CN1204396C - 细胞外记录电极 - Google Patents

Abstract

多电极包含位于衬底上的多个微电极和用于给微电极提供电信号或从微电极引出电信号的布线部分。每个微电极具有其表面上的多孔导电材料，微电极的阻抗为50kΩ或更低。最好，多孔导电材料是金，并且通过在1.0-5.0A/dm²的电流密度下导通电流10-360秒来形成。此多电极可以包含以矩阵的形式位于衬底上的微电极、与微电极连接的引线和与引线的端部连接的电节点。

Description

细胞外记录电极

技术领域

本发明涉及用于细胞外记录的多电极，其在电生理学领域中是非常有用的，并用来测试与神经细胞的活性有关的电位的变化。

背景技术

近来，已经努力进行了神经细胞对电子设备的可应用性研究，以及医学上的研究。在活动状态下的神经细胞中产生一个活动电位。神经细胞的离子渗透性的变化导致细胞内外离子浓度的变化，这就是活动电位产生的原因。因此，如果测量神经细胞周围与离子浓度变化有关的电位变化，可以监测神经细胞的活性。

通常通过借助于显微操作设备等在细胞周围放置用于测量细胞外电位的玻璃或金属(例如铂)电极，来进行上述利用细胞活性的电位测量。也可以将类似的电极插入细胞以便测量细胞的电活性。这些传统的技术具有下列缺点：需要电极准备方面的技能；电极具有高阻抗，因此信号易受外部噪声的影响；如果将电极插入细胞，会伤害细胞或组织。因此，传统的电极不适于长期监视。

为了避免这种问题，本发明人已经开发了多电极，所述多电极包含在绝缘衬底上提供的、由导电材料制成的多个微电极和可以在其上培养细胞或组织的引线图形(日本特开No.6-78889和日本特开No.6-296595)。利用此多电极，可以在不伤害细胞或组织的情况下长期监测神经细胞的活性。

在上述多电极中，利用电解方法将多孔铂黑镀覆到接触细胞的电极的最上表面(日本特开No.6-78889)，或利用淀积方法将金镀覆到上述表面(日本特开No.6-296595)。在铂黑镀覆的情况下，尽管易于将电极的阻抗调整到一个实用的水平，即大约50kΩ或更低，但电极的强度低，因此电极的可循环使用性低。在通过淀积形成金的情况下，强度提高了，但难以将阻抗减小到大约50kΩ或更低。

本发明的公开

本发明要解决上述问题。本发明的目的是提供一种细胞外记录电极，具有适于记录细胞电信号的阻抗频率特性，此细胞外记录电极具有低水平的阻抗、对外界噪声的抗干扰性、高强度并且易于循环使用电极。

本发明人已经发现，在细胞外电极的制造中，用于在其最上表面上形成导电材料的电流密度被优化，从而得到粗糙的多孔导电材料表面，因此具有增大的表面积，并且对于细胞外记录电极来说，多孔导电材料具有更优的特性。本发明正是基于上述发现而实现的。

本发明提供了一种用于测量细胞的电生理学特性的多电极。此电极包含衬底上提供的多个微电极和用于向微电极提供电信号或从微电极引出电信号的布线部分。微电极的表面上具有多孔导电材料，此导电材料选自金、氮化钛、氧化银和钨，并且每个微电极的阻抗为50kΩ或更低。

最好，多孔导电材料是金，并且通过在1.0-5.0A/dm²的电流密度下导通电流10-360秒来提供。

本发明还提供了用于测量细胞的电生理学特性的多电极。此电极包含衬底上提供的多个微电极和用于给微电极提供电信号或从微电极引出电信号的布线部分。根据具有基本上与微电极相同的阻抗的等效电路的静电容量而计算出的微电极的表面积大于或等于微电极的突出面积的至少10倍而小于200倍，，并且每个微电极的阻抗为50kΩ或更低。

