WO2016060260A1 - 組織片 - Google Patents

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fiber sheet
tissue piece
oriented fiber
cardiomyocytes
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劉　莉
俊君 李
南　一成
勇 陳
憲夫 中辻
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国立大学法人京都大学
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • FIG. 1 Photographs of cardiomyocytes cultured for 32 days and 14 days on a multi-electrode array (AF) with a PMGI-oriented fiber sheet and gelatin-coated multi-electrode array (Flat), respectively.
  • the electrical activity signal detection rates of cardiomyocytes on PLGA oriented fiber sheet (AF), random fiber sheet (RF) and gelatin coated multi-electrode array (Flat) are shown. Shown are cardiomyocytes cultured on a multielectrode array (Flat) coated with gelatin on a multielectrode array for 10 days (left) and cardiomyocytes cultured on a PLGA oriented fiber sheet (AF) for 32 days (right).
  • random fiber sheet means a fiber sheet in which fibers are randomly integrated.
  • An “orientation fiber sheet” is a fiber sheet in which fibers are integrated so that they are oriented in one direction. In particular, 60% or more of the fibers constituting the sheet are ⁇ 20 in the orientation direction (0 °). It means something within °.
  • an oriented fiber sheet is used in which 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more of the fibers constituting the sheet are within ⁇ 20 ° of the orientation direction.
  • multi-electrode array means an electrode in which a large number, for example, 64 microelectrodes are arranged on a substrate.
  • the cardiac muscle tissue piece of the present invention is brought into contact with the multi-electrode array, and the influence of the electrical stimulation or drug stimulation applied to the cells on the cell function can be observed.
  • drug candidate substance safety it is possible to evaluate the possibility that the candidate substance generates a lethal arrhythmia.
  • the shape and size of the cell culture sheet of the present invention are not limited, and may be appropriately determined according to the shape and size of the target tissue piece. For example, when used for transplantation, it may be determined according to the transplant target portion. In addition, when the obtained tissue piece is used in an assay using a multi-electrode array system, the size may be determined according to the multi-electrode array to be used.
  • the cell culture sheet of the present invention may have a spacer on the cell culture sheet, for example, on a frame.
  • the spacer is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cell culture and can be easily removed from the frame after the tissue piece is produced.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the tissue piece having the frame part may be used for transplantation as it is, or the frame may be cut off and used for transplantation.
  • the frame When cutting off the frame, cut off the part other than the part of the frame to be sandwiched with tweezers etc. in advance, attach the part where the cell layer is formed to the part to be transplanted, and then cut off the remaining part of the frame.
  • the frame portion is made of a material that is difficult to be decomposed in vivo, the frame portion can be similarly cut off and used for transplantation.
  • the tissue pieces produced on the cell culture sheet of the present invention include those having culture cell layers on both sides of the culture sheet.
  • a tissue piece having cell layers on both sides can be produced, for example, using the cell culture sheet of the present invention provided with a spacer.
  • cells may be seeded on one side of the sheet, or cells may be seeded in order on each side.
  • seeding cells one side at a time first place the spacer-attached surface in a culture vessel, seed the cells on one side of the sheet, and allow the cells to adhere. After the seeded cells adhere, the sheet is inverted and the cells are seeded on the opposite side of the sheet.
  • shaking culture may be performed.
  • a tissue piece having a three-dimensional structure can be obtained by forming cultured cell layers on both sides of the sheet.
  • packaging material used in the product examples include, but are not limited to, a packaging material having both gas permeability and airtightness, for example, a cell culture bag (Takara Bio Inc.).
  • the present invention evaluates the cell function of a tissue piece by detecting an electrical signal with a multi-electrode array from a tissue piece produced on a cell culture sheet having a frame around the sheet-shaped cell culture section. Provide a method. Furthermore, the present invention provides a method for evaluating the efficacy and / or safety of a drug candidate substance using the cell function as an index.
  • Example 1 Production of oriented fiber sheet by electrospinning method 1-1. Production of PLGA oriented fiber sheet Manufacturing Procedure 20-25% PLGA solution (PLGA (PLA 75%: PGA 25%): Sigma, P-1941, molecular weight: 66,000-107,000) in THF solution is placed in a syringe with a 23G plant needle (Nipro), and bubbles are removed. The sample was removed and set in a microsyringe pump at a flow rate of 10 mL / min. Aluminum adhesive tape (Sansho) was affixed to the surface of the high-speed rotating drum and placed at a distance of 10 cm from the tip of the syringe needle.
  • Fiber Sheet Thickness and Density According to the above method A, a PLGA oriented fiber sheet produced under a jet time of 40 seconds was photographed with an electron microscope (JEOL JEM1400, Japan), and the thickness was measured. Further, for each fiber sheet, the number (density) of fibers per 1 mm width of the sheet was examined by counting the number of PLGA fibers per unit length in a section cut perpendicular to the orientation direction.
  • the PLGA oriented fiber sheet had a thickness of 2 ⁇ m and a density of 300 / mm.
  • PMGI-oriented fiber sheet Production Procedure
  • a fiber material instead of PLGA solution, 16% PMGI solution (Michro chem) was used, and the above 1-1.
  • PMGI-oriented fiber sheet was produced.
  • electrospinning method it is possible to obtain a higher density fiber by increasing the fiber ejection time.
  • Low-density PMGI-oriented fiber sheet (AF (Low)) and high-density PMGI-oriented fiber sheet (AF (High) were prepared with an ejection time of 90 seconds and 300 seconds, respectively (FIG. 2F; scale bar 50 ⁇ m) Showing).
  • AF Low-density PMGI-oriented fiber sheet
  • AF (High) high-density PMGI-oriented fiber sheet
  • the thickness and density of the PMGI oriented fiber obtained under each condition were measured according to the method described in 1-1 above.
  • the thickness of the low-density PMGI-oriented fiber sheet (ejection time: 90 seconds) was 2 ⁇ m
  • the thickness of the high-density PMGI-oriented fiber sheet ejection time: 300 seconds
  • the density of each oriented fiber sheet was found to be 300 / mm in the case of the low density PMGI oriented fiber sheet and 400 / mm in the case of the high density PMGI oriented fiber sheet (FIG. 2H).
  • Example 2 Culture of cardiomyocytes on oriented fiber sheet 2-1. Cardiomyocytes on PLGA oriented fiber sheet Culture of cardiomyocytes derived from human iPS cells (IMR90-1) Cardiomyocytes differentiated from human iPS (IMR90-1) cells according to the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 5 were used. The cardiomyocyte colonies were transferred to a 50 ml centrifuge tube and centrifuged at 50 g ⁇ 2 minutes. The supernatant was discarded and washed once with PBS (GIBCO).
  • the protease solution was passed through a 40 ⁇ m filter set in the collecting centrifuge tube, and 10 ml of FBS 20% medium was added from the top of the filter (total 45 ml with 15 ml of protease solution and 30 ml of FBS medium). The total number of cells in 45 ml of the protease solution was counted. The cells were centrifuged at 1000 rpm ⁇ 3 minutes and the supernatant was discarded. Cells FBS20% medium is added in accordance with the concentration required (number of cells was adjusted to be 5 5x10 per FBS20% medium 100 [mu] l, then adjusted to 2x10 5 cells) were suspended by pipetting.
  • the surface is coated with glass or gelatin to which an oriented fiber sheet (AF, jetting time: 40 seconds, thickness: 2 ⁇ m) or random fiber sheet (RF, jetting time: 20 seconds, thickness: 2 ⁇ m) made of PLGA is adhered.
  • AF jetting time: 40 seconds, thickness: 2 ⁇ m
  • RF jetting time: 20 seconds, thickness: 2 ⁇ m
  • the adhesion of cardiomyocytes to each was compared using a glass (Gelatin Flat) and a glass (PLGA Flat) whose surface was coated with non-fibrous PLGA as a substrate.
  • 100 ⁇ l of the cell suspension obtained in A above was taken and seeded on PLGA oriented fiber sheet (AF), random fiber sheet (RF), gelatin flat and PLGA flat glass (cell number: 2 ⁇ 10 5 / substrate 1 cm 2). ).
  • FBS ( ⁇ ) IMDM medium composition: 1% MEM non-essential amino acid solution (Sigma), 1% penicillin-streptomycin (Gibco), 2 mM L-glutamine (Sigma), 0.5 mM L-carnitine (Sigma) , 0.001% 2-mercaptoethanol (Gibco), 1-2% BSA (Wako) or human serum albumin (Sigma-Aldrich), 4 ⁇ M CHIR (Axon) and 2 ⁇ M BIO (Calbiochem), hereinafter FBS ( ⁇ ) medium ) was changed.
  • Example 1-2 Cardiomyocytes on PMGI-oriented fiber sheet Using the PMGI-oriented fiber sheet, the effect of fiber sheet density on cell adhesion was similarly examined.
  • Example 1-2 A low-density PMGI-oriented fiber sheet (ejection time: 90 seconds, thickness: 2 ⁇ m, density: 300 / mm) and a high-density PMGI-oriented fiber sheet (ejection time: 300 seconds, thickness: manufactured by the same method as A) Cardiomyocytes were seeded according to the method of 2-1, on a cell culture substrate to which 4 ⁇ m and a density of 400 pieces / mm) were respectively adhered and a substrate (Flat) whose surface was coated with gelatin. The cell adhesion to the substrate was compared.
  • Example 3 Production of device for cell function evaluation by multi-electrode array system PMGI-oriented fiber sheet (AF, ejection time: 90 seconds, thickness: manufactured by electrospinning method according to Example 1 and collected on an aluminum adhesive tape 2 ⁇ m, density: 300 / mm) using a pressure press machine (MNP-001, ASONE), 64 channel multi-electrode systems (nitride-coated gold electrodes, multi-channel systems, Germany) (electrode size: 30 ⁇ m, It was transferred onto a space (200 ⁇ m, 8 ⁇ 8 grid array) to obtain a device for cell function evaluation (FIG. 4A, left).
  • AF ejection time: 90 seconds, thickness: manufactured by electrospinning method according to Example 1 and collected on an aluminum adhesive tape 2 ⁇ m, density: 300 / mm
  • MNP-001, ASONE 64 channel multi-electrode systems
  • 64 channel multi-electrode systems nitride-coated gold electrodes, multi-channel systems, Germany
  • Example 4 Action potential measurement of cardiomyocytes by multi-electrode array system 4-1. Action potential of cardiomyocytes on PMGI oriented fiber sheet Measurement of Action Potential of Cultured Cardiomyocytes
  • iPS cell (IMR90-1) -derived cardiomyocytes were seeded according to the method of Example 2. After 5 hours, it was confirmed that the cells were firmly attached, and a medium was added to the entire chamber (FBS 20% medium). The cells were cultured in a 37 ° C. incubator, and after the second day, the medium was changed to FBS ( ⁇ ) medium, and the medium was changed once every four days. Before changing the medium, the electrical signal was measured.
  • PLGA-oriented fiber sheet AF, ejection time: 40 seconds, thickness: 2 ⁇ m, density: 300 / mm
  • PLGA random fiber sheet RF, ejection time
  • Human iPS (IMR90-1) -derived cardiomyocytes were cultured on a multi-electrode array (20 seconds, thickness 2 ⁇ m) and a multi-electrode array (Flat) coated with gelatin, respectively, and the electrical signals of the cells were measured.
  • the signal detection rate from the cardiomyocytes on the multi-electrode array to which the fiber sheet is transferred increases with time, and electrical signals can be detected from all channels from the sixth day (100% ) Even after 14 days, the signal detection rate did not decrease.
  • the signal detection rate from the channel was low (about 80 to 90%) (FIG. 5E).
  • the cardiomyocytes cultured on the PLGA-oriented fiber sheet were observed after 32 days from the start of culture. No cell detachment was observed (FIG. 5F).
  • the detection rate of the electric signal diagram is high on the fiber sheet due to the high cell adhesion, and the cell adhesion is weak on the gelatin-coated substrate, and the signal detection rate is low because the cell density is not uniform. It is thought to be lower.
  • the propagation speed in the direction parallel to the oriented fiber is compared with the case of using a flat multi-electrode array after the sixth day. It was confirmed that it was obviously faster (FIG. 7C). Since PMGI is non-conductive, the oriented fiber sheet does not become a conductive wire.
  • the excitement propagation on the 6th and 14th days after the culture was compared.
  • the excitement propagation speed increases as the culture period is extended, there is almost no difference in the propagation speed of the cardiomyocytes cultured on each substrate on the sixth day.
  • the propagation speed in the parallel direction of the PLGA-oriented fiber sheet was confirmed to be about 3 times faster than the propagation speed in the vertical direction and the propagation speed of the myocardial tissue on the random fiber sheet and flat substrate. (FIG. 7E). Since PLGA is non-conductive, the oriented fiber sheet does not become a conductive wire.
  • high density PLGA oriented fiber sheet AF-H, ejection time: 10 minutes, thickness: 10 ⁇ m, density: 10,000 / mm
  • low density PLGA oriented fiber A multi-electrode array to which a sheet (ejection time: 40 seconds, thickness: 2 ⁇ m, density: 300 lines / mm) and a random fiber sheet (ejection time: 20 seconds, thickness: 2 ⁇ m) are transferred, and a gelatin-coated multi-electrode array ( (Flat) was used to measure the QT interval of cardiomyocytes on day 10 of culture.
  • the QT interval was measured over time for 14 days from the cardiomyocytes on each substrate, as in 7-1 (FIG. 8E). Although no change in QT interval with time was observed, the QT interval of cardiomyocytes cultured on high-density oriented fiber sheet (AF-H) was always the shortest. From this, it was shown that the maturity of the cells increases as the density of the oriented fiber sheet increases. Moreover, it was confirmed that the QT interval was longer on the low-density oriented fiber (AF) and the random fiber sheet (RF) than the cardiomyocytes on the high-density oriented fiber sheet, and the variation between samples was large. . This is thought to be related to cell adhesion. On the other hand, cells on a flat electrode are considered to have a lower electrophysiological maturity since the QT interval is clearly the longest than the cardiomyocytes on the fiber sheet.
  • Example 8 Immunostaining and RT-PCR of myocardial tissue fragments using myocardial markers 8-1. Immunostaining of myocardial tissue on PLGA oriented fiber sheet Furthermore, in order to investigate the cell maturity of myocardial tissue fragments on oriented fiber sheet, myocardial cell markers ⁇ -MHC, ⁇ -MHC, myosin light chain (MLC) ) -2V, cardiac troponin T (cTnT) 2 and ⁇ -actinin were immunostained.
  • myocardial cell markers ⁇ -MHC, ⁇ -MHC, myosin light chain (MLC) ) -2V, cardiac troponin T (cTnT) 2 and ⁇ -actinin were immunostained.
  • FIG. 9A shows a diagram merged with the fiber and DAPI staining signals.
  • PMGI-oriented fiber sheet Similar to 8-1 above, PMGI-oriented fiber sheet (AF, ejection time: 90 seconds, thickness: 2 ⁇ m) transferred to a multi-electrode array and gelatin-coated electrode ( ⁇ -MHC and MLC2V as cardiomyocyte-specific markers and Actin (primary antibody: cytoskeletal markers) for cardiomyocytes derived from human iPS (IMR90-1) cultured for 14 days each on Immunostaining was performed on goat polyclonal antibody (Santa Cruz, SC 1616) and secondary antibody: Alexa Fluor 488-conjugated anti-goat IgG (Jackson Immno Research # 705-546-147) (FIG.
  • Example 9 Observation of Myocardial Tissue Piece on Oriented Fiber Sheet by Electron Microscope 9-1. Observation of Myocardial Tissue Fragment on PLGA Oriented Fiber Sheet
  • TEM transmission electron microscope
  • the cardiomyocytes cultured on the PLGA fiber sheet were tightly bonded so as to be wound around the fiber (FIG. 10A). Furthermore, in the cell tissue piece produced on the oriented fiber sheet, unlike the random fiber, it was confirmed that the arrangement structure of the myofiber in the myocardial cell coincided with the direction of the fiber. Furthermore, the thickness of the cardiomyocyte tissue piece on this oriented fiber sheet is 30 to 50 ⁇ m, and the cardiomyocyte layer is formed on both sides of the fiber sheet, and has a multilayer structure of about 10 layers. (FIG. 10A, left).
