JP4639982B2

JP4639982B2 - マイクロ反応チップ

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Publication number: JP4639982B2
Application number: JP2005178115A
Authority: JP
Inventors: 真紀子出嶋; 新司入江; 昭裕星野
Original assignee: Toppan Inc
Current assignee: Toppan Inc
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2005-06-17
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2025-06-17
Also published as: JP2006349571A

Description

本発明は、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの生体関連物質の検出に用いられるマイクロ反応チップに関する。

近年、生物の多様な遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が進められており、これらの遺伝子発現や塩基配列の解析のために、例えば、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどのような、固相基板上に高密度に異なるプローブ核酸を配列、固定したチップが用いられている。そして、このプローブ核酸に別途調製された一本鎖のターゲット核酸を供給し、配列の相補性による結合の有無を検出することで遺伝子発現や塩基配列の解析を行っている。

ここで、ＤＮＡチップ上のプローブ核酸断片と、ターゲット核酸断片とのハイブリダイゼーションを検出する方法として、ターゲット核酸断片を検出可能な分子であらかじめ標識する方法がある。中でも、蛍光色素を標準分子としてターゲット核酸に標識する方法が最も一般的である。これは、ハイブリダイゼーションの操作に引き続き、ＤＮＡチップの表面を蛍光測定することで、ＤＮＡチップ上で、プローブ核酸断片とターゲット核酸断片とのハイブリダイゼーションが発生した箇所であるスポットのみを蛍光検出するものである。
また、このように検出された蛍光強度を測定することで、ターゲット核酸断片の存在量を測定する。

一方、ＤＮＡチップ上のプローブ核酸断片とターゲット核酸断片とのハイブリダイゼーションを検出する方法として、二本鎖核酸断片に特異的に結合し、かつ電気化学的に活性な二本鎖核酸断片認識体を用いて検出する方法や、酸化還元酵素を標識することで電気化学的測定によりターゲット核酸を検出する方法がある。

このように、ＤＮＡチップ上のプローブ核酸断片とターゲット核酸断片とのハイブリダイゼーションを利用する検出方法においては、プローブ核酸断片が固相担体表面に安定して固定されているか否かがターゲット核酸の検出の再現性を大きく左右する。また、固相担体表面におけるプローブ核酸断片の固定密度（同一種のプローブ核酸断片が単位面積あたりに固定されている量）は、ターゲット核酸の検出感度や検出限界を左右する。すなわち、ＤＮＡチップによるターゲット核酸の検出方法を実用化するためには、多数のプローブ核酸断片を、固相担体表面に密度をコントロールして安定に固定する必要がある。

ここで、ＤＮＡチップの作成方法としては、あらかじめ調整されたプローブ核酸断片を固相担体表面に結合固定する方法や、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法が知られている。固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィ技術及び固相合成技術とを組み合わせ、所定の微小なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行う方法が代表的であるが、電気化学反応によりオリゴヌクレオチドを固相担体表面で選択的に合成する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

この方法は、保護基を有するヌクレオチドモノマーが電極アレイの近傍にあり、アレイが緩衝液またはスカベンジング液（Scavenging Solution）に接触している。その後、アレイ中の選択した電極へ、保護されたヌクレオチドモノマーを脱保護化させることができる試剤を電気化学的に生成させる為に十分な電位を印加すると、選択した電極の近くの分子が脱保護化されて反応性の官能基にさらされ、これらが結合を形成する。電圧を印加する電極の選択を制御し、上述した反応を繰り返し行うことで、電極上に所望のオリゴヌクレオチドが合成される。
特表２０００−５１４８０２号公報

しかしながら、上記従来のマイクロ反応チップには、以下の課題が残されている。すなわち、例えば円形の電極上で上述した電気化学的なプローブ核酸合成を行った際、プローブ核酸の種類によっては電極の中央領域においてハイブリダイゼーションが行われないことがある。すなわち、検出されるスポットの形状が電極と同様の円形ではなく、電極の中央領域でスポットが検出されずにリング状となる。これにより、スポットの形状が電極と同様に円形状である場合と、リング形状である場合とで、蛍光検出を行った際の蛍光強度や電気化学的検出方法を行った際の電流値や電圧値のような各種応答値を各種のプローブ核酸で比較することが困難となる。したがって、測定の再現性や定量性に乏しくなるという問題がある。