这里所用的术语“微电极的突出面积”指的是提供导电材料之前，微电极的最上表面的整个面积。

最好，利用气体吸收法测量出的微电极的表面积小于或等于微电极的突出面积的5×10⁵倍。

在此发明的一个实施例中，以矩阵的形式在衬底上排列微电极。布线部分包含与微电极连接的引线和与引线的端部连接的电节点，并且至少用绝缘层覆盖引线的表面。

在本发明的一个实施例中，可以通过蚀刻例如RIE(反应离子蚀刻)和ICPRIE(感应耦合等离子RIE)来提供多孔导电材料。

本发明还提供了一种包含上述多电极的一体化的细胞支座(installer)。此一体化的细胞支座具有用于在多电极的衬底上放置细胞或组织的细胞安置区。

本发明还提供了一种细胞电位测量装置，包含上述一体化的细胞支座、一个与微电极连接并用于处理由细胞或组织的电生理学活性而引起的输出信号的输出信号处理器和一个用于有选择地向细胞或组织提供电激励的激励信号供应器。

本发明还提供了细胞电位测量系统，包括上述细胞电位测量装置、用于光学监视细胞或组织的光学监视装置和/或用于控制细胞或组织的培养环境的细胞培养装置。

附图的简要描述

图1a是放大2500倍的显微照片，显示了在比较例中在1.0A/dm²的电流密度下通过电解形成在微电极表面上的金镀层，图中的比例尺为50μm。

图1b是显微照片，显示了根据本发明在1.5A/dm²的电流密度下通过电解形成在微电极表面上的金镀层，图中的比例尺为50μm。

图1c是显微照片，显示了根据本发明在2.0A/dm²的电流密度下通过电解形成在微电极表面上的金镀层，图中的比例尺为50μm。

图2a显示了比较例中相对于恒定的电流激励，金镀覆微电极上的细胞的64个通道的电位变化响应的计算机屏幕打印输出图，所述金镀覆微电极是在1.0A/dm²的电流密度下通过电解得到的。一个激励信号被施加给通道29。

图2b显示了在不存在细胞的情况下，图2a所示的金镀覆微电极的64个通道的噪声水平的计算机屏幕的打印输出图。

图2c显示了根据本发明，相对于恒定的电流激励，在金镀覆微电极上的细胞的64个通道的电位变化响应的计算机屏幕的打印输出图，所述金镀覆微电极是在1.5A/dm²的电流密度下通过电解得到的。

图2d显示了在不存在细胞的情况下，图2c所示的金镀覆微电极的64个通道的噪声水平的计算机屏幕的打印输出图。

图2e显示了根据本发明，相对于恒定的电流激励，在金镀覆微电极上的细胞的64个通道的电位变化响应的计算机屏幕的打印输出图，所述金镀覆微电极是在2.0A/dm²的电流密度下通过电解得到的。

图2f显示了在不存在细胞的情况下，图2e所示的金镀覆微电极的64个通道的噪声水平的计算机屏幕的打印输出图。

图3显示了本发明的微电极的阻抗特性图。

图4a显示了本发明的微电极的等效电路图。

图4b显示了本发明的微电极的等效电路图。

图5显示了本发明的微电极的等效电路的阻抗特性图。

图6显示了本发明的微电极的等效电路的阻抗特性图。

图7显示了比较例的微电极的阻抗特性图。

图8显示了比较例的微电极的等效电路的阻抗特性图。

图9显示了比较例的微电极的阻抗特性图。

图10显示了比较例的微电极的等效电路的阻抗特性图。

图11显示了在重复使用性方面，本发明的电解金镀覆微电极与传统产品相比较的寿命测试结果。

实施本发明的最佳方式

下面将更详细地描述本发明。

(用于微电极的多孔导电材料的制备)

根据本发明用于细胞外记录的多电极包含设置在绝缘衬底上的多个微电极。将细胞放置在微电极上以测量细胞的电活性。

本发明的多电极尤其包含微电极最上表面上的多孔导电材料。此微电极的阻抗为50kΩ或更小。微电极的阻抗优选为35kΩ或更小，更优选为25kΩ或更小，10kΩ或更小最好。这里所用的阻抗定义为在1kHz的频率和50mV的端子间电压下测得的值。本发明的阻抗下限值没有特别的限定，但根据本发明的教导最好尽可能的低。

可以确信的是这种低阻抗归因于在电极上提供的导电材料的多孔结构。这里所用的多孔性指的是导电材料表面粗糙的或具有微小的突起和凹陷的状态。当通过光学显微镜放大观察时，本发明的多孔导电材料表面呈现为大约0.01-25μm直径的小颗粒的密集粘结。当电极的最上表面具有这种多孔结构时，显著增加了表面积。结果，可以实现低水平的阻抗，否则在通过传统的淀积提供的光滑的金表面的情况下，不会得到这种低阻抗。

