JP2018143144A - ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を効率的に産生させる方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を効率的に産生させること。【解決手段】本発明は、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を産生させる方法であって、（ａ）第１電極、第２電極、および複数の絶縁性ファイバーを表面に具備する基板上に心筋細胞を含有する液体培地を供給し、これらを心筋細胞により被覆する工程、ここで、複数の絶縁性ファイバーの少なくとも一部は、第１電極および第２電極の間に位置しており、かつその９０％以上は、第１電極および第２電極の両者を通る直線に対して平行もしくは平行に対して±２０度以内の範囲で配向性を有しており、（ｂ）基板を静置する工程、および（ｃ）第１電極および第２電極を介して心筋細胞にパルス電流が印加されながら心筋細胞を培養する工程、を具備する。【選択図】図１３Ａ
Description
本発明は、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を効率的に産生させる方法に関する。
特許文献１は、培養中の細胞に電気パルスを印加することによって、細胞増殖を促進することを開示している。
特許文献２は、液体培地を介して細胞に電圧を印加する細胞の分化方法を開示している。
特許文献３は、紐状の心筋細胞集合体を形成するための細胞培養支持体を開示している。
特許文献４は、機能を有した細胞組織を作成する方法を開示している。
特許文献５は、多能性幹細胞の心筋分化誘導法を開示している。
特許文献６は、配列構造を示す培養細胞を含む組織片、特に心筋組織片を得る方法を開示している（特に図４Ｂ、図９Ａ、００５５、０１３１、０１４１、０１４２、および０１５３）。
特許文献２は、液体培地を介して細胞に電圧を印加する細胞の分化方法を開示している。
特許文献３は、紐状の心筋細胞集合体を形成するための細胞培養支持体を開示している。
特許文献４は、機能を有した細胞組織を作成する方法を開示している。
特許文献５は、多能性幹細胞の心筋分化誘導法を開示している。
特許文献６は、配列構造を示す培養細胞を含む組織片、特に心筋組織片を得る方法を開示している（特に図４Ｂ、図９Ａ、００５５、０１３１、０１４１、０１４２、および０１５３）。
本発明の目的は、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を効率的に産生させる方法を提供することにある。
本発明は、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を産生させる方法であって、以下の工程
（ａ） 第１電極、第２電極、および複数の絶縁性ファイバーを表面に具備する基板上に前記心筋細胞を含有する液体培地を供給し、前記第１電極の表面、前記第２電極の表面、ならびに前記第１電極および前記第２電極の間に挟まれた領域を前記心筋細胞により被覆する工程、
ここで、
基板の平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの少なくとも一部は、前記第１電極および前記第２電極の間に位置しており、かつ
前記平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの９０％以上は、前記第１電極および前記第２電極の両者を通る直線に対して平行もしくは平行に対して±２０度以内の範囲で配向性を有しており、
（ｂ） 前記基板を静置する工程、および
（ｃ） 前記第１電極および前記第２電極を介して前記心筋細胞にパルス電流が印加されながら、前記心筋細胞を培養する工程、
を具備する、方法を提供する。
（ａ） 第１電極、第２電極、および複数の絶縁性ファイバーを表面に具備する基板上に前記心筋細胞を含有する液体培地を供給し、前記第１電極の表面、前記第２電極の表面、ならびに前記第１電極および前記第２電極の間に挟まれた領域を前記心筋細胞により被覆する工程、
ここで、
基板の平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの少なくとも一部は、前記第１電極および前記第２電極の間に位置しており、かつ
前記平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの９０％以上は、前記第１電極および前記第２電極の両者を通る直線に対して平行もしくは平行に対して±２０度以内の範囲で配向性を有しており、
（ｂ） 前記基板を静置する工程、および
（ｃ） 前記第１電極および前記第２電極を介して前記心筋細胞にパルス電流が印加されながら、前記心筋細胞を培養する工程、
を具備する、方法を提供する。
本発明は、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を効率的に産生させる方法を提供する。
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態が詳細に説明される。
特許文献５の図２Ｃに開示されているように、生体に含まれる心筋細胞と比較して、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においては、βミオシン重鎖（以下、「βＭＨＣ」という）の産生量が著しく小さい。βＭＨＣは、細胞の構造を支えるポリペプチドの１種である。ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞の成熟化のためには、βＭＨＣを効率的に産生することが重要である。
βＭＨＣは、以下の配列番号：０１により表されるアミノ酸配列からなる一次構造を有する。
