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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft eine impedanzarme Elektrodenanordnung zur Messung
von Zellpotentialen, normalerweise mit einer Anzahl von Mikroelektroden
auf einem isolierenden Substrat und mit einer Wand, die den Bereich
mit den Mikroelektroden einschließt. Die Vorrichtung ist in
der Lage, elektrophysiologische Aktivitäten einer überwachten Probe unter Verwendung
der Mikroelektroden zu messen, während
diese Zellen oder Gewebe im Bereich der Mikroelektroden kultiviert
werden. Die Erfindung nutzt unabhängige Referenzelektroden, um
die Impedanz des Gesamtsystems zu verringern und dadurch das Rauschen
zu verringern, das den Meßdaten
häufig
eigen ist. Optimal sind die Mikroelektroden von einer physischen
Wand umschlossen, die zur Steuerung der Atmosphäre um die überwachte Probe verwendet wird.
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Hintergrund der Erfindung
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Vorrichtungen
zur Messung von Zellpotentialen sind bisher entwickelt worden, um
die Aktivität oder
das elektrische Potential, das durch eine Aktivität von Nervenzellen,
anderen Zellen oder Geweben entsteht, zu messen (z. B. in der japanische
Patentschrift Kokai 8-62 209), ohne Glaselektroden oder dergleichen
in die Zellen einzuführen.
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Die
Messung eines Zellpotentials durch Einfügen einer Glaselektrode oder
dergleichen in die Zelle kann diese Zelle zerstören. Eine Langzeitmessung des
Zellpotentials ist sehr schwierig. Es ist ferner schwierig, mehrere
Positionen gleichzeitig zu messen; es besteht eine Grenze für die Anzahl
der Elektroden, die man in einer Meßelektrodenanordnung plazieren
kann, und es ist ebenso schwierig, die Position der Probe über Meßelektroden
angemessen zu bestimmen. Dagegen ermöglicht die Verwendung einer
Elektrode zur Messung von Zellpotentialen mit mehreren Mikroelektroden
auf einem Substrat (mit einer Wand zum Einschließen eines Bereichs mit den Mikroelektroden)
die Kultivierung der Zellen innerhalb des Bereichs, der von der
Wand eingeschlossen ist, und die gleichzeitige Messung des Potentials
von mehreren Positionen, ohne diese Zellen zu zerstören.
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Diese
Vorrichtungen zur Messung von Zellpotentialen messen das Zellpotential
gegen ein Referenzpotential. Eine solche Möglichkeit ist beschrieben in
Hinblick auf Kokai 8-62
209 (zur Patentfamilie von EP-A- 0 689 051 gehörig). Wenn 64 Mikroelektroden
in acht Spalten und acht Reihen angeordnet sind, kann theoretisch
unter Verwendung einer Mikroelektrode als Referenzpotential (d.
h. als eine gemeinsame Referenzelektrode, die mit dem Potential des
Kulturmediums verbunden ist) das Zellpotential der anderen 63 Positionen
gleichzeitig unter Verwendung der verbleibenden 63 Mikroelektroden
gemessen werden.
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Wenn
jedoch sehr niedrige oder Mikropotentiale als Zellpotentiale gemessen
werden, ist Rauschen ein Problem. Der Rauschpegel ändert sich
erheblich in Abhängigkeit
von der Auswahl des Typs und der Lage der Referenzelektrode. Wenn,
wie oben erwähnt,
eine Mikroelektrode als Referenzelektrode verwendet wird, ist eine
gleichzeitige Messung des Potentials bei 63 Positionen unter Verwendung der
63 verbleibenden Mikroelektroden wegen des hohen Rauschpegels unmöglich. Wenn
die Referenzelektroden und die Meßelektroden einander 1:1 entsprechen,
kann das Potential bei einem sehr niedrigen Rauschpegelzustand gemessen
werden. Aber wenn 64 Mikroelektroden verwendet werden, die beispielsweise
32 Referenzelektroden und 32 Meßelektroden
entsprechen, können
nur 32 Positionen gleichzeitig gemessen werden.
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In
der Theorie muß man
jedoch die Anzahl der Referenzelektroden begrenzen, um das Potential an
möglichst
vielen Positionen gleichzeitig zu messen.
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Wie
in 14 von Kokai 8-62 209 gezeigt, werden
acht Mikroelektroden in einer Reihe als Referenzelektroden verwendet,
und sieben Meßelektroden
sind jeweils mit je einer der Referenzelektroden korreliert, so
daß das
Potential gleichzeitig an 7 × 8
= 56 Positionen gemessen werden kann. Wenn 56 Mikroelektroden als
Meßelektroden
verwendet werden, d. h. unter Verwendung von acht Mikroelektroden
in einer Reihe als Referenzelektroden, beträgt der Verlust an Meßstellen
etwa 12% im Vergleich zu dem Fall, wenn alle 64 oder 63 Stück als Meßelektroden verwendet
werden. Selbst wenn sieben Meßelektroden
bei einer Referenzelektrode verwendet werden, ist das Rauschen dennoch
sehr groß.
Es ist sehr schwierig, aus dem Rauschen eine kleine Änderung im
Zellpotential zu detektieren.
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Wenn
außerdem,
wie in 14 von Kokai 8-62 209 gezeigt,
ein Segment S einer Zelle oder eines Gewebes an den mehreren Mikroelektroden
plaziert wird, sollte das Segment S nicht in der Reihe der Mikroelektroden
plaziert werden, die als Referenzelektroden verwendet werden. Eine
solche Plazierung erfordert Geschicklichkeit und ist schwierig,
da das Segment mit einer Pinzette gehalten und bewegt werden muß, während das
Segment unter einem Mikroskop beobachtet wird. Es ist extrem schwierig, das
Segment S so anzuordnen, daß die
acht Mikroelektroden in einer Reihe vollständig freiliegen, während die
verbleibenden 56 Mikroelektroden vollständig vom Segment bedeckt sind.