如上所述，电极的最上表面的多孔结构可以由电极的最上表面的表面积来限定。例如，可以利用本领域技术人员公知的利用气体吸收的BET法来限定电极的最上表面的表面积。阻抗还可以基于电路的等效电路的静电容量来计算，所述电路代表微电极和溶液之间的界面模型。

典型的情况是利用过电流密度下的电镀来制造本发明的多孔导电材料。过电流密度优选指的是1.2A/dm²范围内的电流密度，1.0-5.0A/dm²范围内更好，1.4-2.1A/dm²范围内最好。这是与一般的导电材料的工业电镀即电流密度为大约1.0A/dm²或更小相比较而言的。需要注意的是甚至当采用大于3.0A/dm²的电流密度时也能进行多孔导电材料的镀覆。如果电流密度极大，表面非常粗糙以至于难以保持想要的微电极的形状(例如正方形)。在本发明中，可以通过在过电流密度下一般通以电流10-360秒、比较好的是30-240秒的情况下来制造导电材料镀层。如果电流的导通时间过短，导电材料镀层不能充分地形成在微电极上。如果电流的导通时间过长，微电极上导电材料的生长不均匀，以至于一部分导电材料镀层迅速生长而其它部分生长缓慢，电极的形状很可能偏离正方形。

上述电镀条件仅仅是为了便于说明起见。根据所用的电镀设备的限制或操作程序的需要，可以在能够实现上述低阻抗的范围内有选择地修改上述电镀条件。

本发明的多孔导电材料也可以通过蚀刻来得到。例如，可以采用使用氧化剂和增溶剂的化学蚀刻、在包含酸作为主成分的电解质溶液中利用直流电或交流电进行电解的电化学蚀刻等，从而可以增加表面积。

本发明的微电极的最上表面具有上述多孔结构。此外，作为例子，用于最上表面的材料为金，从而可以实现高强度以及低阻抗特性。因此，微电极的重复使用效率高，得到了高的成本效能。这是与大量用在传统电极中的铂黑的电镀层相比较而言的，所述传统电极具有低的阻抗，但具有非常低的强度，以致于不能进行循环使用。尤其是，当在与下述实施例5中的条件基本一样的条件下进行寿命测试时，20个循环之后，本发明的电极的阻抗相对于原始阻抗的增加率一般是30％或更低，较好的是20％或更低，更好的是15％或更低。

在本发明的微电极的最上表面上提供上述多孔导电材料。为多孔导电材料打底的电极材料可以是能够与多孔导电材料充分粘接的任何材料。为多孔导电材料打底的电极材料的例子包含：最好是非电镀或电镀的镍、通常采用的非电镀金等，但不限于上述材料。这些打底的层的厚度没有特别的限制。例如，镍镀层的厚度大约为3000-7000埃。可以在镍镀层上提供厚度大约为300-700埃的非电镀金。

在本发明的多电极中，有代表性的是，在衬底上以下列方式提供多个微电极：即使得多个微电极以矩阵的形式放置在格线的交点处。在此排列中，多个电极可以等间距设置。因此，可以将相邻的神经细胞的细胞体放置在相邻的电极上，以检测细胞体之间电信号的传输。

每个微电极均外供电信号。可以选择的是，将电信号从每个微电极引到外侧的布线部分与每个电极连接。典型的是，布线部分包含与每个微电极连接并从电极向衬底的周边引出的引线。布线部分还可以包含一般位于衬底的周边并且与引线的端点连接的电节点。用于布线部分的材料的例子最好包含氧化铟锡(ITO)。需要注意的是上述阻抗是微电极和布线部分的总的特性值。实际上，与由电极最上表面的材料和尺寸限定的值相比，上述布线部分的阻抗值是可以忽略的。因此，用于电极的打底层和布线部分的材料的选择基本上对阻抗没有影响。

典型的是，引线的表面用绝缘层覆盖。绝缘层可以只设置在引线上，但最好除了微电极和电节点附近之外，在衬底的几乎整个上表面上都设置绝缘层。绝缘层的例子最好包含易于加工的聚丙烯树脂或光敏聚酰亚胺。

(多电极的结构)

对于本发明的多电极的详细设计，可以使用已知多电极的任何结构特征(例如，日本特开No.6-78889)，只要不影响上述多孔导电材料的形成和功能即可。在下文中，将显示出多电极的典型例子的结构。考虑各种因素，例如将测量的神经细胞的特性、将测量的数据特性等，可以对这里所描述的实施例有选择地修改。