  • the hERG channel is an inwardly rectifying voltage-gated potassium channel in the heart, and it is known that a QT interval extension is observed by blocking. Arrhythmia is caused by increasing the concentration used and low cell maturity. With the addition of E-4031, an extension of the QT interval was observed depending on the concentration of E-4031 regardless of the structure of the fiber and the presence or absence of fiber (FIG. 11A).
  • Example 12 Cardiomyocyte tissue graft transplantation into heart Adhesion of Cardiomyocyte Tissue Piece to Mouse Heart
  • the adhesion between the myocardial tissue produced on the oriented fiber sheet and the isolated mouse heart was examined.
  • the method of Example 2 was applied to a PLGA oriented fiber sheet having a PLGA frame (ejection time: 10 minutes, thickness: 10 ⁇ m, density: 10,000 / mm), prepared according to the method of Example 11 and A.
  • cardiomyocytes were cultured for 6 days to produce cultured tissue pieces. The cultured tissue piece was peeled off together with the PLGA-oriented fiber sheet, and the fiber myocardial tissue piece was allowed to stand on the surface of a 3-month-old mouse heart.
  • FIG. 13A Three hours after standing, it was observed that the heart tissue piece adhered to the pericardium (FIG. 13A). Lifting the myocardial tissue piece with tweezers did not peel off the mouse heart.
  • a myocardial tissue piece was similarly prepared on a PLGA-oriented fiber sheet having a PDMS frame part, and the three sides of the frame part were cut off, and only the cell culture part was similarly allowed to stand on the surface of the mouse heart. In some cases, adhesion of the myocardial tissue piece to the heart surface was also observed (FIG. 13B).
  • A. Implantation of myocardial cell tissue piece into living body rat In the same manner as A described above, it was produced on a PLGA oriented fiber sheet having a PLGA frame part (ejection time: 10 minutes, thickness: 10 ⁇ m, density: 10,000 / mm).
  • the myocardial tissue piece was transplanted to the heart surface of a nude rat 6 days after the start of cell culture. Two weeks after transplantation, the heart was collected, fixed with 4% paraformaldehyde and dehydrated, and then embedded in paraffin to prepare 2 ⁇ m sections.
  • the myocardial grafts formed on both surfaces of the PLGA oriented fiber sheet were stacked in two layers so that the orientation directions were the same (FIG. 14A, upper stage).
  • the stacked grafts adhered to each other after 2 hours, and their adhesive strength was such that they could not be easily removed with tweezers (FIG. 14A, bottom). From this result, it became clear that the myocardial tissue piece formed on the oriented fiber can be easily multilayered.
  • the tissue piece was peeled from the PDMS spacer, and a multi-electrode array (30 ⁇ m spaced 200 ⁇ m , 8 ⁇ 8 grid array), and the electrical signal was measured.
  • the two-layer myocardial grafts overlapped each other one minute at the time one minute later, but after three hours, the two-layer myocardial grafts synchronized. It was confirmed that the pulsation occurred (FIG. 14B).
  • Oriented fiber 2 Multi-electrode array 3: Oriented fiber sheet + multi-electrode array 4: Culture chamber 5: Multi-electrode array 6: Frame 7: Spacer 8: Myocardial tissue piece

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Abstract

　本発明は、配列構造を示す培養細胞を含む組織片、特に心筋組織片を得る方法であって、配向性ファイバーシート上で細胞を培養することを含む、方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法により製造される組織片を提供する。　また、本発明は、細胞の電気生理学的機能を評価するためのデバイス、並びに細胞の電気生理学的機能を評価するための方法を提供する。本発明はさらに、細胞培養用シートを提供する。

Description

組織片
　本発明は、配列構造を示す培養細胞を含む組織片を得る方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法により製造される組織片を提供する。
　本発明はさらに、細胞の電気生理学的機能を評価するためのデバイス、並びに細胞の電気生理学的機能を評価するための方法を提供する。本発明はまた、細胞培養用シートを提供する。
　心筋梗塞を始めとする重症心不全疾患の患者は日本で約８０万人おり、年間約１８万人が死亡している。現在のところ心臓移植が唯一の有効な治療法であるが、日本では極めて深刻なドナー不足であり、また免疫拒絶反応などの問題を抱えている。多能性幹細胞（例えば、胚性多能性幹細胞（ＥＳ）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））の樹立によって、心臓移植に代わる治療法として、心筋細胞再生治療による心筋機能を回復させることが出来ると期待されている。臨床において移植治療に用いるためには、生体内と同じ配列構造を模倣し、高成熟で安全な心筋組織片を得る必要がある。
　ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞から心筋細胞を誘導する方法は種々提案されている。現在心筋細胞の誘導に使用されている最も一般的な方法は、胚様体のサイトカイン（例えば、DKK1、bFGF、アクチビンA（ActivinA）、およびBMP4）との懸濁培養、またはマウスEND2(近位内胚葉(visceralendoderm)様細胞)との接着共培養である（非特許文献１～４）。
　また本発明者らは、新規低分子化合物を用いた安定で高効率な臨床グレードの心筋分化誘導法（～98%）を提案している(非特許文献５、特許文献１)。かかる方法にて誘導した心筋細胞も、分化した細胞はヒト心筋細胞の重要な成熟マーカーであるβ-MHC遺伝子発現量が成体ヒト心臓の発現量と比べて少ない(～10%)、心筋配列組織構造を持たず、電気生理学的にも十分な成熟度が得られないという課題が残る。
　心筋細胞移植法として提案されている方法には大別すると以下の２種類がある:（１）心不全の疾患部に細胞を直接注射する方法（２）心筋細胞をシート状に成形し、疾患部に移植する方法。
　ヒトES細胞由来心筋細胞の直接注射法によって、モルモットの心筋梗塞を改善することに成功したとの報告がある(非特許文献６)。しかしながら直接注射法では、注入した細胞溶液が心筋組織より流出する、血流にのって全身に散布されるなど、細胞移植の効率が低いことが指摘されている。また生着する細胞が数%以下であり、治療効果も十分ではないと考えられている。
　また、細胞シート技術として温度応答性培養皿を用いた細胞のシート化技術が提案されている（非特許文献７）。かかる技術を用いて心筋シートを作成し、これを移植する臨床試験が開始されている。しかし、この技術を用いて構築された心筋シートは細胞が単層で、配向性がなくランダムに分布され、生体内の心筋構造を模倣することができない。そのため、心筋細胞収縮力が弱い、成熟度が低い、強度が低くハンドリングが難しいなどの課題が依然として残されている。また、支持体上に形成されたままで移植可能な心筋細胞シートの製造については未だ報告されていない。
　より効果的な移植やアッセイに使用するため、生体内細胞構造を模倣した構造の組織片の作製が望まれており、マイクロエンジニアリング手法で生体内細胞構造を模倣する研究が注目されている。例えば生体内において、心筋細胞は配列構造を有しており、マイクロラインや、マイクロパンチや、ファイバーなどの手法によって、培養心筋細胞を配列化させる試みが報告されている（非特許文献８～１４）。
　医薬品の開発における安全性の評価には従来、動物由来の初代培養細胞や動物が使用されてきたが、ヒトの生体組織の細胞と機能との種差、ロットによる差など様々な問題を抱えている。また、現在では、全ての領域の医薬品について心毒性心電図ＱＴ延長に関する非臨床実験の実施を求める指針がある。ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞から心筋細胞を誘導し、これを培養して得られる心筋組織片を用いて薬物の毒性評価や動態評価に応用することに対する産業界の需要は高い。
　細胞の電気生理学的評価には、細胞内電位を記録することができるパッチクランプ法がよく使われている。しかしながらパッチクランプ法には、パッチ電極により細胞が侵襲され、長期間の測定が難しい。また、手技が難しくスクリーニングに向かない。
　多電極技術の発展により、多電極上でヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を培養し、その電気生理学機能を評価することが可能となっている（非特許文献１５および１６）。この技術は細胞外電位活動を測定するため、細胞にダメージを与えずに、細胞培養しながらその機能を長期間観察・測定することができる。この技術により創薬スクリーニングに欠かせない薬物の毒性評価のみならず、ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導および成熟度プロセスをモニタリングすることも可能となっている。
　従来の心筋分化誘導法で得られる心筋細胞組織は心筋細胞の向きがバラバラで配向されておらず筋収縮力が弱い、ＱＴ延長実験等心電図を取得すると頻繁に不整脈が発生する、電極との接着性が弱く、長期培養ができないなど、創薬スクリーニングの応用に用いるための、安定した評価システムとして提供するにはまだまだ課題が残る。そもそも、心筋細胞がランダム、あるいは塊状に増殖した心筋細胞組織からの電気信号は、生体内の心筋組織における挙動を十分に模倣しているとは言い難い。
国際出願公開第２０１３／１１１８７５号公報
Laflamme，M.A. & Murry，C.E. Heart regeneration. Nature 473，326-335（2011). Rajala，K.，Pekkanen-Mattila，M. & Aalto-Setala，K. Cardiac differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cells Int 2011，383709（2011). Yang，L. et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature 453，524-528（2008). Paige，S.L. et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One 5，e11134（2010). Minami I，et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined，cytokine- and xeno-free conditions. Cell Rep. 2012 Nov 29; 2(5): 1448-60. Shiba Y，et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature 489，322-325（2012) Kawamura M，et al. Enhanced survival of transplanted human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes by the combination of cell sheets with the pedicled omental flap technique in a porcine heart. Circulation，128，587-594（2013) D.-H. Kim et al. "Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs" PNAS. 12(2)，565-570（2010) D.-H. Kim et al. "Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration" Integrative Biology 4，1019-1033（2012) Donghui Zhang et al. "Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes" 34 5813-5820（2013) C.-W Hsiao et al. "Electrical coupling of isolated cardiomyocyte clusters grown on aligned conductive nanofirous meshes for their synchronized beating" Biomaterials 34，1063-1072（2013) X. Zong et al. "Electrospun fine-textured scaffolds for heart tissue constructs" Biomaterials 26，5330-5338（2005) I. C. Parrag et al. "Fiber alignment and coculture with fibroblasts improves the differentiated phenotype of murine embryonic stem cell-derived cardiomyocutes for cardiac tissue engneering" 109（39)，813-822（2012) J. Wang et al. "Effect of engineered anisotropy on the susceptibility of human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes to arrhythmias" Biomaterials 34（35)，8878-8886（2013) Otsuji T. G. et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research，4，201-213（2010) A. L. Lahti，et al. Silvennoinen and K. Aalto-Setala "Model for long QT syndrome type 2 using human iPS cells demonstrates arrhythmogenic characteristics in cell culture. Sisease Models & Mechanisms，5，220-230（2010)
　本発明の第一の態様においては、一方向に配列された培養細胞を有する組織片、例えば心筋組織片を得ることのできる細胞培養用方法を提供することを目的とする。本発明はまた、当該方法を用いて得られる、配列された培養細胞を有する組織片並びに当該組織片の評価方法を提供することを目的とする。
　本発明の第二の態様においては、培養細胞の電気生理学的機能を評価するためのデバイスを提供することを目的とする。
　本発明の第三の態様においては、細胞培養の足場材として用いられる細胞培養用シートを提供することを目的とする。
　本発明は、下記を提供する：
（１)　配向性ファイバーシートと、該配向性ファイバー上の培養心筋細胞とを含む、心筋組織片。
（２)　配向性ファイバーシートが培養心筋細胞層の間に介在している、１の心筋組織片。