Wenn das Segment S so angeordnet ist, daß es die acht Mikroelektroden in
einer Reihe vollständig
freilegt, liegen gewöhnlich einige
der verbleibenden 56 frei, und somit verringert sich die Anzahl
der Positionen für
eine gleichzeitige Messung.
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Sensors
and Actuators B, Vol. B24, Nr. 1/03, Teil 1, März 1995, S. 300–303 offenbart
eine Anordnung von Arbeitselektroden mit entsprechenden Referenzelektroden,
die in nächster
Nähe zu
den Arbeitselektroden positioniert sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung soll diese Probleme lösen.
Die Erfindung stellt eine Elektrode zur Messung von Zellpotentialen
bereit, die gegen Rauschen weniger anfällig und dennoch in der Lage
ist, das Potential an vielen Positionen durch effektive Nutzung
aller verfügbaren
Mikroelektroden gleichzeitig zu messen, wenn die Positionierung
nicht sehr genau ist, wenn das zu messende Zell- oder Gewebesegment
angeordnet wird.
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Die
erfindungsgemäße Zellpotentialmeßelektrode
weist vorzugsweise auf: mehrere Mikroelektroden auf einem isolierenden
Substrat, eine Leiterstruktur zum Verbinden der Mikroelektroden
mit einem bestimmten Bereich außerhalb
der Mikroelektrodenfläche,
elektrische Kontakte, die mit dem Ende der Leiterstruktur verbunden
sind, einen Isolierfilm, der die Oberfläche der Leiterstruktur überzieht,
und eine Wand, die den Bereich mit den Mikroelektroden auf der Oberfläche des
Isolierfilms einschließt.
Die erfindungsgemäßen Referenzelektroden
haben eine vergleichsweise niedrigere Impedanz als die Impedanz
der Meßmikroelektroden.
Sie sind jeweils an mehreren Positionen in dem Bereich, der von
der Wand eingeschlossen ist, angeordnet und häufig in einem spezifischen
Abstand von den Mikroelektroden. Die elektrischen Kontakte sind
ferner normalerweise zwischen die Leiterstruktur zur Verdrahtung
jeder Referenzelektrode und das Ende der Leiterstruktur geschaltet.
Die Oberfläche
der Leiterstruktur zur Verdrahtung der Referenzelektroden ist normalerweise
mit einem Isolierfilm überzogen.
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Da
erfindungsgemäß an mehreren
Positionen exklusive Referenzelektroden vorgesehen sind, die von
dem Bereich mit den mehreren Meßelektroden
entfernt sind, ist es einfach, das Zellprobensegment so anzuordnen,
daß alle
Mikroelektroden überzogen
sind, während
kein Kontakt zu den Referenzelektroden besteht. Die Referenzelektrode
hätte normalerweise
zum Beispiel eine größere Fläche als eine
Meßmikroelektrode
und hat somit eine kleinere Impedanz. Daher ist der Rauschpegel
klein, auch wenn sie gemeinsam mit mehreren Referenzpotentialen
verbunden ist, um Meßpositionen
zu bilden. Gemeinsame Referenzelektroden können daher mit mehreren Meßmikroelektroden
verwendet werden. Da jede der mehreren Referenzelektroden für mehrere
Meßmikroelektroden
zuständig
ist, können
die Zellpotentiale außerdem
ohne weiteres gleichzeitig unter Verwendung aller Mikroelektroden
gemessen werden.
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Vorzugsweise
sind die mehreren Referenzelektroden in nahezu gleichen Entfernungen
vom Bereich der mehreren Mikro elektroden und in Intervallen von
nahezu gleichem Winkel angeordnet. Unter "Intervallen von nahezu gleichem Winkel" verstehen wir, daß, wenn
der Bereich der mehreren Mikroelektroden von oben gesehen wird,
die mehreren Referenzelektroden sich in gleichwinkligen Strahlen
von dem Bereich erstrecken. Besonders bevorzugt sind die mehreren
Mikroelektroden in einer rechteckigen Matrix angeordnet, und vier
der Referenzelektroden sind an einer Verlängerung von Diagonalen des
Bereichs vorgesehen, der diese rechteckige Matrix hält. In einer
solchen symmetrischen Plazierung wird der Rauschpegel jeder Mikroelektrode
Bemittelt.
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Als
spezifisches Beispiel befinden sich die Mikroelektroden in einer
Matrixanordnung in einem Rechteck mit Seiten von beispielsweise
0,8 bis 2,2 mm (bei einem Mikroelektrodenrastermaß von 300 μm) oder 0,8
bis 3,3 mm (bei einem Mikroelektrodenrastermaß von 450 μm). Vier Referenzelektroden
befinden sich an vier Ecken eines Rechtecks von 5 bis 15 mm auf
einer Seite. Besonders bevorzugt sind 64 Mikroelektroden in acht
Reihen und acht Spalten mit mittigen Rastermaßen von etwa 100 bis 450 μm, vorzugsweise
100 bis 300 μm,
angeordnet.
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Um
die Impedanz der Referenzelektroden so einzustellen, daß sie ausreichend
kleiner ist als die Impedanz der Mikroelektroden, beträgt die Fläche der
Referenzelektroden vorzugsweise das 4- bis 25fache (besonders bevorzugt
das 16fache) der Fläche
der Mikroelektroden. Als spezifisches Beispiel beträgt die Fläche jeder
der Mikroelektroden vorzugsweise zwischen etwa 4 × 102 und 4 × 104 μm2, und die Fläche jeder der Referenzelektroden
beträgt vorzugsweise
zwischen etwa 64 × 102 und 64 × 104 μm2.
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Vorzugsweise
bestehen die Mikroelektroden und die Referenzelektroden aus dem
gleichen Material, um den Herstellungsprozeß zu vereinfachen und einen
Kostenvorteil zu erlangen. Vorzugsweise sind die Mikroelektroden
und die Referenzelektroden aus Nickelplattierungs-, Goldplattierungs-
und Platinmohrschichten auf einem Indium-Zinnoxid-(ITO-)Film ausgebildet.