细胞培养之后，为了光学监视，包含在多电极中的衬底最好由透明的绝缘材料制成。这种材料的例子包含：玻璃，例如氧化硅玻璃、铅玻璃和硼砂玻璃；无机物质，例如石英；有机玻璃或共聚物；和透明的有机物质，例如聚苯乙烯和聚对苯二甲酸乙二酯。最好是具有机械强度和透明度的无机物质。

位于衬底上的用于电极的材料的例子包含氧化铟锡(ITO)、氧化锡、铬(Cr)、金(Au)、铜(Cu)、镍(Ni)、铝(Al)和铂(Pt)。在这些材料中，较好的是ITO和氧化锡。最好是具有透明度和高电导率的ITO。上述微电极一般是通过在具有所需要的位置和形状的电极材料的一部分的最上表面上提供多孔导电材料镀层来制造的。

一般，多个微电极等间隔设置，使得相邻的电极之间的距离彼此全都相等。相邻电极之间的距离通常可以在大约10-1000μm的范围内。一般，电极的形状基本上是正方形或圆形，其边长或直径在大约20-200μm的范围内。具有了上述设置，如果将要测量的神经细胞(即，细胞体、树突和轴突)的细胞体位于电极上，很可能与前述细胞体的树突连接的另一个细胞体位于相邻的电极上。

与微电极连接的引线可以用与上述的电极材料一样的电极材料制成。在这种情况下，还是最好是ITO。一般，在衬底上淀积这种电极材料。此后，利用光致抗蚀剂进行蚀刻，从而形成所需要的微电极的最下层和包含引线的布线部分成一体的图形。在这种情况下，微电极的最下层和布线部分的厚度大约为500-5000埃。

引线一般设置为基本上从每个微电极呈放射状延伸。与此基本上放射状的设置相结合，多个微电极最好设置为使得其中心置于8×8格线的各个交点上。

覆盖引线的绝缘层材料的例子包含透明树脂，例如聚酰亚胺(PI)树脂和环氧树脂。较好的是光敏树脂，例如负相光敏聚酰亚胺(NPI)。例如，当采用光敏树脂作为绝缘层材料时，通过利用光刻形成的图形，在微电极上的绝缘层部分中形成开口，可以只露出电极。如上所述，以这种方式设置绝缘层，以便基本上覆盖绝缘衬底的除了电极附近和具有外电路的电节点之外的整个表面。这在生产效率等方面是较好的。

(用于测量细胞电位的装置和系统)

对于有效地利用本发明的多电极以测量神经细胞等的系统的各个元件的详细设计来说，只要不影响上述多孔导电材料的形成和功能，可以采用已知的用于测量细胞电位的系统的任何结构特征(例如，日本特开No.8-62209)。

一般，本发明的多电极另外配置有便于在多电极上进行的细胞培养的结构，并且可以选择配置便于操纵多电极的其它结构。得到的多电极可以设置为一体化的细胞支座。

为了在多电极上进行细胞培养，典型地，可以通过衬底上的绝缘层提供能够保持培养基的结构部件，所述衬底基本上被绝缘层整个覆盖。例如，可以在衬底上固定由聚苯乙烯制成的筒状框架，使其围绕多个电极，从而得到上述保持结构。在这种情况下，聚苯乙烯框架的内侧限定了细胞保持区。在提供保持结构之前或之后，可以将本发明的多孔导电材料镀层形成在微电极的表面上。

例如，为了便于在细胞测量中操纵多电极，可以使用印刷电路板。此印刷电路板具有与多个电极上的电节点电连接的导体图形，从而起着延伸电连接的作用，这种电连接是由微电极到电节点、到外侧而建立的。例如，可以采用具有适当形状的保持器，如夹着多电极的两部分分开的保持器，以便在其间保持电连接的同时，用多电极可靠地固定印刷电路板。

一体化的细胞支座还可以与激励信号供应器和输出信号处理器结合，从而得到用于在多电极上电激励细胞并处理响应于激励的输出信号的细胞电位测量装置。

激励信号供应器可以给多个微电极之外的任何电极对提供激励信号。当细胞响应于激励信号时，另一个电极检测所引起的电位变化并且将与此变化相对应的输出信号输出给信号处理器。例如，输出信号通过适当的处理传输给显示装置等。注意可以同样测量在没有收到激励信号的情况下细胞中产生的自发电位。