（３）　該心筋細胞が多能性幹細胞から誘導された心筋細胞である請求項１または２に記載の心筋組織片。
（４）　配向性ファイバーシートにおけるファイバーの直径が０．１μｍ～５μｍ、シートの幅１ｍｍ当たりのファイバーの本数３０～１５０００本、シートの厚みが０．１μｍ～２０μｍである、１～３いずれかに記載の心筋組織片。
（５）　心筋細胞層の数が１０層以上である、１～４いずれかに記載の心筋組織片。
（６）　配向性ファイバーシートが生体内分解性の材料で構成されている、１～５いずれかに記載の心筋組織片。
（７）　配向性ファイバーシートが分解されにくい素材で構成されている、１～５いずれかに記載の心筋組織片。
（８）　配向性ファイバーシートが、周囲にフレーム部を有する、１～７何れかに記載の心筋組織片。
（９）　フレーム部が配向性ファイバーシートと同一素材で構成されている、８記載の心筋組織片。
（１０）　フレーム部が配向性ファイバーシートと別素材で構成されている、８記載の心筋組織片。
（１１）　複数の配向性ファイバーシートと、該複数の配向性ファイバーシート上で培養された複数の心筋細胞層を含み、配向性ファイバーシートが同一配向方向にて心筋細胞層間に介在している、１～１０いずれかに記載の心筋組織片。
（１２）　さらに培養用チャンバー部分を有し、該心筋細胞が、該配向性ファイバーシート上の培養用チャンバー中にある、１～４、６および７いずれかに記載の心筋組織片。
（１３）　該心筋細胞のβ－ＭＨＣの発現量が成人の正常心筋細胞の１０％以上である、１～１２いずれかに記載の心筋組織片。
（１４）　細胞の機能評価に用いるための、１～１３いずれかに記載の心筋組織片。
（１５）　移植に用いるための、６、８～１１および１３いずれかに記載の心筋組織片。
（１６）　複数の心筋組織片を配向性ファイバーシートの配向が同一となるよう重ねて培養する工程を含む、１１に記載の心筋組織片の製造方法。
（１７）　得られた心筋組織片の電気信号を、該心筋組織片と接触させた多電極アレイにより検出して心筋細胞の機能を評価する工程をさらに含む、１６に記載の方法。
（１８）　１４に記載の心筋組織片を多電極アレイに接触させて電気信号を検出することを含む、心筋細胞の機能評価方法。
（１９）　細胞機能を指標に医薬候補物質の有効性の評価を行う、１８に記載の方法。
（２０）　細胞機能を指標に物質の安全性の評価を行う、１８に記載の方法。
（２１）　滅菌された包装材および、その中に封入されている１～１５いずれかに記載の心筋組織片を含む製品。
（２２）　多電極アレイおよび、該多電極アレイ上の配向性ファイバーシートを含む、心筋細胞機能評価用デバイス。
（２３）　該配向性ファイバーシート上に培養用チャンバー部分をさらに有する、２１に記載の心筋細胞機能評価用デバイス。
（２４）　該培養用チャンバー部分の中に培養心筋細胞をさらに含む、２３に記載の心筋細胞機能評価用デバイス。
（２５）　２４記載のデバイスの培養心筋細胞の電気信号を多電極アレイにより検出する工程を含む、心筋細胞機能評価方法。
（２６）　シート状細胞培養部と該細胞培養部の周囲にフレームを含む、細胞培養用シート。
（２７）　該シート状細胞培養部がファイバーシートである、２６に記載の細胞培養用シート。
（２８）　シート状細胞培養部とフレームが同一素材で構成されている、２６または２６に記載の細胞培養用シート。
（２９）　該シート状細胞培養部とフレームが異なる素材で構成されている、２６または２７に記載の細胞培養用シート。
（３０）　該ファイバーシートにおいて、ファイバーがランダムな構造を有する、２７～２９いずれかに記載の細胞培養用シート。
（３１）　該ファイバーシートにおいて、ファイバーが配向性の構造を有する、２７～２９いずれかに記載の細胞培養用シート。
（３２）　該ファイバーシートが生体内分解性の素材で構成されている、２７～３１いずれかに記載の細胞培養用シート。
（３３）　該ファイバーシートが分解されにくい素材で構成されている、２７～３１いずれかに記載の細胞培養用シート。
（３４）　フレーム上に、スペーサーをさらに備える、２６～３３いずれかに記載の細胞培養用シート。
（３５）　２６～３４何れかに記載の細胞培養用シートと、該細胞培養用シート上の培養細胞を含む、組織片。
（３６）　複数の細胞培養用シートが培養細胞層間に介在している、３５記載の組織片。
（３７）　滅菌された包装材および、その中に封入されている３５または３６に記載の組織片を含む製品。
　本発明により、配列した培養細胞を含む組織片を得ることができる。生体内において配列構造を取る心筋細胞などを本発明の方法によって培養して得られる配列構造を有する心筋組織片は、ランダムに増殖させた培養細胞と比べて成熟度が高く、また不整脈を生じ難い等、移植や薬物スクリーニングにおいて好適に用いることができる。
配向性ファイバーシート上での心筋組織片の製造および、配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイシステムによる心筋細胞機能評価の一態様の概略図を示す。 エレクトロスピニング法により製造したＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）およびランダムファイバーシート（ＲＦ）を電子顕微鏡により撮影した写真。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）およびランダムファイバーシート（ＲＦ）を構成するファイバーの直径の分布を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）およびランダムファイバーシート（ＲＦ）の弾力性を示す。 エレクトロスピニングにより紡糸する際の、ＰＬＧＡファイバーの素材濃度の変化によるファイバー直径の変化を示す。 噴出時間４０秒にて作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシート中のファイバーの配向性を示す。 エレクトロスピニング法における噴出時間を９０秒（左）および３００秒（右）の条件下で製造したＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの顕微鏡撮影写真。スケールバーは５０μｍを示す。 噴出時間９０秒にて製造したＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの配向性を示す。 図２Ｆに示すそれぞれのＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの厚みを示す。 図２Ｆに示すそれぞれのＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの、シートの厚み１ｍｍあたりのファイバーの本数を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）、ランダムファイバーシート（ＲＦ）、ゼラチンコーティングしたフラット基板またはＰＬＧＡコーティングしたフラット基板上に播種した心筋細胞の接着性を示す。 エレクトロスピニングによる噴出時間１０秒、４０秒、１０分、１５分の条件下で作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシートを示す。 図３Ｂの条件下で作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの厚みを示す。 図３Ｂの条件下で作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシートにおける、シートの幅１ｍｍあたりのファイバーの本数を示す。 図３Ｂの条件下で作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシートに対する細胞接着性を示す。 高密度および低密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートおよびゼラチンコーティングした基板上でそれぞれ培養したヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）細胞由来心筋細胞の接着性を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを多電極アレイに貼り付け、さらにＰＤＭＳ培養用チャンバーをその上に設けたデバイスの写真。 ＰＳ配向性ファイバーシート（左図）およびＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（右図）を多電極アレイに接着させたデバイスの写真。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で２日間培養した心筋細胞の写真。 多電極アレイ上に貼り付けたＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上で１４日間培養した心筋細胞の写真（左）、および多電極アレイより取り外した配向性ファイバー部分（右上）並びに多電極アレイ部分（右下）を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で心筋細胞を１４日間培養した際の電気シグナルの経時的な検出を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）並びにゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上でそれぞれ３２日間および１４日間培養した心筋細胞の写真。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞の電気活動シグナル検出率を示す。 多電極アレイ上に配したゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で１０日間培養した心筋細胞（左）およびＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）上で３２日間培養した心筋細胞（右）を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）並びにゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で１４日間培養した心筋細胞の電気活動パターンを示す。 図６Ａの電気活動パターンにおいて検出される不整脈の頻度（％）を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で６日間培養した心筋細胞の活動電位の振幅を示す。 図６Ａの各電極上で１４日間培養した際の電位振幅の経時的な変化を示す。 高密度（ＡＦ－Ｈ）および低密度（ＡＦ）のＰＬＧＡ配向性ファイバーシート、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞の電気活動パターンを示す。 ゼラチンコーティングしたフラット上の心筋細胞で検出される不整脈（上段）並びに高密度（ＡＦ－Ｈ）および低密度（ＡＦ）のＰＬＧＡ配向性ファイバーシート、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞から検出される不整脈の頻度（下段）を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞の振幅値の経時的変化を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）、およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で心筋細胞を１４日間培養した後、心筋組織片の一点へ電気刺激を与えた場合の、興奮到達分布図（Activation map）を示す。 図７Ａのそれぞれのデバイス上の心筋細胞の、培養開始１４日後における、興奮の伝播速度を示す。 図７Ａのぞれぞれのデバイス上の心筋細胞の、培養開始から１４日間における、興奮伝播速度の経時的変化を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞の培養開始６日目、１４日目における、電気刺激時の電気的興奮の到達分布図を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞の培養開始後６日目、１４日目における興奮伝播速度を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）並びにゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で６日間培養した心筋細胞におけるＱＴ間隔を示す。 図８Ａの各多電極アレイ上で１４日間培養した際のＱＴ間隔の経時的な変化を示す。 高密度（ＡＦ－Ｈ）および低密度（ＡＦ）のＰＬＧＡ配向性ファイバーシート、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞におけるＴ波の検出効率の経時的変化を示す。 高密度（ＡＦ－Ｈ）および低密度（ＡＦ）のＰＬＧＡ配向性ファイバーシート、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞の培養開始１０日目におけるＱＴ間隔延長を示す。 高密度（ＡＦ－Ｈ）および低密度（ＡＦ）のＰＬＧＡ配向性ファイバーシート、ランダムファイバーシート（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞の経時的なＱＴ間隔の変化を示す。 ＰＳ配向性ファイバーシートが多電極アレイに接着しており、その上にガラスチャンバーを有する機能評価用デバイス（左図）および該デバイス上で培養した心筋細胞の、培養１４日目におけるＱＴ間隔を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）、ランダムファイバー（ＲＦ）およびゼラチンコーティングしたフラット（Ｆｌａｔ）上の心筋細胞における、心筋細胞特異的なマーカー（α－ＭＨＣ、β－ＭＨＣ、ＭＬＣ２Ｖ、ＴｎＴ２およびα－Ａｃｔｉｎｉｎ）についての免疫染色を行い、ファイバーおよびＤＡＰＩ染色シグナルとマージした図を示す。 図９Ａのそれぞれの条件で培養した心筋組織片におけるβ－ＭＨＣのＲＮＡレベルをＲＴ－ＰＣＲにより検出したグラフを示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ、上段）、ランダムファイバーシート（ＲＦ、中段）およびゼラチンコーティングしたフラット（Ｆｌａｔ、下段）のそれぞれについて、図９ＡのＴｎＴ２についての染色シグナルを高速フーリエ変換した値を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）およびゼラチンコーティングしたフラットな多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で心筋細胞を１４日間培養して得られた心筋組織片の、心筋細胞マーカー（ＭＣＬ２Ｖおよびβ－ＭＨＣ）ならびにアクチンについての免疫染色像を示す。配向性ファイバーの上で培養された心筋細胞はファイバーの方向に沿って、並んでいることがわかった。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）およびランダムファイバーシート（ＲＦ）上で製造した心筋組織片の電子顕微鏡による撮影図を示す。 ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上で心筋細胞を培養して得られた心筋組織片を、急速凍結、ディープエッチ電子顕微鏡法により撮影した心筋組織片内部の構造を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＡＦ）、ランダムファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ（ＲＦ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で培養した心筋細胞へ、Ｅ－４０３１を添加した際のＱＴ間隔延長を示す。 ゼラチンコーティングしたフラットな多電極アレイ上の細胞における、Ｅ－４０３１添加５～１０分後における不整脈の検出を示す。 Ｅ－４０３１添加５～１０後における、図１１Ａのそれぞれの多電極アレイ上の心筋細胞で検出された、不整脈の頻度（％）を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの周囲にフレームを有する細胞培養用シートならびに、該シート上で製造した心筋シート。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの周囲にＰＬＧＡフレームを有する、ＰＤＭＳ製スペーサーに接着した細胞培養用シート。 ＰＳ配向性ファイバーシートの周囲にＰＤＭＳフレームを有する、ＰＤＭＳ製スペーサーに接着した細胞培養用シート。 粘着剤として市販の粘着剤であるシリコーン一液縮合型ＲＶＴゴムを用いて製造した、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートがガラスリングに接着している、細胞培養用シート。 生体内分解性素材ＰＬＧＡの分解性を示す写真。 ＰＬＧＡフレームを有するＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上で作製した心筋組織片を接着させたマウスの心臓を示す。 ＰＤＭＳフレームの三片を切り落として、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート状の心筋組織片を接着させたマウスの心臓を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の心筋組織片を移植したヌードラットの心臓（左）における、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色、ヒト特異的プローブによるin situ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ｃＴｎＴの免疫染色像を示す。 ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上で作製した単層の心筋組織片の二層化を示す。 二層化させた心筋組織片の、二層化１分後および３時間後における拍動を示す。
　本発明は、配向性ファイバーシート上で細胞を培養する工程を含む、配列構造を有する組織片、例えば心筋組織片の製造方法を提供する。本発明の方法により製造した組織片は、例えば、移植および、例えば多電極アレイシステムを用いた電位測定による細胞機能評価に使用し得る。さらに、該細胞機能評価に基づいて、医薬候補物質の有効性および安全性を評価し得る。
　本発明はさらに、上記の製造方法により製造された、配向性ファイバーシートおよび、該配向性ファイバーシート上の培養細胞、例えば培養心筋細胞を含む、組織片を提供する。該組織片は、移植に使用しうる。また、多電極アレイシステムによって、電位測定による細胞機能評価およびそれに基づいた、医薬候補物質の安全性および有効性の評価に使用し得る。
　本明細書ならびに請求の範囲において、「組織片（tissue-like construct）」は、シート状の細胞培養用基材、例えばファイバーシートおよび、該シート状の基材上の培養細胞を含む、複合体を指す。組織片を構成する培養細胞が培養心筋細胞の場合、「心筋組織片（cardiac tissue-like construct）」という。なお、培養細胞から組織片が形成されるという点で、「組織片」を「再生組織片」あるいは「心筋組織片」を「再生心筋組織片」ということがある。