Nach der Platinierung beträgt
die Impedanz der Referenzelektroden vorzugsweise zwischen 2 und
3 kΩ.
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Das
isolierende Substrat (z. B. ein Glassubstrat) kann nahezu quadratisch
sein. Mehrere elektrische Kontakte können mit dem Ende der Leiterstruktur
verbunden und vorzugsweise an den vier Seiten des isolierenden Substrats
angeordnet sein. Infolgedessen ist der Entwurf der Leitungsstrukturen
mehrerer Mikroelektroden und Referenzelektroden einfach. Da die
Rastermaße
der elektrischen Kontakte relativ groß ausgeführt sein können, ist die elektrische Verbindung über die
elektrischen Kontakte mit externen Einheiten auch einfach.
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Der
Mikroelektrodenbereich ist normalerweise sehr klein. Wenn man die
Probe unter einem Mikroskop beobachtet, ist es schwer, eine Position
und vertikale und seitliche Richtungen zu unterscheiden. Es ist
erwünscht,
kennzeichnende Mikromarkierungen nahe dem Mikroelektrodenbereich
anzuordnen, um eine optische Erkennung unter dem Mikroskop unter
Variierung der Richtungen, Achsen und Position zu ermöglichen.
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Die
besonders bevorzugte erfindungsgemäße Zellpotentialmeßvorrichtung
besteht aus einer Zellplazierungsvorrichtung mit Zellpotentialmeßelektroden,
Kontaktstellen zur Kontaktherstellung mit einem elektrischen Kontakt
und einem Elektrodenhalter zur Fixierung des isolierenden Substrats
durch sandwichartige Anordnung von oben und unten. In einer Variante
der Erfindung kann ein Signalprozessor nahe der Mikroelektrodenmatrix
oder dem Mikroelektrodenbereich angeordnet sein. Die Zellpotentialmeßelektroden
können
elektrisch mit der Zellplazierungsvorrichtung verbunden sein, um
eine Verarbeitung der Spannungssignale zu ermöglichen, die durch die Probe
erzeugt werden und zwischen jeweiliger solcher Mikroelektrode und
Referenzelektroden gemessen werden. Die Zellpotentialmeßanordnung weist
normalerweise einen von einer Wand eingeschlossenen Bereich zur
Kultivierung von Probenzellen oder -geweben auf. Sie weist auch
vorzugsweise eine optische Vorrichtung zur Vergrößerung und optischen Beobachtung
der Zellen oder Gewebe auf, die in dem von der Wand eingeschlossen
Bereich kultiviert werden. Diese Zellpotentialmeßvorrichtung weist ferner vorzugsweise
eine Bildspeichervorrichtung zur Speicherung des von der optischen
Vorrichtung gewonnenen vergrößerten Bildes
auf.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein Blockschaltbild, das eine Gesamtstruktur einer erfindungsgemäßen Zellpotentialmeßvorrichtung
zeigt.
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2 ist
eine auseinandergezogene Ansicht einer Zellplazierungsvorrichtung
mit der erfindungsgemäßen Zellpotentialmeßelektrode.
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3 ist
eine Teildraufsicht, die ein Beispiel von Mikroelektroden im Mittelteil
der Zellpotentialmeßvorrichtung
und eine Leiterstruktur zu ihrer Verdrahtung zeigt.
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4 ist
eine Draufsicht, die eine Gesamtstruktur einer Zellpotentialmeßelektrode
zeigt.
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5 ist
eine schematische Darstellung eines Teils einer Zellpotentialmeßelektrode.
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6 ist eine Draufsicht und eine Seitenschnittansicht,
die einen Zustand der Fixierung der Zellpotentialmeßelektrode
durch sandwichartige Anordnung mit oberen und unteren Haltern zeigen.
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7 ist
eine perspektivische Ansicht der Zellpotentialmeßelektrode und des oberen und
unteren Halters aus 6.
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8 ist
eine Seitenansicht von Kontaktmetallverbindungsstücken, die
im oberen Halter vorgesehen sind.
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9 ist
ein Wellenformdiagramm, das einen Rauschpegel bei 50 μm2 großen
Referenzelektroden zeigt, die in der Zellpotentialmeßelektrode
vorgesehen sind.
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10 ist
ein Wellenformdiagramm, das einen Rauschpegel bei 200 μm2 großen
Referenzelektroden zeigt, die in der Zellpotentialmeßelektrode vorgesehen
sind.
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11 ist
ein Diagramm, das die zentralen sieben Meßstellen innerhalb des Meßbereichs
der Zellpotentialmeßelektrode
zeigt.
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12 ist
ein Blockschaltbild, das ein Beispiel eines Zellpotentialmeßverfahrens
unter Verwendung einer herkömmlichen
Zellpotentialmeßelektrode
zeigt.
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Beschreibung
der Erfindung
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1 zeigt
ein typisches Beispiel einer gesamten Zellpotentialmeßvorrichtung,
die eine Zellpotentialmeßelektro de
und eine Referenzelektrode verwendet, die erfindungsgemäß hergestellt
sind. Diese Zellpotentialmeßvorrichtung
weist auf: eine integrierte Zellplazierungsvorrichtung 1,
die die erfindungsgemäße Zellpotentialmeßelektrode
enthält,
eine optische Beobachtungsvorrichtung 20 mit einem umgekehrten
Mikroskop 21 zur optischen Messung der in der Zellplazierungsvorrichtung 1 plazierten
Probe oder Zellen, einen Computer 30 zur Verabreichung eines
Stimulussignals an die Zellen und zur Verarbeitung des Ausgangssignals
der Zellen und ein Zellkultursystem 40 zur Aufrechterhaltung
einer Kulturatmosphäre
um die Probe herum.