一般通过具有适当的测量软件的单个计算机来实现激励信号供应器和输出信号处理器。在计算机屏幕上，测量软件提供了用于设置激励条件等的参数设置窗口、用于记录从细胞检测的电位变化并且实时地通过多通道显示数据的记录窗口和用于分析所记录的数据的数据分析窗口等。较好的是，将来自计算机的激励信号通过D/A转换器传输给多电极，同时来自于细胞的输出信号通过A/D转换器传输给计算机。

细胞电位测量装置还可以与光学监视装置和细胞培养装置相结合，从而得到用于长时间培养神经细胞并且稳定和精确地测量神经细胞的电生理活性的细胞电位测量系统。光学监视装置可以包含翻转显微镜以及包含高清晰显示器和图像文件存储装置的用于显微镜的SIT摄像机。作为细胞培养装置，可以采用能够控制培养环境的温度、培养基循环、空气和二氧化碳的气体混合物的供应等的任何装置或其组合。

举例

下面将通过说明性的例子来具体描述本发明。本发明并不限于这些例子。

(例1)

在各种电流密度下用电解的金镀层镀覆平的多电极表面(具有50×50μm尺寸的每个电极的中心部分位于8×8格线的交点之一处。因此微电极的整个表面积(突出面积)为50×50×64＝160000μm²)。

尤其是，在1.0A/dm²、1.5A/dm²和2.0A/dm²的电流密度下形成电解的金镀层。在1kHz频率、50mV的端子间电压的条件下测量具有在各个电流密度下形成的金镀层的微电极的阻抗，并计算5个测量结果的平均值。结果示于表1。当电流密度增加时，每个微电极的平均阻抗将降低。

表1：电流密度和平均阻抗

电流密度(A/dm2)	平均阻抗(KΩ)
		1.0	336.39±78.59
1.5	22.07±1.95
		2.0	16.56±2.34

用光学显微镜观察微电极的镀金表面。显微照片示于图1a至1c。图1a、1b和1c是镀覆表面的显微照片，此镀覆表面分别是在1.0A/dm²、1.5A/dm²和2.0A/dm²的电流密度下得到的。在1.0A/dm²的电流密度情况下，得到了基本上光滑的镀覆表面。相反，当电流密度增加时，镀金表面的孔隙更显著，电极表面的面积增加。

(例2)

实际上采用例1中得到的微电极表面和老鼠海马(hippocampus)(大脑)的切片来测量所引发的电位和噪声。海马切片是由老鼠得到的。用Fluothane给五个星期大的雄性c57黑6鼠施加麻醉，并且实施断头术以取出整个脑。取出的脑立即在冰上的林格氏溶液中冷却。解剖仅包含海马的脑区。此后，用组织切片刀切割得到脑区，得到厚250μm的切片。将此切片放在微电极上并且在微电极上测试。

在施加10μA恒定电流的情况下，测量引发的电位和噪声，所述恒定电流具有双极性脉冲(脉冲宽度为100微妙)。在激励之后，从激励之前5毫秒到激励之后45毫秒测量64个电极的响应，并且显示在具有64通道的计算机屏幕上。结果示于图2a至2f。图2a、2c和2e显示了相对于上述恒定电流激励，镀金微电极上细胞的电位变化响应(即，引发的电位)。图2a显示了在1.0A/dm²的电流密度下通过电解而得到的电极的引发电位。图2c显示了在1.5A/dm²的电流密度下通过电解而得到的电极的引发电位。图2e显示了在2.0A/dm²的电流密度下通过电解而得到的电极的引发电位。

图2b、2d和2f显示了在图2a、2c和2e中显示的各个镀金微电极中出现的噪声水平。

从图2a、2c和2e可以看出，与通过在1.0A/dm²的电流密度下的电解而得到的金镀层(图2a)相比，具有利用更高的电流密度得到的多孔金镀层的电极对施加的激励信号具有清晰的响应，并且能够以有效的方式给电极施加恒定的电流激励(图2c和2e)。特别是，具有在1.5A/dm²的电流密度下得到的镀层的微电极具有低的阻抗值和另人满意的表面状态。

对于噪声水平，在2.0A/dm²的电流密度下得到的镀层(图2f)具有最低值，在1.5A/dm²的电流密度下得到的镀层(图2d)具有第二低的值。可是，在1.0A/dm²的电流密度下得到的镀层(图2b)具有明显的噪声水平，其难以高精度地测量神经细胞的电位变化。

