DE69333945T2

DE69333945T2 - Flache Elektrode

Info

Publication number: DE69333945T2
Application number: DE1993633945
Authority: DE
Inventors: Hirokazu Katano-shi Sugihara; Makoto Taketani; Tadayasu Hirakata-shi Mitsumata
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1992-09-04
Filing date: 1993-09-02
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: EP0585933B1; DE69333945D1; EP0585933A2; EP0585933A3

Description

Diese Erfindung betrifft eine flache Elektrode, die auf dem Gebiet der Neurophysiologie für elektrische Messungen von biologischen Aktivitäten, insbesondere elektrischen Aktivitäten von Nervenzellen, verwendet wird. Diese flache Elektrode weist eine große Anzahl von Elektroden auf und ermöglicht eine Langzeitkultur von Nervenzellen auf den Elektroden, dient der elektrischen Stimulation von Nervenzellen mittels Elektroden während des Kulturzeitraums und ist in der Lage, elektrische Aktivitäten von Nervenzellen unter Verwendung der Elektroden aufzuzeichnen.
Seit kurzem werden medizinische Untersuchungen an Nervenzellen und Untersuchungen über die Möglichkeit, Nervenzellen als elektronische Bauteile zu verwenden, aktiv betrieben.
Das Innere einer Nervenzelle ist von der äußeren Umgebung durch die Zellmembran getrennt, durch welche Substanzen in die Zelle und aus der Zelle heraus transportiert werden. Die Zellmembran hat für verschiedene Substanzen unterschiedliche Permeabilität. Diese Eigenschaft wird selektive Permeabilität genannt.
Die Zellmembran von Nervenzellen hat auch für verschiedene Sorten von Ionen eine selektive Permeabilität. Überdies variiert diese Selektivität entsprechend dem Zustand der Zelle. Innerhalb der Nervenzelle ist im Ruhezustand die Konzentration von Na⁺ niedrig und diejenige von K⁺ hoch. Dagegen ist außerhalb der Zelle die Konzentration von Na⁺ hoch und diejenige von K⁺ niedrig. Demzufolge entsteht zwischen dem Innern und dem Äußeren der Zelle ein Ionenkonzentrationsgradient und entwickelt sich eine Potentialdifferenz (Membranpotential). Dieses Membranpotential ist innerhalb der Zelle bezüglich des Zelläußeren negativ und für Wirbeltiere um die –70 mV. Dieses Membranpotential wird Ruhemembranpotential genannt.
Bei einer Stimulation der Nervenzellen (im allgemeinen eine elektrische Stimulation) und einer Änderung des Membranpotentials von einem Ruhe- zu einem positiven Membranpotential (Depolarisation), ändert sich die selektive Permeabilität der Zellmembran für Ionen nicht und wird das Aktionspotential nicht erzeugt, falls die Größe der Depolarisation unterhalb eines bestimmten Schwellenwerts ist. Wenn die Depolarisation den Schwellenwert überschreitet, ändert sich die selektive Permeabilität der Zellmembran für Ionen und das Aktionspotential wird erzeugt. Bei der Erzeugung des Aktionspotentials ändert sich die Ionenkonzentration innerhalb und außerhalb der Zellmembran. Eine Messung dieser Potentialänderung, die von einer Ionenkonzentrationsänderung in der Nähe der Nervenzellen (das heißt, einem Ionenstrom) begleitet ist, mittels Elektroden, erlaubt die Erfassung und Untersuchung von Nervenaktivitäten.
Um die elektrische Aktivität von Nervenzellen zu messen, ist es herkömmlich allgemeine Praxis, eine aufzeichnende Elektrode und eine stimulierende Elektrode, die Glas, Metall oder andere Elektroden aufweisen, zu verwenden, sie in oder zwischen Zellen hinein zu bringen und die elektrischen Aktivitäten der Nervenzellen mit der aufzeichnenden Elektrode zu messen, wenn ein Stimulationsstrom (oder eine Stimulationsspannnung) von der stimulierenden Elektrode aus zugeführt wird.
Zusätzlich dazu gibt es viele modifizierte Verfahren, wie beispielsweise das sogenannte "Whole cell patch clamp"-Verfahren, in welchem eine Zelle in einer Glaselektrode absorbiert ist, die in eine Tropfpipette mit einer Spitze von ungefähr 1 um geformt ist, die konstruiert ist, um einen Teil der Zellmembran aufzubrechen, das Innere des Zellkörpers mit der Flüssigkeit in der Glaselektrode zurückfließt und elektrische Signale von dieser Glaselektrode ausgegeben werden, um elektrische Eigenschaften der Zelle zu beobachten.
In der herkömmlichen Technik und ihren modifizierten Verfahren müssen Elektroden, beispielsweise Glaselektroden, verwendet werden, die größer sein müssen als die Zelle selbst. Folglich sind hauptsächlich aufgrund räumlichen Beschränkungen und beschränkter Meßgenauigkeit gleichzeitige Messungen an mehreren Punkten, wobei zwei oder mehrere aufzeichnende Elektroden gleichzeitig in eine Probe hinein gebracht werden, um elektrische Aktivitäten der Nervenzellen zu registrieren, sehr schwierig.
Um die Tätigkeit des gesamten Nervenschaltungsnetzwerks zu untersuchen, ist es notwendig, viele Nervenzellenaktivitäten gleichzeitig aufzuzeichnen, und mit zunehmender Anzahl von Meßpunkten erhöht sich der Schwierigkeitsgrad, was das Problem erzeugt, daß es schwierig ist, über eine große Anzahl von Zellen hinweg zu beobachten.
Da zudem Glas, Metall oder andere Elektroden in oder zwischen Zellen hinein gestochen werden müssen, gibt es ein weiteres Problem, daß die Beschädigung der Zelle ernsthaft ist und eine Messung über einen langen Zeitraum, wie beispielsweise über mehr als einige Stunden, schwierig durchzuführen ist.