本発明は、前述の課題に鑑みてなされたもので、プローブ核酸の種類によらず、再現性や定量性の良好な測定を行うことができるマイクロ反応チップを提供することを目的とする。

本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。すなわち、本発明のマイクロ反応チップは、生体関連物質を捕捉するプローブが固定される固定面を有する電極からなる固相担体が少なくとも１つ設けられたマイクロ反応チップにおいて、プローブは前記固定面に対して電気化学反応によって合成されており、固定面は複数形成されてマイクロアレイ化されており、固定面の中央領域に、前記プローブの固定を防止すると共に固定面上に形成された絶縁体によって形成された非固定部が形成されていることを特徴とする。

この発明のマイクロ反応チップによれば、固定面の中央領域に非固定部を形成し、固定面の中央領域にプローブを固定させないことで、プローブの種類によらずにほぼ同一形状のスポットを得ることができる。すなわち、プローブが生体関連物質を捕捉するハイブリダイゼーションを行って蛍光強度や電流、電圧値を測定する際、固定面の周縁領域のみにプローブを固定してハイブリダイゼーションを行うので、再現性や定量性の良好な測定を行うことができる。
しかも、プローブが、固定面に対して電気化学反応によって合成されているため、固定面上に所望の種類のプローブを合成することができる。
また、非固定部が、固定面上に形成された絶縁体によって形成されているので、平面視において環状の固定部が形成される。
また、固定面が複数形成されてマイクロアレイ化されているため、各固定面上にそれぞれ種類の異なるプローブを固定した測定を同時に行うことができる。ここで、上述したように、プローブの種類によらず同一形状のスポットを得ることができるので、各固定面において再現性や定量性の良好な測定を行うことができる。

また、本発明のマイクロ反応チップは、前記固相担体が、白金または金によって形成された電極であることが好ましい。
この発明によれば、電極に電圧を印加することでプローブを電気化学的に合成することができる。また、電気化学的測定を行うことができる。ここで、電極が白金または金によって形成されているので、電極の耐腐食性などを向上させることができる。

また、本発明のマイクロ反応チップは、前記絶縁体が、シリコンの酸化物あるいは窒化物またはタンタルの酸化物のいずれかによって形成されていることが好ましい。
この発明によれば、絶縁体としてシリコンの酸化物あるいは窒化物またはタンタルの酸化物のいずれかのみを用いることで、非固定部の形成が容易であると共に、固定面の中央領域に非固定部が確実に形成される。

また、本発明のマイクロ反応チップは、前記非固定部が、前記固相担体に形成された貫通孔であることとしてもよい。
この発明によれば、固相担体に形成された貫通孔によって、固定面の中央領域に非固定部を形成する。

本発明のマイクロ反応チップによれば、固定面に固定されるプローブの種類によらず、ハイブリダイゼーションを行った際にほぼ同一のスポット形状が得られるので、再現性や定量性の良好な測定を行うことができる。

以下、本発明にかかるマイクロ反応チップの一実施形態を、図１を参照しながら説明する。
本実施形態によるマイクロ反応チップ１は、ＣＭＯＳ（Complimentary Metal Oxide Semiconductor：相補型金属酸化膜半導体）部２と、ＣＭＯＳ部２の上面に形成されてプローブ核酸（プローブ、図示略）が固定される合成電極部３と、合成電極部３と対向配置された対向電極４とを備えている。なお、図１（ａ）において、対向電極４の図示を省略している。

ＣＭＯＳ部２は、合成電極部３に対して印加する電流や電圧を制御するＣＭＯＳ能動素子部１１と、ＣＭＯＳ能動素子部１１と外部とを接続する入出力電極１２と、ＣＭＯＳ能動素子部１１及び入出力電極１２の外表面に形成されてＣＭＯＳ能動素子部１１を保護するＣＭＯＳ保護層１３とを備えている。
ＣＭＯＳ能動素子部１１は、後述する各固定電極部（固相担体）２３に対してそれぞれ独立して電流や電圧を印加すると共に、各固定面２３ａで検出した電流や電圧を増幅して外部に出力するように構成されている。
入出力電極１２は、例えばＡｌ（アルミニウム）のような導電体によって形成されており、ＣＭＯＳ保護層１３に形成された貫通孔であるコンタクトホール１３ａから外部に向けて露出している。
また、ＣＭＯＳ保護層１３は、その膜厚が例えば２μｍであって、例えばＳｉＮ（窒化珪素）／ＳｉＯ_２（二酸化珪素）のような絶縁体によって形成されている。

