CN103196966A - 一种双氧水传感器、其制备方法及其在检测单细胞双氧水中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双氧水传感器、其制备方法及其在检测单细胞双氧水中的应用，用乙二醇还原法将铂纳米颗粒负载到多壁碳纳米管上，再将其制成铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液，用铂电极蘸取分散好的铂纳米颗粒/多壁碳纳米管制得双氧水传感器，本发明传感器灵敏度高，检测限低，线性范围宽，将该传感器作为毛细管电泳的检测器，实现了对单细胞中H₂O₂的定量检测。

Description

一种双氧水传感器、其制备方法及其在检测单细胞双氧水中的应用

技术领域

本发明主要涉及一种双氧水传感器，利用毛细管电泳电化学法检测单个细胞内的H₂O₂，属于生物电分析化学检测技术领域。

背景技术

H₂O₂是体内较为重要的代谢产物之一，它能穿过细胞膜，并且是比较稳定的一种活性氧。许多报道还证明它是细胞信号传导的第二使者。并且H₂O₂与肿瘤的发生、发展和凋亡有密切的联系，对生物体内，特别是单细胞内H₂O₂的检测可以诊断和预防由氧化胁迫和损伤诱导的疾病。

许多分析方法已被用于H₂O₂的检测，如荧光法，分光光度法，电化学检测法和化学发光法等。毛细管电泳电化学分析法由于进样量小、分析速度快、分离效率高等优点而被广泛的用于单细胞分析。Gong等用芯片毛细管电泳法对H₂O₂进行了检测，并实现了单个RAW264.7细胞中H₂O₂的检测，测定其浓度为1.86±0.05μmol/L。Ruttinger等将金微电极作为工作电极，利用毛细管电泳安培检测法对H₂O₂进行了检测分离。

现有对H₂O₂的检测，灵敏度不高，检测限不够低，抗坏血酸、半胱氨酸等细胞内可能存在的电活性物质对H₂O₂的测定有干扰。

申请号为201110020554.4的中国专利公开了一种纳米Co-Fe普鲁士蓝配合物-碳纳米管复合双氧水传感器的制备方法，该专利的双氧水传感器制作比较繁琐，传感器较大不适于毛细管电泳电化学检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种双氧水传感器及其制备方法，该传感器灵敏度高，检测限低，线性范围宽。

本发明的另一目的是提供双氧水传感器在检测单细胞双氧水中的应用，及对单细胞内的H₂O₂进行测定的方法。

本发明采取的技术方案为：

一种双氧水传感器，包括铂电极和分布在铂电极上的负载铂纳米颗粒的多壁碳纳米管。

一种双氧水传感器的制备方法，包括步骤如下：

（1）用细金相砂纸将铂丝电极打磨平滑，使得铂丝截面与毛细管截面平齐，将打磨好的铂电极分别在二次水、无水乙醇、二次水中超声清洗；

（2）称取多壁碳纳米管，加入H₂PtCl₆溶液和乙二醇，再加入氢氧化钾溶液，搅拌均匀，110°C～140°C下还原1～4h，再降至室温，用丙酮清洗过滤，将过滤得到的固体60-80°C下干燥10-14h，即得到负载铂纳米颗粒的多壁碳纳米管，将干燥后的固体放入Nafion溶液中，超声分散10-40min，得铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液；

（3）将步骤（1）洗净后的电极蘸取铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液，倒置自然晾干。

上述步骤（2）中所述的H₂PtCl₆溶液的浓度范围8～12g/L，氢氧化钾溶液的浓度范围0.02～0.05mol/L，碳纳米管与氯铂酸质量比为1:10-11，H₂PtCl₆溶液：乙二醇：氢氧化钾溶液的体积比1:10:2，Nafion溶液为全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物用水和异丙醇稀释后的溶液，质量分数为0.1～1%，水和异丙醇体积比1:1。所述的铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液中铂纳米颗粒/多壁碳纳米管浓度为1～10mg/mL。

上述步骤（3）中铂纳米颗粒与多壁碳纳米管质量比1:1～1:9。铂电极蘸取铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液的时间为1～2s，次数为1～4次。