MGDSEMAVFGAAAPYLRKSEKERLEAQTRPFDLKKDVFVPDDKQEFVKAKIVSREGGKVTAETEYGKTVTVKEDQVMQQNPPKFDKIEDMAMLTFLHEPAVLYNLKDRYGSWMIYTYSGLFCVTVNPYKWLPVYTPEVVAAYRGKKRSEAPPHIFSISDNAYQYMLTDRENQSILITGESGAGKTVNTKRVIQYFAVIAAIGDRSKKDQSPGKGTLEDQIIQANPALEAFGNAKTVRNDNSSRFGKFIRIHFGATGKLASADIETYLLEKSRVIFQLKAERDYHIFYQILSNKKPELLDMLLITNNPYDYAFISQGETTVASIDDAEELMATDNAFDVLGFTSEEKNSMYKLTGAIMHFGNMKFKLKQREEQAEPDGTEEADKSAYLMGLNSADLLKGLCHPRVKVGNEYVTKGQNVQQVIYATGALAKAVYERMFNWMVTRINATLETKQPRQYFIGVLDIAGFEIFDFNSFEQLCINFTNEKLQQFFNHHMFVLEQEEYKKEGIEWTFIDFGMDLQACIDLIEKPMGIMSILEEECMFPKATDMTFKAKLFDNHLGKSANFQKPRNIKGKPEAHFSLIHYAGIVDYNIIGWLQKNKDPLNETVVGLYQKSSLKLLSTLFANYAGADAPIEKGKGKAKKGSSFQTVSALHRENLNKLMTNLRSTHPHFVRCIIPNETKSPGVMDNPLVMHQLRCNGVLEGIRICRKGFPNRILYGDFRQRYRILNPAAIPEGQFIDSRKGAEKLLSSLDIDHNQYKFGHTKVFFKAGLLGLLEEMRDERLSRIITRIQAQSRGVLARMEYKKLLERRDSLLVIQWNIRAFMGVKNWPWMKLYFKIKPLLKSAEREKEMASMKEEFTRLKEALEKSEARRKELEEKMVSLLQEKNDLQLQVQAEQDNLADAEERCDQLIKNKIQLEAKVKEMNERLEDEEEMNAELTAKKRKLEDECSELKRDIDDLELTLAKVEKEKHATENKVKNLTEEMAGLDEIIAKLTKEKKALQEAHQQALDDLQAEEDKVNTLTKAKVKLEQQVDDLEGSLEQEKKVRMDLERAKRKLEGDLKLTQESIMDLENDKQQLDERLKKKDFELNALNARIEDEQALGSQLQKKLKELQARIEELEEELESERTARAKVEKLRSDLSRELEEISERLEEAGGATSVQIEMNKKREAEFQKMRRDLEEATLQHEATAAALRKKHADSVAELGEQIDNLQRVKQKLEKEKSEFKLELDDVTSNMEQIIKAKANLEKMCRTLEDQMNEHRSKAEETQRSVNDLTSQRAKLQTENGELSRQLDEKEALISQLTRGKLTYTQQLEDLKRQLEEEVKAKNALAHALQSARHDCDLLREQYEEETEAKAELQRVLSKANSEVAQWRTKYETDAIQRTEELEEAKKKLAQRLQEAEEAVEAVNAKCSSLEKTKHRLQNEIEDLMVDVERSNAAAAALDKKQRNFDKILAEWKQKYEESQSELESSQKEARSLSTELFKLKNAYEESLEHLETFKRENKNLQEEISDLTEQLGSSGKTIHELEKVRKQLEAEKMELQSALEEAEASLEHEEGKILRAQLEFNQIKAEIERKLAEKDEEMEQAKRNHLRVVDSLQTSLDAETRSRNEALRVKKKMEGDLNEMEIQLSHANRMAAEAQKQVKSLQSLLKDTQIQLDDAVRANDDLKENIAIVERRNNLLQAELEELRAVVEQTERSRKLAEQELIETSERVQLLHSQNTSLINQKKKMDADLSQLQTEVEEAVQECRNAEEKAKKAITDAAMMAEELKKEQDTSAHLERMKKNMEQTIKDLQHRLDEAEQIALKGGKKQLQKLEARVRELENELEAEQKRNAESVKGMRKSERRIKELTYQTEEDRKNLLRLQDLVDKLQLKVKAYKRQAEEAEEQANTNLSKFRKVQHELDEAEERADIAESQVNKLRAKSRDIGTKGLNEE （配列番号：０１）
MGDSEMAVFGAAAPYLRKSEKERLEAQTRPFDLKKDVFVPDDKQEFVKAKIVSREGGKVTAETEYGKTVTVKEDQVMQQNPPKFDKIEDMAMLTFLHEPAVLYNLKDRYGSWMIYTYSGLFCVTVNPYKWLPVYTPEVVAAYRGKKRSEAPPHIFSISDNAYQYMLTDRENQSILITGESGAGKTVNTKRVIQYFAVIAAIGDRSKKDQSPGKGTLEDQIIQANPALEAFGNAKTVRNDNSSRFGKFIRIHFGATGKLASADIETYLLEKSRVIFQLKAERDYHIFYQILSNKKPELLDMLLITNNPYDYAFISQGETTVASIDDAEELMATDNAFDVLGFTSEEKNSMYKLTGAIMHFGNMKFKLKQREEQAEPDGTEEADKSAYLMGLNSADLLKGLCHPRVKVGNEYVTKGQNVQQVIYATGALAKAVYERMFNWMVTRINATLETKQPRQYFIGVLDIAGFEIFDFNSFEQLCINFTNEKLQQFFNHHMFVLEQEEYKKEGIEWTFIDFGMDLQACIDLIEKPMGIMSILEEECMFPKATDMTFKAKLFDNHLGKSANFQKPRNIKGKPEAHFSLIHYAGIVDYNIIGWLQKNKDPLNETVVGLYQKSSLKLLSTLFANYAGADAPIEKGKGKAKKGSSFQTVSALHRENLNKLMTNLRSTHPHFVRCIIPNETKSPGVMDNPLVMHQLRCNGVLEGIRICRKGFPNRILYGDFRQRYRILNPAAIPEGQFIDSRKGAEKLLSSLDIDHNQYKFGHTKVFFKAGLLGLLEEMRDERLSRIITRIQAQSRGVLARMEYKKLLERRDSLLVIQWNIRAFMGVKNWPWMKLYFKIKPLLKSAEREKEMASMKEEFTRLKEALEKSEARRKELEEKMVSLLQEKNDLQLQVQAEQDNLADAEERCDQLIKNKIQLEAKVKEMNERLEDEEEMNAELTAKKRKLEDECSELKRDIDDLELTLAKVEKEKHATENKVKNLTEEMAGLDEIIAKLTKEKKALQEAHQQALDDLQAEEDKVNTLTKAKVKLEQQVDDLEGSLEQEKKVRMDLERAKRKLEGDLKLTQESIMDLENDKQQLDERLKKKDFELNALNARIEDEQALGSQLQKKLKELQARIEELEEELESERTARAKVEKLRSDLSRELEEISERLEEAGGATSVQIEMNKKREAEFQKMRRDLEEATLQHEATAAALRKKHADSVAELGEQIDNLQRVKQKLEKEKSEFKLELDDVTSNMEQIIKAKANLEKMCRTLEDQMNEHRSKAEETQRSVNDLTSQRAKLQTENGELSRQLDEKEALISQLTRGKLTYTQQLEDLKRQLEEEVKAKNALAHALQSARHDCDLLREQYEEETEAKAELQRVLSKANSEVAQWRTKYETDAIQRTEELEEAKKKLAQRLQEAEEAVEAVNAKCSSLEKTKHRLQNEIEDLMVDVERSNAAAAALDKKQRNFDKILAEWKQKYEESQSELESSQKEARSLSTELFKLKNAYEESLEHLETFKRENKNLQEEISDLTEQLGSSGKTIHELEKVRKQLEAEKMELQSALEEAEASLEHEEGKILRAQLEFNQIKAEIERKLAEKDEEMEQAKRNHLRVVDSLQTSLDAETRSRNEALRVKKKMEGDLNEMEIQLSHANRMAAEAQKQVKSLQSLLKDTQIQLDDAVRANDDLKENIAIVERRNNLLQAELEELRAVVEQTERSRKLAEQELIETSERVQLLHSQNTSLINQKKKMDADLSQLQTEVEEAVQECRNAEEKAKKAITDAAMMAEELKKEQDTSAHLERMKKNMEQTIKDLQHRLDEAEQIALKGGKKQLQKLEARVRELENELEAEQKRNAESVKGMRKSERRIKELTYQTEEDRKNLLRLQDLVDKLQLKVKAYKRQAEEAEEQANTNLSKFRKVQHELDEAEERADIAESQVNKLRAKSRDIGTKGLNEE （配列番号：０１）
参考までに、心筋細胞においては、心筋ミオシン調節／必須軽鎖（Myosin regulatory light chain 2、以下、「MYL2」という）も産生される。ＭＹＬ２は、以下の配列番号：０２により表されるアミノ酸配列からなる一次構造を有する。
MAPKKAKKRAGGANSNVFSMFEQTQIQEFKEAFTIMDQNRDGFIDKNDLRDTFAALGRVNVKNEEIDEMIKEAPGPINFTVFLTMFGEKLKGADPEETILNAFKVFDPEGKGVLKADYVREMLTTQAERFSKEEVDQMFAAFPPDVTGNLDYKNLVHIITHGEEKD （配列番号：０２）
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以下、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞は、単に「心筋細胞」と呼ばれる。よく知られているように、ｉＰＳ細胞とは、人工多能性幹細胞を意味する。
（工程（ａ））
まず、第１電極、第２電極、および複数の絶縁性ファイバーを表面に具備する基板１００上に心筋細胞を含有する液体培地が供給される。
まず、第１電極、第２電極、および複数の絶縁性ファイバーを表面に具備する基板１００上に心筋細胞を含有する液体培地が供給される。
図１は、基板１００の平面図を示す。図２は、図１に含まれる領域Ａの拡大図を示す。
図１に示されるように、基板１００はガラス板１およびその上に配置された囲い部材１０を具備している。ガラス板１の表面には、電気接点２および配線３が設けられている。各電気接点２は１本の配線３の一端に接続されている。囲い部材１０の内部では、絶縁性シート６０がガラス板１上に配置されている。配線３は絶縁性シート６０によって被覆されている。
図２に示されるように、各配線３の他端は露出している。この露出している部分が、第１電極３１または第２電極３２として機能する。図２では、４本の配線３が描かれている。第１電極３１は、左端に位置する配線３の露出している先端部から形成されている。同様に、第２電極３２は、右端に位置する配線３の露出している先端部から形成されている。
図１および図２に示されるように、基板１００の表面には、絶縁性ファイバー５０が配置されている。ファイバー５０は絶縁性であることが必要とされる。これは、第１電極３１および第２電極３２の間に短絡回路が誤って形成されることを防ぐためである。短絡回路が誤って形成された場合には、後述されるパルス電流が心筋細胞に印加されない。
図２に示されるように、絶縁性ファイバー５０の少なくとも一部は、第１電極３１および第２電極３２の間に位置している。万一、絶縁性ファイバー５０が第１電極３１および第２電極３２の間に位置していない場合（絶縁性ファイバー５０が基板１００に設けられない場合を含む）、後述される比較例６において実証されているように、βＭＨＣは効率的に産生されない。
絶縁性ファイバー５０は、基板１００の表面上に露出している。第１電極３１および第２電極３２もまた、基板１００の表面上に露出している。
基板１００の平面視において、絶縁性ファイバー５０は、その９０％以上が、±２０度以下の範囲で第１電極３１および第２電極３２の両者を通る直線に平行となるような配向性を有している。言い換えれば、当該９０％以上の各絶縁性ファイバー５０は、当該直線に対して２０度以下の角度を形成している。従って、９０％以上の絶縁性ファイバー５０は、第１電極３１および第２電極３２の間に電流（例えば、パルス電流）が流された際に生じる電界の方向に実質的に平行である。言うまでもないが、この直線は架空のものである。言い換えれば、この直線は基板１００上に実在するわけではない。望ましくは、絶縁性ファイバー５０は、その９０％以上が、±５度以下の範囲で第１電極３１および第２電極３２の両者を通る直線に平行となるような配向性を有している。特許文献６の段落番号００２３も参照せよ。特許文献６は、本明細書に参考として援用される。
万一、９０％以上の絶縁性ファイバー５０が第１電極３１および第２電極３２の両者を通る直線に実質的に平行でない場合、βＭＨＣは効率的に産生されない。後述される比較例３〜比較例６を参照せよ。比較例２および比較例３では、ほぼ全ての絶縁性ファイバー５０は、第１電極３１および第２電極３２の両者を通る直線に実質的に直交している。言い換えれば、比較例２および比較例３では、ほぼ全ての各絶縁性ファイバー５０は、当該直線に対しておよそ９０度を形成している。比較例４および比較例５では、およそ半分の絶縁性ファイバー５０が第１電極３１および第２電極３２の両者を通る直線に直交しており、かつおよそ残りの半分の絶縁性ファイバー５０が当該直線に平行である。