合成電極部３は、入出力電極１２と接続する接続電極部２１と、接続電極部２１を封止する第１絶縁層２２と、第１絶縁層２２上に形成されて接続電極部２１と接続する固定電極部２３と、固定電極部２３及び第１絶縁層２２を覆う第２絶縁層２４とを備えている。
接続電極部２１は、例えばＡｌによって形成されており、コンタクトホール１３ａを充填すると共に、一部がコンタクトホール１３ａの近傍におけるＣＭＯＳ保護層１３の上面に積層されている。この接続電極部２１は、コンタクトホール１３ａが充填されるように、例えば３μｍ形成した後、ＣＭＯＳ保護層１３の上面からの突出量が０．５μｍ以下となるように平坦化されている。

第１絶縁層２２は、例えばＳｉＮやＳｉＯ_２のような絶縁体によって構成されており、接続電極部２１を充填するように形成されている。この第１絶縁層２２は、プラズマＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition：化学的気相成長）法などを用いてＣＭＯＳ保護層１３または接続電極部２１の上面に、例えば厚さが０．５μｍとなるように平坦化されて形成されている。
また、第１絶縁層２２には、平面視でＣＭＯＳ保護層１３に形成されたコンタクトホール１３ａと一致しない位置に、接続電極部２１に至る貫通孔であるコンタクトホール２２ａが設けられている。このコンタクトホール２２ａは、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたドライエッチングなどによって形成されている。

固定電極部２３は、例えばＰｔ（白金）によって形成されており、平面視で例えば矩形状を有している。そして、固定電極部２３の一部が、コンタクトホール２２ａ内に形成されることで、接続電極部２１に接続されている。この固定電極部２３は、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたスパッタリング法によって、第１絶縁層２２上に厚さが０．２μｍ〜０．３μｍとなるように形成されている。
また、固定電極部２３には、第２絶縁層２４に形成された貫通孔２４ａによって外部に露出されてプローブ核酸が固定される固定面２３ａが形成されている。この固定面２３ａは、平面視で円形を有しており、その中央に円柱状の非固定部２４ｂが形成されている。したがって、固定面２３ａの非固定部２４ｂを除く周縁領域は、平面視でリング状であり、その外径が例えば４０μｍ、リングの幅が例えば８μｍとなっている。なお、固定電極部２３は第１絶縁層２２上の２方向で等間隔となるように複数設けられており、固定面２３ａが複数形成されることでマイクロアレイ化されている。

第２絶縁層２４は、例えばＳｉＮで形成されており、平面視において固定電極部２３と重なると共にコンタクトホール２２ａと一致しない位置に、円筒状の貫通孔２４ａが形成されている。この貫通孔２４ａによって、固定面２３ａの中央領域に非固定部２４ｂが形成される。
また、第２絶縁層２４は、プラズマＣＶＤ法を用いて固定電極部２３または第１絶縁層２２上に厚さが０．７μｍ〜０．９μｍとなるように形成されている。そして、貫通孔２４ａは、所定の開口形状を有するマスクパターンを用いたドライエッチングなどによって形成されている。

プローブ核酸は、表面で生体関連物質であるターゲット核酸を捕捉する核酸であって、固定面２３ａに電気化学的な合成によって結合固定されている。ここで、１つの固定面２３ａには同一種のプローブ核酸が結合固定されており、複数の固定面２３ａのそれぞれで多種のプローブ核酸が結合固定されている。なお、本明細書において、「核酸」とは、一般的な塩基配列により表されるＤＮＡ、ＲＮＡ（リボ核酸）及び核酸類似物質などを総括して示しており、このような核酸は天然に存在するものであっても、人工的に合成または修飾されたものであってもよい。また、本明細書において、核酸を構成するための一単位に含まれる塩基の種類を表す語は、その一単位に含まれる塩基名、すなわち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）及びチミン（Ｔ）で示す。

以上のような構成のマイクロ反応チップ１を用いて遺伝子発現や塩基配列の解析をする際には、まず、各固定面２３ａにプローブ核酸を電気化学的に合成して固定する。そして、別途調製したターゲット核酸を供給し、固定されたプローブ核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションが発生した箇所であるスポットを蛍光検出してその強度を測定する。また、電気化学的検出方法を用いて、固定電極部２３と対向電極４との間の電流値や電圧値を測定する。
その後、供給したターゲット核酸と、測定した蛍光強度や電流値、電圧値とから、固定面２３ａに固定されているプローブ核酸の遺伝子発現や塩基配列を解析する。