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Zusätzlich zu
dem umgekehrten Mikroskop 21, auf dem die Zellplazierungsvorrichtung 1 angeordnet
ist, kann die optische Beobachtungsvorrichtung 20 auch
eine SIT-Kamera 22 für
das Mikroskop 21, eine hochauflösende Anzeige 23 und
eine Bildspeichervorrichtung 24 aufweisen. Die hochauflösende Anzeige 23 kann
auch als Anzeige für
den Computer 30 verwendet werden.
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Der
Computer 30 ist normalerweise ein Personalcomputer (PC),
in dem Meßsoftware
installiert ist. Der Computer 30 und die Zellplazierungsvorrichtung 1 sind über eine
E/A-Karte zur Messung verbunden. Die E/A-Karte weist einen A/D-Umsetzer 31 und einen
D/A-Umsetzer 32 auf. Der A/D-Umsetzer 31 dient
normalerweise zum Messen und Umsetzen der resultierenden Potentiale;
der D/A-Umsetzer 32 ist bestimmt für Stimulussignale an die Probe.
Beispielsweise hat der A/D-Umsetzer 31 16 Bit und 64 Kanäle und der
D/A-Umsetzer 32 hat 16 Bit und 8 Kanäle.
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Die
im Computer 30 installierte Meßsoftware kann Software zum
Einstellen von Bedingungen zur Verabreichung eines Stimulussignals,
zur Bildung des Stimulussignals und zum Aufzeichnen des gewonnenen
Detektionssignals aufweisen. Unter Verwendung einer solchen Meßsoftware
kann der Computer 30 eine Einrichtung zum Verabreichen
eines Stimulussignals an die Zellen und eine Einrichtung zum Verarbeiten
des von den Zellen detektierten Signals aufweisen. Der Computer 30 kann
auch die optische Beobachtungsvorrichtung (SIT-Kamera und Bildspeichervorrichtung)
und das Zellkultursystem steuern.
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Ein Überblick über die
Funktionalität
der erwünschten
Meßsoftware
wird nachstehend bildschirmweise beschrieben.
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Auf
einem Parametereinstellbildschirm können komplizierte Stimulusbedingungen
durch Zeichnen einer Stimuluswellenform auf dem Bildschirm unter
Verwendung einer Tastatur oder einer Maus eingestellt werden. Wenn
die Einstellung einer Aufzeichnungsbedingung 64 Eingangskanälen und
einer Abtastrate von 10 kHz entspricht, kann der Computer eine nachfolgende
Aufzeichnung für
mehrere Stunden durchführen.
Außerdem
können
Elektroden zur Verabreichung eines Stimulussignals und Elektroden zur
Aufnahme des Detektionssignals von den Zellen dadurch gewählt werden,
daß die
auf dem Bildschirm angezeigten Mikroskopbilder mittels der Maus
oder des Computer-Stifts ausgesucht werden. Die Temperatur, der
pH und andere Bedingungen des Zellkultursystems 40 werden
vorzugsweise über
die Tastatur eingestellt.
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Auf
einem Aufzeichnungsbildschirm kann das Spontanaktivitätspotential
oder das induzierte Potential, das an den Zellen detektiert wird,
in Echtzeit angezeigt werden. Daneben können die aufgezeichnete Spontanaktivität, das Potential
oder das induzierte Potential durch Überlagerung mit dem Mikroskopbild
der Zelle angezeigt werden. Wenn das induzierte Potential gemessen
wird, wird die gesamte aufgezeichnete Wellenform angezeigt. Wenn
das Spontanaktivitätspotential
gemessen wird, durch die Impulsspitzendetektionsfunktion unter Verwendung eines
Fensterdiskriminators oder Wellenformdiskriminators, wird die aufgezeichnete
Wellenform nur dann angezeigt, wenn die Erzeugung von Spontanaktivität detektiert
wird. Zusammen mit der Anzeige der aufgezeichneten Wellenform können Meßparameter
(z. B. Stimulusbedingung, Aufzeichnungsbedingungen, Temperatur,
pH usw.) auch in Echtzeit angezeigt werden. Eine Alarmfunktion ist
vorgesehen zur Warnung, wenn die Temperatur oder der pH den zulässigen Bereich
verläßt.
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Was
die Datenanalyse oder -verarbeitung betrifft, so sind die Fourier-Funktionstransformations-(FFT-)Analyse,
Kohärenzanalyse
und Korrelationsanalyse auch erwünscht.
Verwendbare Funktionen können
u. a. sein: Einzelimpulsspitzentrennfunktion unter Verwendung einer
Wellenformunterscheidung, Zeitprofilanzeigefunktion, Topographieanzeigefunktion
und Stromquellendichteanalysefunktion. Die Analyseergebnisse können ange zeigt
werden durch Überlagerung
mit den in der Bildspeichervorrichtung gespeicherten Mikroskopbildern.
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Wenn
ein Stimulussignal vom Computer 30 ausgegeben wird, wird
dieses Stimulussignal über den
D/A-Umsetzer 32 und ein Trennglied 33 an die Zellplazierungsvorrichtung
gesendet. Die Zellplazierungsvorrichtung 1 weist eine Zellpotentialmeßelektrode
auf, die, wie später
beschrieben wird, aus 64 Mikroelektroden auf einem Glassubstrat
in einer Matrixform bestehen kann und eine Umschließungswand,
damit die Probe (z. B. Segmente von Zellen oder Geweben) mit den
Mikroelektroden und ihrem Kulturfluid in Kontakt gehalten werden
kann. Das an die Zellplazierungsvorrichtung 1 gesendete
Stimulussignal wird an beliebige Elektroden von den 64 Mikroelektroden
und dann an die Probe oder Proben angelegt.
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Das
induzierte, evozierte oder spontane Potential, das zwischen jeder
Mikroelektrode und dem Referenzpotential auftritt (das dem Potential
des Kulturfluids entspricht), wird über einen hochempfindlichen
Verstärker 34 mit
64 Kanälen
und den A/D-Umsetzer 31 in den Computer 30 übergeben.
