JP4748451B2 - ハイブリダイゼーションの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、たとえばマイクロ反応チップを用いたＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの生体関連物質のハイブリダイゼーションの検出方法に関する。

近年、生物の多様な遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進められており、
これらの遺伝子発現や塩基配列の解析のために、例えば、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどのようなマイクロ反応チップに、固相基板上に高密度に異なるプローブ核酸を配列、固定したチップが用いられている。そして、このプローブ核酸に別途調製された一本鎖のターゲット核酸を供給し、配列の相補性による結合の有無を検出することで遺伝子発現や塩基配列の解析を行なっている。
ここで、ＤＮＡチップ上のプローブ核酸断片とターゲット核酸断片とのハイブリダイゼーションを検出する方法として、二本鎖核酸断片に特異的に結合し、かつ電気化学的に活性な二本鎖核酸断片標識体を用いて検出する方法や、酸化還元酵素を標識することで電気化学的測定によりターゲット核酸を検出する方法がある。

このようなプローブ核酸を配列、固定する方法としては、あらかじめ調整されたプローブ核酸断片を電極の表面に結合固定する方法や、電極の表面で直接オリゴヌクレオチドを
合成する方法が知られている。電極の表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィ技術および固相合成技術を組み合わせ、所定の微小なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行う方法が代表的であるが、電気化学反応によりオリゴヌクレオチドを電極の表面で選択的に合成する方法が提案されている（例えば、特許文献
１参照）。

図４は、従来のマイクロ反応チップの概略平面図および概略断面図である。
ＤＮＡチップは、シリコンウエハ上に、図４に示すように、プローブ核酸断片が結合固定された電極であって絶縁性の基材５１表面の複数箇所に設けられた固定電極５２と
、各固定電極５２とプローブ核酸断片を介して対向配置された対向電極５３とを備えている。例えばＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ Ｍｅｔａｌ Ｏｘｉｄｅ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：相補型金属酸化膜半導体）に接続されている。そして、固定電極５２と対向電極５３とを流れる信号電流や、固定電極５２と対向電極５３の間の電位差を測定する。
ここで上述した酸化還元酵素を標識としてハイブリダイゼーションの検出を行うために、固定電極５２と対向電極５３との間には、用いる基質によって異なるが、５０ｍＶ~５００ｍＶの酸化還元電位が印加される。なお、各固定電極５２の間隔は例えば、０．０５ｍｍ〜０．５ｍｍ、また固定電極５２と対向電極５３との距離は例えば０．０５〜１．０ｍｍである。
特表２０００−５１４８０２号公報

しかしながら、上記従来のハイブリダイゼーションの検出方法には、以下の課題が残されている。すなわち、検出速度を向上させるために、マイクロ反応チップのすべての固定電極に同時に電圧を印加して同時に結合による電気信号を検出するが、各電極にそれぞれ設置された増幅器の特性のばらつきの影響で、各固定電極でそれぞれ異なる電位を有していることがあり、各固定電極間で電流が流れることがある。この電流値の大きさが配列の相補性による結合の有無の電気信号に比較して十分小さくないので、結合の有無の電気信号が各固定電極間で流れる電流に埋もれる場合がある。ここで、各固定電極間の電位差は平均で１０ｍＶ〜３０ｍＶ、最大で５０ｍＶの場合もある。一方、固定電極と対向電極との電位差は５０ｍＶ〜５００ｍＶであって、各固定電極のばらつきは無視できない大きさとなっている。また、各固定電極間の距離が固定電極と対向電極の距離に対して数分の１と短いので、各固定電極間で流れる電流は、比較的大きいことになる。すなわち、実際に固定電極間を流れる電流が、対向電極と固定電極との間を流れる電流の大きさの半分程度になる場合もある。

本発明は、前記課題に鑑みてなされたもので、各固定電極間を流れる電流を減少させ、精度よい検出を行うことができるハイブリダイゼーションの検出方法を提供することを目的とする。

本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、生体関連物質を捕捉するプローブが固定されている固定面を有する固定電極が複数設けられていたマイクロ反応チップに前記プローブを固定し、該プローブを介して前記固定電極と対向配置される対向電極に電圧を印加するハイブリダイゼーションの検出方法において、前記複数の固定面の位置番号を端から順番に２次元配列（ｍ，ｎ）で番号付け、１つおきのグループ（２ｍ＋１、２ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・・）、２つおきのグループ（３ｍ＋１、３ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，４，・・・）または３つおきのグループ（４ｍ＋１、４ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・）の場合を含む、ある一定の間隔を隔てた固定面を選んでグループ化する組分工程と、前記各固定面にプローブを固定する固定工程と、そのグループ毎に同時に電圧を印加し、電流を測定する検出工程とを備えたことを特徴とする。