絶縁性ファイバー５０の望ましい直径は、１マイクロメートル以上５マイクロメートル以下である。絶縁性ファイバー５０の望ましい材質は、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリメチルグルタルイミド、またはポリ乳酸である。第１電極３１および第２電極３２の間の望ましい距離は、１５０マイクロメートル以上５０００マイクロメートル以下である。
基板１００の製造方法の一例は、後述される実施例において詳細に説明される。後述される実施例を読んだ当業者は、基板１００の製造方法を容易に理解できるであろう。
図８Ａに示されるように、上記で説明された基板１００の表面に、心筋細胞１８０を含有する液体培地１８２が供給される。液体培地１８２は、囲い部材１０の内部で基板１００の表面上に展開される。このようにして、第１電極３１の表面、第２電極３２の表面、ならびに第１電極３１および第２電極３２の間に挟まれた領域Ｃが、心筋細胞により被覆される。万一、第１電極３１の表面、および第２電極の表面、および当該領域Ｃの少なくとも１つが心筋細胞１８０により被覆されない場合には、後述される工程（ｂ）においてパルス電流が心筋細胞１８０に印加されない。その結果、βＭＨＣは効率的に産生されない。このように、工程（ａ）では、第１電極３１の表面、および第２電極の表面、および当該領域Ｃを被覆するために十分な量の心筋細胞１８０を含有する液体培地１８２が基板１００の表面に供給される。
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に実施される。工程（ｂ）では、基板１００が静置される。このようにして、絶縁性ファイバー５０または基板１００の表面上に心筋細胞を接着させる。望ましくは、基板１００は２４時間以上静置される。
工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に実施される。工程（ｂ）では、基板１００が静置される。このようにして、絶縁性ファイバー５０または基板１００の表面上に心筋細胞を接着させる。望ましくは、基板１００は２４時間以上静置される。
（工程（ｃ））
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に実施される。工程（ｃ）では、第１電極３１および第２電極３２を介して心筋細胞１８０にパルス電流が印加されながら、心筋細胞１８０が培養される。第１電極３１および第２電極３２に同一のパルス電流が印加されても良い。第１電極３１および第２電極３２にパルス電流が印加される際には、基準電極４が用いられ得る。基準電極４は接地されている。図８Ａに示されるように、基準電極４は基板１００の表面に設けられ得る。しかし、図８Ｂに示されるように、基準電極４は基板１００の表面に設けられる必要はない。図８Ｂでは、基準電極４は液体培地１８２の内部に含まれている。いずれにせよ、基準電極４は液体培地１８２に接することが望ましい。
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に実施される。工程（ｃ）では、第１電極３１および第２電極３２を介して心筋細胞１８０にパルス電流が印加されながら、心筋細胞１８０が培養される。第１電極３１および第２電極３２に同一のパルス電流が印加されても良い。第１電極３１および第２電極３２にパルス電流が印加される際には、基準電極４が用いられ得る。基準電極４は接地されている。図８Ａに示されるように、基準電極４は基板１００の表面に設けられ得る。しかし、図８Ｂに示されるように、基準電極４は基板１００の表面に設けられる必要はない。図８Ｂでは、基準電極４は液体培地１８２の内部に含まれている。いずれにせよ、基準電極４は液体培地１８２に接することが望ましい。
図３は、望ましいパルス電流の例を示すグラフである。図３に示されるように、望ましいパルス電流は、３３３ミリ秒〜２秒（図３では１秒）の周期を有している。１つのパルスは正または負のいずれかである。図３では、まず、負のパルスが印加され、次いで正のパルスが印加される。負のパルスが印加されている間は、心筋細胞から第１電極３１（または第２電極３２）に電流が流れる。正のパルスが印加されている間は、第１電極３１（または第２電極３２）から心筋細胞に電流が流れる。
１つのパルスは０．０５ミリ秒〜４ミリ秒（図３では０．４ミリ秒）の時間長、および１〜２０マイクロアンペア（図３では３〜１２マイクロアンペア）の高さ（すなわち、電流値）を有している。パルスの大きさ（すなわち、図３において１つのパルスの面積）は、０．１ナノクーロン以上１．０ナノクーロン以下であることが望ましい。さらに望ましくは、第１電極３１（または第２電極３２）の面積に対するパルスの大きさの比は、０．０４クーロン／平方メートル以上０．４クーロン／平方メートルである。負のパルスの大きさ（すなわち、図３において負のパルスの面積）は、正のパルスの大きさ（すなわち、図３において正のパルスの面積）と同一であることが望ましい。
実施例１において実証されているように、このようにして培養された心筋細胞１８０は、多くのβＭＨＣを含有する。言い換えれば、このようにして培養された心筋細胞１８０では、βＭＨＣが効率的に産生される。万一、パルス電流が印加されない場合、効率的にβＭＨＣは産生されない。後述される比較例１、３、５、および７を参照せよ。
（実施例）
以下の実施例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。
以下の実施例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。
（基板１００の作成）
図１に示される基板１００が、以下のように作成された。まず、正方形のガラス板１が用意された。ガラス板１は、０．７ミリメートルの厚みおよびおよそ２５００平方ミリメートル（５０ミリメートル×５０ミリミリメートル）の面積を有していた。次に、図４に示されるように、電気接点２および配線３がガラス板１上に形成された。配線３は、フォトレジストを用いて１５０ナノメートルの厚みを有する酸化インジウム錫膜をエッチングすることにより形成された。電気接点２および配線３の数は６８本であった。
図１に示される基板１００が、以下のように作成された。まず、正方形のガラス板１が用意された。ガラス板１は、０．７ミリメートルの厚みおよびおよそ２５００平方ミリメートル（５０ミリメートル×５０ミリミリメートル）の面積を有していた。次に、図４に示されるように、電気接点２および配線３がガラス板１上に形成された。配線３は、フォトレジストを用いて１５０ナノメートルの厚みを有する酸化インジウム錫膜をエッチングすることにより形成された。電気接点２および配線３の数は６８本であった。