Der Verstärkungsfaktor
des Verstärkers 34 kann
z. B. in einem Frequenzband von etwa 0,1 bis 10 kHz oder bis 20
Hz beispielsweise etwa 80 bis 100 dB sein. Wenn man jedoch das Potential
mißt,
das von einem Stimulussignal induziert wird, dann ist bei Verwendung
eines Tiefenabsenkungsfilters das Frequenzband 100 Hz bis 10 kHz.
Spontane Potentiale sind gewöhnlich im
Bereich von 100 Hz bis 20 Hz.
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Das
Zellkultursystem 40 weist normalerweise einen Temperaturregler 41,
eine Kulturfluidzirkulationsvorrichtung 42 und eine Zuführeinrichtung 43 zum
Zuführen
beispielsweise eines Mischgases aus Luft und Kohlendioxid auf. Das
Zellkultursystem 40 kann statt dessen aus einem handelsüblichen
Mikroinkubator, einem Temperaturregler und einem CO2-Zylinder
bestehen. Der Mikroinkubator kann verwendet werden, um einen Temperaturbereich
von 0 bis 50 °C
mittels eines Peltier-Elements zu steuern, und ist auf eine Flüssigkeitszuführungsrate
von 3,0 ml/min oder weniger und eine Gasdurchflußrate von 1 l/min oder weniger
anwendbar. Oder es kann ein Mikroinkubator mit einem Temperaturregler
verwendet werden.
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Die
Struktur der Zellplazierungsvorrichtung 1 (in 1 gezeigt)
wird ausführlicher
mit Bezug auf die in 2 gezeigte auseinandergezogene
Ansicht beschrieben. Die bevorzugte Zellplazierungsvorrichtung 1 kann
bestehen aus: einer Zellpotentialmeßelektrode (auch als integrierte
Mehrfachelektrode oder Mikroelektrodenanordnung bezeichnet) 2 mit
einer zylindrischen Wand 6, die auf einem transparenten Glassubstrat
vorgesehen ist und mehrere Mikroelektroden in ihrem Innenbereich
hat, Haltern 3, 4, die in zwei Abschnitte zur
Fixierung der Zellpotentialmeßelektrode 2 durch
sandwichartige Anordnung von oben und unten geteilt sind, und einer
gedruckten Leiterplatte 5 zum Fixieren der Halter.
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3 zeigt
die Einzelheiten des Glassubstrats. Die Größe des Glassubstrats zur Bildung
der Zellpotentialmeßelektrode
(integrierte Mehrfachelektrode) 2 kann eine Dicke von 1,1
mm und eine Größe von etwa
50 mm2 haben. Im Mittelteil des Glassubstrats
sind 64 Mikroelektroden 11 in einer Matrixform von 8 × 8 ausgebildet.
Die Mikroelektroden sind gegeneinander und gegen die Referenzelektroden
isoliert. Eine Leiterstruktur 12 zur Verdrahtung ist mit
jeder Mikroelektrode 11 verbunden. Die Mikroelektrode 11 kann
etwa 50 μm2 groß sein
und der Abstand zwischen den Mittelpunkten angrenzender Elektroden ist
etwa 150 μm.
Die dargestellten 64 Mikroelektroden 11 sind daher in einer
Matrix von 8 × 8
dargestellt, eine Seite des ausgebildeten rechteckigen Bereichs
ist etwa 1,1 mm.
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Obwohl
die Beschreibung der Erfindung viele spezifische Angaben zu bestimmten
Größen und Flächen enthält, ist
die Erfindung nicht darauf beschränkt; diese sind lediglich als
Richtwerte zu verstehen und sind nicht entscheidend für die Erfindung, wenn
dies nicht ausdrücklich
angegeben ist.
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Außerdem sind,
wie in 4 gezeigt, Referenzelektroden 10 an vier
Positionen auf Linien ausgebildet, die sich von Diagonalen des rechteckigen Bereichs
im Mittelteil des Glassubstrats erstrecken, in dem die Mikroelektroden
angeordnet sind. Die Referenzelektroden sind gegeneinander und gegen
die Mikroelektroden isoliert. Diese Referenzelektroden 10 sind
auch mit den elektrischen Kontakten 7, die an vier Seiten
des Glassubstrats angeordnet sind, durch die Leiterstruktur 12 zur Verdrahtung
verbunden wie die Mikroelektroden 11. Die Referenzelektroden 10 sind
in dem gleichen Prozeß wie
die Mikroelektroden 11 hergestellt, wie nachstehend ausgeführt, aber
ihre Größe ist im
allgemeinen erheblich größer als
die der Mikroelektroden 11, die beispielsweise ein Rechteck von
etwa 200 μm
Seitenlänge
bilden. Daher ist die rechteckige Fläche im Vergleich zu einer der
50 μm2 großen
Mikroelektroden 11 größer, vorzugsweise etwa
16mal größer, und
bei diesem Verhältnis
ist die Impedanz der Referenzelektroden 10 kleiner als
die Impedanz der Mikroelektroden 11.
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Die
Positionen der Referenzelektroden 10 sind vorzugsweise
auf Linien, die sich von den Diagonalen des rechtwinkligen Bereichs
im Mittelteil des Glassubstrats erstrecken, in dem die Mikroelektroden 11 angeordnet
sind. Die Referenzelektroden 10 in dieser Variante befinden
sich etwa 6 mm von der Mitte des rechteckigen Bereichs. Das heißt, sie
sind an vier Ecken eines Quadrats von etwa 8,5 mm Seitenlänge angeordnet.
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Außerdem befinden
sich, wie in 4 gezeigt, auf jeder der vier
Seiten des Glassubstrats 17 elektrische Kontakte 7.