(例3)

将在各种电流密度下得到的镀有电解金镀层的平坦微电极表面的频率特性与传统的产品进行比较。具有分别在2.0A/dm²和1.5A/dm²的电流密度下得到的多孔镀金表面的电极具有与传统电极相似的频率特性，所述传统电极具有通过电解得到的铂黑镀层。然而，在1.0A/dm²的电流密度下得到的金镀层具有明显劣于传统产品的频率特性。

(例4)

通过下列方法测量或计算微电极表面积。

1.通过气体吸收法测量

利用CO气体通过气体吸收法测量具有多孔镀金表面的微电极的表面积，所述多孔镀金表面是在例1中在1.5A/dm²的电流密度下得到的。作为将要测量的样品，采用在1.3mm×1.3mm×1.1mm的玻璃衬底(下文称为镀金微电极块)上提供的64个镀金微电极。单个的微电极太小而不能作为将用气体吸收法测量的样品。另外，使用在如上所述的玻璃衬底上提供的64个铂黑镀覆微电极(下文称为铂黑镀覆微电极块)作为比较样品，所述铂黑镀覆微电极具有通过用传统方法(电解镀覆)代替金镀覆的铂黑镀层。注意每个样品块重0.004克。测量的结果示于表2。

表2：具有镀金表面的电极的表面积的测量结果

样品	表面积
		镀金微电极块	0.02m2/g或更小
铂黑镀覆微电极块(比较例)	20.2m2/g

镀金微电极块或铂黑镀覆微电极块的整个表面积表示如下：

S’＝(S-s)+αs

其中S’代表镀金微电极块或铂黑镀覆微电极块(下文称为微电极块)的整个表面积；S代表在1.3mm×1.3mm×1.1mm的玻璃衬底上形成镀层之前微电极块的整个表面积；s代表镀覆之前微电极的表面积(突出面积)，S’代表镀金微电极块或铂黑镀覆微电极块的整个表面积；αs代表经过镀覆的微电极的表面积s增加到α倍；S-s，即除了微电极之外的微电极块的表面积不变化，只有微电极的表面积通过镀覆增加了。α值通过下式计算：

α＝(S’-S)/s+1。

在本例中，S值是1.3mm×1.3mm×1.1mm矩形平行六面体的表面积即7.41mm²。s(突出面积)的值是每个电极具有50μm×50μm的尺寸的64个电极的表面积，即0.16mm²，。因此，根据表2所示的S’的测量结果，计算的铂黑镀覆微电极的α值为504955。注意，镀金电极的α值(表面积的增加)低于气体吸收法的检测限制，估计低于455。

2.微电极的表面积的计算

2.1.镀金电极的阻抗特性

通过频率从1Hz到100kHz连续变化，测量例1中的具有在1.5A/dm²的电流密度下得到的多孔镀金表面的微电极的阻抗。在本测量中，采用0.3mmφ的铂线作为反电极，在1.4wt％NaCl水溶液中进行测量。偏压为0伏，测量电压的振幅为50mV。结果示于图3。图3是本领域技术人员公知的伯德图，显示了阻抗测量的结果，其示出了测量的阻抗Z的绝对值的对数(即log|Z|)和相角(θ)关于频率f的对数的关系。基于伯德图，用等效电路表示测量系统，从而量化微电极的表面积。

可以推算包含微电极的测量系统与一个电路等效，此电路除了包含以串联和并联形式复杂连接的溶液的电阻、ITO电路图形的电阻、微电极表面中的电双层的电容等之外，实际上还包含在ITO电路图形部分和溶液之间产生的电容、在微电极界面上产生的电阻等。例如，图4a显示了包含微电极的测量系统的等效电路。图4a所示的整个等效电路的综合阻抗Z可以表示如下：

$Z=R_1+\frac{(R_2+R_3)(1-{\mathrm{\ω}}^2{R}_2{R}_3{C}_1{C}_2)+{\mathrm{\ω}}^2{R}_2{R}_3{C}_1\{R_3{C}_1+(R_2+R_3)C_2\}}{{(1-{\mathrm{\ω}}^2{R}_2{R}_3{C}_1{C}_2)}^2+{\left[\mathrm{\ω}\right\{R_3{C}_1+(R_2+R_3)C_2\left\}\right]}^2}$