Da in dem "Whole cell patch clamp"-Verfahren das Zellinnere mit der in der Glaselektrode enthaltenen Flüssigkeit zurückfließt, ist die Beschädigung der Zelle sogar größer, was die Meßzeit auf ungefähr eine Stunde begrenzt.
Die JP-A-04204244 und die englische Zusammenfassung in PATENT ABSTRACTS OF JAPAN, Bd. 016, Nr. 536 (P-1449); DATABASE WPI Section Ch.; Week 9236 Derwent Publications Ltd., London, GB; Class L03, AN 92-296180, betrifft eine integrierte Verbundelektrode zum Messen der elektrischen Aktivität von Nervenzellen. Der Zweck dieser Elektrode ist, eine einfache gleichzeitige Mehrpunktmessung zu machen und die Signalübertragung, die zwischen vielen Zellen verläuft, zu beobachten. Komplexe Elektroden sind in eine einzige eingebaut und sind mit einem Verdrahtungselement versehen, wobei Leitungsdrähte von den mehreren Elektroden aus radial angeordnet sind. Die Abstände zwischen nächst gelegenen Elektroden sind gleich. Ferner ist eine isolierende Schicht mit Löchern an der Elektrode bereitgestellt.
Somit weist die gesamte Vorrichtung eine isolierende Basisplatte, eine mit einem Muster versehene leitende Schicht und eine mit einem Muster versehene isolierende Schicht auf. Die leitende Schicht ist mit einem Muster versehen, um Elektrodenpfade und Leitungen zu erzeugen. Die isolierende Schicht besteht aus Polyimid und weist ein Loch oberhalb jeder Elektrode auf, somit hat die obere isolierende Schicht ein solches Muster, daß nur ein Teil der leitenden Schicht frei liegt. Der freiliegende Bereich der leitenden Schicht wirkt als Elektrode, die mit Neuronen und Lösungen Kontakt haben kann. Somit ist die eigentliche Elektrode der Teil, der nicht mit der isolierenden Schicht bedeckt ist und ihre Größe entspricht der Größe des Lochs. Nur dieser Teil der Elektrode kann Kontakt mit Neuronen und einer Lösung haben.
Daher haben die offenbarten Elektroden einen Durchmesser von 15 μm, aber die tatsächliche Größe der Elektrode entspricht der Größe des Lochs, das in der beschriebenen Ausführungsform einen Durchmesser von 10 μm hat. Somit ist die Größe der tatsächlichen Elektrode 78,5 μm² (= 5 × 5 × 3,14). Es ist erwähnt, daß die Größe des Lochs in Bereich von 5 bis 20 μm liegen kann.
TRANSACTIONS ON BIOMEDICAL ENGINEERING; Feb. 1986, USA, Bd. BME-33, Nr. 2, ISSN 0018-9294, Seite 196–202, NOVAK J L et al.: "Recording from the Aplysia abdominal gangolin with a planar microelectrode array", betrifft eine passive Mehrelektrodenanordnung, die hergestellt und verwendet worden ist, um ein neurales Ereignis aus dem abdominalen Ganglion der Meeresmolluske Aplysia californica aufzuzeichnen. Die Anordnung besteht aus einem Muster aus Goldleiterbahnen auf einem Glassubstrat, das mit einem Polyimid isoliert ist. Die 32 Elektroden haben einen Durchmesser von 25 μm und sind in einer 4 × 8-Matrix an 200 μm Mittelpunkten angeordnet. Oberhalb jeder Elektrode ist ein Loch mit 10 μm Durchmesser bereitgestellt. An der Oberseite dieser Anordnung ist eine Kammer für Kulturmedium bereitgestellt.
JOURNAL OF NEUROSCIENCE METHODS; Feb. 1980, Netherlands, Bd. 2, Nr. 1, ISSN 0165-270, Seite 19–31, Pine J: "Recording action potentials from cultured neurons with extra-cellular microcircuit electrodes", betrifft die Aufzeichnung von Aktionspotentialen aus kultivierten Neuronen mit extrazellulären Mikroschaltkreis-Elektroden. Dissoziierte Zellkulturen von Neuronen aus oberen Halsganglien neugeborener Ratten wurden in speziell präparierten Schalen gezogen, deren Böden aus Deckgläschen bestanden, auf welchen Dünnschicht-Mikroschaltungen aufgebracht waren. Die Mikroschaltung stellte 32 Mikroelektroden pro Schale bereit, jede mit einer Fläche von ungefähr 8 × 10 μm. Durchgeführt wurden extrazelluläre Aufzeichnungen der Aktionspotentiale aus einzelnen Neuronen mit guten Signal/Rausch-Verhältnissen für Zellen im Bereich von 40 μm um den Elektrodenmittelpunkt. Jedoch sind beispielsweise unterschwellige synaptische Potentiale nicht gesehen worden.
IEEE Transactions on Biomedical Engineering; Nov. 1978, Bd. BME25, Nr. 6, Seite 494–500, beschreibt eine Mikroelektroden-Anordnung, die Stimulationselektroden mit einer effektiven Elektrodenfläche von 75 μm Durchmesser aufweist. Dies entspricht einer Fläche von 4418 μm². Jedoch ist diese Vorrichtung für eine in-vivo-Verwendung angepaßt.
Demgemäß ist ein Merkmal der Erfindung die Bereitstellung einer flachen Elektrode, die die Probleme des Stands der Technik löst und eine einfache Stimulierung und Messung von Nervenzellen sowie der Signalübertragung gleichzeitig an mehreren Punkten und eine Beobachtung über viele Zellen hinweg für mehr als nur einige Stunden ermöglicht.
Diese Probleme werden mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst.
Die Erfindung zeichnet sich aus durch eine flache Elektrode, die ein isolierendes Substrat, mehrere daran angeordnete Elektroden mit gleichem Abstand zwischen benachbarten Elektroden, einen Verdrahtungsabschnitt, in welchem Leitungsdrähte im wesentlichen radial von den Elektroden aus angeordnet sind, und eine isolierende Schicht aufweist, die die Leitungsdrähte bedeckt. Jede Elektrode hat eine Fläche von 2500 μm². Eine Kammer ist an der Oberseite der Anordnung gebildet.