本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、すべての固定面の電位の測定なしに、例えば、２つおきまたは５つおきに固定面をグループ分けし、このグループごとに電圧を印加して電気信号を検出している。すなわち、互いに隣接、または近距離の２つの固定面の電位が大きく異なっていても、組分工程で同時に印加する電極は十分離れているので、同時に電位を印加した固定面間の電流の流れはほとんど無視できる。また、印加していない固定面と印加した固定面間の電流の流れもない。これにより、電気信号の検出を行う一方の固定面に向けて検出を行わない他方の固定面から電流が流れ込まないので、一方の固定面で検出した電気信号に対するノイズを低減できる。したがって、精度よい検出・解析を行うことができる。

また、本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、固定工程で、前記各グループを構成する前記固定面の少なくとも１つに、前記複数のグループで共通する参照用プローブを固定することが好ましい。
この発明では、各グループで参照用プローブがハイブリダイゼーションを行った際の電気信号を取得して比較することで、各グループで検出した参照用プローブ以外の他のプローブの電気信号を補正することができる。したがって、各グループ間における電気信号の検出結果のバラツキを抑制し、他のプローブにおける検出結果をより正確に解析することができる。

また、本発明のハイブリダイゼーションの検出方法は、前記マイクロ反応チップが、前記固定面から離間して該固定面の外周を囲む包括電極を備えることが好ましい。
この発明では、互いに近接する２つの固定面において電位差が生じていても、一方の固定面から他方の固定面に向けて流れる電流が一方の固定面と包括電極の間で流れる。これにより、近接する２つの固定面の間で電流が流れることを防止する。したがって、電気信号に対するノイズの低減が図れて電気信号の検出をより精度よく行うことができる。

本発明のハイブリダイゼーションの検出方法によれば、互いに近接する２つの固定面における電位が大きく異なっても、組分工程で隣接固定面は異なるグループに分別されるので、検出工程で、接近したこの２つの固定面に同時に電圧が印加されない。したがって電気信号の検出を行う一方の固定面に他方の固定面から電流が流れ込まない。そのため、一方の固定面における電気信号に対するノイズの低減が図れ、より精度よい検出を行うことができる。

（実施例１）
以下、本発明にかかるハイブリダイゼーションの検出方法の一実施例を、図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の実施例１におけるハイブリダイゼーションの検出方法が適用される検出装置の構成を示すブロック図である。
本実施例によるハイブリダイゼーションの検出方法は、図１に示すように、ＤＮＡチップ（マイクロ反応チップ）１と、ＤＮＡチップ１の電気的な制御を行う制御装置２とを用いて行う。
図２は、本実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法におけるＤＮＡチップの部分平面図、Ｘ−Ｙ断面図である。
ＤＮＡチップ１は、図２に示すように、ＣＭＯＳ部１１と、ＣＭＯＳ部１１の上面に形成されているプローブ核酸（プローブ、図省略）が固定されている合成電極部１２とを備えている。

ＣＭＯＳ部１１は、合成電極部１２に対して印加する電圧を制御するＣＭＯＳ能動素子部１５と、ＣＭＯＳ能動素子部１５と外部とを接続する入出力電極１６と、ＣＭＯＳ能動素子部１５および入出力電極１６の外表面に形成されてＣＭＯＳ能動素子部１５を保護するＣＭＯＳ保護層１７とを備えている。

ＣＭＯＳ能動素子部１５は、後述する固定電極部（固定電極）２３および包囲電極部（包囲電極）２４に対してそれぞれ独立して電圧を印加すると共に、後述する各固定面２３ａで検出した電圧を増幅して後述する電位測定部３１に出力するよう構成されている。
入出力電極１６は、例えばＡｌ（アルミニウム）のような導電体によって構成されており、ＣＭＯＳ保護層１７に形成された貫通孔であるコンタクトホール１７ａから外部に向けて露出している。
また、ＣＭＯＳ保護層１７は、その膜厚が例えば２ｕｍであって、例えばＳｉＮ（窒化珪素）／ＳｉＯ_２（二酸化珪素）のような絶縁体によって形成されている。