Diese elektrischen Kontakte 7 sind (einzeln) an jeder der
64 Mikroelektroden 11 und vier Referenzelektroden 10 über die
Leiterstruktur 12 angebracht. Das Rastermaß der 17
elektrischen Kontakte ist vorzugsweise vom Rastermaß 1,27 mm des
universellen Verbinders beabstandet. Der Herstellungsprozeß dieser
integrierten Mehrfachelektrode 2 ist nachstehend mit Bezug
auf die Schnittansicht in 5 beschrieben.
Die Darstellung in 5 ist zum besseren Verständnis nicht
maßstabsgetreu.
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Auf
die Oberfläche
eines Glassubstrats 13 wird ein ITO(Indium-Zinnoxid-)Film
in einer Dicke von 150 nm aufgebracht, und eine Leiterstruktur 12 wird mittels
Photoresist und Ätzung
ausgebildet. Ein negativer lichtempfindlicher Polyimidfilm von etwa
1,4 μm Dicke
wird darauf aufgebracht, und ein Isolierfilm 14 wird ausgebildet.
Auf Abschnitten der Mikroelektroden 11 (oder als Alternative
der Referenzelektroden 10) und der elektrischen Kontakte 7 wird
der ITO-Film belichtet, und eine Nickelplattierung 15 von 500
nm Dicke und eine Goldplattierung 16 von 50 nm Dicke werden
dann aufgebracht.
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Ein
Polystyren- oder Glaszylinderteil 6, das einer Wand mit
etwa 22 mm Innendurchmesser, etwa 25 mm Außendurchmesser und 8 mm Höhe entspricht,
kann dann auf dem Mittelteil des Glassubstrats unter Verwendung
eines Silikonklebers angeordnet werden (siehe 2 und 4).
Ein stark bevorzugter Kleber ist ein RTV-(Kaltvulkanisations-)Silikonkautschuk,
insbesondere solche, die ein säurehärtendes
System verwenden. Diese haben wegen der Essigsäure, die während des Härtungsschritts entsteht, einen
niedrigen Toxizitätsgrad.
Zwei geeignete Varianten sind u. a. KE42T (Shin-Etsu-Silikon) und
Silastic Medical Adhesive Silicone Typ A (Dow Corning). Ein zylindrisches
Wandteil 6 ist zwar dargestellt, aber die Wand kann oval
sein, um einen besseren Zugriff auf die Probe zu ermöglichen.
Das Wandteil 6 ist in der Mitte des Glassubstrats befestigt,
d. h. in einem Zustand, der mit dem Mittelteil des rechteckigen
Bereichs ausgerichtet ist, in dem die 64 Mikroelektroden angeordnet
sind. In dem Bereich, der von diesem zylindrischen Teil 6 umgeben
ist, werden die Zellen oder Gewebe kultiviert. Dieses zylindrische Teil 6 ist
beispielsweise mit einer wäßrigen Lösung von
1 Gew.-% Chlorplatinsäure,
0,01 Gew.-% Bleiacetat und 0,0025 Gew.-% Salzsäure gefüllt, und wenn ein Strom von
20 mA/cm2 für eine Minute durchgeleitet
wird, wird Platinmohr 11a (oder als Alternative Referenzelektroden-Platinmohr 10a)
auf den Oberflächen
der Mikroelektroden 11 und der Referenzelektroden 10 abgeschieden.
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Der
Bereich im zylindrischen Teil 6 wird gelegentlich als der "Messungsbereich" bezeichnet, der die
Fläche
umfaßt,
die die Mikroelektroden 11 und die Referenzelektroden 10 einschließt. Es liegt
ferner im Schutzbereich der Erfindung, daß die Referenzelektroden auf
der Innenfläche
des zylindrischen Teils 6 angeordnet sind.
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In
einer Ecke der integrierten Mehrfachelektrode 2 ist eine
Hinweis- oder Pfeilmarkierung 17 vorgesehen, die die Richtung
anzeigt. Diese Pfeilmarkierung 17 kann im gleichen Herstellungsprozeß wie die
Mikroelektroden 11 und die Referenzelektroden 10 hergestellt
werden. Die Oberfläche
ist jedoch lediglich mit Goldplattierung beschichtet, und Platinmohr
wird nicht ausgebildet. Die Länge
und Breite der Pfeilmarkie rung 17 sind beide etwa 5 mm.
Außerdem
ist nahe einer Ecke des rechteckigen Bereichs, wo die Mikroelektroden 11 angeordnet
sind, eine kleine Hinweismarkierung, z. B. eine Mikromarkierung 18, ähnlich der
Pfeilmarkierung vorgesehen. Diese Mikromarkierung 18 ist
nicht mit bloßem
Auge erkennbar, aber das gleiche Muster wie die Pfeilmarkierung 17 ist
in einer vergrößerten Ansicht
durch eine optische Beobachtungsvorrichtung der Meßvorrichtung
zu erkennen, so daß die
Richtung, Position, Achsen usw. identifiziert werden können. Wie
die Pfeilmarkierung 17 kann die Mikromarkierung 18 auch
im gleichen Herstellungsprozeß wie
die Mikroelektroden 11 und die Referenzelektroden 10 hergestellt
werden.
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In 2 ist
die integrierte Mehrfachelektrode 2 sandwichartig zwischen
Haltern 3, 4 angeordnet. Eine elektrische Verbindung
ist genauso ausgeführt. Die
Halter 3, 4 sind normalerweise aus Polymer. Der Stufenabschnitt
wird verwendet, um den Rand der integrierten Mehrfachelektrode 2 zu
halten, und die rechteckigen Öffnungen
sind im Mittelteil ausgebildet. Der obere Halter 3 ist
mit einem Paar Befestigungselementen 8 und mit 17 × 4 Paaren
von Kontaktmetallflächen 9 versehen.