Es ist in der Erfindung bevorzugt, daß der kürzeste Elektrode-Elektrode-Abstand von 10 bis 1000 μm ist.
Es ist in der Erfindung bevorzugt, daß die isolierenden Schichten, die die Leitungsdrähte bedecken, Löcher an jeder Elektrode haben und fast über die gesamte Oberfläche des isolierenden Substrats hinweg bereitgestellt sind, ausgenommen in der Nähe der Kontakte der Leitungsdrähte mit einer externen Schaltung.
Es ist in der Erfindung bevorzugt, daß der Oberflächenwiderstand der Elektrode 10 Ω/cm² oder weniger ist. Aus diesem Grund ist bevorzugt, die Oberfläche der Elektrode entweder mit Platin, Platinschwarz oder Gold zu überziehen.
Es ist in der Erfindung bevorzugt, daß der Mittelpunkt jeder der mehreren Elektroden jeweils an einem Schnittpunkt eines 8 × 8 Gitters angeordnet ist.
Es ist wünschenswert, daß das isolierende Substrat aus einem transparenten Material besteht, so daß die auf dem isolierenden Substrat kultivierte Nervenzelle leicht beobachtet werden kann. Aus ähnlichen Gründen ist es wünschenswert, daß die Elektroden, die Leitungsdrähte und die isolierende Schicht aus einem transparenten Material bestehen.
Es ist in der Erfindung ferner bevorzugt, daß sowohl die Elektrode als auch der Leitungsdraht aus Indiumzinnoxid (ITO), Zinnoxid, Cr, Au, Cu, Ni oder Al bestehen.
Insbesondere besteht die isolierende Schicht vorzugsweise aus entweder Polyimidharz (PI-Harz), negativem, lichtempfindlichem Polyimidharz (NPI-Harz), Epoxyharz, Acrylatharz, Polyesterharz oder Polyamidharz.
Durch Zuführen von Signalen zu Nervenzellen, die auf der erfindungsgemäßen flachen Elektrode kultiviert werden, und gleichzeitiges Messen des Signals zwischen den Zellen ermöglicht die flache Elektrode der Erfindung die Erfassung der Signalübertragung zwischen benachbarten Zellkörpern. Dies ist, weil ein einziger Zellkörper auf der Elektrode angeordnet ist und er mit einem hohen Grad an Wahrscheinlichkeit so angeordnet werden kann, daß der zwischen den Zellfortsätzen (z.B. Dendrite und Axone an Nervenzellen) liegende Zellkörper an benachbarten Elektroden angeordnet ist, indem der kürzeste Elektrode-Elektrode-Abstand so eingestellt wird, daß er fast gleich der Länge einer zu messenden Nervenzelle ist (das heißt, Zellkörper, Dendrite, Axon), und die Elektroden im gleichen Abstand angeordnet werden.
Werden ferner die sich von den Elektroden aus erstreckenden Leitungsdrähte im wesentlichen radial angeordnet, so verringert dies die kapazitive Komponente (Kapazitanz) zwischen den Leitungsdrähten im Vergleich zur Kapazitanz, wenn sie parallel angeordnet sind. Der Abfall einer Pulssignalwellenform der elektrischen Signale ist ebenfalls verringert und die Zeitkonstante der Schaltung wird klein, was die Antwort auf schnelle Pulssignale verbessert und damit das Nachfolgende auf die Komponente bei schnellen Nervenzellenaktivitäten verbessert.
Wird außerdem die Elektrodenfläche angepaßt, so ermöglicht dies das Anlegen einer elektrischen Stimulation an eine Zelle über einen langen Zeitraum von mehr als einigen Tagen sowie eine Messung der elektrischen Aktivitäten der Zelle. Insbesondere am unteren Ende des Bereichs für die Elektrodenfläche eignet sich die flache Elektrode der Erfindung zur Aufzeichnung von feinen Zellaktivitäten, während sich am oberen Ende des Bereichs für die Elektrodenfläche die Erfindung zum Anlegen einer elektrischen Stimulation an Zellen über einen langen Zeitraum eignet. Eine Anpassung der Elektrodenfläche ermöglicht ein Entwerfen einer flachen Elektrode, die für verschiedene Anwendungen geeignet ist.
Bringt man in der flachen Elektrode der Erfindung außerdem den kürzesten Elektrode-Elektrode-Abstand auf die gewünschte Bedingung von 10 bis 1000 μm, hat dies eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Folge, daß die Zellkörper auf benachbarten Elektroden angeordnet sind und sie über ihre Axone verbunden sind, wobei ein Elektrode-Elektrode-Abstand erzielt ist, der für eine Untersuchung von Informationsübertragung zwischen Nervenzellen günstig ist.
In der erfindungsgemäßen flachen Elektrode erlaubt die isolierende Schicht, in welcher die die Leitungsdrähte bedeckenden isolierenden Schichten jeweils Löcher oberhalb jeder Elektrode haben und fast über die gesamte Oberfläche des isolierenden Substrats mit Ausnahme in der Nähe des Abschnitts, wo der Leitungsdraht in Kontakt mit der externen Schaltung kommt, vorhanden sind, eine leichte Herstellung der erforderlichen isolierenden Schicht, dadurch, daß das isolierende Material, das lichtempfindliches Harz aufweist, fast auf die gesamte Oberfläche aufgetragen wird und daß die isolierende Schicht mittels eines Photoätzverfahrens an jeder Elektrode weggenommen wird und Löcher geöffnet werden, um die Elektroden freizulegen, wodurch eine einfache Herstellung erzielt wird und die Wahrscheinlichkeit eines Versagens der Isolierung minimiert wird, was sehr erwünscht ist.
Werden Elektroden und Leitungsdrähte so entworfen, daß sie sich aus einem transparenten Material herstellen lassen, ermöglicht dies ein leichtes Beobachten der auf der flachen Elektrode kultivierten Nervenzellen, was ebenfalls sehr wünschenswert ist.