合成電極部１２は、入出力電極１６と接続する接続電極部２１と、接続電極部２１を封止する第１絶縁層２２と、第１絶縁層２２上に形成されて接続電極部２１と接続する固定電極部２３および包囲電極部２４と、固定電極部２３、包囲電極２４および第１絶縁層２２を覆う第２絶縁層２５とを備えている。
接続電極部２１は、例えばＡｌによって形成されており、コンタクトホール１７ａを充填すると共に、一部がコンタクトホール１７ａ近傍におけるＣＭＯＳ保護層１７の上面に積層されている。この接続電極部２１は、コンタクトホール１７ａを充填するように、例えば３ｕｍ形成した後、ＣＭＯＳ保護層１７の上面からの突出量が０．５ｕｍ以下となるように平坦化されている。

第１絶縁層２２は、例えばＳｉＮやＳｉＯ_２のような絶縁体によって構成されており、
接続電極部２１を充填するように形成されている。この第１絶縁層２２は、プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：化学的気相成長）法などを用いてＣＭＯＳ保護層１７または接続電極部２１の上面に、例えば厚さが０．５ｕｍとなるように平坦化して形成されている。
また、第１絶縁層２２には、平面視でＣＭＯＳ保護層１７に形成されたコンタクトホール１７ａと一致しない位置に、接続電極部２１に至る貫通孔であるコンタクトホール２２ａが設けられている。このコンタクトホール２２ａは、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたドライエッチングなどによって形成されている。

固定電極部２３は、例えばＰｔ（白金）によって構成されており、平面視でほぼ円形状を有している。そして、固定電極部２３の一部が、コンタクトホール２２ａ内に形成され
ることで、接続電極部２１に接続されている。この固定電極部２３は、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたスパッタリング法によって、第１絶縁層２２上に厚さが例えば０．２〜０．３ｕｍとなるように形成されている。
また、固定電極部２３には、第２絶縁層２５に形成された貫通孔２５ａによって外部に露出されていてプローブ核酸が固定化される固定面２３ａが形成されている。この固定面２３ａは、平面視においてほぼ円形となっており、その直径が例えば１０ｕｍ〜１００ｕｍとなっている。なお、固定電極部２３ａは第１絶縁層２２上の２方向で等間隔となるように複数設けられており、固定面２３ａが複数形成されることでマイクロアレイ化されている。

第２絶縁層２５は、例えばＳｉＮで形成されており、平面視において固定電極部２３と重なると共にコンタクトホール２２ａと一致しない位置に、円状の貫通孔２５ａが形成されている。また、第２絶縁層２５は、平面視において包囲電極２４と重なると共にコンタクトホール２２ａと一致しない位置に、環状の貫通孔２５ｂが形成されている。この貫通孔２５ｂによって、露出面２４ａが固定面２３ａの周囲を囲むように形成されている。

また、第２絶縁層２５は、プラズマＣＶＤ法を用いて固定電極部２３または第１絶縁層２２上に厚さが例えば０．７ｕｍ〜０．９ｕｍとなるように形成されている。そして、貫通孔２５ａ、２５ｂは、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたドライエッチングなどによって形成されている。

制御装置２は、複数の固定面２３ａをグループに分けて組分判断部３２と、固定面２３ａと対向配置される対向電極３３と、対向電極３３と固定面２３ａとの間に電圧を印加する電圧印加部３４と、固定面２３ａに接続されたＣＭＯＳ能動素子部１５から出力された電気信号を検出する信号検出部３５と、記録部３６と、出力部３７を備えている。

組分判断部３２は、各固定面２３ａの電位の測定結果から、例えば隣接する５固定面ごとの固定面２３ａのグループ分けを行い、その結果を記録部３６に出力するように構成されている。
対向電極３３は、複数の固定面２３ａとそれぞれプローブを介して対向配列されている。
ハイブリダイゼーションの検出時には、プローブ核酸のハイブリダイゼーションにおける酵素反応で電流を取り出すために、対向電極３３と固定面２３ａとの間に酸化還元電位を与えている。なお、用いる基質によって、酸化還元電位が５０ｍＶ〜５００ｍＶとなっている。
電圧印加部３４は、グループ分けした固定面２３ａのグループごとにグループを構成する固定面２３ａと対向電極３３との間に電圧を印加するように構成されている。
信号検出部３５は、固定面２３ａと対向電極３３との間に電圧を印加されたときに固定面で検出される電気信号を検出し、その結果を記録部３６に出力するように構成されている。
記録部３６は、メモリなどによって構成されており、モニタやハードディスクなどで構成された出力部３７に信号検出部３５で検出した電気信号の強度を表示または出力させる
。