Eine Draufsicht der Halter 3, 4, die die integrierte
Mehrfachelektrode 2 sandwichartig einschließen und
fixieren, ist in 6(A), ihre Seitenansicht
(Schnitt B-B) in 6(B) und ihre perspektivische
Hinteransicht in 7 gezeigt. Wie aus diesen Darstellungen
hervorgeht, ist das Befestigungselement 8 auf Wellenzapfen 8a auf
zwei gegenüberliegenden
Seiten des oberen Halters 3 gelagert und dreht sich um
diese. Wie in 7 gezeigt, sind Nuten 4a an
zwei gegenüberliegenden
Seiten der Rückseite
des unteren Halters 4 ausgebildet. Vorsprünge 8b des
Befestigungselements 8 sind in Nuten 4a eingefügt, und
die oberen und unteren Halter 3, 4 sind fest in
einem Zustand des sandwichartigen Haltens der integrierten Mehrfachelektrode 2 angeordnet.
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Insgesamt 68 Kontaktmetallverbindungsstücke 9,
die am oberen Halter 3 vorgesehen sind, um den elektrischen
Kontakten 7 der integrierten Mehrfachelektrode 2 zu
entsprechen, können
durch Verarbeitung elastischer und leitender Metallplatten, z. B. eine
Be/Cu-Federlegierung, die mit Ni und Au plattiert ist, ausgebildet
sein. Die Metallverbindungsstücke 9 haben
eine Schnittfläche,
wie in 8 gezeigt. Das heißt, sie bestehen aus einem
Zapfen 9a, seinem Basisteil 9b und einem beweglichen
Kontaktteil 9d, das sich vom Basisteil 9b über ein
gekrümmtes
Teil 9c erstreckt. Bei einer solchen Struktur kann das
bewegliche Kontaktteil 9d elastisch vom Basisteil 9b weg verschoben
werden. Im oberen Halter 3 sind Löcher zum Einfügen des
Zapfens 9a des Kontaktmetallverbindungsstücks 9 und
Nuten zum Einfügen
des Basisteils 9b in 68 (17 × 4) Positionen ausgebildet.
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Wenn,
wie in 2 und 6(B) gezeigt, das
Kontaktmetallverbindungsstück 9 in
das Loch und die Nut eingefügt
und darin fixiert ist, steht der Zapfen 9a vom oberen Halter 3 vor.
Von den Kontaktmetallverbindungsstücken 9 gibt es zwei
Typen, die sich in der Länge
des Basisteils 9b unterscheiden. Die zwei Größen aufweisenden
Verbindungsstücke 9 sind
abwechselnd angeordnet, 16 Zapfen 9a, die vom
oberen Halter 3 vorstehen, sind in zwei Zickzack-Reihen
angeordnet. Wie später
beschrieben wird, sind diese Zapfen 9a mit den Verbindern
verbunden, die auf der gedruckten Leiterplatte 5 zur Verbindung
mit der Außenwelt
angeordnet sind.
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Das
bewegliche Kontaktteil 9d des Kontaktmetallverbindungsstücks 9 steht
von der unteren Seite des oberen Halters 3 vor, wenn das
Kontaktmetallverbindungsstück 9 in
das Loch und die Nut des oberen Halters 3 eingefügt und darin
befestigt wird. Wenn die Halter 3, 4 auf beiden
Seiten der integrierten Mehrfachelektrode 2 fixiert sind,
tritt das bewegliche Kontaktteil 9d jedes Kontaktmetallverbindungsstücks 9 mit
dem elektrischen Kontakt 7 der integrierten Mehrfachelektrode 2 in
Kontakt, und ein vorgegebener Kontaktdruck wird auf die Kontaktfläche durch elastische
Deformation des gekrümmten
Teils 9c ausgeübt.
Auf diese Weise werden die elektrischen Kontakte 7 zum
Verbinden mit den Mikroelektroden 11 und den Referenzelektroden 10 der
integrierten Mehrfachelektrode 2 über die Leiterstruktur 12 elektrisch
mit einem niedrigen Kontaktwiderstand (30 mΩ oder weniger)
im Vergleich zu dem der Kontaktmetallverbindungsstücke 9 verbunden.
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Wie
oben erwähnt,
werden die Halter 3, 4, die die integrierte Mehrfachelektrode 2 in
einem Zustand des elektrischen Kontakts mit der integrierten Mehrfachelektrode 2 fest
fixieren, mit der gedruckten Leiterplatte 5 elektrisch
verbunden und an ihr befestigt, wie in 2 gezeigt.
Die elektrische Verbindung von den Mikroelektroden 11 und
der Referenzelektrode 10 der integrierten Mehrfachelektrode 2 zur
Leiterstruktur 12, den elektrischen Kontakten 7 und
den Kontaktmetallverbindungsstücken 9 ist
ferner über die
gedruckte Leiterplatte 5 mit der oben erwähnten Zellpotentialmeßvorrichtung
verbunden. Die Handhabung der integrierten Mehrfachelektrode auf
der Meßvorrichtung
wird durch die Verwendung der gedruckten Leiterplatte 5 erleichtert.
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Wie
ebenfalls in 2 gezeigt, kann die gedruckte
Leiterplatte 5 beispielsweise aus einem zweiseitigen Glasepoxidharz-Substrat
bestehen. Verbinder 5a sind auf der Rückseite von vier Positionen
am Umfang der kreisförmigen Öffnung vorgesehen,
die in der Mitte der gedruckten Leiterplatte 5 ausgebildet ist.
Da 16 Zapfen 9a, die in zwei Zickzack-Reihen von den vier
Positionen auf der Oberfläche
des oberen Halters 3 vorstehen, in die einzelnen entsprechenden Verbinder 5a eingefügt sind,
ist die Anordnung der integrierten Mehrfachelektrode 2 und
der Halter 3, 4 auf der gedruckten Leiterplatte 5 befestigt
und elektrisch verbunden.