　本発明に用いられるファイバーシートは、ファイバーが集積されてなるシートである。該ファイバーシートでは、ファイバーはランダムに集積されていても、配向、特に一方向に配向するよう集積されていてもよい。
　本明細書において、「ランダムファイバーシート」は、ファイバーがランダムに集積されてなるファイバーシートを意味する。「配向性ファイバーシート」は、ファイバーが一方向に配向するよう集積されてなるファイバーシートであって、特に、シートを構成するファイバーのうち６０％以上のファイバーが配向方向（０°）の±２０°以内にあるものを意味する。好ましくは、シートを構成するファイバーのうち７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のファイバーが配向方向の±２０°以内にある配向性ファイバーシートが用いられる。
　ファイバーの素材はポリマーである。ファイバーの製造に用いられるポリマーとしては、細胞の増殖および生理活性に有意に影響を及ぼさないものであればよく、使用目的に応じて生体内分解性のものであっても生体内で分解されにくいものであってもよい。例えば、移植に用いる細胞シートの製造に用いる場合には、生体内分解性のものが好適に用いられる。一方、薬物のスクリーニングおよび/または心毒性試験に用いられる組織片の製造に用いる場合には、長期培養向き、強度の高いものが好適に用いられる。
　生体内分解性のポリマーとしては、医療用素材として知られている素材が好ましく、安全性が確認され、いずれかの先進国において生体内分解性の医療用材料に使用することが認可されているものが特に好適に用いられる。例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ酪酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン酢酸ビニル（ＰＥＶＡ）、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）およびポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＬＧＡは最終的に生体内で分解し、水と炭酸ガスとなって排出されることが知られている素材であり、特に好適に用いられる。ＰＬＧＡはＰＬＡ（ポリ乳酸）とＰＧＡ（ポリグリコール酸）の組み合わせ比率によって、分解スピードを調節することが可能である。
　生体内で分解されにくいファイバーの素材としては、細胞培養に対して障害となるような成分を含まないものであって、かつファイバーを形成できるものであればよく例えば（ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアミド（ＰＡ）およびポリメチルグルタルイミド（ＰＭＧＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。ポリメチルグルタルイミド（ＰＭＧＩ）およびポリスチレン（ＰＳ）が特に好適に用いられる。
　シートを構成するファイバーの直径は特に限定されないが、例えば０．１～５μｍ、好ましくは０．５～３μｍ、より好ましくは１～２．５μｍのものが例示される。ファイバーの直径は、用いる素材、素材溶液の濃度および製造手法によって変動し得、素材および目的に応じて適宜最適なものを得ればよい。
　例えば、ＰＬＧＡおよびＰＭＧＩを素材として用いる場合、ファイバーの直径が１～１．５μｍであるものが例示される。また、ＰＳを用いる場合は、ファイバーの直径は２～２．５μｍであるものが例示される。
　本発明の組織片に用いる配向性ファイバーシートは、シートの厚みが０．１μm以上、例えば１μm～２０μm、好ましくは１μｍ～１５μｍのものが好適に用いられる。移植に用い得る組織片には、５～２０μｍ、より好ましくは５～１５μｍの厚みを有する配向性ファイバーシートが好適に用いられる。多電極アレイを用いた創薬スクリーニングに用い得る組織片製造には、好ましくは１～５μｍ、より好ましくは２μｍ～５μｍの厚みを有するものが好適に用いられる。
　配向性ファイバーシートの幅１ｍｍあたりのファイバー数（密度）は、用いるファイバーの直径によって変動し得る。したがって、該配向性ファイバーシートの密度は、用いる素材によって変動し得る。本発明の配向性ファイバーシートの密度は、１０本／ｍｍ以上、好ましくは３０～１５０００本／ｍｍ、より好ましくは５０～１３０００本／ｍｍのものが好適に用いられる。該配向性ファイバーシート幅１ｍｍ当たりのファイバーの数は、該シートを配向方向と垂直になるよう切断した断面の、配向方向と垂直方向の単位長さに対するファイバー数をカウントすることによって確認することができる。
　例えば、ファイバー直径が１～１．５μｍである配向性ファイバーシート、例えばＰＬＧＡまたはＰＭＧＩ配向性ファイバーシートは、好ましくは、１ｍｍあたり１５０～１５０００本、より好ましくは２００～１３０００本の密度を有する。該配向性ファイバーシートを移植に用い得る組織片の製造に用いる場合は、１ｍｍあたり５０００～１５０００本、より好ましくは８０００～１３０００本の密度を有している配向性ファイバーシートが好ましい。また、該配向性ファイバーシートを、多電極アレイによる機能評価用の組織片製造に用いる場合は、該ファイバーシートは、好ましくは１ｍｍあたり１５０～１０００本、より好ましくは１５０～５００本の密度を有する。
　例えば、ファイバー直径が２～２．５μｍである配向性ファイバーシート、例えばＰＳ配向性ファイバーシートは、好ましくは、１ｍｍあたり３０～１０００本、より好ましくは５０～５００本、さらに好ましくは５０～３００本の密度を有する。該配向性ファイバーシートを移植に用い得る組織片の製造に用いる場合は、１ｍｍあたり１５０～１０００本、より好ましくは２００～５００本の密度を有している配向性ファイバーシートが好ましい。また、該配向性ファイバーシートを、多電極アレイによる機能評価用の組織片製造に用いる場合は、該ファイバーシートは、好ましくは１ｍｍあたり３０～１００本、より好ましくは５０～１００本の密度を有する。
　本発明の配向性ファイバーシートは、例えばファイバーの素材となるポリマーを含む溶液または懸濁液を用い、エレクトロスピニング法によって製造することができる。エレクトロスピニング法では、ファイバーのコレクターとなるシート、例えばアルミテープのような金属製シートを巻き付けた回転ドラムを用い、ドラムを回転させながらノズルから噴射されるファイバーを回転ドラム上へ巻き取ることで、ファイバーシートを得る態様が例示されるがこれに限定されるものではない。
　かかる態様の場合には、ポリマーの種類、分子量、溶媒の種類、ポリマー溶液の濃度や温度、ノズルの口径、ポリマー溶液供給速度、ドラムの回転速度、ノズルとコレクターの距離、印可電圧等を調節することによって、所望の径のファイバーからなる所望の構成を有するシートを得ることができる。
　ポリマー溶液の濃度は、使用するポリマーの種類や分子量、溶媒により異なるため一概にはいえないが、０．１～４０ｗｔ％に調製することが好ましい。ポリマー濃度が０．１ｗｔ％以上であれば生産性に優れ、ファイバー集積シートが得られやすい。また、ポリマー濃度が４０ｗｔ％以下であれば、ポリマー溶液の粘度が上昇しすぎて、ノズルから噴出しにくくなることを防ぎやすい。
　ポリマー溶液の溶媒は、上記の濃度でポリマーを溶解させることができれば、特に限定されず、例えば、アセトン、トリアセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン等を用いてよい。溶媒は、溶媒が揮発してノズルの先端にポリマーが詰まることを抑制しやすい点から、揮発性の高い溶媒を用いることが好ましい。また、溶媒は、ポリマーの溶解性の向上等のために、複数の溶媒を混合して用いてもよい。
　印可する電圧は、用いるポリマーの種類や物性により適宜設定すればよい。例えば０．１～５０ｋｖ、特に１ｋｖ～４０ｋｖとすることが例示される。
　ノズルとコレクターの距離は、用いるポリマーの種類や物性、印可電圧により適宜設定すればよい。例えば１０～１０００ｍｍ、特に３０ｍｍ～５００ｍｍとすることが例示される。
　本発明の配向性ファイバーシートの形状およびサイズは限定的ではなく、目的とする組織片の形状またはサイズに応じて適宜定めればよい。例えば、移植に用いる場合には、移植対象部分に応じて定めればよい。また、多電極システムを用いたアッセイに利用する場合には、使用する多電極アレイにあわせてサイズを定めればよい。
　本発明の方法により培養できる細胞の種類は、一方向へ配向した状態での培養が望まれる細胞であれば特に限定されない。例えば心筋細胞が例示される。心筋細胞としては、多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から誘導された細胞が例示される。多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する方法は種々知られており、例えば特許文献１および非特許文献５に記載の方法が例示される。また、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来の心筋細胞として市販されている細胞を用いてもよい。
　本発明の組織片製造方法においては、配向性ファイバーシート上に細胞を播種し、細胞を培養する。配向性ファイバーシートを通常使用される細胞培養用容器に設置して、細胞を播種して培地中で細胞培養を行えばよい。配向性ファイバーシートは、細胞培養容器の底面に接着させても、または該ファイバーシートを培地中で浮遊させてもよい。シートの接着には、例えば圧着、または、粘着剤、例えば後で剥がすことのできる接着剤を用いて接着する等、種々の方法を用いることができる。粘着剤は、細胞培養に影響を及ぼさない物質であればとくに限定されず、例えば、ポリマー溶液、例えばファイバー製造に用いたものと同じポリマー溶液、ＰＤＭＳおよび市販の生体適合性粘着剤（例えばシリコーン一液縮合型ＲＶＴゴム（信越　KE-45-T））が挙げられる。
　あるいは、培養用チャンバーを形成して配向性ファイバーシート上に設置し、該チャンバー内で細胞を培養してもよい。本明細書並びに請求の範囲において、「培養用チャンバー」は、細胞培養時に、培地を投入するための壁として設置される構造体を指す。該チャンバーの素材は細胞培養に悪影響を及ぼさない物質であれば特に限定されない。例えば、透明、無毒の特性があり、マイクロ流体材料としてよく使われているポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）およびガラスが例示される。また、市販の細胞培養用プレートのごとく、チャンバーが設置された配向性ファイバーシートが複数一体となった構造体、例えば市販の６穴や９６穴ウエル細胞培養用プレートの底部が配向性ファイバーシートとなっているごとき構造のものも本態様に含まれる。
　本発明の方法において細胞培養用培地、培養条件は公知の細胞培養法より培養する細胞、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、培養は、静置した状態で行っても、振盪しながら行ってもよい。本発明の方法により細胞を培養すると、一方向に配向するファイバーの配向方向に沿って培養細胞が配向した組織片を得ることができる。
　例えば、ｉＰＳ細胞より誘導された心筋細胞を培養する場合の条件として下記が例示される：
　播種：１～１００×１０５／ｃｍ２
　培地：２０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ（非特許文献５および以下の実施例２に記載）あるいは０．０４～０．４％アルブミン含有ＩＭＤＭ（非特許文献５および以下の実施例２に記載）等
　培養条件：３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養。適宜培地交換を行う。
　例えば移植に用いる心筋組織片を調製する場合、かかる条件にて約４～１０日培養すればよい。
　本発明の方法により心筋細胞を播種して培養した場合、生体内に近い配列構造を取る心筋細胞で構成される心筋組織片を得ることができる。本発明の方法により得られる心筋組織片に含まれる心筋細胞においては、細胞の成熟度を示す心筋細胞特異的なマーカーであるβ－ＭＨＣの発現が上昇することが確認された。また、かかる心筋細胞の電位活動を多電極アレイ上で調べたところ、生体の心臓において認められるものと類似したＱＴ波形が確認された。
　本明細書において、「ファイバーシート上」で細胞を培養する、という記載は、ファイバーシートの片面に培養細胞が形成される態様で培養する場合、両面に培養細胞が形成される態様で培養する場合のいずれも含む。培養細胞がファイバーシートのファイバー間に入り込んでいてもよい。また、本明細書並びに請求の範囲における、「ファイバーシート上」の培養細胞または組織片という記載は、ファイバーシートの片面に培養細胞層が形成されている態様、ファイバーシートの両面に培養細胞層が形成されている態様のいずれをも含む。また、ファイバーシートのファイバー間に細胞が入り込んでいてもよい。
　シートの両面で細胞を培養するには、例えばファイバーシートの周囲にスペーサーを有するシートを用いてもよい。本明細書において、「スペーサー」は、シート面が培養容器の底面と接触しないようにするために、細胞培養用シートの周辺に設置する構造体である。スペーサーの素材は、細胞培養に影響を及ぼさず、かつシートから容易に剥がすことができる素材であれば特に限定されない。例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）およびガラスが例示される。スペーサーの貼り付け方法は限定的ではなく、例えばスペーサーをシートへ圧着する、細胞培養に影響を及ぼさず、後で剥がすことの可能な粘着剤を用いて接着する等、適宜常套の手段を用いればよい。該粘着剤は、細胞に影響を及ぼさないものであればよく、例えば、ポリマー溶液、例えばファイバー製造に用いたものと同じポリマー溶液およびＰＤＭＳ、および市販の生体適合性粘着剤（例えばシリコーン一液縮合型ＲＶＴゴム（信越　KE-45-T））が挙げられる。
　配向性ファイバーシートにスペーサーを付した場合は、シートの片面に細胞を播種しても、または、片面ずつ順番に細胞を播種してもよい。片面ずつ細胞を播種する場合、まずスペーサーが付された面を上にして培養容器へ置き、シートの片面へ細胞を播種して細胞を接着させる。播種した細胞が接着した後、シートを反転させ、シートの反対面へ細胞を播種する。両面に細胞層を有する組織片を製造する場合、例えば、培養容器ごと振盪しながら培養を行ってもよい。シート両面に培養細胞層が形成されることにより、三次元立体構造を有する組織片を得ることが可能となる。
　配向性ファイバーシートの両面に培養細胞層を有する組織片は所望により複数重ねて用いても良い。具体的には、スペーサーを備えた細胞培養用シートの両面に培養細胞層を形成させたものを２以上準備し、各配向性ファイバーシートよりスペーサーを外し、２以上の配向性ファイバーシートの配列方向が同じとなるようこれらを重ね合わせる。あるいは振盪培養によって得られた２以上の組織片を同様に重ね合わせる。重ねて培養すると上下の組織片が結合して、一体となった、厚みのある三次元・多層配列構造を有する組織片、例えば心筋組織片を得ることができる。
　本発明の製造方法により、例えば１０層以上の多層構造を有する組織片、例えば心筋組織片を得ることができる。こうして得られる三次元・多層配列構造を有する組織片は、多層構造の間にファイバー層による空隙が設けられることから、多層構造の内部にある細胞へも栄養が届き、組織片の可能な厚みに関する制限が少ない。
　本発明の製造方法により得られた組織片の性質、例えば細胞成熟度を、例えば、培養用容器またはガラス等の基板に接着して、免疫染色等のアッセイにより調べることができる。例えばｉＰＳ細胞から誘導された心筋細胞を本発明の製造方法に用いた場合、心筋細胞マーカーであるβ－ＭＨＣが強く発現した、配列構造を有する心筋細胞から構成される心筋組織片を得ることができる。
　本発明は、本発明の製造方法によって得られる心筋組織片を提供する。本発明の心筋組織片としては、含まれる心筋細胞のβ－ＭＨＣの発現量が成人由来の正常心筋細胞の５％以上、１０％以上、または１５％以上のもの、例えば約２０％のものが例示される。
　本発明はさらに、製造した組織片、例えば心筋組織片の電気信号を、該組織片に接触させた多電極アレイにより検出して細胞機能を評価する工程を含む、組織片製造方法を提供する。
　本発明はさらに、組織片、例えば心筋組織片を多電極アレイに接触させて電気信号を検出することを含む、細胞の機能評価方法を提供する。
　培養細胞の細胞外電位を測定できる多電極アレイ（Multiple electrode array：MEA）システムとしては、例えばMulti-channel system MCS GmbH社（ドイツ）のマルチ電極アレイシステムやアルファメッドサイエンティフィック社のＭＥＤシステムなどが市販されている。多電極アレイシステムとは基板上に配した多数の微小電極により複数の細胞からの電気信号を同時に観測し、あるいは細胞や組織へ電気的に刺激を与えて刺激に対する細胞の応答を観測することができるシステムである。多電極アレイシステムを用いることにより、細胞に損傷を与えることなく、細胞の機能を評価することができる。
　本発明の心筋組織片では、生体内における細胞により近い機能を観察することが期待される。具体的には、多電極アレイシステムによって、活動電位波形を測定し、電気信号を検出可能なチャネルの数、心拍数、電位振幅、ＱＴ間隔、Ｔ波の検出率、不整脈の有無などに基づいて心筋細胞の機能を評価することができる。
　本明細書並びに請求の範囲において、「多電極アレイ」とは基板上に微小電極が多数、例えば64個配された電極を意味する。
　さらに、本発明の心筋組織片を多電極アレイへ接触させ、細胞へ与えた電気刺激や薬物刺激の、細胞機能に対する影響を観察することができる。また、医薬候補物質安全性の評価において、候補物質が致死性の不整脈を発生させる可能性を評価することができる。
　配向性ファイバーシート上で製造した組織片、例えば心筋組織片を多電極アレイ上に接触させることによって、電気信号を測定することができる。本態様においては、配向性ファイバーシートを含む組織片、例えば心筋組織片を多電極アレイ上に接触させてよい。または、培養用チャンバーを有する配向性ファイバーシートの培養用チャンバー内で細胞を培養し、チャンバーごと多電極アレイ上に接触させてもよい。培養細胞は配向性ファイバーシートへ強く結合し、またシートが丈夫であるため、組織片の取り扱いが容易である。
　また、移植に用いるために製造した組織片、例えば心筋組織片を、多電極アレイシステムによって評価することも可能である。例えば、移植用組織片の培養と並行して同じ条件で確認用の組織片の培養を行い、適宜、該確認組織片から細胞外電位を計測しながらちょうど良い成熟度となったタイミングで組織片を移植に用いることができる。
　あるいは、移植用組織片を製造し、移植前に多電極アレイ上で細胞の機能を調べて移植用の組織片の状態が良いことを確認した上で移植することができる。本態様においては、同時に作成した複数の組織片から最も状態の良いものを選んで移植に供することも可能である。
　例えば、移植用の心筋組織片を作製する場合、その成熟度をＱＴ間隔などを指標に確認して、移植のタイミングを図ることが可能である。さらに、多電極アレイを用い、得られる心筋組織片の拍動を観察して心筋組織片が不整脈を生じにくいことを移植前に確認した上で移植に用いることで、より安全性の高い治療を行うことができる。
　細胞機能はまた、配向性ファイバーシートを多電極アレイ上へ接着し、該配向性ファイバーシート上で培養している細胞から電気信号を測定することによって評価してもよい。本体用では細胞を培養しながら、当該培養細胞の活動電位を測定することによって、細胞の培養と同時に細胞の機能を評価することができる。