上述双氧水传感器在检测单细胞双氧水中的应用。

上述双氧水传感器检测单细胞内双氧水的方法，步骤如下：

（1）中性粒细胞的提取：取新鲜抗凝血与全血及组织匀浆稀释液于离心管中混匀，20-30°C下静置30-40min，取上清液离心，分离出中性粒细胞层，细胞洗涤、破红细胞得中性粒细胞待测样；

（2）单个全细胞进样：将盛有PB（磷酸盐缓冲液）的自制进样池放在倒置显微镜的载物台上，选择放大倍数为400倍，将毛细管的进样端小心的插入进样池中，并将毛细管固定好，调节三维显微操纵器，使毛细管的进样端位于显微镜的观察视野范围内，事先烧掉毛细管进样端外壁2-3mm的聚酰亚胺涂层，再将中性粒细胞待测样放入自制进样池中，使其悬浮，后迅速将高压电源的正极也放入中性粒细胞待测样中，调节进样电压约为3.0kV，当单个中性粒细胞漂移到毛细管口附近时，在电渗流的作用下整个单细胞进入到毛细管内，然后将毛细管和高压电源的正极都放回缓冲池中，调节高压电源至18kV；

（3）毛细管电泳检测单个中性粒细胞中H₂O₂：调节高压电源至18kV，待基线平稳后，调节高压电源至5kV，进样H₂O₂标准样品10s，再将高压电源调回至18kV，运行实验并记录电泳图。

铂电极表面的铂纳米颗粒和多壁碳纳米管具有多孔的结构，从而增大了电极的表面积，促进了电子的转移，提高了灵敏度。本发明传感器灵敏度高，检测限低，线性范围宽，将该传感器作为毛细管电泳的检测器，实现了对单细胞中H₂O₂的定量检测。

本发明的双氧水传感器是微型传感器，适于毛细管电泳电化学检测，适于单细胞中活性物质的检测，而且制作简单。

附图说明

图1为本发明铂纳米颗粒/多壁碳纳米管修饰铂微电极的扫描电镜图；a-铂电极扫描电镜图，b-铂纳米颗粒/多壁碳纳米管修饰铂电极扫描电镜图；

图2为本发明毛细管电泳电化学检测H₂O₂的装置图；

图3为本发明干扰物质混合样的电泳谱图；a、b、c、d、e分别为多巴胺、肾上腺素、过氧化氢、半胱氨酸、抗坏血酸；

图4为本发明单细胞的进样图；

图5为本发明单细胞的电泳谱图；

图6为H₂O₂在铂微电极、多壁碳纳米管修饰铂电极和铂纳米颗粒/多壁碳纳米管修饰铂电极上的电泳对比图；a、铂微电极，b.多壁碳纳米管修饰铂电极，c.铂纳米颗粒/多壁碳纳米管修饰铂电极。

其中，1．工作电极；2.参比电极；3.对电极；4.石英玻璃毛细管；5.参比池；6.检测池；7.连接管。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步阐述。

实施例1

双氧水传感器的制备方法：

（1）将一根铂丝（直径200μm，长度约为5cm）穿入到长度约为3cm，内径为250μm，外径为375μm的石英毛细管中，两端露出铂丝。将其一端涂满JC-311型环氧树脂胶，将铂丝从另一端往回至毛细管内，使毛细管内填充涂有环氧树脂胶的铂丝，并使铂丝刚好露至毛细管端口，将用金相砂纸打磨好的铜丝与毛细管用502胶粘在一起，接触的长度大约为1cm。将露出的铂丝缠绕在铜丝上，并用银浆涂抹铂丝和铜丝，70°C下烘干30min。将电极插入到一段长约3cm，内径约为0.5mm，外径约为1mm的石英玻璃管中，使涂有银浆和502胶的部分正好包含在玻璃管中，然后用JC-311型环氧树脂胶封住玻璃管两端，24小时固化，备用。将其在金相砂纸上磨平，然后在二次水、无水乙醇、二次水中各超声5min。