次いで、感光性アクリル樹脂からなる絶縁膜４０を用いて、ガラス板１の表面が被覆された。電気接点２は絶縁膜４０で被覆されなかった。配線３の先端も第１電極３１、第２電極３２、または基準電極４として用いられるため、配線３の先端も絶縁膜４０で被覆されなかった。続いて、ガラス板１は、プラズマ処理装置（ＨＡＲＲＩＣＫ ＰＬＡＳＭＡ社製、商品名「ＰＤＣ−３２Ｇ」）を用いて、１８ＷのＲＦパワーで、２分間、プラズマ表面処理に供された。
図５は、図４に含まれる領域Ｂの拡大図を示す。図５に示されるように、１つの電極セット６は４本の配線３の先端から構成された。電極セット６の数は１６セットであった。残りの４つの配線３の先端は、基準電極４として用いられた。図６Ａは、配線３の先端部分の拡大平面図を示す。図６Ｂは、図６Ａに含まれる線６Ｂ−６Ｂに沿って切断された断面図を示す。
表面に露出している配線３の先端（すなわち、第１電極３１および第２電極３２）は、約１５マイクロメートル×約１７０マイクロメートルの大きさを有していた。基準電極４は、およそ２００平方マイクロメートルの面積を有していた。隣接する２つの配線３の先端の間の距離は、およそ４００マイクロメートルであった。隣接する２つの電極セット６の距離は、およそ４ミリメートルであった。
その一方で、アルミニウムテープ（日立マクセル株式会社より入手、商品名：ＳＬＩＯＮＴＥＣ）の表面上に、ポリメチルグルタルイミドから形成された絶縁性ファイバーが、特許文献６の段落番号０１２２に開示された手法に従ってエレクトロスピニング法により表面に形成された。特許文献６の段落番号０１２２に開示された手法とは異なり、実施例１では、エレクトロスピニング法におけるポリメチルグルタルイミドの噴出時間は３０分であった。絶縁性ファイバーは、３０％の表面被覆率を有していた。
次に、絶縁性ファイバーがアルミニウムテープおよび配線３の間に挟まれるように、絶縁性ファイバーを有するアルミニウムテープがガラス板１の表面上に配置された。絶縁性ファイバーを有するアルミニウムテープは、絶縁膜４０の表面および露出している配線３の先端の部分の表面に押しつけられた。次いで、アルミニウムテープが剥がされた。図７Ａは、配線３の先端部分の拡大平面図を示す。図７Ｂは、図７Ａに含まれる線７Ｂ−７Ｂに沿って切断された断面図を示す。図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、絶縁膜４０の表面および露出している配線３の先端の部分の表面に絶縁性ファイバー５０が転写された。図２および図７Ａに示されるように、９０％以上の絶縁性ファイバー５０は、第１電極３１および第２電極を通る直線に平行な方向（すなわち、図において左右方向）に配置されていた。
次に、図２に示されるように、絶縁膜４０上にシリコーン樹脂シート６０（東レ・ダウコーニング社より入手、商品名：ＳＹＬＧＡＲＤ １８４）がシリコーン接着剤を用いて接着された。シリコーン樹脂シート６０の膜厚は、約１ミリメートルであった。配線３の先端およびその周囲は、シリコーン樹脂シート６０によって被覆されなかった。さらに、シリコーン樹脂シート６０を内部に含むように囲い部材１０がシリコーン接着剤を用いて接着された。囲い部材１０は、ガラスから形成されていた。囲い部材１０は、およそ２２ミリメートルの内径、２５ミリメートルの外径、および１０ミリメートルの高さを有していた。
露出している配線３の先端の部分が白金黒５を用いてメッキされた。具体的には、メッキ溶液を用いて、２０ｍＡ／ｃｍ２の電流密度で２分間、当該部分がメッキされた。メッキ時には、配線３はカソードとして用いられた。メッキ溶液は、以下の表１に示される組成を有していた。このようなメッキ処理を介して配線３の先端の表面に第１電極３１または第２電極３２が形成された。言い換えれば、第１電極３１および第２電極は、白金黒から形成されていた。
このようにして、基板１００が得られた。図１３Ａは、このようにして得られた基板１００上に形成された第１電極３１、第２電極３２、および絶縁性ファイバー５０の顕微鏡写真である。図１３Ｂもまた、同様に得られた基板１００上に形成された第１電極３１、第２電極３２、および絶縁性ファイバー５０の顕微鏡写真である。図１３Ｂに示されるように、エレクトロスピニング法による製造手法での問題が原因で、絶縁性ファイバー５０には、わずかな量の無配向ファイバーが含まれる。このような無配向ファイバーの量は、１０％未満である。
（心筋細胞の培養）
基板１００を用いて、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化された心筋細胞が培養された。その後、βＭＨＣの産生率が測定された。具体的には、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化された心筋細胞（ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手、商品名：ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅｓ）が用いられた。ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅｓに含まれている説明書に記載されたプロトコルに従って、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化された心筋細胞（以下、単に「心筋細胞」という）を含有する液体培地が調製された。
基板１００を用いて、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化された心筋細胞が培養された。その後、βＭＨＣの産生率が測定された。具体的には、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化された心筋細胞（ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手、商品名：ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅｓ）が用いられた。ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅｓに含まれている説明書に記載されたプロトコルに従って、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化された心筋細胞（以下、単に「心筋細胞」という）を含有する液体培地が調製された。