$-\mathrm{j\ω}\frac{(R_2+R_3)\{R_3{C}_1+(R_2+R_3)C_2\}-R_2{R}_3{C}_1(1-{\mathrm{\ω}}^2{R}_2{R}_3{C}_1{C}_2)}{{(1-{\mathrm{\ω}}^2{R}_2{R}_3{C}_1{C}_2)}^2+{\left[\mathrm{\ω}\right\{R_3{C}_1+(R_2+R_3)C_2\left\}\right]}^2}---\left[I\right]$

其中R₁代表ITO电路图形部分(不接触溶液)的电阻；R₂代表ITO电路图形部分的电阻和溶液的电阻；R₃代表微电极表面的电阻；C₁代表微电极表面的电双层的电容；C₂代表ITO电路图形部分和溶液之间通过绝缘膜产生的电容；和ω＝2πf(ω：角频率，f：频率)。上述综合阻抗的绝对值|Z|和相角θ分别表示为：|Z|＝(Z_Re ²+Z_Im ²)^1/2和θ＝tan^-1(-Z_Im/Z_Re)(其中Z_Re是Z的实部，Z_Im是Z的虚部)。

这里，通过改变R₁、R₂、C₁和C₂以选择R₁、R₂、R₃、C₁和C₂的组合，提供最接近图3所示的伯德图，通过计算等效电路的综合阻抗来模拟图4a所示的等效电路。图5是R₁＝200Ω、R₂＝5kΩ、R₃＝5MΩ、C₁＝0.01μF和C₂＝100pF的伯德图。很显然，图5所示的结果在很大程度上与图3所示的实际测量一致。

这里，在包含微电极的测量系统中，R₃＞＞R₁、R₃＞＞R₂和C₂＜＜C₁。因此，如果假设R₃→∞和C₂→0，上述表达式[I]可以近似为：

$\underset{R_3\→\∞}{\lim }\underset{C_2\→0}{\lim }Z=R_1+R_2-j\frac{1}{\mathrm{\ω}{C}_1}=R_1+R_2+\frac{1}{\mathrm{j\ω}{C}_1}---\left[\mathrm{II}\right]$

如果R₁+R₂＝R和C₁＝C，包含微电极测量系统可以近似为图4b所示的简单电路。下文，利用图4b所示的等效电路进一步进行了分析。

图4b所示的整个等效电路的综合阻抗表示为Z＝R+(jωc)^-1，其中R代表电路图形的电阻；C代表微电极表面的电双层的电阻；ω＝2πf(ω代表角频率，f代表频率)。上述综合阻抗的绝对值|Z|和相角θ分别表示为：|Z|＝(R²+(1/ωc)²)^1/2和θ＝tan^-1(-ωc/R)。

通过改变R和C以选择R和C的组合，提供最接近于图3所示的伯德图，通过计算等效电路的综合阻抗模拟图4b所示的等效电路。图6是R＝5kΩ和C＝0.01μF的伯德图。很显然图6所示的结果在很大程度上与图3所示的实际测量一致。

然后，图7是显示用做控制的微电极的阻抗的实际测量值曲线图，该微电极不具有镀金表面。测量条件与用于测量具有上述镀金表面(图3)的多电极阻抗的条件一样。

然后，图8显示了通过模拟图4b所示的等效电路(其中R＝5kΩ和C＝250Pf)得到的等效电路的综合阻抗的结果。很显然图8所示的结果在很大程度上与图7所示的实际测量结果一致。

这里，假设具有镀金表面的微电极的电双层的电容用C_A来表示，镀金处理之前的微电极的电双层的电容用C_B表示。根据上述模拟结果，微电极的静电容量C_A和C_B分别为0.01μF和250pF，从而得到关系C_A＝40C_B。这里，通常静电容量C_ap表示为：C_ap＝ε₀ε_rS/d(ε₀：真空的介电常数；ε_r：介电材料的相对介电常数；S：电极的表面积；和d：介电材料的厚度)。静电容量C_ap值正比于电极的表面积。因此，上述关系表明通过提供金镀层，具有镀金表面的微电极的表面积增加到40倍。

图9以与具有镀金表面的微电极一样的方式显示了具有铂黑镀覆表面的微电极的阻抗的实际测量值的曲线图。测量条件与在具有镀金表面的微电极的阻抗测量(图3)中所用的条件一样。然后，图10显示了通过模拟(其中R＝5kΩ，C＝0.05μF)得到的图4b所示的等效电路的综合阻抗的结果。很显然，图10所示的结果在很大程度上与图9所示的实际测量结果一样。