（2）称取60mg的多壁碳纳米管，加入2.5mL的H₂PtCl₆溶液和25mL的乙二醇，再加入5mL0.04mol/L的氢氧化钾溶液，搅拌均匀。130°C下还原2h，再降至室温，用丙酮清洗过滤三次。最后将过滤得到的固体80°C下干燥12h，即得到负载铂纳米颗粒的多壁碳纳米管。将干燥后的固体放入0.5%Nafion溶液中，超声分散30min，得铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液，铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液中铂纳米颗粒/多壁碳纳米管浓度为5mg/mL。

（3）将步骤（1）洗净后的电极蘸取分散好的铂纳米颗粒/多壁碳纳米管，铂纳米颗粒与多壁碳纳米管质量比分别为1:5，倒置自然晾干。多壁碳纳米管和负载铂纳米颗粒的多壁碳纳米管的透射电镜图如图1所示。

实施例2

双氧水传感器的制备方法：

包括步骤（1）、（2）、（3），步骤（3）铂纳米颗粒与多壁碳纳米管质量比分别为1:1、1:3、1:7、1:9，其他步骤如实施例1。

实施例3

双氧水传感器的制备方法：

包括步骤（1）、（2）、（3），步骤（2）中铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液中铂纳米颗粒/多壁碳纳米管浓度分别为3mg/mL，7mg/mL，10mg/mL，其他步骤如实施例1。

单细胞内双氧水的检测

自组装毛细管电泳系统：CHI810c电化学分析仪（上海辰华仪器有限公司）；0-30kV高压电源（山东师范大学仪器厂，山东）。

使用实施例1制备的双氧水传感器。

实验步骤：

（1）中性粒细胞的提取：取2mL新鲜抗凝血与2mL全血及组织匀浆稀释液于10mL的离心管中混匀，20-30°C下静置30min。此时大量的血红细胞沉于离心管底部，上层清液呈微红色，含有大量的白细胞、少量红细胞、淋巴细胞和血清。取三份上清液慢慢铺在三份细胞分离液（事先放入离心管中）液面之上，保持两相界面清晰，1000r/m离心15min。此时，离心管中由上至下细胞分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色淋巴细胞层；第三层为透明分离液；第四层为含有少量红细胞的中性粒细胞层。收集第四层细胞，加入2mL细胞洗涤液，吹散混匀后，2000r/m离心5min，弃去上清液。再加入2mL无菌水，震荡20s，红细胞由于不等渗而破膜。后立即加入2mL的1.8%NaCl溶液，轻轻震荡混匀，恢复等渗。2000r/m离心5min，此时离心管底部只剩中性粒细胞。弃去上清液，加入2mL细胞洗涤液，吹散混匀后，2000r/m离心5min，如此重复清洗三次后，备用。

（2）单个全细胞进样及溶膜：

将盛有PB的自制进样池放在倒置显微镜的载物台上，选择放大倍数为400倍。缓冲溶液为0.025mol/L pH=7.4的磷酸盐缓冲液。将毛细管的进样端小心的插入进样池中，并将毛细管固定好。调节三维显微操纵器，使毛细管的进样端位于显微镜的观察视野范围内。为便于观察，事先烧掉毛细管进样端外壁2-3mm的聚酰亚胺涂层。再将清洗干净的细胞放入自制进样池中，使其悬浮，后迅速将高压电源的正极也放入细胞悬浮液中，调节进样电压约为3.0kV。当单个中性粒细胞漂移到毛细管口附近时，在电渗流的作用下整个单细胞进入到毛细管内，然后将毛细管和高压电源的正极都放回缓冲池中，调节高压电源至18kV，开始检测。

（3）毛细管电泳检测单个中性粒细胞中的H₂O₂：待基线平稳后，调节高压电源至5kV，进样H₂O₂标准样品10s，再将高压电源调回至18kV，运行实验并记录电泳图。