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An
beiden Rändern 5b der
gedruckten Leiterplatte 5 befinden sich elektrische Kontakte
für beide
Steckerleisten mit einem Rastermaß von 2,54 mm. Diese elektrischen
Kontakte und die Mittelverbinder 5a sind in der Leiterstruktur 5c verbunden.
Die innere Reihe der beiden Verbinder 5a ist durch die Oberflächenstruktur
und die äußere Reihe
durch die Rückseite
der Struktur verdrahtet, und es sind je 34 auf der Oberfläche und
auf den Rückseiten
der beiden Ränder 5b,
das heißt
insgesamt 68 elektrische Kontakte, ausgebildet. Um die mechanische
Fixierung sicher zu machen, kann der obere Halter 3 an der
gedruckten Leiterplatte 5 durch Befestigung mit Schrauben
angebracht werden.
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Die
Referenzelektroden 10 der integrierten Mehrfachelektrode 2 sind
mit Bezug auf 4 beschrieben. Die Refe renzelektroden 10 werden
normalerweise in das Kulturfluid als das Referenzpotential zur Messung
des in jeder Mikroelektrode auftretenden Potentials eingetaucht.
Daher ist jede Mikroelektrode 11 mit einem Eingang des
Verstärkers 34 (1)
verbunden, und die Referenzelektroden 10 sind mit den Referenzspannungsanschlüssen eines jeweiligen
Verstärkers
verbunden. Der 64-Kanal-Verstärker
ist in vier Gruppen von je 16 Kanälen geteilt, und jede der vier
Referenzelektroden ist gemeinsam mit dem Referenzspannungsanschluß einer
Gruppe für
16 Kanäle
verbunden.
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Zunächst wird,
wie aus 4 hervorgeht, bevorzugt, die
vier Referenzelektroden 10 an Verlängerungen der Diagonalen des
mittleren rechteckigen Bereichs, der die Mikroelektroden 11 enthält, zu positionieren.
Im allgemeinen ist dies praktisch für die Verdrahtung. Um die Segmente
der Zellen oder Gewebe auf einfache Weise so zu plazieren, daß alle 64 Mikroelektroden,
aber nicht die vier Referenzelektroden überdeckt sind, sollte außerdem der
Abstand zwischen dem mittleren rechteckigen Bereich, der die Mikroelektroden 11 darstellt,
und den Referenzelektroden 10 so groß sein, wie es sinnvoll möglich ist. Wenn
außerdem
die vier Referenzelektroden 10 in gleichen Abständen von
der Mitte des rechteckigen Bereichs plaziert werden, ist der Rauschpegel,
der in jeder Mikroelektrode auftritt, im wesentlichen gleichmäßig. Obwohl
die Positionen der Referenzelektroden oben genau angegeben sind,
sollen die Zahlenwerte keine absoluten Werte sein, sondern nur Richtliniencharakter
haben.
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Die
Größe der Referenzelektroden 10 kann das
4- bis 64fache, vorzugsweise etwa das 16fache der Fläche einer
Mikroelektrode betragen, wie oben erwähnt. Infolgedessen ist die
Impedanz zwischen der Meßpotentialeingabeseite
des Verstärkers
und der Referenzpotentialeingabeseite ausgeglichen, und der Rauschpegel
wird minimiert. Wenn die Mikroelektroden und Referenzelektroden
beispielsweise in dem gleichen genannten Prozeß ausgebildet werden und die
Fläche
der Referenzelektrode 16mal so groß ist wie die der Mikroelektrode,
sind die Impedanz der 16 Mikroelektroden und die Impedanz einer zuständigen Referenzelektrode
nahezu gleich.
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Beispiel
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Das
Beispiel zeigt die Differenz des Rauschpegels zwischen einem System
mit einer integrierten Mehrfachelektrode, z. B. der oben beschriebenen, und
der Referenzelektroden von 50 μm2 und 200 μm2. 9 und 10 zeigen
diese Vergleichsrauschpegel.
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Wir
haben integrierte Mehrfachelektroden (wie z. B. in 4 dargestellt)
mit jeweils Referenzelektroden von 50 μm2 und
Referenzelektroden von 200 μm2 hergestellt. Die integrierten Mehrfachelektroden
hatten jeweils zylindrische Teile 6. Das gleiche Kulturmedium,
wie es normalerweise bei Gewebekultivierung verwendet wird, wurde
im Inneren der zylindrischen Teile 6 plaziert. Um die resultierenden
Signale auf das Rauschen zu begrenzen, wurde keine Zell- oder Gewebeprobe
auf den Mikroelektroden plaziert. Wie in 11 gezeigt,
wurden von den 64 Mikroelektroden die mittleren 7 Stellen (Kanäle 1 bis 5,
7, 8) gemessen.
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9 zeigt
die Rauschwellenform der Referenzelektroden bei 50 μm2 und 10 bei
200 μm2. In jedem Diagramm ist die Spannung auf
der Ordinatenachse 0,02 mV/Teilstrich, und die Zeit auf der Abszissenachse
ist 5,0 ms/Teilstrich. Wie aus dem Vergleich zwischen 9 und 10 hervorgeht,
ist der Rauschpegel deutlich kleiner, wenn die Referenzelektroden
200 μm2 (10) im
Vergleich zu Referenzelektroden von 50 μm2 (9)
sind. Wenn übrigens,
wie in Bezug auf den Stand der Technik beschrieben, eine der 64
Mikroelektroden als die Referenzelektrode verwendet wurde, die für 16 Mikroelektroden
zuständig
war, war der Rauschpegel so groß wie
in 9.
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Wie
hierin beschrieben ist, ist gemäß der erfindungsgemäßen Zellpotentialmeßelektrode
und Vorrichtung der Rauscheffekt klein, und wenn die Positionierung
beim Anordnen der zu messenden Segmente der Zellen oder Gewebe nicht
sehr genau ist, werden alle Mikroelektroden effektiv genutzt, und
an mehreren Punkten können
Potentiale gleichzeitig gemessen werden.