プローブ核酸は、表面で生態関連物質であるターゲット核酸を捕捉する核酸であって、固定面２３ａに電気化学的な合成によって結合固定されている。ここで、１つの固定面２３ａには同一種のプローブ核酸が結合固定されており、複数の固定面２３ａのそれぞれで各種プローブ核酸が結合固定されている。なお、本明細書において、「核酸」とは、一般的な塩基配列により表されるＤＮＡ、ＲＮＡ（リボ核酸）および核酸類似物質などを総括して示しており、このような核酸は天然に存在するものであっても、人工的に合成または修飾されたものであってもよい。

以上のような構成のＤＮＡチップ１を用いたハイブリダイゼーションの検出方法について説明する。なお、本実施例において、ＤＮＡチップ１は、１１行×３０列の固定面２３ａを有している。
本実施例におけるハイブリダイゼーションの検出方法は、組分工程と固定工程と、検査工程とで構成されている。
最初に、組分工程を行う。これは、電位測定部３１がＤＮＡチップ１の一点を基準として複数の固定面２３ａの電位を測定し、測定結果を記録部３６に出力する。この結果、例えば、各固定面２３ａに電位が得られる。
図３は、この組分工程の各固定面の電位分布およびグループの分布を示す説明図である。そして、組分判断部３２が記録部３６に記録された各固定面２３ａの電位測定結果から固定面２３ａのグループ分けを行う。たとえば、３固定面おきに測定するとか、５固定面おきに測定するとか、必要な測定精度に応じて同時に印加する各固定面間の距離を決める。精度が必要なときには、必要な距離だけ離れた電極で同時に電圧を印加することを決める。

次に、固定工程を行う。これは、各固定面２３ａにプローブ核酸を電気化学的に合成して固定する。ここで、各グループを構成する固定面２３ａの少なくとも１つずつに共通のプローブ核酸を参照用プローブ核酸として固定する。このとき、グループに共通する参照用プローブを固定する個数は、所望する検出精度によって適宜設定するが、各グループで３箇所以上の固定面２３ａに参照用プローブを固定することが望ましい。

そして、検出工程を行う。これは、電気化学的検出法を用いて固定電極部２３と対向電極３３との間の電流値や電圧値などの電気信号の検出を行う。まず、ＤＮＡチップ１に別途調製したターゲット核酸を供給しグループＡを構成する固定面２３ａと対向電極３３との間に酸化還元電位として、例えば、１００ｍＶの電圧を印加する。このとき、固定したプローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションが起こると、固定面２３ａに電気信号が流れる。そして、信号検出部３５は、この電気信号を検出し、記録部３６に出力する。ここで、包囲電極部２４の電位が、固定電極部２３の電位とほぼ同じ電位となるように制御されている。
続いて、距離の離れたグループＢを構成する固定面２３ａと対向電極３３との間に電圧を印加して、ハイブリダイゼーションが発生した際の電気信号を信号検出部３５で検出する。

その後、グループＢと同様に、グループＣ、Ｄのそれぞれを構成する固定面２３ａにおける電気信号を検出する。
そして、供給したターゲット核酸と、取得した電気信号から、固定面２３ａに固定されているプローブ核酸の遺伝子発現や塩基配列を解析する。この際、各グループＡ〜Ｄを構成する固定面２３ａに固定された参照用プローブのハイブリダイゼーションによる電気信号の検出結果を基に、各個底面２３ａで検出された電気信号を補正する。これは、基準グループであるプローブＡにおける参照用プローブの電気信号の検出結果と他のグループにおける参照用プローブの電気信号の検出結果とを比較し、その差を補正値とする。そして、各グループで検出された電気信号を補正値に基づいて補正する。

以上のように、本実施例によれば、互いに隣接する２つの固定面２３ａの電位差が大きい場合でも、組分工程でこの２つの固定面２３ａが異なるグループに区分されるので、検出工程でのこの２つの固定面２３ａに対して同時に電圧が印加されることを回避することができる。これにより、電気信号の検出を行う一方の固定面２３ａに他方の固定面２３ａから電流が流れ込まない。したがって、検出を行う一方の固定面２３ａにおける電気信号に対するノイズの低減が図れ、精度よい検出を行うことができる。