Wird der Oberflächenwiderstand des Elektrodenabschnitts so festgelegt, daß der gewünschte Bereich von 10 Ω/cm² oder weniger erzielt wird, wird ein Auftreten einer Polarisation an der stimulierenden Elektrodenoberfläche der Nervenzelle im wesentlichen verhindert, wenn an einer bestimmte Elektrode für einen langen Zeitraum ein Stimulationsstrom zu den Nervenzellen zugeführt wird und an anderen Elektroden elektrische Aktivitäten (Potentialänderung) der Nervenzellen, die dem Stimulationsstrom entsprechen, aufgezeichnet werden, wobei Einflüsse (d.h. Artefakte) des Stimulationsstroms auf die aufgezeichnete Potentialwellenform minimiert sind. Da mit der Erfindung insbesondere sogar nach Zuführen eines Stimulationsstroms über einen langen Zeitraum Artefakte klein sind und der Modus frei von Änderung ist, können elektrische Aktivitäten von Nervenzellen vor und nach einer langen Stimulation verglichen werden.
Wenn zudem die Elektrodenoberfläche entweder mit Platin, Platinschwarz oder Gold überzogen ist, um den Oberflächenwiderstand der Elektrode auf 10 Ω/cm² oder weniger zu bringen, kommt das Platin, Platinschwarz oder Gold in direkten Kontakt mit Nervenzellen; da diese Metalle dafür bekannt sind, geringe zytotoxische Wirkung zu haben, sind sie geeignet, um die Ziele der Erfindung zu erreichen.
Werden in der erfindungsgemäßen flachen Elektrode ferner die Mittelpunkte der mehrerer Elektroden jeweils an einem Schnittpunkt eines 8 × 8 Gitters angeordnet, stellt dies die maximale Anzahl von Elektroden sicher, die ermöglicht, Leitungsdrähte im wesentlichen radial von den erfindungsgemäßen Elektroden aus anzubringen, was sehr wünschenswert ist.
Diese Erfindung stellt eine flache Elektrode mit ausgezeichnetem Ansprechvermögen bereit, auf welcher Nervenzellen kultiviert werden können und mit welcher Messungen der elektrischen Aktivitäten von Nervenzellen gleichzeitig an mehreren Punkten und eine Langzeitbeobachtung der Signalübertragung über viele Zellen hinweg für mehr als mehrere Stunde erzielt werden können, was herkömmlich ein unmögliches oder sehr schwer zu erzielendes Ergebnis war.
Das erforderliche Muster der isolierenden Schicht läßt sich leicht mittels eines Photoätzverfahrens herstellen und stellt eine flache Elektrode bereit, die leicht herzustellen ist und eine geringe Wahrscheinlichkeit für ein Versagen der Isolierung hat. Das Verfahren kann ohne weiteres eine Elektrode erzeugen, in welcher die isolierenden Schichten auf den Leitungsdrähten oberhalb jeder Elektrode Löcher haben und fast auf der gesamten Oberfläche des isolierenden Substrats aufgebracht sind, mit Ausnahme in der Nähe der Abschnitte, wo die Leitungsdrähte in Kontakt mit der externen Schaltung kommen, im Vergleich zu einer flachen Elektrode, in welcher eine isolierende Schicht nur an den Leitungsdrähten vorgesehen ist. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß ein isolierendes Material, das ein lichtempfindliches Harz aufweist, fast auf die gesamte Oberfläche aufgetragen wird und die isolierende Schicht an jeder Elektrode weggenommen wird, um ein Loch herzustellen, um die Elektrode freizulegen.
Wenn geeignete Elektroden verwendet werden, um einen Stimulationsstrom zuzuführen und die Potentialänderung mittels anderer geeigneter Elektroden aufgezeichnet wird, stellt die Erfindung eine flache Elektrode bereit, die eine geringere Elektrodenpolarisation hat und eine stabile Aufzeichnung bereitstellt, sogar nach Anlegen der Stimulation über einen langen Zeitraum, da jede Elektrode einen kleinen Oberflächenwiderstand hat und mit einer Substanz geringer Zytotoxizität überzogen ist.
Außerdem stellt die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, in welcher mehrere Elektroden jeweils an Schnittpunkten eines 8 × 8 Gitters angeordnet sind, eine flache Elektrode mit einer maximalen Anzahl von Elektroden bereit, die erlaubt, Leitungsdrähte fast radial von den Elektroden aus anzuordnen.
1 ist eine Ansicht einer Ausführungsform der Erfindung vor dem Auftragen einer Isolationsschicht auf die erfindungsgemäße flache Elektrode und zeigt Elektroden und Leitungsdrähte, die auf einem isolierenden Substrat gebildet sind;
2 ist eine teilweise abgeschnittene Ansicht der Ansicht von 1, wobei die isolierende Schicht einer Ausführungsform der Erfindung auf einer flachen Elektrode aufgetragen ist;
3 ist ein Teil einer Schnittansicht einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen flachen Elektrode;
4 zeigt eine mit anderen geeigneten Elektroden aufgezeichnete, sich ändernde Potentialwellenform vor Zuführen eines Stimulationsstroms über einen langen Zeitraum unter Verwendung von geeigneten Elektroden in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen flachen Elektrode;
5 zeigt die mit anderen geeigneten Elektroden aufgezeichnete, sich ändernde Potentialwellenform nach Zuführen eines Stimulationsstroms über einen langen Zeitraum unter Verwendung von geeigneten Elektroden in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen flachen Elektrode;
6 zeigt die mit anderen geeigneten Elektroden aufgezeichnete, sich ändernde Potentialwellenform vor Zuführen eines Stimulationsstroms über einen langen Zeitraum mit geeigneten Elektroden, wobei eine flache Elektrode verwendet wird, die sich von der erfindungsgemäßen flachen Elektrode nur dadurch unterscheidet, daß die Elektrodenoberfläche nicht mit Gold überzogen ist;
7 zeigt eine mit einer Elektrode aufgezeichnete andere Art einer sich ändernden Potentialwellenform nach Zuführen eines Stimulationsstroms über einen langen Zeitraum mit geeigneten Elektroden, wobei eine flache Elektrode verwendet wird, die sich von der erfindungsgemäßen flachen Elektrode nur dadurch unterscheidet, daß die Elektrodenoberfläche mit Gold überzogen ist.