　本態様においては、細胞培養のために配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイごと培養容器へ投入しても、多電極アレイに貼り付けた配向性ファイバーシートが培養液に浸かるよう、多電極アレイ上に貼り付けた配向性ファイバーシート上に培養用チャンバーを設けてもよい。
　本発明はさらに、多電極アレイおよび、該多電極アレイ上に貼り付けたファイバーシートを含む、細胞機能評価用デバイスを提供する。該デバイスのファイバーシートは、ランダムファイバーシートであっても、または配向性ファイバーシートであってもよい。
　該デバイスに配向性ファイバーシートを用いる場合、該ファイバーシートは上記配向性ファイバーシートについて説明したような性質、例えば厚み、直径および密度を有していてよい。
　該細胞機能評価用デバイスは、デバイスごと細胞培養容器内に投入して用いてもよいし、ファイバーシート上に培養用チャンバーを有し、チャンバー内で細胞を培養するものでもよい。また市販の細胞培養用プレートのごとくチャンバーを有するデバイスを複数一体とした態様で提供されてもよい。
　本発明のデバイスにより、細胞機能の評価ができる細胞は特に限定されない。ファイバーシートが配向性ファイバーシートである場合は、生体内で配列した状態を構成している細胞、例えば心筋細胞の機能の評価に好適に用いられる。心筋細胞は、例えば、多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から誘導された細胞であってもよい。
　細胞培養にあたっての細胞培養用培地、培養条件は公知の細胞培養法より培養する細胞、目的に応じて適宜選択すればよい。配向性ファイバーシートを貼り付けた多電極アレイ上で細胞を培養すると、一方向に配向するファイバーの配向方向に沿って培養細胞が配列し、多電極アレイ上に配列した培養細胞層が形成される。
　本発明のデバイスへ心筋細胞を播種して培養した場合、多電極アレイ上に配列した心筋細胞層が形成される。該細胞層は、従来の方法で得られるランダムなあるいは塊状の細胞層よりも、生体内の心筋細胞に近い構造となり、生体内における細胞により近い機能を観察することが期待される。
　本発明のデバイスは、培養用チャンバー中に培養細胞、例えば培養心筋細胞を有するものとして提供されてもよい。
　本発明のデバイスは、創薬の種々の段階において好適に用いることができる。具体的には、薬剤スクリーニングにおいて、医薬候補物質の有効性および/または安全性の評価に用いることができる。
　したがって、本発明はさらに、本発明のデバイスの、配向性ファイバーシート上の培養細胞、例えば培養心筋細胞の電気信号を多電極アレイにより検出する工程を含む、細胞機能評価方法を提供する。本発明の細胞機能評価方法は、さらに本発明のデバイスの配向性ファイバーシート上で細胞を培養する工程を含んでいてもよい。
　本発明のデバイス上で培養された心筋細胞は、細胞の成熟度を示す心筋細胞特異的なマーカーであるβ－ＭＨＣの発現やＱＴ間隔の観察により、成熟度が高いものであることが確認された。また、本発明のデバイス上で培養した心筋細胞を培養した場合、細胞の電極上への接着性が高く、多電極上に配向性ファイバーシートを設けないで培養した場合と比して長期培養が可能、電気信号を検出可能なチャネル数が格段に多い、また不整脈の発生が格段に少ないことから、安定したアッセイを行うことができる。
　本発明はまた、配向性ファイバーシートを多電極アレイに接着させる工程、該配向性ファイバーシート上で細胞を培養する工程、および細胞の電気信号を多電極アレイにより検出する工程を含む、細胞機能評価方法を提供する。
　本発明はさらに、配向性ファイバーシート上の、配列構造を有する培養細胞の電気信号を、該細胞と接触させた多電極アレイにより検出する工程を含む、細胞機能評価方法を提供する。当該細胞機能評価方法において、細胞は、本発明のデバイス上、例えば配向性ファイバーシート上に設けられたチャンバー内で培養されていてもよい。あるいは、配向性ファイバーシート上、例えばシート上のチャンバー内で培養した、配列構造を有する細胞を、多電極アレイと接触させてもよい。
　本発明は、シート状細胞培養部および、該細胞培養部の周囲にフレームを含む、細胞培養用シートを提供する。当該細胞培養用シートは、組織片、例えば移植、または薬剤スクリーニングに使用し得る組織片の製造に用いることができる。
　本明細書ならびに請求の範囲において、「細胞培養用シート」は、細胞培養部を含む、組織片の製造に用い得る、シート状の細胞培養用の基材を指す。
　本明細書ならびに請求の範囲において、「シート状細胞培養部」は、本発明の細胞培養用シートの一部であって、細胞がその上で培養されるシート上の構造を有する部分を指す。
　細胞培養部は、その表面に細胞が接着して増殖できる素材並びに表面形状を有するものであればよく、従来から細胞培養用支持体に用いられるポリマー素材のシート、ポリマー線維の不織布、ゲル状シート、ナノ加工した基板などが例示される。細胞培養用の支持体に用いられるポリマーとしては、配向性ファイバーシートの素材として例示する樹脂がいずれも好適に用いられる。細胞培養部の素材並びに表面の形状は培養しようとする細胞に応じて適宜選択すればよい。
　本発明の細胞培養用シートの細胞培養部として、ポリマー製のファイバーを集積させてなるファイバーシートが例示される。該ファイバーシートは、ランダムファイバーシートであっても、配向性配向性ファイバーシートであってもよい。
　ファイバーシートの素材は、細胞培養用シートの使用目的に応じて、生体内分解性のものであっても、または生体内で分解されにくいものであってもよい。例えば、移植に用いる組織片の製造に用いる場合には、生体内分解性のものが好適に用いられる。一方、薬物のスクリーニングおよび/または安全性試験に用いられる組織片の製造に用いる場合には、長期培養に向き、強度の高いものが好適に用いられる。
　該細胞培養用シートの細胞培養部が配向性ファイバーシートである場合、該配向性ファイバーシートは、上記のような性質、例えば厚み、直径および密度を有していてよい。
　本明細書ならびに請求の範囲において、「フレーム」は、細胞培養部の周囲に形成された、枠状の部分を意味する。フレーム部分は、ピンセット等で挟むことができ、それによりファイバーシート部分の構造にダメージを与えずに細胞培養用シートを取り扱うことが容易となる。また、フレーム部分を形成することによって、ファイバーシート上に細胞を培養して組織片を作製した後、培養細胞部分にダメージを与えず、組織片を取り扱うことが容易となる。
　フレームの幅は限定的ではなく、用途によって適宜定めればよいが、例えば２ｍｍ～２ｃｍ程度、特に５ｍｍ～１．５ｃｍ程度とすればよい。
　フレームを構成する素材は、細胞増殖ならびに生理活性に有意に影響を及ぼさないものであって、ピンセット等で扱うことができる程度の強度を有していれば良く、特に限定されない。フレームを構成する素材は、生体内分解性の素材であっても、分解されにくい素材であってもよく、細胞培養部と同一であっても異なる素材であってもよい。フレーム部分は、例えば、細胞培養部、例えばファイバーシートを形成した後、その周囲に所望の幅となるよう樹脂素材を塗布した後、固化させることによって形成することができる。
　本発明の細胞培養用シートの形状およびサイズは限定的ではなく、目的とする組織片の形状やサイズに応じて適宜定めればよい。例えば、移植に用いる場合には、移植対象部分に応じて定めれば良い。また、得られる組織片を、多電極アレイシステムを用いたアッセイに利用する場合には、使用する多電極アレイにあわせてサイズを決めればよい。
　本発明の細胞培養用シートは、該細胞培養用シート上、例えばフレーム上に、スペーサーを有していてもよい。スペーサーは細胞培養に悪影響を及ぼさず、かつ組織片製造後にフレームから容易に剥がすことができる素材であれば特に限定されない。例えば、透明、無毒の特性があり、マイクロ流体材料としてよく使われているポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が例示される。
　スペーサー幅は特に限定的でなく、シートを支えることができればよい。スペーサーの高さは目的とする組織片の厚み、使用する培養用容器のサイズ等に応じて適宜定めれば良い。
　フレームとスペーサーの接着方法は限定的ではなく、例えばフレーム上へスペーサーを圧着する、ポリマー溶液、例えばファイバーを形成するポリマー溶液を塗りつける、細胞培養に影響を及ぼさず、後で剥がすことの可能な粘着剤、例えば市販の生体適合性粘着剤（例えばシリコーン一液縮合型ＲＶＴゴム（信越　KE-45-T）で接着する等、適宜常套の手段を用いれば良い。または、細胞培養部を作成した後、これをスペーサーへ、例えば圧着などにより転写し、次いでスペーサー部分上に溶液としたポリマーを塗布する等によってフレームを形成してもよい。または、スペーサーに、粘着剤を塗布して、細胞培養部を接着すると同時に、フレームを作成してもよい。粘着剤は、例えば、ポリマー溶液、例えばファイバー製造に用いたものと同じポリマー溶液およびＰＤＭＳ、および市販の生体適合性粘着剤（例えばシリコーン一液縮合型ＲＶＴゴム（信越　KE-45-T））であってよい。
　本発明の細胞培養用シートを用いて培養できる細胞の種類は特に限定されない。例えば細胞培養部に配向性ファイバーシートを用いる場合には、一方向へ配向した状態での培養が望まれる細胞であれば特に限定されない。例えば心筋細胞が例示される。心筋細胞としては、多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から誘導された細胞が例示される。多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する方法は種々知られており、例えば非特許文献５や特許文献1に記載の方法が例示される。また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞や由来の心筋細胞として市販されている細胞を用いてもよい。
　本発明の方法においては、細胞培養部上に細胞を播種し、培養する。例えば、本発明の細胞培養用シートを通常使用される細胞培養用容器に設置し、細胞を播種して、培地中で細胞培養を行ってよい。細胞培養容器の底面に細胞培養用シートを培養後に剥がせるように貼り付けて用いてもよい。シートの貼り付けには、例えば圧着や、後で剥がすことのできる接着剤にて接着する等種々の方法を用いることができる。または、本発明の細胞培養用シートを、培地中で浮遊させて培養を行ってもよい。
　細胞培養用シート上に細胞を播種し、細胞を培養する。細胞培養用培地、培養条件は公知の細胞培養法より培養する細胞、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、培養は、静置した状態で行っても、振盪させながら行ってもよい。本発明の細胞培養用シート上で細胞を培養して製造される組織片は、細胞培養用シートのフレーム部分に培養細胞層が形成されない。よって、ピンセット等でフレーム部分を挟んで取り扱うことが可能なため、細胞を傷つけることなく組織片を取り扱うことができる。
　本発明の細胞培養用シートの細胞培養部に配向性ファイバーシートを用いる場合、一方向に配向するファイバーの配向方向に沿って培養細胞が配向して組織化した組織片を得ることができる。
　細胞培養部が配向性ファイバーシートである細胞培養用シート上に心筋細胞を播種して培養した場合、生体内に近い配列構造を取る心筋細胞で構成される心筋組織片を得ることができる。本発明の方法により得られる心筋組織片に含まれる心筋細胞においては、細胞の成熟度を示す心筋細胞特異的なマーカーであるβ－ＭＨＣの発現が上昇することが確認された。また、かかる心筋細胞の電位活動を多電極アレイ上で調べたところ、生体の心臓において認められるものと類似したＱＴ波形が確認された。
　本発明はさらに、本発明の細胞培養用シートおよび、該細胞培養用シート上の培養細胞を含む、組織片を提供する。本発明は特に、本発明の細胞培養用シートおよび、該培養用シートの細胞培養部上に培養細胞を含む、組織片を提供する。
本発明はさらに、本発明の細胞培養用シート上で、細胞を培養する工程を含む、組織片の製造方法を提供する。
　例えば、細胞培養部が配向性ファイバーシートである本発明の細胞培養用シートを用いて心筋細胞を培養して得られる心筋組織片は、心筋細胞が一方向に配列して組織化されており、生体内と同様の配向性を有している、より生体組織に近い組織片である。
　また、本発明の細胞培養用シートを用いて製造される組織片は、培養細胞が結合していないフレーム部分を有するため、細胞を傷つけることなく組織片を容易に取り扱うことができる。そのため、該組織片を用いて移植を行う場合、移植操作の効率が改善される。
　フレーム部分が生体内分解性素材で構成されている場合、フレーム部分を有する組織片をそのまま移植に用いても、または、フレームを切り落として移植に用いてもよい。フレームを切り落とす場合は、ピンセット等で挟むためのフレームの一部分以外を事前に切り落として、細胞層が形成されている部分を移植対象部分に接着させた後に、フレームの残りの部分を切り落として移植操作を行うことで、移植操作を効率良く行うことも可能である。また、フレーム部分が生体内で分解されにくい素材で構成されている場合は、同様にフレーム部分を切り落として、移植に用いることができる。
　本発明の細胞培養用シート上で製造された組織片は、該培養用シートの両面に培養細胞層を有するものを含む。両面に細胞層を有する組織片は、例えば、スペーサーを備えた、本発明の細胞培養用シートを用いて製造し得る。スペーサーを備えた細胞培養用シートを用いる場合は、該シートの片面に細胞を播種しても、または片面ずつ順番に細胞を播種してもよい。片面ずつ細胞を播種する場合は、まずスペーサーが付された面を上にして培養容器へ置き、シートの片面へ細胞を播種して細胞を接着させる。播種した細胞が接着した後、シートを反転させ、シートの反対面へ細胞を播種する。両面に細胞層を有する組織片の製造時には、振盪培養を行ってもよい。シート両面に培養細胞層が形成されることにより、三次元立体構造を有する組織片を得ることができる。
　両面に細胞層を有する組織片を、所望により複数重ねて用いても良い。具体的には、スペーサーを備えた細胞培養用シートの両面に培養細胞層を形成させたものを２以上準備し、各細胞培養用シートよりスペーサーを外し、２以上の組織片の配向方向が同じとなるようこれらを重ね合わせる。あるいは、振盪培養に得られた両面に培養細胞層が形成された組織片を同様に重ね合わせる。重ねてしばらく培養すると上下の組織片が結合して、一体となった、厚みのある三次元・多層配列構造を有する組織片を得ることができる。
　本発明の細胞培養用シートを用いて製造される、三次元・多層配列構造を有する組織片、例えば１０層以上の構造を有する組織片は、多層構造の間にファイバー層による空隙が設けられることから、多層構造の内部にある細胞へも栄養が届き、組織片の可能な厚みに関する制限が少ない。
　例えばｉＰＳ細胞から誘導された心筋細胞を用いて、本発明の細胞培養用シート上で組織片を製造した場合、一方向に配列した、β－ＭＨＣが強く発現した心筋組織片を得ることができる。さらに、該心筋組織片は、多電極アレイシステムによる活動電位の測定により生体内で見られるものと類似したＱＴ波形を示し得る。
　さらに、本発明の細胞培養用シート上で製造した組織片を、多電極アレイ上に置いて細胞外活動電位を測定することができる。したがって、本発明はさらに、多電極アレイにより電気信号を検出する工程を含む、組織片の機能評価方法を提供する。
　例えば移植用組織片を製造する場合、移植用組織片の培養と並行して同じ条件で確認用の組織片の培養を行い、適宜、確認用組織片から細胞外電位を計測しながら、ちょうど良い成熟度となったタイミングで組織片を移植に用いることができる。本態様においては、組織片を多電極アレイ上へ置く。例えば移植用心筋細胞を培養する場合、その成熟度をＱＴ間隔を指標に確認して、移植のタイミングを図ることが可能である。
　あるいは、移植用組織片を製造し、移植前に多電極アレイ上で細胞の機能を調べて移植用の組織片の状態が良いことを確認した上で移植することができる。本態様においては、同時に作成した複数の組織片から最も状態の良いものを選んで移植に供することも可能である。
　例えば、心筋細胞を用いて移植用心筋組織片を製造する場合は、移植前に多電極アレイを用いて得られる心筋組織片が不整脈を生じにくいことを確認した上で移植に用いることで、より安全性の高い治療を行うことができる。
　本発明はさらに、本発明の細胞培養用シートを用いて製造した組織片を、例えば心筋組織片を滅菌された包装材に封入してなる製品を提供する。該製品は、滅菌された包装材中に、本発明の組織片を、細胞培養用の培地とともに含んでいてよい。包装材中に封入することにより、運搬が容易となる。
　該製品に用いる包装材としてはガス透過性と得気密性を併せ持つ包装材、例えば細胞培養用バッグ(タカラバイオ株式会社)）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また、本発明の組織片はまた、多電極アレイを用いた創薬スクリーニングに好適に用いられる。移植用の組織片と同様に、好適なＱＴ間隔時間を示すものや、不整脈を起こさないものを選んで薬剤スクリーニングに適用することができる。
　したがって、本発明は、シート状細胞培養部の周辺にフレームを有する細胞培養用シート上で製造した組織片から、多電極アレイにより電気信号を検出することにより、該組織片の細胞機能を評価する方法を提供する。さらに、本発明は、該細胞機能を指標に医薬候補物質の有効性および/または安全性を評価する方法を提供する。
　図１に本願の概要を示す。配向性ファイバーシートを用いて製造した心筋細胞片は、（Ａ）機能評価または（Ｂ）移植および機能評価等に使用し得る。（Ａ）機能評価プロセスに使用する場合、例えば該配向性ファイバーシートを多電極システムの電極上に転写する（ａ）。該ファイバーシート（ｂ）上に、さらに培養用チャンバーを設置し、心筋細胞を培養し、電気信号をリアルタイムで測定して（ｃ）、薬剤スクリーニングを行うことができる（ｄ）。（Ｂ）移植および機能評価に使用できる組織片を製造する場合、配向性ファイバーシートの周囲に、所望によりフレームを作成し（ａ）、該ファイバーシート上に心筋細胞を播種する（ｂ）。所望により、スペーサーを接着させた配向性ファイバーシートを使用してもよい。配向性ファイバーシート上で心筋細胞を配向した状態で培養する（ｃ）。また、製造した心筋組織片（ｄ）は、多電極アレイに接触させることによって機能を評価でき（ｅ）、薬剤スクリーニングに使用し得る（ｆ）。製造した組織片（ｄ）を、所望により複数重ね合わせてさらに多層化させてよく（ｇ）、これらの組織片を移植に使用することができる（ｈ）。
　本発明を実施する具体的方法の一例を以下に示す。本発明はこれら具体的手法に限定されるものではない。
実施例１．エレクトロスピニング法による配向性ファイバーシートの製造
１－１．ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの製造
Ａ．製造手順
　２０～２５％ＰＬＧＡ溶液（ＰＬＧＡ（ＰＬＡ７５％：ＰＧＡ２５％）：Ｓｉｇｍａ, P-1941, 分子量：66,000～107,000）のＴＨＦ溶液を２３Ｇのプラント針（ニプロ）を付けたシリンジにいれ、気泡を抜き、マイクロシリンジポンプに流速１０ｍＬ／分でセットした。高速回転ドラムの表面にアルミ粘着テープ（三商）を貼り付け、シリンジの針先端から１０ｃｍの距離に設置した。プラント針にプラス電極、高速回転ドラムにマイナス電極を設置し、高速回転ドラムを３０００回転／分で回転させた。マイクロシリンジポンプのスイッチを入れ、８ｋＶの電圧下で、回転ドラム上のアルミ粘着テープの上にファイバーを一方向に配向させて噴出した（噴出時間：４０秒）。ファイバー噴出後、配向性ファイバーシートが収集されたアルミテープを回収し、配向性ファイバーシートを得た。また、同様の方法でランダムにファイバーを噴出させ、ランダムファイバーシート（Ｒａｎｄｏｍ　Ｆｉｂｅｒ，ＲＦ）を作製した（噴出時間：２０秒）（図２Ａ）。