以上のように構成されたマイクロ反応チップ１によれば、固定面２３ａの中央領域に非固定部２４ｂを形成することによって、プローブ核酸が固定面２３ａの周縁部において平面視でリング状に固定されることとなる。これにより、このプローブ核酸に対してハイブリダイゼーションを行ったときに形成されるスポットの形状が、プローブ核酸の種類によらずほぼ同一となる。したがって、蛍光強度や電流値、電圧値などの定量測定が再現よく行える。
また、固定電極部２３がＰｔで形成されていることで、耐腐食性などを向上させることができる。

次に、本発明にかかるマイクロ反応チップを実施例により具体的に説明する。
まず、固定面２３ａが横１６箇所、縦６４箇所、合計１０２４箇所に形成されてマイクロアレイ化されたマイクロ反応チップ１を製造した。そして、表１に示すような塩基配列である６種類のプローブ核酸と、他の３５ｍｅｒの塩基配列である１００種類のプローブ核酸とを、電気化学的に合成してそれぞれ固定面２３ａ上に固定する。

基板上でのプローブ合成は、コンビメートリックス社の合成機Ｂ３を用いてホスホアミダイト法で行っている。そして、ＱＣｐｒｏｂｅ１からＱＣｐｒｏｂｅ６と、他の１００種のプローブ核酸とは、それぞれ４箇所の固定面２３ａ上に合成した。

ＱＣｐｒｐｂｅ１は指定した配列通りに合成が完了したかを確認するためにあり、そのスポットが確認できれば３５ｍｅｒの合成が完了しているとみなすことができる。ＱＣｐｒｏｂｅ２からＱＣｐｒｏｂｅ６は、それぞれ１０、３、１、０．３、０．１ｐｍｏｌとなるように調製したものを用いるため、そのスポットの蛍光強度について検量線を引くことにより、検出結果に濃度依存性があるかを判断することができる。

そして、表２に示すようなターゲット核酸を準備した。ここで、各ターゲット核酸には、３’末端に蛍光色素標識が施されており、ＱＣｔａｒｇｅｔ１からＱＣｔａｒｇｅｔ６にはＣｙ５、ＱＣｔａｒｇｅｔ７にはＣｙ３という蛍光色素が結合している。また、ＱＣｔａｒｇｅｔ１からＱＣｔａｒｇｅｔ６はＱＣｐｒｏｂｅ１からＱＣｐｒｏｂｅ６に相補的な塩基配列を含んでいる。また、ＱＣｔａｒｇｅｔ７は９ｍｅｒのランダムな配列で、すべてのプローブ核酸にハイブリダイズすることが可能となっている。これらＱＣｔａｒｇｅｔ１からＱＣｔａｒｇｅｔ７はプロリゴ社で合成したものを用いている。

また、ターゲット核酸溶液の調整は、以下の通りである。
溶液Ａ：ＱＣｔａｒｇｅｔ１は終濃度が３ｎｍｏｌ、ＱＣｔａｒｇｅｔ２からＱＣｔａｒｇｅｔ６は終濃度がそれぞれ１０、３、１、０．３、０．１ｐｍｏｌとなるように３ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した混合液を調製し、９５℃で１０分加熱
溶液Ｂ：ＱＣｔａｒｇｅｔ７は終濃度が５００ｎｍｏｌとなるように６ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈して調製

そして、ハイブリダイゼーションは、以下の手順１〜手順１０の順番で行った。
手順１：３ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０５０℃ １分
手順２：溶液Ａ５０℃ ６０分
手順３：３ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０５０℃ ３分
手順４：３ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０室温１分
手順５：０．５ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０室温３分
手順６：６ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０室温１分
手順７：溶液Ｂ４℃ ６０分
手順８：６ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０室温１分
手順９：６ｘＳＳＰＥ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０室温１分
手順１０：６ｘＳＳＰＥ４℃ １５分
（イメージングするまで）