结果表明单个中性粒细胞中的含量约为3.39±1.01fmol（平均值±标准偏差）

在上述实验步骤条件下，对不同浓度的H₂O₂进行了三次平行检测，取平均值，结果表明，H₂O₂的浓度0.8μmom/L～0.8mmol/L范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为A_p(nC)=2.5112+406.58C(mmol/L)，线性相关系数为0.9989。H₂O₂的物质的量在2.18fmol～21.76fmol和21.76fmol～2.18pmol/L范围内，物质的量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程分别为A_p(nC)=0.5851+0.1646n(fmol)和A_p(nC)=4.9116+153.149n(pmol)，相关系数分别为0.9997和0.9998。说明该传感器线性范围宽，适于单细胞中H₂O₂含量的检测。

检测限及重现性

在上述实验步骤条件下对0.1mmol/L的H₂O₂进行八次平行测定，迁移时间t_m和峰电流i_p的相对标准偏差分别为0.93%，4.33%。说明该修饰电极对H₂O₂有良好的重现性。当信噪比S/N=3时，H₂O₂的浓度检测限为0.4μmol/L。进样体积为2.72nL，H₂O₂的摩尔浓度的检测限为2.18fmol。表1列出了电化学法检测H₂O₂的工作电极、线性范围和检测限。本发明所用的工作电极制作简单、修饰方法简单，而且对H₂O₂的检测是在正电位区进行的，操作过程无须除氧，比文献报道的其他电化学法检测H₂O₂的检测限低。

表1电化学检测H₂O₂所用工作电极、线性范围、检测限对比

*S/N=3

[28]Xu B.,Ye M.L.,Yu Y.X.,Zhang W.D.A highly sensitive hydrogen peroxide amperometricsensor based on MnO2-modified vertically aligned multiwalled carbon nanotubes[J].AnalyticaChimica Acta.,2010,674:20-26.

[29]Sanford A.L.,Morton S.W.,Whitehouse K.L.,Oara H.M.,Lugo-Morales L.Z.,Roberts J.G.,Sombers L.A.Voltammetric detection of hydrogen peroxide at carbon fiber microelectrodes.Anal.Chem.,2010,82:5205-5210.

[30]Niua X.H.,Zhaoa H.L.,Chena C.,Lan M.Platinum nanoparticle-decorated carbon nanotubeclusters on screen-printed gold nanofilm electrode for enhanced electrocatalytic reduction ofhydrogen peroxide[J].Electrochimica Acta.,2012,65:97-103.

[31]Tseng K.S.,Chen L.C.,Ho K.C.Amperometric detection of hydrogen peroxide at a PrussianBlue-modified FTO electrode[J].Sens.Actuators,B,2005,108:738-745.

[32]Lian W.P.,Wang L.,Song Y.H.,Yuan H.Z.,Zhao S.C.,Li P.,Chen L.L.A hydrogenperoxide sensor based on electrochemically roughened silver electrodes[J].Electrochimica Acta,2009,54:4334-4339.

干扰实验

细胞内常含有多巴胺（DA）、肾上腺素（E）、半胱氨酸（Cys）、抗坏血酸（AA）等电活性物质，在检测H₂O₂的过程中它们产生的峰电流可能会对H₂O₂的检测产生干扰。因此，我们在选定的实验条件【a-多巴胺（50μmol/L），b-肾上腺素（50μmol/L），c-H₂O₂（0.1mmol/L），d-半胱氨酸（0.1mmol/L），e-抗坏血酸（0.1mmol/L）】和上述实验方法下进行多巴胺、肾上腺素、半胱氨酸、抗坏血酸对0.1mmol/L H₂O₂的干扰实验，如图3所示。由图可知，DA、E、Cys、AA与H₂O₂的迁移时间不同，虽然DA和E只能部分分离，但都能与H₂O₂较好的分离，因此不会对H₂O₂的测定产生干扰。

对比电泳：

在下列条件下测各电极电泳图：

H₂O₂浓度：0.1mmol/L；毛细管：25μm I.D./40cm；Pt:MWNT质量比：1:5；Pt/MWNT浓度：5mg/mL；检测电势：0.7V(vs.SCE)；分离电压：18kV；缓冲溶液：25mmol/L PB(PH7.4)；进样：5.0kV/10s