Ｂ．ＰＬＧＡファイバーの性質
ＰＬＧＡファイバーシートの直径
　上記Ａで作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシートおよびランダムファイバーシートを電子顕微鏡（ＪＥＯＬ　ＪＥＭ１４００、日本）で撮影し、イメージソフトウェア(Image J)を用いてファイバーの直径サイズを測定した。直径サイズの分布図（図２Ｂ）に示すように、ＰＬＧＡランダムファイバーシートおよびＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの平均直径サイズは１～１．５μｍであった。
ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの弾力性
　上記Ａに準じて作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）とＰＬＧＡランダムファイバーシート（噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）の弾力性を比較するために、島津精密万能試験機（ＡＧＳ－Ｘ）を用いて、引っ張り実験を行った。その結果、配向性ファイバーシートと配向方向に平行する方向の弾力性はランダムファイバーシートの弾力性よりも約３倍高い（２２０ＭＰａ）ことが示された（図２Ｃ）。
ＰＬＧＡファイバーシートの素材濃度の検討
　ファイバーの直径は、装置の条件を一定とすればファイバーの素材濃度を変えることによって調節することができる。上記Ａに記載のエレクトロスピニング条件下における、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート製造の最適素材濃度を検討するため、それぞれ２０％、２３％および２５％のＰＬＧＡ溶液を用いて、上記Ａの方法に準じて配向性ファイバーシートを作製した。作製したファイバーの直径の分布を測定した結果、材料の濃度が増加するにつれて、ファイバーの直径も大きくなることが示された（図２Ｄ）。直径１～１．５μｍのサイズのファイバーを安定して作製できる条件として、２０～２３％ＰＬＧＡ溶液を用いるのが適当であることが明らかになった。
ファイバーシートの厚みおよび密度
　上記Ａの方法に準じて、噴出時間４０秒の条件下で作製したＰＬＧＡ配向性ファイバーシートを電子顕微鏡（ＪＥＯＬ　ＪＥＭ１４００、日本）で撮影し、厚みを測定した。さらに、それぞれのファイバーシートについて、配向方向と垂直に切断した断面において、単位長さに対するＰＬＧＡファイバー数をカウントすることにより、シートの幅１ｍｍ当たりのファイバーの本数（密度）を調べた。該ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの厚みは２μｍ、密度は３００本／ｍｍであった。
ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート中のファイバーの配向性
　さらに、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：４０秒）中のファイバーの配向性を調べるために、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの電子顕微鏡写真から、イメージソフトウェア(Image J) を用いてファイバーの角度を測定した。配向性ファイバーシートを構成するファイバーのうち、９０．８％以上のファイバーが配向方向（０°）の±２０°以内にあることが確認できた（図２Ｅ）。また、上記Ａに記載の条件で作製したＰＬＧＡランダムファイバーシートの厚みは、２μｍであった。
１－２．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの製造
Ａ．製造手順
　ファイバーの材料として、ＰＬＧＡ溶液の代わりに、１６％ＰＭＧＩ溶液（Ｍｉｃｈｒｏ　ｃｈｅｍ）を用いて、上記１－１．Ａの方法に準じて、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを作製した。エレクトロスピニング法では、ファイバー噴出時間を増やすことによって、より高密度のファイバーを得ることが可能となる。噴出時間をそれぞれ、９０秒および３００秒として、低密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（ＡＦ（Ｌｏｗ））および高密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（ＡＦ（Ｈｉｇｈ））を作製した（図２Ｆ；スケールバーは５０μｍを示す）。
Ｂ．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの性質
　それぞれの条件下で得られたＰＭＧＩ配向性ファイバーの厚みおよび密度を上記１－１に記載の方法に準じて測定した。低密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（噴出時間：９０秒）の厚みは２μｍであり、高密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（噴出時間：３００秒）の厚みは４μｍであることがわかった（図２Ｇ）。さらに、各配向性ファイバーシートの密度は、低密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの場合は、３００本／ｍｍ、高密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの場合は、４００本／ｍｍであることがわかった（図２Ｈ）。さらに、ＰＭＧＩ低密度配向性ＰＭＧＩファイバーシートを用いて、上記１－１に記載の方法に準じて該ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート中のファイバーの配向性を計測した結果、９７％以上のファイバーが配向方向（０°）の±２０°以内にあることがわかった（図２Ｉ）。
１－３．ポリスチレン配向性ファイバーシートの製造
Ａ．製造手順
　３０％ポリスチレン溶液（ＰＳ：Ｓｉｇｍａ、１８２４３５、分子量：130,000～290,000）のＤＭＦ溶液を２７Ｇのプラント針（ニプロ）を付けたシリンジにいれ、気泡を抜き、マイクロシリンジポンプに流速１ｍＬ／時間でセットした。高速回転ドラムの表面にアルミ粘着テープ（三商）を貼り付け、シリンジの針先端から１５ｃｍの距離に設置した。プラント針にプラス電極、高速回転ドラムにマイナス電極を設置し、高速回転ドラムを１０００回転／分で回転させた。マイクロシリンジポンプのスイッチを入れ、２０ｋＶの電圧下で、回転ドラム上のアルミ粘着テープの上にファイバーを一方向に配向させて噴出した（噴出時間：１０分および５０分）。ファイバー噴出後、配向性ファイバーシートが収集されたアルミテープを回収し、ＰＳ配向性ファイバーシートを得た。ナノファイバー作成装置：ＭＥＣＣ、ＮＦ５００、日本。
Ｂ．ＰＳ配向性ファイバーシートの性質
　上記Ａで得られたＰＳ配向性ファイバーシートの厚みおよび密度を、上記１－１に記載の方法に準じて測定した。低密度ＰＳナノファイバー（噴出時間：１０分、厚み：２μｍ、密度：５０本／ｍｍ）；高密度ＰＳナノファイバー（噴出時間：５０分、厚み：１０μｍ、密度：３００本／ｍｍ）。さらに、上記１－１に記載の方法に準じた測定により、該ＰＳ配向性ファイバーシート中のＰＳファイバーの平均直径サイズは２μｍであり、該ファイバーシート中のファイバーは、０±５°以内にあることが明らかになった。
実施例２．配向性ファイバーシート上の心筋細胞培養
２－１．ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の心筋細胞
Ａ．ヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞の培養
　特許文献１および非特許文献５に記載の方法にしたがってヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）細胞から分化誘導した心筋細胞を用いた。心筋細胞のコロニーを５０ｍｌ遠心管に移し、５０ｇ×２分間遠心した。上清を捨て、ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）で一回洗浄した。プロテアーゼ溶液（０．１％コラゲナーゼタイプＩ（Life technologies）、０．２５％トリプシン、１Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅＩ(Applied Biosystems)、１１６ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭ　グルコース、５．４ｍＭ　ＫＣｌ、０．８ｍＭ　ＭｇＳＯ４）を１０ｍｌ加えて、ガスバーナーで滅菌したスターラーバーを遠心管中に２個入れ、２０～３０分間、３７℃で撹拌した。細胞がある程度溶解している該プロテアーゼ溶液（ｐＨ７．３５）を、別の回収用５０ｍｌ遠心管にセットした４０μｍフィルター（ＭｉｌｌｉＱ）に通した。ＦＢＳ２０％含有ＩＭＤＭ培地（ＳＩｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（組成：２０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ　Ｌ－カルニチン（Ｓｉｇｍａ）、０．００１％２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、０．００５Ｎ　ＮａＯＨおよび１０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ４含有、以下ＦＢＳ２０％培地）をフィルターの上からゆっくり２０ｍｌ加えた。フィルター上に残ったコロニーを回収するために、６ｃｍペトリディッシュ内でフィルターを裏返して、プロテアーゼ溶液５ｍｌで裏側から洗い落とし、最初に用いたスターラーバー入り遠心管に戻し、２０～３０分間、３７℃にて撹拌した。該プロテアーゼ溶液を、該回収用遠心管にセットした４０μｍフィルターに通し、ＦＢＳ２０％培地をフィルターの上から１０ｍｌ加えた（プロテアーゼ溶液１５ｍｌとＦＢＳ培地３０ｍｌで計４５ｍｌ）。該プロテアーゼ溶液４５ｍｌ中の全細胞数を計測した。細胞を１０００ｒｐｍ×３分間遠心して、上清を捨てた。細胞に必要な濃度に合わせてＦＢＳ２０％培地を加え（ＦＢＳ２０％培地１００μｌにつき細胞数が５ｘ１０５個となるように調整し、次に２ｘ１０５個に調整する）、ピペッティングにより懸濁した。
　ＰＬＧＡを素材とする配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ）またはランダムファイバーシート（ＲＦ、噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）を接着させたガラス、ゼラチンで表面をコーティングしたガラス（Ｇｅｌａｔｉｎ　Ｆｌａｔ）およびファイバー化していないＰＬＧＡで表面をコーティングしたガラス（ＰＬＧＡ　Ｆｌａｔ）を基板として用いて、それぞれに対する心筋細胞の接着性を比較した。上記Ａで得られた細胞懸濁液１００μｌを取り、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ）、ランダムファイバーシート（ＲＦ）、ゼラチンフラットおよびＰＬＧＡフラットガラスにそれぞれ播種した（細胞数：２ｘ１０５/基板１ｃｍ２）。ＰＬＧＡファイバーシートは疎水性が高いため、細胞懸濁液は楕円状の水滴状になる様子が観察された。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に５時間～１５時間静置して細胞を接着させた。細胞の接着状態を確認し、シートが沈むまでＦＢＳ２０％培地を追加した。３日目にＦＢＳ（－）ＩＭＤＭ培地（組成：１％ＭＥＭ　非必須アミノ酸溶液（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ　Ｌ－カルニチン（Ｓｉｇｍａ）、０．００１％２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１～２％ＢＳＡ（Ｗａｋｏ）もしくはヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、４μＭ　ＣＨＩＲ（Ａｘｏｎ）および２μＭ　ＢＩＯ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）含有、以下ＦＢＳ（－）培地）に培地を交換した。
Ｂ．心筋細胞の接着性
　各基板に対する細胞接着性を検討するために、細胞を播種した５時間後に、接着していない細胞を除き、接着している細胞数を測定した（図３Ａ）。その結果、ＰＬＧＡファイバーを接着した基板はファイバー化していないフラットな基板よりも明らかに細胞接着性が高いことが確認された。
Ｃ．配向性ファイバーシート製造時の噴出時間の検討
　細胞接着性に対する、配向性ファイバーシートの密度の影響を検討した。上述したとおり、エレクトロスピニング法では、ファイバー製造時の噴出時間を増やすことによって、より高密度のファイバーを得ることができる。噴出時間１０秒、４０秒、１０分および１５分の条件下で、実施例１－１．Ａの方法に準じてＰＬＧＡ配向性ファイバーを作製し、電子顕微鏡で撮影した（図３Ｂ）。さらに、それぞれの条件下で得られたファイバーシートの厚みを、実施例１－１．Ｃ記載の方法に準じて測定した。ファイバーの密度が高くなることにより、ファイバーシートの厚みも１μｍから１６μｍまで上昇することが確認できた（図３Ｃ）。
　それぞれの製造条件下で得られたＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの顕微鏡写真（図３ｂ）および厚み（図３Ｃ）から、各ファイバーの密度が、それぞれ、１０秒:１５０本/ｍｍ、４０秒：３００本/ｍｍ、１０分:１００，０００本/ｍｍ、１５分：１５０，０００本/ｍｍ程度であることが測定によりわかった（図３Ｄ）。
　各ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上で、上記ＡおよびＢの方法に準じて、ヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞を培養し、細胞接着性を測定した。その結果、ファイバーの密度が高くなるにつれて（特に噴出時間１０分および１５分で製造した場合）、細胞の接着率が再現性よく上昇することが明らかになった。一方、密度が低いファイバーを用いた場合、細胞接着率のばらつきがサンプル間で大きいことが確認された（図３Ｅ）。
２－２．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞
　ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを用いて、同様に細胞接着性に対するファイバーシート密度の影響を検討した。実施例１－２．Ａと同様の方法で製造した低密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（噴出時間：９０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）および高密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（噴出時間：３００秒、厚み：４μｍ、密度：４００本／ｍｍ）をそれぞれ接着した細胞培養用基板およびゼラチンで表面をコーティングした基板（Ｆｌａｔ）上に、２－１の方法に準じて心筋細胞を播種し、５時間後における各基板に対する細胞接着性を比較した。その結果、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートにおいても、ファイバー密度が高い場合に、細胞接着率が上昇することが示された（図３Ｆ）。一方、低密度ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の細胞とゼラチンコーティング基板上の細胞は、同程度の接着率を示した。
実施例３．多電極アレイシステムによる細胞機能評価用デバイスの作製
　実施例１に準じてエレクトロスピニング法により製造し、アルミ粘着テープの上に収集されたＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：９０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）を、圧力プレス機（ＭＮＰ－００１、アズワン）を用いて、６４チャネル多電極アレイ（nitride-coated gold electrodes、multi-channel systems、ドイツ）（電極サイズ：３０μｍ，ｓｐａｃｅｄ ２００μｍ，８×８ｇｒｉｄ　ａｒｒａｙ）上に転写し、細胞機能評価用デバイスを得た（図４Ａ、左）。さらに、細胞培養用ＰＤＭＳ製チャンバー（２ｃｍｘ２ｃｍ）を作製し、電極上のＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上に接着させた（図４Ａ、右）。一晩乾燥させて溶媒を蒸発させ、３０分間ＵＶ照射により滅菌を行った後に、心筋細胞の機能評価に用いた。
　ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートの代わりにＰＳファイバーシート（噴出時間：１０分、厚み：２μｍ、密度：５０本／ｍｍ）およびＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度３００本／ｍｍ）を多電極アレイ上に転写することにより、同様に細胞機能評価用デバイスが得られた（図４Ｂ）。
実施例４．多電極アレイシステムによる心筋細胞の活動電位測定
４－１．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞の活動電位
Ａ．培養心筋細胞の活動電位測定
　実施例３で得られた、機能評価用デバイスのＰＤＭＳチャンバー内に、ｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）由来の心筋細胞を、実施例２の方法に準じて播種した。５時間後、細胞がしっかり接着していることを確認し、チャンバー全体に培地を添加した（ＦＢＳ２０％培地）。３７℃インキュベーター内で細胞を培養し、２日目以降、培地をＦＢＳ（－）培地に交換し、４日間に一回培地交換を行った。培地を交換する前に、電気信号の測定を行った。測定は、多電極システムを３７℃ヒートプレートの上に設置し、温度が安定するまで５分間待った後に行った。測定後、培地交換を行い、インキュベーターで培養を続けた。活動電位測定用のソフトウェアとしては、Multi-channel systems MC-RACK、データ解析用ソフトウェアとしてはOriginPro9.0を使用した。
Ｂ．配向性ファイバーシート上の培養心筋細胞