Als das für die Erfindung verwendete Material für das isolierende Substrat ist ein transparentes Substrat wünschenswert, da mikroskopische Beobachtung nach der Zellkultur, wie oben beschrieben, erforderlich ist. Beispiele umfassen Gläser, wie beispielsweise Quarzglas, Bleiglas oder Borsilikatglas, oder anorganische Substanzen, wie Quarz, oder organische Substanzen mit Transparenz, wie beispielsweise Polymethylmethacrylat oder dessen Copolymere, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polyester, Po lypropylen, Harnstoffharz und Melaminharz. Unter Berücksichtigung mechanischer Festigkeit kombiniert mit Transparenz sind jedoch anorganische Substanzen wünschenswert.
Als die für die Erfindung verwendeten Elektrodenmaterialien umfassen Beispiele Indiumzinnoxid (ITO), Zinnoxid, Cr, Au, Cu, Ni und Al. Insbesondere erzeugt die Verwendung von ITO oder Zinnoxid eine leicht gelbliche transparente Elektrode, was eine gute Sichtbarkeit von Nervenzellen unter dem Mikroskop bereitstellt und für experimentelles Arbeiten vorteilhaft ist, jedoch ist ITO besonders wegen seiner guten Leitfähigkeit wünschenswert.
Die gleichen Materialien können für die Leitungsdrähte verwendet werden und ITO ist aus den gleichen Gründen wie den für die Elektrodenmaterialien erwähnten wiederum wünschenswert.
Es ist keine besondere Einschränkung der Erfindung, aber im allgemeinen sollte die Dicke der Elektroden und Leitungsdrähte ungefähr 50 bis 500 nm sein und im allgemeinen werden diese Materialien auf das isolierende Substrat aufgedampft und durch Ätzen unter Verwendung eines Photoresists in ein gewünschtes Muster geformt.
Als Material für die isolierende Schicht, die verwendet wird, um die für die Erfindung verwendeten Leitungsdrähte zu isolieren, umfassen Beispiele Polyimidharz (PI-Harz), Epoxyharz, Acrylatharz, Polyesterharz, Polyamidharz und andere transparenten Harze.
Diese Harzsorten werden mittels herkömmlichen Techniken auf die Leitungsdrähte aufgetragen, um eine isolierende Schicht zu erzeugen. Wenn das isolierende Material ein lichtempfindliches Harz ist, das photochemische Polymerisationseigenschaften usw. hat, ist dies wünschenswert, da Muster gebildet werden können, um Löcher an dem isolierenden Schichtabschnitt an den Elektroden bereitzustellen, um die Elektroden freizulegen, wie oben beschrieben ist.
Wenn insbesondere das isolierende Material PI ist und die zu kultivierende Zelle eine Nervenzelle ist, findet ein zufriedenstellendes Wachstum statt, und daher ist es sehr wünschenswert. Außerdem ist unter den Sorten von PI negatives lichtempfindliches Polyimid (NPI) am stärksten gewünscht, da an den E lektroden Löcher unter Verwendung eines Photoätzprozesses erzeugt werden können, nachdem das negative lichtempfindliche Polyimid auf eine ähnliche Weise wie bei der Erzeugung der Muster des Verdrahtungsabschnitts fast über die gesamte Oberfläche aufgetragen worden ist.
Die Dicke der isolierenden Schicht kann so sein, daß sie eine isolierende Fähigkeit verleihen kann. Es bedeutet keine besondere Beschränkung, aber im allgemeinen ist eine Dicke von 0,1 bis 10 μm, insbesondere von 1 bis 5 μm, wünschenswert.
An der erfindungsgemäßen flachen Elektrode lassen sich Zellen direkt kultivieren und elektrische Aktivitäten der Zellen messen und aufzeichnen. Abhängig von den Kulturbedingungen oder den Zelltypen kann die Größe des Zellkörpers oder die Länge der Zellfortsätze, wie beispielsweise Dendrite oder Axone, variieren, aber als Elektrode-Elektrode-Abstand der am nächsten gelegenen flachen Elektroden ist 10 bis 1000 μm wünschenswert. Wenn der Elektrode-Elektrode-Abstand weniger als 10 μm ist, sind die Elektroden so nahe beieinander, daß die Wahrscheinlichkeit, daß die Zellkörper über Zellfortsätze aneinander angrenzen, abnimmt. Ferner wird die Verdrahtung der Leitungsdrähte schwierig. Wenn der Elektrode-Elektrode-Abstand mehr als 1000 μm ist, können die Leitungsdrähte leicht verdrahtet werden, aber da es sehr selten ist, daß sich die Zellfortsätze von kultivierten Nervenzellen bis auf ungefähr 1000 μm erstrecken, nimmt die Wahrscheinlichkeit ab, daß der Zellkörper auf der Elektrode angeordnet ist. Selbst unter den allgemeinen Bedingungen ist als Elektrode-Elektrode-Abstand ungefähr 200 bis 300 μm wünschenswert, da bei Zellen des zentralen Nervensystems von Säugetieren die Länge der Zellfortsätze einer kultivierten Zelle durchschnittlich ungefähr 200 bis 300 μm ist.
Was die Elektrodenfläche betrifft, so ist zur Vermeidung eines Elektrodendurchbruchs bei Anlegen einer elektrischen Stimulation an die Zelle über einen langen Zeitraum erforderlich, den Widerstand an der Grenzfläche zum Kulturmedium zu verringern, was eine Größe erfordert, die ein gewisses Maß überschreitet. Mit zunehmender Elektrodenfläche und abnehmendem Widerstand an der Schnittstelle zum Kulturmedium nimmt jedoch die elektrische Aktivität der zu messenden Zelle ab und nimmt das Signal/Rausch-Verhältnis ab. Das heißt, wenn der Stromwert I konstant ist, folgt aus I = V/R, daß das zu messende Potential mit abnehmendem Widerstand R abnimmt. Das heißt, die elektrischen Aktivitäten der zu messenden Zelle nehmen ab und das S/N-Verhältnis sinkt. Folglich muß die Elektrodenfläche sorgfältig eingestellt werden.