同样地，这里假设具有镀金表面的微电极的电双层的电容用C_A表示，金镀覆处理之前的微电极的电双层的电容用C_B来表示。根据上述模拟结果，微电极的静电容量C_A和C_B分别为0.01μF和0.05pF，从而得到关系C_A＝200C_B。此关系表明通过提供金镀层，具有镀金表面的微电极的表面积增加200倍。

根据此模拟，为了得到作为微电极的阻抗极限的50kΩ或更低的阻抗，与突出面积相比，需要利用金镀层将表面积增加10倍或更多。

(例5)

与传统电极(铂黑镀层)相比较，对具有多孔金镀层的平的多电极进行寿命测试，所述多孔金镀层是在1.5A/dm²的电流密度下通过电解得到的。在此寿命测试中，重复与一般的严格实验类似的实验。特别是重复例2所描述的实验。每个实验结束之后，用胶原酶(20u/ml)处理电极一个晚上，剥去细胞切片样本，接着用蒸馏水冲洗。然后，测量微电极的阻抗。图11的曲线图示出了每个实验结束之后阻抗的变化。根据此结果，随着使用次数的增加，阻抗的增加和变化比传统的镀层(铂黑镀层)小。

相反，如图11所示，在17-18个循环之后，通过电解方法具有铂黑镀覆表面的传统产品的阻抗显著增加。如上所述，具有多孔金镀层的电极具有更高水平的可再循环使用性，并且与传统产品相比，可以稳定地测量电极的电位变化。

尽管参考上述例子描述了本发明，但本发明并不限于这些例子。在不离开本发明的范围的情况下，基于本领域技术人员的知识，可以在实施本发明时修改、提高和改变实施例。

                       工业实用性

根据本发明，提供了用于细胞外记录的多电极，此多电极具有高强度，能长时间记录神经细胞的电活性，并易于循环使用。通过利用多孔金镀层，包含在多电极中的多个微电极在不丧失强度的情况下具有低的阻抗。因此，易于给多电极施加恒定的电流激励，最好使多电极适于监视培养的细胞对电激励的响应。

Claims (10)

1.一种用于测量细胞的电生理学特性的多电极，此电极包括：

位于衬底上的多个微电极；用于给微电极提供电信号或从微电极引出电信号的布线部分，

其特征在于，微电极具有在其表面上的多孔导电材料，此导电材料选自金、氮化钛、氧化银和钨，每个微电极的阻抗小于等于50kΩ。

2.根据权利要求1的多电极，其特征在于，多孔导电材料是金，并且通过在1.0-5.0A/dm²的电流密度下导通电流10-360秒来提供。

3.根据权利要求1或2的多电极，其特征在于，以矩阵的形式在衬底上排列微电极，布线部分包含与微电极连接的引线和与引线的端部连接的电节点，至少用绝缘层覆盖引线的表面。

4.根据权利要求3的多电极，其特征在于，通过蚀刻提供多孔导电材料。

5.一种包括根据权利要求1或2的多电极的一体的细胞支座，其特征在于，一体的细胞支座具有用于在多电极的衬底上放置细胞或组织的细胞安置区。

6.一种包括根据权利要求3的多电极的一体的细胞支座，其特征在于，一体的细胞支座具有用于在多电极的衬底上放置细胞或组织的细胞安置区。

7.一种细胞电位测量装置，包括：根据权利要求5的一体的细胞支座；由于细胞或组织的电生理学活性而与微电极连接并用于处理输出信号的输出信号处理器；和用于有选择地给细胞或组织提供电激励的激励信号供应器。

8.一种细胞电位测量装置，包括：根据权利要求6的一体的细胞支座；由于细胞或组织的电生理学活性而与微电极连接并用于处理输出信号的输出信号处理器；和用于有选择地给细胞或组织提供电激励的激励信号供应器。

9.一种细胞电位测量系统，包括：根据权利要求7的细胞电位测量装置；用于光学监视细胞或组织的光学监视装置；和/或用于控制细胞或组织的培养环境的细胞培养装置。

10.一种细胞电位测量系统，包括：根据权利要求8的细胞电位测量装置；用于光学监视细胞或组织的光学监视装置；和/或用于控制细胞或组织的培养环境的细胞培养装置。

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