于其表面，使得半固态电解质与创面相贴合，静置一段时间后进行电化学检测，将得到的电流值带入过程二的线性回归方程，计算出植物激素的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤一中所述电解质盐包括KCl和KH2PO4；所述盐酸或氢氧化钾的浓度均为1M，所述调节溶液的pH至8~13。
3. 根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤一中所述凝胶剂包括琼脂糖、黄原胶或明胶；所述加热搅拌时加热的温度为80~100℃。
4. 根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤二的过程一中所述硝酸钴的浓度为0.1~0.5 mM。
5. 根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤二的过程二中所述二甲基咪唑的浓度为1~5 mM。
6. 根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤二的过程三中所述混合溶液C与混合溶液D混合时的体积比为1:1；所述真空干燥的温度为50~100 ℃；所述仿生酶溶液的浓度为1 mg/mL；所述胶体金溶液、仿生酶溶液的用量比为5~10 mL：1~5 mL；所述胶体金溶液的浓度为0.01~0.1 mg/mL；所述搅拌时间为1~5 h；所述功能化MOFs溶液的浓度为2 mg/mL。
7. 根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤三中所述丝网印刷电极为单通道丝网印刷电极或多通道丝网印刷电极；所述H2SO4溶液的浓度为1 mol/L；所述胶体金溶液的浓度为0.01~0.1 mg/mL；所述功能化MOFs溶液的用量为10~50 µL，浓度为2 mg/mL；所述反应时间为1~5 h；所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM。
8. 根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤三中所述植物激素抗体的浓度为1~5 µg/mL，用量为5~10 µL；所述静置时间为1~5 h；所述BSA的质量分数为1%，用量为50~100 µL；所述封闭时间为0.5~3 h；所述植物激素抗体包括脱落酸抗体、赤霉素抗体或生长素抗体。
9.根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤四的过程一中所述电极传感区域为工作电极、辅助电极、对电极所组成的区域。
10. 根据权利要求1所述的一种植物激素原位微区电化学传感分析方法，其特征在于，步骤五的过程一中所述植物激素标准溶液的浓度范围为0 ~ 3×10-4 M；所述聚酯薄膜的尺寸为：长×宽为1~5 cm×1~5 cm；所述静置一段时间为20~90 min；所述植物激素包括脱落酸、赤霉素或生长素；过程二中所述电化学检测软件包括PSTouch、CHI和GPES；过程三中所述静置一段时间为30~60 min。
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|---|---|---|---|
| CN202210338055.8A CN114839234B (zh) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 一种植物激素原位微区电化学传感分析方法 |
Publications (2)
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|---|---|
| CN114839234A CN114839234A (zh) | 2022-08-02 |
| CN114839234B true CN114839234B (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=82563319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210338055.8A Active CN114839234B (zh) | 2022-04-01 | 2022-04-01 | 一种植物激素原位微区电化学传感分析方法 |
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| CN (1) | CN114839234B (zh) |
Citations (6)
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|---|---|---|---|---|
| CN102749373A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-10-24 | 济南大学 | 一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN104297464A (zh) * | 2014-09-06 | 2015-01-21 | 济南大学 | 一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用 |
| CN109521070A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-26 | 南通大学 | 一种植物抗病相关激素的多位点检测方法 |
| WO2022049540A1 (en) * | 2020-09-03 | 2022-03-10 | Gwanzura Zvikomborero Takunda | An electrochemical biosensor |
| CN114199968A (zh) * | 2021-11-23 | 2022-03-18 | 江苏大学 | 一种协同催化电化学传感器的制备方法及其应用 |
| WO2022062100A1 (zh) * | 2020-09-25 | 2022-03-31 | 常州大学 | 用于检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器及其制备方法 |
-
2022
- 2022-04-01 CN CN202210338055.8A patent/CN114839234B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102749373A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-10-24 | 济南大学 | 一种环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
| CN104297464A (zh) * | 2014-09-06 | 2015-01-21 | 济南大学 | 一种原位生成CdS真菌毒素光电化学传感器制备方法及应用 |
| CN109521070A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-26 | 南通大学 | 一种植物抗病相关激素的多位点检测方法 |
| WO2022049540A1 (en) * | 2020-09-03 | 2022-03-10 | Gwanzura Zvikomborero Takunda | An electrochemical biosensor |
| WO2022062100A1 (zh) * | 2020-09-25 | 2022-03-31 | 常州大学 | 用于检测卡那霉素的电化学发光适配体传感器及其制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 植物激素电化学传感技术研究进展;苏招红;徐孝林;李朝荣;王辉宪;马艳;肖浪涛;;中国科学:化学;20160820(08);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114839234A (zh) | 2022-08-02 |
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