Um den Oberflächenwiderstand der Elektrode auf 10 Ω/cm² oder weniger zu bringen, wird die obere ITO-Oberfläche mit Metall beschichtet. Beispiele für ein Beschichtungsmaterial umfassen Ag, Al, Bi, Au, Cu, Cr, Pt und Co, aber unter Berücksichtigung einer geringen Toxizität für Nervenzellen ist die Verwendung von Au oder Pt wünschenswert. Die Dicke der Beschichtung ist nicht besonders beschränkt, ist aber ungefähr 50 nm und im allgemeinen werden diese Materialien auf das isolierende Substrat aufgedampft und mittels Ätzen unter Verwendung eines Photoresists in gewünschte Muster geformt.
Durch Träufeln einer Platinsalzlösung auf die Elektrode und ihre Elektrolyse, um Platinschwarz an der Elektrode abzuscheiden, ist es möglich, die Elektroden zu beschichten.
Gemäß einer vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden außerdem Löcher in der isolierenden Schicht der flachen Elektrode gebildet, um Elektroden freizulegen, nicht nur um den auf der flachen Elektrode kultivierten Zellkörper zu stimulieren, sondern auch um elektrische Aktivitäten aus benachbarten Zellkörpern zu erfassen, die am Mittelabschnitt der Elektrode angeordnet sind.
Werden die Leitungsdrähte, die sich von der Elektrode aus erstrecken, fast radial angeordnet, so eliminiert dies die Kapazitanz zwischen Leitungsdrähten, reduziert die Zeitkonstante und verbessert die Meßgenauigkeit.
Die Ausführung, in welcher die Elektrodenmittelabschnitte der erfindungsgemäßen flachen Elektrode jeweils an einem Schnittpunkt eines 8 × 8 Gitters oder kleineren Gitters angeordnet sind, ermöglicht ein radiales Anordnen der Leitungsdrähte, und unter dem Gesichtspunkt, so viele Elektroden wie möglich herzustellen und Stimulation an mehreren Punkten gleichzeitig bereitzustellen und aufzuzeichnen, ist es wünschenswert, Elektroden an jedem Schnittpunkt des 8 × 8 Gitters anzuordnen.
Unter Bezugnahme auf die folgenden speziellen Ausführungsformen wird die flache Elektrode der Erfindung detaillierter beschrieben.
Ausführungsform 1
Zunächst wird eine Herstellung einer Verdrahtung einer flachen Elektrode beschrieben. Als isolierendes Substrat 3 der flachen Elektrode in 1 und 3 wurde ein 50 × 50 × 1 mm Hartglas ("IWAKI CODE 7740 Glass" – Iwaki Glass Co., Ltd.) verwendet dies ist ein transparentes isolierendes Material mit hoher mechanischer Festigkeit.
Mit Bezug auf 3 wurde ITO als Material für die Elektrode 1 und den Leitungsdraht 2 verwendet, und auf die gesamte Fläche des isolierenden Hartglas-Substrats 3 wurde ITO aufgedampft, um eine ungefähr 100 nm dicke Schicht zu bilden, mit anschließendem Spülen.
Dann wurde das Substrat durch einen Photoresist belichtet, so daß der mittlere Abschnitt jeder Elektrode 1 an einem Schnittpunkt eines 8 × 8 Gitters (Position 5 wie in 2 gezeigt) angeordnet war, die Abstände zwischen den Mittelpunkten nächst gelegener Elektroden für alle Elektroden gleich waren und der Leitungsdraht 2 das Muster der Elektrode 1 und des Leitungsdrahts 2 bildete, in welchem sich der Leitungsdraht 2 radial erstreckte. Er wurde dann mit ITO in einer Lösung geätzt, die unter Verwendung von entmineralisiertem Wasser, Salzsäure und Salpetersäure in einem Volumenverhältnis 50:50:1 hergestellt wurde, und der Photoresist wurde entfernt. Ein Verdrahtungsabschnitt mit einer Elektrode 1 eines Durchmessers von 60 μm, einem Leitungsdraht einer Breite von 30 μm und einem Abstand der Mittelpunkte der Elektroden von 300 μm wurde auf diese Weise hergestellt.
Dann wurde für die isolierende Schicht 4 negatives lichtempfindliches Polyimid (nachstehend "NIP" genannt) im Schleuderverfahren aufgetragen, so daß sich nach dem Trocknen eine dünne Schicht von 1 μm Dicke bildete und ein Muster einer isolierenden Schicht wurde mittels Belichtung gebildet, so daß an dem Mittelpunkt jeder Elektrode des Verdrahtungsabschnitts ein quadratisches Loch 5 von 50 μm entstand, wie in 2 gezeigt ist. Ferner wurde auf dem freigelegten Abschnitt jeder Elektro de (das heißt, das Innere des 50 μm Quadrats) Gold in einer Schichtdicke von 50 nm aufgedampft.
Der Kontakt des Abschnitts nahe dem der Elektrode 1 gegenüberliegenden Ende des Leitungsdrahts 2 mit der externen Schaltung wurde mit Gold 7 und Nickel 8 beschichtet, um die Lebensdauer zu erhöhen.
In dieser Ausführungsform wurde ITO für die Elektrode 1 und den Leitungsdraht 2, NPI für die isolierende Schicht und Gold als Beschichtungsmaterial für die Elektrodenoberfläche verwendet; es ist jedoch bereits gesagt worden, daß die verwendeten Materialien nicht auf diese beschränkt sind.
Der Prozeß zur Herstellung der erfindungsgemäßen flachen Elektrode ist nicht auf das in dieser Ausführungsform beschriebene Verfahren beschränkt.
Ausführungsform 2
Als nächstes wird die Kultur von Nervenzellen auf der flachen Elektrode beschrieben.
Auf der in Ausführungsform 1 hergestellten flachen Elektrode wurden als Nervenzellen Zellen aus der Sehrinde von Rattengehirnen kultiviert.