　上記Ａの方法にしたがって、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシートを転写した多電極アレイ（ＡＦ）および対照として、ゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上に心筋細胞を播種し、培養を行った。開始２日後には、顕微鏡観察により、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の培養細胞が配向性を示すことを確認した。一方、フラットな多電極アレイ上では、細胞が塊状に凝集しやすく、接着性が弱い様子が観察された（図５Ａ）。１４日間培養した後、ピンセットで該心筋組織片をファイバーシートごと電極から取り外した。その結果、細胞はファイバーシート側にしっかりと接着しており、多電極アレイ側には細胞およびファイバーは残っていない様子が観察された（図５Ｂ）。
Ｃ．心筋細胞の経時的な電気信号測定
　実施例３および上記Ａの方法に準じて、多電極アレイ上に転写されているＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（ＡＦ）上で培養した心筋細胞から、培養開始後２日目、６日目、１０日目、１４日目において、電気信号を測定し、ゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上の細胞と比較した（図５Ｃ）。その結果、配向性ファイバーシート上で培養した細胞は、シグナル検出率が時間と共に増加し、６日目以降は全てのチャネルから電気信号を検出することができた（１００％）。一方、フラットな多電極アレイ上で培養した心筋細胞は、６日目におけるシグナル検出率が配向性ファイバーシート上の細胞と比較して低かった（約６０～８０％）。また、培養開始から１４日経過すると、フラットな多電極アレイ上の細胞は基板から剥離する傾向が見られたのに対し、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の細胞は培養開始から１４日以上経過しても細胞の剥離は観察されず（図５Ｄ）、電気信号の検出率も低下しなかった。
４－２．ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の心筋細胞の活動電位
　同様に、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）およびＰＬＧＡランダムファイバーシート（ＲＦ、噴出時間：２０秒、厚み２μｍ）をそれぞれ転写した多電極アレイおよびゼラチンでコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上でヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞を培養し、細胞の電気信号を測定した。ファイバーの構造によらず、ファイバーシートを転写した多電極アレイ上の心筋細胞からのシグナル検出率は時間と共に増加し、６日目からは全てのチャネルから電気信号を検出することができ（１００％）、１４日経過してもシグナルの検出率は低下しなかった。一方、フラットな多電極アレイを用いた場合、チャネルからのシグナル検出率が低かった（約８０～９０％）（図５Ｅ）。また、フラットな多電極アレイ上では、培養１０日目の時点で細胞が剥離する傾向が見られたのに対し、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上で培養した心筋細胞は、培養開始から３２日後においても細胞の剥離は観察されなかった（図５Ｆ）。このことから、ファイバーシート上では、細胞接着性が高いために電気信号図の検出率が高く、ゼラチンコーティングした基板上では細胞の接着性が弱く、細胞密度が不均一なためにシグナル検出率が低くなると考えられる。
　また、細胞播種から５時間後の時点では、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の細胞とゼラチンコーティングした基板上の細胞接着性が同程度であったのに対し（図３Ａ）、長期間の培養後では、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の細胞が、ゼラチンコーティング基板上の細胞よりも明らかに高い細胞接着性を示したことから（図５Ｆ）、配向性ファイバーシート上では、接着性が安定して長期間維持されることが示される。
実施例５　配向性ファイバー上の心筋細胞の機能評価
５－１．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞の活動電位パターン
不整脈の検出
　実施例３の方法に準じて、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：９０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）を転写した多電極アレイおよびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で、実施例４の方法に準じて、ヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）細胞由来心筋細胞を培養し、該心筋細胞から電気信号を測定した（ｎ＝６）。ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞からは、培養開始から６日間、不整脈（arrhythmia）に対応する不規則な電気活動が全く検出されなかった（図６Ａ下段並びに図６Ｂ）。これに対し、フラットな多電極アレイ上で培養した心筋細胞からは、実験サンプル数に対して40%の確率で不整脈が検出された（図６Ａ上段並びに図６Ｂ）。
電位振幅
　また、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート(ＡＦ)上で培養した心筋細胞は、フラット上の細胞よりも電位振幅の値が高いことが確認された（図６Ａおよび図６Ｃ）。さらに、電位振幅を、１４日間経時的に測定した結果、フラットな電極上で培養した心筋細胞では、電位振幅値が変化しなかったのに対し、配向性ファイバーシート上の心筋細胞は、電位振幅値が経時的に上昇することがわかった（図６Ｄ）。
５－２．ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の心筋細胞の活動電位パターン
　５－１と同様に、高密度ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ－Ｈ、噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）、低密度ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本/mm）、およびＰＬＧＡランダムファイバーシート（ＲＦ、噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）をそれぞれ転写した多電極アレイ、および表面をゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）を用いて、６日間培養したヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞の電気信号を測定し、さらに１４日間の電位振幅値を経時的に測定した。その結果、ファイバー構造の違いによらず、ＰＬＧＡファイバー上で培養した心筋細胞は、電位振幅の値がフラットな多電極アレイ上で培養した細胞よりも高いことが確認でき、さらに、ＰＬＧＡファイバー上で培養した心筋細胞からは、不整脈に相当する不規則な電気活動が全く見られなかった（図６Ｅ）。これに対し、従来細胞培養に使われているゼラチンコーティングした基板（Ｆｌａｔ）を用いた場合には、頻繁に不整脈が検出された（図６ＥおよびＦ）。ゼラチンコーティング基板上の心筋細胞における不整脈の検出率は実験サンプル数に対して３４．５％であった（図６Ｆ下段）。また、１４日間の培養の間、フラットな多電極アレイ上の細胞の電位振幅値は変化しなかったのに対し、ファイバーシート上の心筋細胞の電位振幅値は、時間と共に上昇することが分かった（図６Ｇ）。特に培養開始から１０日目以降において、配向性ファイバーシート培養条件で培養した心筋細胞が、ランダム培養条件下で培養した心筋細胞よりも振幅値が高い傾向が見られた。
　これらの結果により、電極に接着させたファイバーシート上で心筋細胞を培養することにより、不整脈を起こさない正常な培養細胞を安定して維持することができることが示された。かかる結果は、電極に接着させた配向性ファイバーシート上で心筋細胞を培養することにより、ファイバーを介して電極と細胞との接着性が高くなり、また細胞の分布が均一になることによるものであると考えられる。
実施例６　配向性ファイバーシート上の心筋組織の興奮伝播方向および伝播速度
６－１．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋組織の興奮伝播
　心機能に重要である、心筋組織の興奮伝播方向および伝播速度について測定・評価を行った。実施例３および４の方法に準じて、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：９０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）を転写した多電極アレイおよびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上でヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞を培養した。培養開始から１４日後において、電極を介して、視野の中央部分に電気刺激（±1500 mV、40μs持続）をかけ、心筋細胞の電気信号を測定し、刺激によって引き起こされる電気的興奮の到達分布図を作製した（図７Ａ）。等高線の形の変化は到達方向を表し、色の変化は伝播速度を表す。また、培養開始１４日後における、興奮の伝播速度を定量化した（図７Ｂ）。
　心筋細胞の興奮伝播方向は配向性ファイバーの配向方向と一致しており、配向に平行な方向の興奮の伝播速度は、ファイバーの配向方向に対する垂直方向およびゼラチンコーティング上の伝播速度と比較して著しく速いことがわかった。一方、ゼラチンコーティング上で培養を行った場合、電気刺激に対して、応答反応が刺激点から起こらず、離れている場所から興奮が誘発される様子が観察された（図７Ａ、右）。これは、図５Ｄに見られるように、培養開始１４日目時点のゼラチンコーティング基板上では細胞の接着が弱く、細胞が擬集しやすくなっているため、細胞分布が不均一になっているためと推測される。また、興奮伝播速度を培養開始から１４日間経時的に測定した結果、６日目以降において、配向性ファイバーと平行している方向の伝播速度はフラットな多電極アレイを用いた場合と比較して、明らかに速くなることが確認された（図７Ｃ）。なお、ＰＭＧＩは非導電性のため配向性ファイバーシートは導線にはならない。
６－２．ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の心筋組織の興奮伝播
　上記６－１と同様に、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）およびＰＬＧＡランダムファイバーシート（ＲＦ、噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）をそれぞれ転写した多電極アレイならびにゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で培養した心筋細胞に、６日目、１４日目において、視野の中央部分に電気刺激（±1500 mV, 40 μs持続）をかけ、心筋細胞の電気信号を測定し、電気的興奮の到達分布図を作製した（図７Ｄ）。また、６日目および１４日目の興奮伝播速度をそれぞれ定量化した（図７Ｅ）。ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートにおいても、興奮伝播方向は配向性ファイバーシートの方向（視野の左右方向）と一致していることがわかった（図７Ｄ、左欄）。また、ファイバーがない場合は、６－１の結果と同様に、電気刺激に対して、刺激点から応答反応が起こらず、離れている場所から興奮が誘発される様子が観察された（図７Ｄ、右欄）。
　また、培養後６日目および１４日目の興奮伝播を比較した。その結果、ファイバーの有無または構造に関係なく、培養期間が延びると興奮伝播速度も速くなるものの、６日目ではそれぞれの基板上で培養された心筋細胞の伝播速度にはほとんど差がないが、１４日目では、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの平行方向の伝播速度が、垂直方向の伝播速度やランダムファイバーシート上およびフラット基板上の心筋組織の伝播速度と比較して、約３倍速いことが確認された（図７Ｅ）。なお、ＰＬＧＡは非導電性であるため、配向性ファイバーシートは導線にはならない。
　これらの結果は、配向性ファイバーシート上の心筋細胞は、配列構造を持つことにより、ファイバーの配向方向の電気的結合構造が発達するため、ファイバーシートの平行方向の興奮伝播速度が、垂直方向およびフラット基板上の心筋組織の伝播速度と比較して著しく速くなることを示すものである。このことは、配向性ファバーシート上の心筋細胞は、成熟度および機能性が高いことを示している。
実施例７　配向性ファイバーシート上の心筋細胞の心電図
７－１．ＰＭＧＩ配向性ファイバー上の心筋細胞の心電図
　心筋細胞の電気生理学的成熟度と心毒性試験において、心電図ＱＴ間隔（電位依存性Ｎａ＋電流由来のＱ波と電位依存性Ｋ＋電流由来のＴ波の間隔）が一つの代表的指標となる。実施例３および４に準じて、電極に転写したＰＭＧＩ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：９０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）およびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上でヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞を培養した。培養開始後１０日目において、それぞれの細胞におけるＱＴ間隔を測定した結果、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞では、ＱＴ間隔が、フラットな多電極アレイ上の心筋細胞より短いことが確認された（図８Ａ）。さらに、それぞれの条件下で培養した心筋細胞からＱＴ間隔を１４日間、経時的に測定した結果、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞のＱＴ間隔は、フラットな多電極上の細胞と比較して明らかに短くなっていることが分かった（図８Ｂ）。この結果は、配向性ファイバーシート上の培養心筋細胞は電気生理学的成熟度が高いことを示すものである。
７－２．ＰＬＧＡ配向性ファイバー上の心筋細胞の心電図
Ａ．Ｔ波の測定
　ＱＴ間隔に加えて、心電図Ｔ波の検出率もまた、心筋細胞の電気生理学的な成熟度や心毒性を測定する指標の一つとして用いられる。実施例３および４に準じて、多電極アレイ上に接着させた低密度ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本/mm）および高密度ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ－Ｈ、噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）、ＰＬＧＡランダムファイバーシート（ＲＦ、噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）を転写した多電極アレイおよびゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上でそれぞれ培養したヒトｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞から、心電図のＴ波にあたる電位依存性Ｋ＋電流由来のＴ波を多電極システムを用いて１４日間経時的に検出し、検出効率を比較した（図８Ｃ）。
　６日目以後、高密度配向性ファイバー上において、全てのチャネルからＴ波を検出（１００％）することができた。一方、低密度配向性／ランダムファイバーおよびゼラチンコーディング上の細胞では、６日目におけるＴ波の検出率が低かった（５０～８０％）。このことは、これらの基板上の細胞の成熟度が低いことを示唆するものである。また、これらの基板上では、Ｔ波の検出率は時間経過と共にさらに低くなる傾向が見られた。これは、細胞と電極との接着性が弱いことに関連していると考えられる。さらに、フラットな多電極アレイを用いた場合、１０日目以降Ｔ波の検出率が顕著に低下した。これは、細胞が基板から細胞が剥がれる傾向が見られる（図５Ｆ）ことによると推測される。
Ｂ．ＱＴ間隔
　さらに、上記７－１と同様に、高密度ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ－Ｈ、噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１０，０００本／ｍｍ）、低密度ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）およびランダムファイバーシート（噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）をそれぞれ転写した多電極アレイ、ならびにゼラチンコーティングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）を用いて、培養１０日目における心筋細胞のＱＴ間隔を測定した。その結果、配向性ファイバーシート上の心筋細胞のＱＴ間隔が、ランダムファイバーシート上およびフラットな電極上の心筋細胞よりも短いこと、ならびに、高密度配向性ファイバーシート（ＡＦ－Ｈ）上で培養することで、ＱＴ間隔がさらに短くなることがわかった（図８Ｄ）。このことより、配向性ファイバーシート上で培養された心筋細胞は電気生理学的成熟度が高く、ファイバーの密度が高くなると成熟度がさらに高くなることが示唆される。
　さらに、７－１と同様に、それぞれの基板上の心筋細胞から、ＱＴ間隔を１４日間経時的に測定した（図８Ｅ）。時間によるＱＴ間隔の変化は見られなかったものの、高密度配向性ファイバーシート（ＡＦ－Ｈ）上で培養した心筋細胞のＱＴ間隔が常に最短であった。このことから、配向性ファイバーシートの密度が高くなることにより、細胞の成熟度が高くなることが示された。また、低密度の配向性ファイバー（ＡＦ）およびランダムファイバーシート（ＲＦ）上では、高密度配向性ファイバーシート上の心筋細胞よりもＱＴ間隔が長くなり、サンプル間のばらつきも大きいことが確認できた。これは、細胞の接着性とも関連していると考えられる。一方、フラットな電極上の細胞は、ファイバーシート上の心筋細胞よりも明らかにＱＴ間隔が一番長いことから、電気生理学的成熟度が低いと考えられる。
７－３．ＰＳ配向性ファイバーシート上の心筋細胞の心電図
　実施例１－３の方法で作製したＰＳ配向性ファイバーシート（噴出時間：５０分、厚み：１０μｍ、密度：３００本／ｍｍ）を転写した多電極アレイを用いて、上記７－１と同様に培養開始６日目時点における細胞のＱＴ間隔を測定した結果、該ＰＳ配向性ファイバーシート上の心筋細胞は０．１６秒という非常に短いＱＴ間隔を示した（図８Ｆ）。この値は、成人のＱＴ間隔（約０．２秒）と近い値であり、このことは、該配向性ファイバーシート上の細胞は成人と同程度の電気生理学的成熟度が高いことを示すものである。