なお、イメージングはＡｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂで行った。また、測定波長は、Ｃｙ３については５３２ｎｍで行い、Ｃｙ５については６３５ｎｍで行った。そして、取得した蛍光イメージからコンビメートリックス社のＭｉｃｒｏａｒｒａｙＩｍａｇｅｒというソフトウエアで各スポットの蛍光強度を読み取った。
そして、各固定面２３ａの蛍光強度に基づいて、ＱＣｐｒｏｂｅ２からＱＣｐｒｏｂｅ６の検量線及び合成したすべてのプローブ核酸の蛍光強度のバラツキを計算した。この結果、検量線の相関係数は０．９９８、すべてのスポットのバラツキの平均値は０．１０であった。このことから検出結果には濃度依存性があり、またマイクロ反応チップ１全体の検出結果のバラツキも比較的小さいことがわかった。

次に、比較例として、従来のマイクロ反応チップを用いて同様の測定を行った。この結果、検量線の相関係数は０．９９８、すべてのスポットのバラツキの平均値は０．２２であった。
以上より、実施例は従来例と比較して性能的に遜色がないことがわかった。また、従来例は複数形成された固定面２３ａのうち一つでもスポットの形状がリング状となることでデータの比較ができなくなってしまうが、実施例の場合はその問題がない。

なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
例えば、上記実施形態において、固定面２３ａの非固定部２４ｂを除く周縁領域の外径が４０μｍ、リングの幅が５μｍとなっているが、設計に応じて適宜変更してもよく、外径が３０μｍ〜５０μｍであるときはリングの幅が５μｍ〜１０μｍ、外径が５０μｍ〜８０μｍであるときはリングの幅が１０μｍ〜１５μｍであればよい。また、これら数値範囲以外であってもよい。
また、固定面２３ａが平面視において円形を有しているが、中央領域に非固定部が形成されていればよく、中央に非固定部が形成された平面視において矩形状など、他の形状であってもよい。
また、１つの固定電極部２３に対して１箇所に固定面２３ａが形成されているが、複数の固定面２３ａが形成された構成としてもよい。
また、固定面２３ａの中央領域上に絶縁体である非固定部２４ｂを設けているが、固定電極部２３の中央領域に貫通孔を形成することで非固定部を形成する構成としてもよい。

また、プローブ核酸の一端が直接固定面２３ａ上に固定されているが、リンカーを介して固定されてもよく、ポリマー網を介して固定されてもよい。ここで、リンカーとしては、例えばアリールアセチレンや２〜１０モノマー単位を有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、ジアシッド、アミノ酸またはこれらの組み合わせたものが挙げられる。
また、プローブ核酸が捕捉する生体関連物質としてターゲット核酸を適用しているが、タンパクなど、他の生体関連物質を捕捉するようにしてもよい。さらに、プローブとしてタンパクなど他の生体関連物質を適用してもよい。

また、固定電極部２３がコンタクトホール２２ａにおいて接続電極部２１と接続するように形成されているが、固定電極部２３を接続電極部２１上に直接スパッタリング法などによって形成してもよい。
また、ＣＭＯＳ部２によって各固定電極部２３に対して印加する電圧や電流の制御などを行っているが、ＣＭＯＳに限らず、他の半導体装置によって各固定電極部２３の電圧や電流の制御などを行ってもよい。
また、各固定面２３ａのそれぞれと対向するように複数の対向電極４が設けられているが、測定時にすべての固定面２３ａと対向するような形状の対向電極４を０．５ｍｍ〜１ｍｍだけ離間した位置で１つ配置する構成としてもよい。

この発明によれば、ＤＮＡなどの生体関連物質の検出に用いられるマイクロ反応チップに関して、プローブ核酸の種類によらず、再現性や定量性の良好な測定を行うことができ、産業上の利用可能性が認められる。

本発明の一実施形態におけるマイクロ反応チップを示すもので、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ断面図である。

符号の説明

１マイクロ反応チップ
２３固定電極部（固相担体）
２３ａ固定面
２４ｂ非固定部

Claims

生体関連物質を捕捉するプローブが固定される固定面を有する電極からなる固相担体が少なくとも１つ設けられたマイクロ反応チップにおいて、
前記プローブは前記固定面に対して電気化学反応によって合成されており、
前記固定面は複数形成されてマイクロアレイ化されており、
前記固定面の中央領域に、前記プローブの固定を防止すると共に前記固定面上に形成された絶縁体によって形成された非固定部が形成されていることを特徴とするマイクロ反応チップ。
前記固相担体が、白金または金によって形成された電極であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ反応チップ。
前記絶縁体が、シリコンの酸化物あるいは窒化物またはタンタルの酸化物のいずれかによって形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロ反応チップ。
前記非固定部が、前記固相担体に形成された貫通孔であることを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロ反応チップ。