次いで、図８Ａに示されるように、基板１００上に、液体培地１８２が供給された。基板１００上での心筋細胞１８０の密度は、１．５×１０４個／平方ミリメートルであった。このようにして、第１電極３１の表面、第２電極３２の表面、ならびに領域Ｃは、心筋細胞１８０により被覆された。心筋細胞１８０は、ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅｓに含まれている説明書に記載されたプロトコルに従って培養された。
液体培地１８２の供給から２日後に、図２に示される第１電極３１および第２電極３２を介して心筋細胞１８０に、図３に示されるパルス電流が基準電極４を用いて印加され、心筋細胞１８０を刺激した。パルス電流の印加のために、パルス電流発生器２００が電気接点２を介して第１電極３１および第２電極３２に電気的に接続された。液体培地１８２の電位は、基準電極４を介して基準電位（ＧＮＤ）に保たれた。
培地を交換する時を除いて、パルス電流は、１２日間に渡って心筋細胞１８０に印加された。このようにして、心筋細胞１８０は培養された。
（βＭＨＣの産生率の測定）
このようにして培養された心筋細胞１８０に含有されるβＭＨＣの産生率が、以下のように測定された。
このようにして培養された心筋細胞１８０に含有されるβＭＨＣの産生率が、以下のように測定された。
心筋細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定され、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／０．５％トリトンＸ−１００で０．５時間透過処理された。ブロッキング処理（ＰＢＳ／５％ロバ血清／３％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、４℃、１６時間）を施した後、ブロッキング緩衝液で１：１００に希釈されたマウスＭＹＨ７モノクローナルＩｇＭ一次抗体（サンタクル−ズバイオテクノロジー社より入手、商品名：ＳＣ−５３０８９）と共に摂氏４度の温度下で１６時間放置された。このようにして、一次抗体が心筋細胞に結合された。この一次抗体に結合する抗原はβＭＨＣ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５１８３７．１）であった。
次いで、一次抗体が結合された心筋細胞はＰＢＳで洗浄され、そしてブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈された蛍光標識された抗マウスＩｇＭ二次抗体（商品名：ＤｙＬｉｇｈｔ−５９４−Ｄｏｎｋｅｙ抗マウスＩｇＭ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．より入手）と共に２５℃で１時間放置された。このようにして、蛍光標識された二次抗体が一次抗体に結合された。このようにして、心筋細胞は蛍光標識された。
蛍光標識された心筋細胞は、蛍光顕微鏡を用いて観察された。図９Ａは、実施例１における心筋細胞の蛍光顕微鏡写真である。観察された蛍光の輝度は、２５６階調のデジタル輝度値に変換された。デジタル輝度値０は、輝度が最も低いことを意味する。デジタル輝度値２５５は、輝度が最も高いことを意味する。
以下、βＭＨＣ産生率とは、６５以上のデジタル輝度値を有する領域の合計面積の全体の観察領域の面積に対する割合として定義される。言い換えれば、βＭＨＣ産生率は、以下の数式により算出される。
βＭＨＣ産生率＝（６５以上のデジタル輝度値を有する領域の面積の合計）／（全体の観察領域の面積）
実施例１では、βＭＨＣ産生率は、５７．９％であった。
βＭＨＣ産生率＝（６５以上のデジタル輝度値を有する領域の面積の合計）／（全体の観察領域の面積）
実施例１では、βＭＨＣ産生率は、５７．９％であった。
参考として、培養された心筋細胞に含有される心筋ミオシン調節／必須軽鎖（Ｍｙｏｓｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ２、以下、「ＭＹＬ２」という）の産生率が同様に測定された。具体的には、以下の２つの事項を除き、βＭＨＣ産生率の場合と同様にしてＭＹＬ２産生率が算出された。
（Ｉ） マウスＭＹＨ７モノクローナルＩｇＭ抗体に代えて、一次抗体としてウサギＭＹＬ２ポリクローナルＩｇＧ抗体（希釈率：１／２００、ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社より入手、商品名：１０９０６０−１−ＡＰ）が用いられたこと、および
（ＩＩ） 抗マウスＩｇＭ蛍光標識二次抗体に代えて、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ蛍光標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．より入手、商品名：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）が用いられたこと。
その結果、実施例１において、ＭＹＬ２産生率は、３６．７％であった。
（Ｉ） マウスＭＹＨ７モノクローナルＩｇＭ抗体に代えて、一次抗体としてウサギＭＹＬ２ポリクローナルＩｇＧ抗体（希釈率：１／２００、ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社より入手、商品名：１０９０６０−１−ＡＰ）が用いられたこと、および
（ＩＩ） 抗マウスＩｇＭ蛍光標識二次抗体に代えて、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ蛍光標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．より入手、商品名：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）が用いられたこと。
その結果、実施例１において、ＭＹＬ２産生率は、３６．７％であった。
（比較例１）
パルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
パルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
（比較例２）
図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ほぼ全ての絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に実質的に垂直な方向（すなわち、図１０Ａにおいて上下方向）に配置されたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。図９Ｂは、比較例２における心筋細胞の蛍光顕微鏡写真である。図１３Ｃは、比較例２および後述される比較例３において用いられた基板１００に形成された第１電極３１、第２電極３２、および絶縁性ファイバー５０の顕微鏡写真である。図１３Ｃに示されるように、比較例２および比較例３では、絶縁性ファイバー５０は、第１電極３１および第２電極を通る直線に垂直な方向（すなわち、図において上下方向）に配置されていた。
図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ほぼ全ての絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に実質的に垂直な方向（すなわち、図１０Ａにおいて上下方向）に配置されたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。図９Ｂは、比較例２における心筋細胞の蛍光顕微鏡写真である。図１３Ｃは、比較例２および後述される比較例３において用いられた基板１００に形成された第１電極３１、第２電極３２、および絶縁性ファイバー５０の顕微鏡写真である。図１３Ｃに示されるように、比較例２および比較例３では、絶縁性ファイバー５０は、第１電極３１および第２電極を通る直線に垂直な方向（すなわち、図において上下方向）に配置されていた。
（比較例３）
図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ほぼ全ての絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に実質的に垂直な方向（すなわち、図において上下方向）に配置されたこと、およびパルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、ほぼ全ての絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に実質的に垂直な方向（すなわち、図において上下方向）に配置されたこと、およびパルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
（比較例４）
図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、およそ半分の絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に平行な方向（すなわち、図１１Ａにおいて左右方向）に配置され、かつ他のおよそ半分の絶縁性ファイバー５０が当該直線に垂直な方向（すなわち、図１１Ａにおいて上下方向）に配置されたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。図９Ｃは、比較例４における心筋細胞の蛍光顕微鏡写真である。図１３Ｄは、比較例４および後述される比較例５において用いられた基板１００上の第１電極３１、第２電極３２、および絶縁性ファイバー５０の顕微鏡写真である。図１３Ｄに示されるように、比較例４および比較例５では、およそ半分の絶縁性ファイバー５０（噴出時間：１５分）は、第１電極３１および第２電極を通る直線に平衡な方向（すなわち、図において左右方向）に配置される一方で、残りの半分の絶縁性ファイバー５０（噴出時間：１５分）は、当該直線に直交する方向（すなわち、図において上下方向）に配置されていた。
図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、およそ半分の絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に平行な方向（すなわち、図１１Ａにおいて左右方向）に配置され、かつ他のおよそ半分の絶縁性ファイバー５０が当該直線に垂直な方向（すなわち、図１１Ａにおいて上下方向）に配置されたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。図９Ｃは、比較例４における心筋細胞の蛍光顕微鏡写真である。図１３Ｄは、比較例４および後述される比較例５において用いられた基板１００上の第１電極３１、第２電極３２、および絶縁性ファイバー５０の顕微鏡写真である。図１３Ｄに示されるように、比較例４および比較例５では、およそ半分の絶縁性ファイバー５０（噴出時間：１５分）は、第１電極３１および第２電極を通る直線に平衡な方向（すなわち、図において左右方向）に配置される一方で、残りの半分の絶縁性ファイバー５０（噴出時間：１５分）は、当該直線に直交する方向（すなわち、図において上下方向）に配置されていた。
（比較例５）
図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、一部の絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に平行な方向（すなわち、図１１Ａにおいて左右方向）に配置され、他の絶縁性ファイバー５０が、当該直線に垂直な方向（すなわち、図１１Ａにおいて上下方向）に配置され、かつパルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、一部の絶縁性ファイバー５０が、第１電極３１および第２電極を通る直線に平行な方向（すなわち、図１１Ａにおいて左右方向）に配置され、他の絶縁性ファイバー５０が、当該直線に垂直な方向（すなわち、図１１Ａにおいて上下方向）に配置され、かつパルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
（比較例６）
図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、絶縁性ファイバー５０が設けられなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。図９Ｄは、比較例６における心筋細胞の蛍光顕微鏡写真である。