ここで各グループＡ〜Ｄに共通の参照用プローブを固定しており、この参照用プローブがハイブリダイゼーションを行った際に取得した電気信号を各グループで比較することで、比較した値を基に各グループで検出した他のプローブ核酸の電気信号を補正することができる。さらに、包囲電極２４を設けることで、一方の固定面２３ａから他方の固定面２３ａに向けて流れる電流が一方の包囲電極２４と他方の包囲電極２４との間で流れ、隣接する２つの固定面２３ａ間で電流が流れることを防止する。以上により、各グループＡ〜Ｄにおける電気信号の検出結果のバラツキを抑制し、各グループＡ〜Ｄを構成する固定面２３ａにそれぞれ固定化された他のプローブ核酸における検出結果をより正確に解析することができる。

なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
例えば、上記実施例では、組分工程において、固定面２３ａを３つおきや５つおきに取っているが、６つおきと適宜変更してもよい。
ここで、同一グループ内で同時に印加する固定面間の距離は十分離れているため、同時に印加する固定面間で流れる電流を十分小さくできる。
また、固定工程において、各グループＡ〜Ｄに共通する参照用プローブを固定しているが、参照用プローブを固定しなくてもよい。

また、プローブ核酸の一端が直接固定面２３ａ上に固定化されているが、リンカーを介して固定されてもよく、ポリマー網を介して固定されていてもよい。ここで、リンカーと
しては、例えばアリールアセチレンや２〜１０モノマー単位を有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、ジアッシド、アミノ酸またはこれらの組み合わせたものが挙げられる。 また、プローブ核酸が捕捉する生体関連物質としてターゲット核酸を適用しているが、タンパクなど、他の生体関連物質を捕捉するようにしてもよい。さらに、プローブとしてタンパクなどの他の生体関連物質を適用してもよい。

また、固定面２３ａが平面視で円形を有しているが、矩形など他の形状であってもよい。
また、露出面２４ａが固定面２３ａの周縁から等間隔で離間した位置に形成されているが、設計に応じて適宜変更してもよい。
また、各包囲電極部２４が電気的に接続され、同電位となるように構成してもよい。
また、１つの固定電極部２３や包囲電極部２４がコンタクトホール２２ａにおいて接続電極部２１と接続されているが、固定電極部２３や包囲電極部２４を接続電極部２１上に直接スパッタリング法などによって形成した構造としてもよい。
また、包囲電極部２４を設けない構成としてもよい。
また、ＣＭＯＳ部１１によって各固定電極部２３に対して印加する電圧の制御などうを行っているが、ＣＭＯＳに限らず、他の半導体装置によって各固定電極部２３の電圧制御や電位測定部３１への出力などを行ってもよい。

この実施例によれば、ハイブリダイゼーションの検出方法に関して、各固定電極間を流れる電流によるノイズを低減し、精度よい検出を行うことができ、産業上の利用可能性が認められる。

本発明の実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法が適用される検出装置の構成を示すブロック図である。 本発明の実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法におけるＤＮＡチップの部分平面図、Ｘ−Ｙ断面図である。 本発明の実施例１のハイブリダイゼーションの検出方法における組分工程の各固定面の電位分布およびグループの分布を示す説明図である。 従来のマイクロ反応チップの概略平面図および概略断面図である。

符号の説明

１……ＤＮＡチップ（マイクロ反応チップ）、２３……固定電極部（固定電極）、２３ａ……固定面、２４……包囲電極部（包囲電極）、３３……対向電極。

Claims (3)

1. 生体関連物質を捕捉するプローブが固定されている固定面を有する固定電極が複数設けられたマイクロ反応チップに前記プローブを固定し、該プローブを介して前記固定電極と対向配置される対向電極に電圧を印加するハイブリダイゼーションの検出方法において、
   前記複数の固定面の位置番号を端から順番に２次元配列（ｍ，ｎ）で番号付け、１つおきのグループ（２ｍ＋１、２ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・・）、２つおきのグループ（３ｍ＋１、３ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，４，・・・）または３つおきのグループ（４ｍ＋１、４ｎ＋１）（ｍ，ｎ＝０，１，２，３，・・・）の場合を含む、ある一定の間隔を隔てた固定面を選んでグループ化する組分工程と、
   前記各固定面にプローブを固定する固定工程と、
   そのグループ毎に同時に電圧を印加し、電流を測定する検出工程と、
   を備えたことを特徴とするハイブリダイゼーションの検出方法。
2. 前記固定工程では、前記各グループを構成する前記固定面の少なくとも１つずつに、前記複数のグループで共通する参照プローブを固定することを特徴とする請求項１記載のハイブリダイゼーションの検出方法。
3. 前記マイクロ反応チップが、前記固定面から離間して該固定面の外周を囲む包囲電極を有することを特徴とする請求項１または２記載のハイブリダイゼーションの検出方法。

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