图6中的曲线a、b、c分别为0.1mmol/L H₂O₂在铂微电极、多壁碳纳米管修饰铂电极和铂纳米颗粒/多壁碳纳米管修饰铂电极上的电泳图。由图可以看出，与裸电极相比，H₂O₂在多壁碳纳米管修饰铂电极上的峰电流增大约1倍，在铂纳米颗粒/多壁碳纳米管修饰铂电极上的峰电流增大约3倍。这是由于铂纳米颗粒进一步增大了电极的比表面积，从而增加催化活性点，促进电子转移，提高了灵敏度。

Claims (8)

1.一种双氧水传感器，包括铂电极和分布在铂电极上的负载铂纳米颗粒的多壁碳纳米管。

2.一种双氧水传感器的制备方法，其特征是，包括步骤如下：

（1）用细金相砂纸将铂丝电极打磨平滑，使得铂丝截面与毛细管截面平齐，将打磨好的铂电极分别在二次水、无水乙醇、二次水中超声清洗；

（2）称取多壁碳纳米管，加入H₂PtCl₆溶液和乙二醇，再加入氢氧化钾溶液，搅拌均匀，110°C～140°C下还原1～4h，再降至室温，用丙酮清洗过滤，将过滤得到的固体60-80°C下干燥10-14h，即得到负载铂纳米颗粒的多壁碳纳米管，将干燥后的固体放入Nafion溶液中，超声分散10-40min，得铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液；

（3）将步骤（1）洗净后的电极蘸取铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液，倒置自然晾干。

3.根据权利要求2所述的一种双氧水传感器的制备方法，其特征是，步骤（2）中所述的H₂PtCl₆溶液的浓度范围8～12g/L，氢氧化钾溶液的浓度范围0.02～0.05mol/L，碳纳米管与氯铂酸质量比为1:10-11，H₂PtCl₆溶液：乙二醇：氢氧化钾溶液的体积比1:10:2。

4.根据权利要求2所述的一种双氧水传感器的制备方法，其特征是，步骤（2）中所述的Nafion溶液为全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物用水和异丙醇稀释后的溶液，质量分数为0.1～1%，水和异丙醇体积比1:1。

5.根据权利要求2所述的一种双氧水传感器的制备方法，其特征是，步骤（2）中所述的铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液中铂纳米颗粒/多壁碳纳米管浓度为1～10mg/mL。

6.根据权利要求2所述的一种双氧水传感器的制备方法，其特征是，步骤（3）中铂纳米颗粒与多壁碳纳米管质量比1:1～1:9，铂电极蘸取铂纳米颗粒/多壁碳纳米管分散液的时间为1～2s，次数为1～4次。

7.权利要求1所述的双氧水传感器在检测单细胞双氧水中的应用。

8.权利要求1所述的双氧水传感器检测单细胞内双氧水的方法，其特征是，步骤如下：

（1）中性粒细胞的提取：取新鲜抗凝血与全血及组织匀浆稀释液于离心管中混匀，20-30°C下静置30-40min，取上清液离心，分离出中性粒细胞层，细胞洗涤、破红细胞得中性粒细胞待测样；

（2）单个全细胞进样：将盛有磷酸盐缓冲溶液的自制进样池放在倒置显微镜的载物台上，选择放大倍数为400倍，将毛细管的进样端小心的插入进样池中，并将毛细管固定好，调节三维显微操纵器，使毛细管的进样端位于显微镜的观察视野范围内，事先烧掉毛细管进样端外壁2-3mm的聚酰亚胺涂层，再将中性粒细胞待测样放入自制进样池中，使其悬浮，后迅速将高压电源的正极也放入中性粒细胞待测样中，调节进样电压约为3.0kV，当单个中性粒细胞漂移到毛细管口附近时，在电渗流的作用下整个单细胞进入到毛细管内，然后将毛细管和高压电源的正极都放回缓冲池中，调节高压电源至18kV；

（3）毛细管电泳检测单个中性粒细胞中H₂O₂：调节高压电源至18kV，待基线平稳后，调节高压电源至5kV，进样H₂O₂标准样品10s，再将高压电源调回至18kV，运行实验并记录电泳图。

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