図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、絶縁性ファイバー５０が設けられなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。図９Ｄは、比較例６における心筋細胞の蛍光顕微鏡写真である。
（比較例７）
図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、絶縁性ファイバー５０が設けられなかったこと、およびパルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、絶縁性ファイバー５０が設けられなかったこと、およびパルス電流が印加されなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表２は、実施例１および比較例１〜比較例７において測定されたβＭＨＣ産生率を示す。
以下の表３は、実施例１および比較例１〜比較例７において測定されたＭＹＬ２産生率を示す。
表２から明らかなように、以下の条件（Ｉ）および（ＩＩ）の両者が充足される場合には、βＭＨＣ産生率は、５７．９％という顕著に高い値である。実施例１を参照せよ。
条件（Ｉ） ９０％以上の絶縁性ファイバー５０は、第１電極３１および第２電極３２の両者を通る直線に±２０度以下の範囲で平行である。
条件（ＩＩ） パルス電流が印加されながら、心筋細胞１８０が培養される。
条件（Ｉ） ９０％以上の絶縁性ファイバー５０は、第１電極３１および第２電極３２の両者を通る直線に±２０度以下の範囲で平行である。
条件（ＩＩ） パルス電流が印加されながら、心筋細胞１８０が培養される。
一方、条件（Ｉ）および（ＩＩ）の少なくともいずれか一方が充足されない場合には、βＭＨＣ産生率は３６．５％未満という低い値である。比較例１〜比較例７を参照せよ。
表３から明らかなように、絶縁性ファイバーの方向に拘わらず、ＭＹＬ２産生率は、概ね３２％〜３７％の一定の値である。一方、表１から明らかなように、βＭＨＣ産生率は、条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の両者が満たされた場合には、著しく高くなる。言い換えれば、絶縁性ファイバーの利用は心筋細胞中のポリペプチド（タンパク質を含む）の産生量を増加させる。心筋細胞中で産生されるポリペプチドの中でも、条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）の両者が満たされた場合には、ＭＹＬ２のような他のポリペプチドとは異なり、βＭＨＣは、顕著に高い産生率で産生される。
本発明は、ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を効率的に産生させる方法を提供する。
１００ 基板
１ ガラス基板
２ 電気接点
３ 配線
４ 基準電極
５ 白金黒
６ 電極セット
１０ 囲い部材
３１ 第１電極
３２ 第２電極
４０ 絶縁膜
５０ 絶縁性ファイバー
６０ 絶縁シート
Ｂ 領域
１８０ 心筋細胞
１８２ 液体培地
２００ パルス電流発生器
１ ガラス基板
２ 電気接点
３ 配線
４ 基準電極
５ 白金黒
６ 電極セット
１０ 囲い部材
３１ 第１電極
３２ 第２電極
４０ 絶縁膜
５０ 絶縁性ファイバー
６０ 絶縁シート
Ｂ 領域
１８０ 心筋細胞
１８２ 液体培地
２００ パルス電流発生器
Claims (8)
- ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を産生させる方法であって、以下の工程
（ａ） 第１電極、第２電極、および複数の絶縁性ファイバーを表面に具備する基板上に前記心筋細胞を含有する液体培地を供給し、前記第１電極の表面、前記第２電極の表面、ならびに前記第１電極および前記第２電極の間に挟まれた領域を前記心筋細胞により被覆する工程、
ここで、
基板の平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの少なくとも一部は、前記第１電極および前記第２電極の間に位置しており、かつ
前記平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの９０％以上は、前記第１電極および前記第２電極の両者を通る直線に対して平行もしくは平行に対して±２０度以内の範囲で配向性を有しており、
（ｂ） 前記基板を静置する工程、および
（ｃ） 前記第１電極および前記第２電極を介して前記心筋細胞にパルス電流が印加されながら、前記心筋細胞を培養する工程、
を具備する、方法。 - 請求項１に記載の方法であって、
工程（ｂ）において、前記絶縁性ファイバーまたは前記基板の表面上に前記心筋細胞が接着するまで前記基板が静置される。 - 請求項１に記載の方法であって、
基準電極が前記液体培地に接している。 - 請求項３に記載の方法であって、
前記基準電極が接地されている。 - 請求項３に記載の方法であって、
前記基板が前記基準電極を表面に具備している。 - 請求項３に記載の方法であって、
前記液体培地が前記基準電極を含んでいる。 - 基板であって、
第１電極、
第２電極、および
複数の絶縁性ファイバー
を具備し、
前記第１電極、前記第２電極、および前記複数の絶縁性ファイバーは、前記基板の表面上に設けられており、
基板の平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの少なくとも一部は、前記第１電極および前記第２電極の間に位置しており、かつ
前記平面視において、前記複数の絶縁性ファイバーの９０％以上は、前記第１電極および前記第２電極の両者を通る直線に対して平行もしくは平行に対して±２０度以内の範囲で配向性を有している、基板。 - 請求項７に記載の基板であって、さらに
基準電極を表面上に具備する、基板。
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| JP2017039998A JP2018143144A (ja) | 2017-03-03 | 2017-03-03 | ヒト由来ｉＰＳ細胞から分化した心筋細胞においてβミオシン重鎖を効率的に産生させる方法 |
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