Nun wird das Kulturverfahren detailliert diskutiert.

(a) Gehirne von Föten von SD-Ratten nach 14 bis 18 Tagen Schwangerschaft wurden entnommen und in eisgekühlte "Hanks Balanced Salt Solution"-Lösung (nachstehend "HBSS" genannt) getaucht.
(b) Aus den Gehirnen in der eisgekühlten HBSS-Lösung wurden Sehrinden heraus geschnitten und in eine "Eagle's minimum essential medium"-Flüssigkeit (nachstehend "MEM" genannt) übertragen.
(c) In der MEM-Flüssigkeit wurden die Sehrinden in möglichst kleine Stücke geschnitten, maximal 0,2 mm im Quadrat.
(d) Die in kleine Stücke geschnittenen Sehrinden wurden in Zentrifugenröhrchen (Teströhrchen für Zentrifugentrennung) gegeben und nach dreimaligem Waschen mit kalzium- und magnesiumfreier HBSS-Lösung (nachstehend "CMF-HBSS" genannt) wurden sie in einem geeigneten Volumen der gleichen Flüssigkeit dispergiert.
(e) In die Zentrifugenröhrchen von Schritt (d) wurde eine CMF-HBSS-Lösung von Trypsin (0,25 Gew.-%) hinzu gegeben, um das Gesamtvolumen zu verdoppeln. Mit sanftem Rühren wurde ein Ablaufen enzymatischer Prozesse ermöglicht, während die Lösung bei 37°C für 15 bis 20 Minuten inkubiert wurde.
(f) DMEM/F-12-Gemischmedium, in welchem "Dulbecco modified Eagle's"-Medium (DMEM) und HamF-12-Medium in einem Volumenverhältnis von 1:1 gemischt waren, wurde in das Zentrifugenröhrchen, das Schritt (e) ausgesetzt war, hinzu gegeben, um das Gesamtvolumen weiter zu verdoppeln. Durch sanftes wiederholtes Pipettieren (ungefähr 20 Mal maximal) mit einer Pasteur-Pipette, die einen reduzierten Durchmesser hatte, der durch Feuerpolitur der Spitze mit einem Brenner hergestellt worden war, wurden die Zellen entwirrt.
(g) Zentrifugieren wurde für ungefähr 5 Minuten bei 9806,65 m/sek² (das heißt, 1000 g) durchgeführt. Nach Beendigung der Zentrifugation wurde der Überstand weggeschüttet und das Präzipitat wurde in einem DMEM/F-12-Gemischmedium, das 5% FCS enthielt, suspendiert.
(h) Schritt (g) wurde noch zwei Mal wiederholt (insgesamt 3 Mal).
(i) Das letztendlich gewonnene Präzipitat wurde in dem DMEM/F-12-Gemischmedium, das 5% FCS enthielt, suspendiert und unter Verwendung eines Erythrocytometers wurde die Konzentration der Zellen in der Suspensionsflüssigkeit gemessen. Unter Verwendung des gleichen Mediums wurde die Konzentration der Zellen auf 1 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ Zellen/mL eingestellt.
(j) In eine Zellkulturkammer, die durch Anbringen eines Kunststoffzylinders eines Durchmessers von 25 mm und einer Höhe von 6 mm an der flachen Elektrode hergestellt wurde, wobei die Mitte der flachen Elektrode mit der Mitte des Kunststoffzylinders ausgerichtet war, wurden vorab 500 μL des DMEM/F-12-Gemischmediums, das 5% FCS enthielt, gegeben und in einem CO₂-Inkubator (Luftgehalt: 95 Vol.-%; CO₂-Gehalt: 5 Vol.-%; relative Feuchtigkeit: 97%; Temperatur: 37°C) erhitzt.
(k) In die Kammer von Schritt (j) wurden 100 μL der Suspensionsflüssigkeit mit der eingestellten Zellkonzentration sanft hinzugefügt und wiederum in dem CO₂-Inkubator stehen gelassen.
(l) Drei Tage nach Ausführung des Schritts (k) wurde eine Hälfte des Mediums durch ein neues ersetzt. Für das ersetzte Medium wurde das DMEM/F-12-Gemischmedium, das kein FCS enthielt, verwendet.
(m) Danach wurde die Hälfte des Mediums alle 4 bis 5 Tage auf gleiche Weise ersetzt.

Über die Reihe dieser Schritte hinweg wurden Nervenzellen aus der Sehrinde von Rattengehirnen auf den flachen Elektroden kultiviert.
Die Zellen wuchsen erfolgreich, sogar auf der isolierenden Schicht (NPI) und sogar auf den mit Gold bedampften Elektroden. Folglich ermöglichte die Verwendung der Elektroden, die für die Stimulationselektroden oder Aufzeichnungselektroden geeignet angeordnet waren, die Messung der elektrischen Aktivitäten von Nervenzellen gleichzeitig an mehren Punkten.
4 und 5 zeigen Beispiele für elektrische Antworten (Potentialänderungen) von Nervenzellen an den an geeigneten Stellen angeordneten Elektroden, aufgezeichnet bevor und nachdem eine Woche lang über die Elektroden, die in der erfindungsgemäßen flachen Elektrode geeignet angeordnet waren, eine Stimulierung mit einem konstanten Strom von 100 μA bei einer Frequenz von 1 Hz bereitgestellt wurde. 4 zeigt die elektrischen Antworten der Nervenzellen vor einer Stimulation, während 5 die elektrischen Antworten der Nervenzellen nach einer Stimulation zeigt.
Außerdem zeigen 6 und 7 Beispiele für elektrische Antworten von Nervenzellen, aufgezeichnet vor und nach Anwenden einer Langzeitstimulation unter den gleichen Bedingungen wie oben, wobei eine flache Elektrode verwendet wurde, deren Oberfläche nicht mit Gold beschichtet war. 6 zeigt die Aufzeichnungen der elektrischen Antwort von Nervenzellen vor der Stimulation, während 7 die Aufzeichnungen der elektrischen Antwort nach der Stimulation zeigt.
In 4 bis 7 zeigen die Pfeilmarkierungen die Artefakte, die als eine Folge des Anlegens des Stimulationsstroms erzeugt wurden, und die Pfeilspitze zeigt die durch elektrische Aktivitäten von Nervenzellen erzeugte Potentialänderung.
Aus 6 wird deutlich, daß bei Verwendung der flachen Elektrode, deren Oberfläche nicht mit Gold beschichtet ist, die Erzeugung von Artefakten groß ist, während bei der Verwendung der flachen Elektrode einer in 4 gezeigten Ausführungsform der Erfindung die Erzeugung von Artefakten unterdrückt ist.
Aus 7 wird deutlich, daß, wenn die Oberfläche der flachen Elektrode nicht mit Gold beschichtet ist, die Erzeugung von Artefakten nach der Stimulation größer ist als vorher; die elektrischen Aktivitäten der Nervenzellen sind durch die Artefakte verborgen und eine Messung ist nicht möglich. Wenn dagegen die flache Elektrode einer Ausführungsform der Erfindung, wie in 5 gezeigt, verwendet wird, ist ebenso wie in dem in 4 gezeigten Fall die Erzeugung von Artefakten unterdrückt und die elektrischen Aktivitäten der Nervenzellen werden erfolgreich aufgezeichnet.
Es gibt viele andere Verfahren als die oben beschriebenen für die Kultur von Nervenzellen auf der erfindungsgemäßen flachen Elektrode.
Die Erfindung kann in anderen speziellen Ausführungen verwirklicht werden. Die offenbarten Ausführungsformen sind in jeder Hinsicht als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung aufzufassen, wobei der Bereich der Erfindung eher durch die angefügten Ansprüche als durch die vorstehende Beschreibung gekennzeichnet ist und alle Änderungen, die dem Sinn und der Bedeutung nach im Bereich der Ansprüche liegen, sollen darin eingeschlossen sein.

Claims

Flache Elektrode mit einer Anordnung, die aufweist: a) ein isolierendes Substrat (3), das eine oder mehrere isolierende Schichten aufweist; b) eine oder mehrere mit Muster versehene leitende Schichten (1, 2) auf dem Substrat (3), was mehrere fast radial angebrachte schmale leitenden Streifen erzeugt; c) eine mit Muster versehene Isolationsschicht (4) auf den leitenden Schichten (1, 2); wobei eine Kombination aus den schmalen leitenden Streifen und der mit Muster versehenen Isolationsschicht (4) einen oder mehrere nicht-isolierte leitende Abschnitte (5) in jedem schmalen leitenden Streifen als Anschlüsse und einen nicht-isolierten leitenden Abschnitt (5) in jedem schmalen leitenden Streifen als Elektrode mit einer Fläche von 2,5 × 10³ μm² erzeugt; und eine Kammer für eine Zellkultur auf der Oberseite der flachen Elektrodenanordnung.
Flache Elektrode nach Anspruch 1, wobei der Abstand zwischen benachbarten Elektroden zwischen 10 und 1000 μm ist.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei die isolierende Schicht, die die Leitungsdrähte bedeckt, über jeder Elektrode Löcher hat und im wesentlichen über die gesamte Oberfläche des isolierenden Substrats hinweg bereitgestellt ist, mit Ausnahme in der Nähe der Kontakte zwischen einer externen Schaltung und den Leitungsdrähten.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei das isolierende Substrat ein transparentes Material aufweist.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Elektroden und die Leitungsdrähte aus einem transparenten Material bestehen.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei sowohl die Elektroden als auch die Leitungsdrähte aus Indiumzinnoxid, Zinnoxid, Cr, Au, Cu, Ni oder Al hergestellt sind.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei die isolierende Schicht ein transparentes Material aufweist.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei die isolierende Schicht aus Polyimidharz, negativem lichtempfindlichem Polyimidharz, Epoxyharz, Acrylatharz, Polyesterharz oder Polyamidharz hergestellt ist.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Oberflächenwiderstand der Elektrode 10 Ω/cm² oder weniger ist.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Oberflächen der Elektroden mit Platin, Platinschwarz oder Gold bedeckt sind.
Flache Elektrode nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Mittelpunkt einer Elektrode auf einem Schnittpunkt eines 8 × 8-Gitters angeordnet ist.
Flache Elektrode nach Anspruch 3, wobei das isolierende Substrat und/oder die Elektroden und/oder die Leitungsdrähte und/oder die isolierende Schicht aus einem transparenten Material hergestellt ist.
Flache Elektrode nach Anspruch 12, wobei die Elektroden und/oder die Leitungsdrähte aus Indiumzinnoxid, Zinnoxid, Cr, Au, Cu, Ni oder Al hergestellt sind.
Flache Elektrode nach Anspruch 12, wobei die isolierende Schicht aus Polyimidharz, negativem lichtempfindlichem Polyimidharz, Epoxyharz, Acrylatharz, Polyesterharz oder Polyamidharz hergestellt ist.
Flache Elektrode nach Anspruch 3, wobei die Oberflächen der Elektroden mit Platin, Platinschwarz oder Gold überzogen sind.
Flache Elektrode nach Anspruch 3, wobei der Mittelpunkt jeder Elektrode auf einem Schnittpunkt eines 8 × 8-Gitters angeordnet ist.
Verwendung einer flachen Elektrodenanordnung nach einem der vorstehenden Ansprüche, zum Erfassen und/oder Erzeugen einer Signalwellenform einer elektrischen Aktivität in einem biologischen Gewebe oder einer Zelle.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das biologische Gewebe und die Zellen dem Nervensystem entnommen sind.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei die elektrische Aktivität vor und nach einer langen Stimulation vorzugsweise von mehr als einer Woche verglichen wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei an einer bestimmten Elektrode dem biologischen Gewebe oder den Zellen ein Stimulationsstrom zugeführt wird und wobei elektrische Aktivitäten des biologischen Gewebes oder der Zellen, die dem Stimulationsstrom entsprechen, an anderen Elektroden aufgezeichnet werden.