実施例８　心筋マーカーを用いた心筋組織片の免疫染色およびＲＴ－ＰＣＲ
８－１．ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の心筋組織の免疫染色
　さらに、配向性ファイバーシート上の心筋組織片の細胞成熟度を調べるために、心筋細胞マーカーであるα－ＭＨＣ、β－ＭＨＣ、ｍｙｏｓｉｎ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ（ＭＬＣ）－２Ｖ、ｃａｒｄｉａｃ　ｔｒｏｐｏｎｉｎ　Ｔ（ｃＴｎＴ）２およびα－Ａｃｔｉｎｉｎについての免疫染色を行った。ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ）、ＰＬＧＡランダムファイバーシート（噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）を接着させたガラス板およびゼラチンコーティングしたガラス板上で、ｉＰＳ細胞由来培養組織片を１４日間培養した。該細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで５分間洗浄した（３回）。ＰＢＳ－０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を用いて３０分間透過処理を行い、ＰＢＳで５分間洗浄した（３回）。ブロッキング液（ＰＢＳ中、５％正常ヤギ血清、５％正常ロバ血清、３％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて１時間ブロッキング処理を行い、ＰＢＳで５分間洗浄した（３回）。一次抗体（α－ａｃｔｉｎｉｎ（マウスモノクローナル抗体　ＥＡ－５３，Ｓｉｇｍａ）、ｃＴｎＴ２；　マウスモノクローナル，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）、ＭＬＣ－２ｖ（ウサギポリクローナル、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ　Ｇｒｏｕｐ，ＩＬ、米国）、α－ＭＨＣ（ウサギモノクローナル抗体、Ｓｉｇｍａ）、β－ＭＨＣ（マウスモノクローナル抗体、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）を用いて、４℃で一晩反応させた後、ＰＢＳで５分間洗浄した（３回）。二次抗体（ＤｙＬｉｇｈｔ　４８８－結合型抗マウスＩｇＧ、ＤｙＬｉｇｈｔ　４８８－結合型抗－ウサギＩｇＧ、ＤｙＬｉｇｈｔ　５９４－結合型抗マウスＩｇＧ、ＤｙＬｉｇｈｔ　５９４－結合型抗－ウサギＩｇＧ）を用いて、室温で１時間反応させ、ＰＢＳで５分間洗浄した（３回）。３００ｎＭ　４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、室温にて３０分間核を染色し、ＰＢＳで５分間洗浄した（３回）。観察は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１０ｉ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて行った。
　図９ＡとしてファイバーおよびＤＡＰＩ染色シグナルとマージした図を示す。観察の結果、ゼラチンコーティング上よりもファイバーシート上の細胞、特に配向性ファイバーシート上の心筋細胞において心筋成熟に関与しているβ－ＭＨＣが非常に強く発現することがわかった（図９Ａ）。また、配向性ファイバーシート（ＡＦ）およびゼラチンコーティング（Ｆｌａｔ）上で培養した心筋細胞中のβ－ＭＨＣのＲＮＡレベルをＲＴ－ＰＣＲによって測定した。その結果、β－ＭＨＣのＲＮＡレベルは、ゼラチンコーティング上で培養した心筋細胞では、成人由来の正常心筋細胞の１０％に満たないのに対し、配向性ファイバーシート上の心筋細胞では、２０％程度まで上昇していた（図９Ｂ）。このことから、ファイバー、特に配向性ファイバーの存在により、心筋細胞が３次元構造および配向性構造をとることによって、心筋細胞の成熟度が亢進していることが示唆される。また、ＭＬＣ２Ｖ、α－Ａｃｔｉｎｉｎ、ＴｎＴ２の染色像から、心筋細胞が配向性ファイバーシートの方向に沿って配向していることが示された。さらに、ｃＴｎＴ２についての免疫染色の結果について高速フーリエ変換解析を行った結果、心筋細胞の配向方向がファイバーの方向と一致していることが定量的に示された（図９Ｃ）。
８－２．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋組織の免疫染色
　上記８－１と同様に、多電極アレイに転写したＰＭＧＩ配向性ファイバーシート(ＡＦ、噴出時間：９０秒、厚み：２μｍ)とゼラチンコーティングした電極（Ｆｌａｔ）の上でそれぞれ１４日間培養したヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞に対して、心筋細胞特異的なマーカーとしてのβ－ＭＨＣおよびＭＬＣ２Ｖ、ならびに細胞骨格系マーカーとしてのＡｃｔｉｎ（一次抗体：ヤギポリクローナル抗体（Santa Cruz, SC 1616）、二次抗体：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８結合型抗ヤギIgG（Jackson ImmnoResearch #705-546-147））について、免疫染色を行った（図９Ｄ）。ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートを用いた場合と同様に、β－ＭＨＣの発現は、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の細胞において、フラットな電極上の細胞と比較して非常に強いことが示された。また、ＭＬＣ２ＶおよびＡｃｔｉｎについての染色像から、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞が配向性ファイバーシートに沿って配向していることが示された。この結果より、ファイバーシートが、心筋細胞の成熟度を亢進していることが示唆される。また、ＭＬＣ２Ｖおよびアクチンの染色像から、心筋細胞は配向性ファイバーの方向に沿って配向していることが明らかになった。
実施例９　配向性ファイバーシート上の心筋組織片の電子顕微鏡による観察
９－１．ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上の心筋組織片の観察
　ファイバーシートと心筋細胞との接着構造、配向構造および組織片の３次元構造を調べるために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察を行った。ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートおよびＰＬＧＡランダムファイバーを接着させたプラスチック製切片および、ゼラチンでコーティングしたフラットな切片を作製した。実施例２の方法に準じて、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞を各切片の表面に播き、１４日間培養を行った。ＮａＨＣａ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、３０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中２％グルタルアルデヒドを用いて細胞を固定した。それぞれの試料を０．２５％オスミウム、０．２５％Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、１％タンニン酸、５０ｍＭ　酢酸ウラニルで順番に処理し、後期固定処理を行った。エタノールシリーズで脱水処理を行い、６５℃で重合処理を行った。ウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ　ＦＣ６，Ｖｉｅｎｎａ，ＡＵ）を用いて、厚みが６０～１００ｎｍになるように、配向性ファイバーシートに対して垂直方向に凍結切片を作製し、断面を観察した。観察は、透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ　ＪＥＭ１４００、日本）を用いて行った。
　上記の切片を電子顕微鏡により観察した結果、ＰＬＧＡファイバーシート上で培養した心筋細胞はファイバーに巻き付くように密着して結合していることがわかった（図１０Ａ）。さらに、配向性ファイバーシート上で作製した細胞組織片では、ランダムファイバーと異なり、心筋細胞内の筋線維の配列構造はファイバーの方向性と一致していることが確認された。さらに、この配向性ファイバーシート上の心筋細胞組織片の厚みは３０～５０μｍであり、心筋細胞層がファイバーシートの両面に形成され、約１０層の多層構造を有していることも明らかになった（図１０Ａ、左）。
９－２．ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋組織片の観察
　ＰＭＧＩ配向性ファイバー(噴出時間：９０秒、厚み：２μｍ)およびゼラチンコーティング上で心筋細胞を培養して作製した心筋組織片を用いて、上記９－１と同様に透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察を行った。その結果、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートを用いた場合と同様に、ＰＭＧＩ配向性ファイバー上で１４日間培養した心筋細胞は、ファイバーに巻き付くように密着して結合していること、筋線維の配列構造はファイバーの方向性と一致していることが観察された（図１０Ｂ、右）。さらに、ＰＭＧＩ配向性ファイバーシート上の心筋細胞は、厚みが約３０μｍであり、心筋細胞層がファイバーシート両面に形成された、約１０層の多層構造を有していることも明らかになった（図１０Ｂ、左）。
実施例１０　電位依存性カリウムチャネル（ＨＥＲＧチャネル）阻害剤添加時のＱＴ間隔延長
Ａ．ＨＥＲＧチャネル阻害剤（Ｅ－４０３１）添加時のＱＴ間隔延長
　実施例３および４の方法に準じて、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（ＡＦ、噴出時間：４０秒、厚み：２μｍ、密度：３００本／ｍｍ）およびランダムファイバーシート（ＲＦ、噴出時間：２０秒、厚み：２μｍ）をそれぞれ転写した多電極アレイならびにゼラチンコーディングした多電極アレイ（Ｆｌａｔ）上で培養した心筋細胞に、代表的なヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ＨＥＲＧ）チャネル阻害剤であるＥ－４０３１を添加し、ＱＴ間隔の延長を５～１０分間連続して調べた。ｈＥＲＧチャネルは、心臓内の内向き整流性電位開口型カリウムチャネルであって、遮断することによって、ＱＴ間隔延長が観察されることが知られている。使用濃度が増加、また細胞成熟度が低いすることによって、不整脈が起こされる。Ｅ－４０３１の添加により、ファイバーの構造およびファイバーの有無によらず、Ｅ－４０３１の濃度依存的にＱＴ間隔の延長が観察された（図１１Ａ）。
Ｂ．薬剤投入後の不整脈の検出
　Ｅ－４０３１投入後５～１０分間、心筋細胞からの電気信号を測定している間における、不整脈の有無を調べた。その結果、薬剤投入後のフラットな電極上の心筋細胞からは、ファイバーシート上の細胞と比較して不整脈が高い頻度で観察された（図１１Ｂ～Ｃおよび表１）。これは、フラットな多電極アレイ上では細胞と基板の接着性が低く、また細胞の成熟度が低い（図９Ａ）ためと考えられる。
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実施例１１　細胞培養部の周辺にフレーム部分を有する細胞培養用シートを用いた心筋組織片の製造
Ａ．細胞培養部が配向性ファイバーシートである細胞培養用シートの製造
　実施例１の方法に準じて、エレクトロスピニング法でＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）を作製し、ＰＤＭＳで作製したスペーサー（1.8 cmx1.8cm）上に転写した。さらに、配向性ファイバーシートと同じＰＬＧＡ溶液にて転写部分を塗布してフレーム部分を形成し、一晩乾燥させてＵＶ照射により滅菌した後に細胞培養に用いた（図１２Ａ）。
　異なるファイバー素材および、粘着剤を用いて、同様の方法により細胞培養用シートを製造することができる。図１２Ｂは、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）を、ファイバーと同じＰＬＧＡ溶液を接着剤としてＰＤＭＳ製スペーサーに接着させて作製した細胞培養用シートを示す。フレーム部分は、配向性ファイバーシートを、スペーサーに生体適合性の粘着剤を塗布することによって、ファイバーシートをスペーサーに接着させると同時にフレーム部分を作製することもできる。また図１２Ｃは、ＰＳ配向性ファイバーシート（噴出時間：５０分、厚み：１０μｍ、密度：３００本／ｍｍ）および、粘着剤としてＰＤＭＳ混合液（SILPOT 184，東レ、プレポリマー：架橋剤＝１０：１）を用いて製造した、ＰＤＭＳスペーサーに接着した細胞培養シートを示す。図１２Ｄは、シリコーン一液縮合型ＲＶＴゴム（信越ＫＥ－４５－Ｔ）を用いて作成した、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）が、リング状のガラス内径２２ｍｍ）（厚木ミクロ）に接着した細胞培養用シートを示す。該ガラスリングは、スペーサーとして用いても、または内側に培地を投入して培養用チャンバーとして用いてもよい。
Ｂ．生体内分解材料であるＰＬＧＡの分解
　移植を目的として組織片を製造する場合、安全性の高い生体内分解材料を用いて配向性ファイバーを作製することが望ましい。ＰＬＡ（ポリ乳酸）とＰＧＡ（ポリグリコール酸）のコポリマーであるＰＬＧＡは、毒性のない生体分解性素材である。ＰＬＡとＰＧＡの組み合わせ比率によって、分解スピードを調節することが可能である。上記Ａに準じて作製したＰＬＧＡ（ＰＬＡ７５％：ＰＧＡ２５％）配向性ファイバーの分解時間を培養条件下で調べた。実施例２の方法に準じて心筋細胞を播いてから、３ヶ月後には、ＰＬＧＡファイバー（噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）が完全に分解されている様子が観察された（図１２Ｅ）。
実施例１２　心筋細胞組織片の心臓への移植
Ａ．心筋細胞組織片のマウス心臓への接着
　配向性ファイバーシート上で製造した心筋組織とマウス摘出心臓との接着性を調べた。実施例１１、Ａの方法に準じて作製した、ＰＬＧＡ製フレームを有するＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）上で、実施例２の方法に準じて心筋細胞を６日間培養し、培養組織片を作製した。該培養組織片をＰＬＧＡ配向性ファイバーシートとともに剥がし、生後３ヶ月のマウスの心臓の表面に該ファイバー心筋組織片を静置した。静置から３時間後には、該心臓組織片が心臓膜に接着している様子が観察された（図１３Ａ）。ピンセットで該心筋組織片を持ち上げても、マウス心臓から剥がれることはなかった。また、ＰＤＭＳ製のフレーム部分を有するＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上で同様に心筋組織片を作製し、該フレーム部分の三辺を切り落として、細胞培養部分のみを同様にマウスの心臓表面に静置した場合にも、心筋組織片の心臓表面への接着が観察された（図１３Ｂ）。
Ｂ．心筋細胞組織片の生体ラットへの移植
　上記Ａと同様に、ＰＬＧＡ製のフレーム部分を有するＰＬＧＡ配向性ファイバーシート（噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ、密度：１００００本/mm）上で作製した心筋組織片を、細胞培養開始６日後に、ヌードラットの心臓表面に移植した。移植２週間後、心臓を回収して、４％パラホルムアルデヒドで固定して脱水した後、パラフィン包埋して２μｍ切片を作製した。該切片の脱パラフィン処理を行った後、ヘマトキシリン・エオジン染色、ヒト特異的プローブによるIn situ hybridization（ＩＳＨ）および心筋マーカーであるｃＴｎＴについての組織染色を行い、顕微鏡観察を行った（図１３Ｃ）。その結果、移植された心筋組織片は宿主の心臓表面に生着していること、宿主心臓表面にヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞が存在していることが明らかになった。
実施例１３　ファイバー上の心筋組織片の多層化
Ａ．配向性ファイバー上の心筋組織片の二層化
　配向性ファイバー上の心筋組織片を重ねることにより、さらに厚みのある心筋組織片を作製することが可能かどうかを検討した。実施例１１の方法に準じて、ＰＤＭＳスペーサーに接着した、ＰＬＧＡ製のフレーム部を有するＰＬＧＡ配向性ファイバーシートを作製した（噴出時間：１０分、厚み：１０μｍ）。実施例２の方法に準じて、該ＰＬＧＡ配向性ファイバーシート上にｉＰＳ細胞（ＩＭＲ９０－１）由来心筋細胞を播種し、培養した。培養開始後１４日目に、ＰＬＧＡ配向性ファイバーシートの両面に形成された心筋移植片を、配向方向が同一となるよう２層に重ねた（図１４Ａ、上段）。重ねた移植片は２時間後にはお互いに接着し、その接着強度はピンセットでは容易に剥がせない程度の強さであった（図１４Ａ、下段）。この結果から、配向性ファイバー上に形成した心筋組織片は容易に多層化できることが明らかになった。
Ｂ．二層化した心筋組織片の拍動
　上記Ａで得た多層のＰＬＧＡ配向性ファイバー上心筋組織片の機能を評価するために、該組織片をＰＤＭＳスペーサーから剥離して多電極アレイ（３０μｍ　ｓｐａｃｅｄ　２００μｍ、８×８　ｇｒｉｄ　ａｒｒａｙ）上におき、電気信号を測定した。その結果、二層の心筋移植片は、重ねて１分後の時点では、それぞれの心筋移植片は単独で拍動していたが、３時間後には、二層の心筋組織片は同期して拍動することが確認された（図１４Ｂ）。
１：配向性ファイバー
２：多電極アレイ
３：配向性ファイバーシート＋多電極アレイ
４：培養用チャンバー
５：多電極アレイ
６：フレーム
７：スペーサー
８：心筋組織片

Claims (37)

  1. 　配向性ファイバーシートと、該配向性ファイバー上の培養心筋細胞とを含む、心筋組織片。
  2. 　配向性ファイバーシートが培養心筋細胞層の間に介在している、心筋組織片。
  3. 　該心筋細胞が多能性幹細胞から誘導された心筋細胞である請求項１または２に記載の心筋組織片。
  4. 　配向性ファイバーシートにおけるファイバーの直径が０．１μｍ～５μｍ、シートの幅１ｍｍ当たりのファイバーの本数３０～１５０００本、シートの厚みが０．１μｍ～２０μｍである、請求項１～３いずれかに記載の心筋組織片。
  5. 　心筋細胞層の数が１０層以上である、請求項１～４いずれかに記載の心筋組織片。
  6. 　配向性ファイバーシートが生体内分解性の材料で構成されている、請求項１～５いずれかに記載の心筋組織片。
  7. 　配向性ファイバーシートが分解されにくい素材で構成されている、請求項１～５いずれかに記載の心筋組織片。
  8. 　配向性ファイバーシートが、周囲にフレーム部を有する、請求項１～７何れかに記載の心筋組織片。
  9. 　フレーム部が配向性ファイバーシートと同一素材で構成されている、請求項８記載の心筋組織片。
  10. 　フレーム部が配向性ファイバーシートと別素材で構成されている、請求項８記載の心筋組織片。
  11. 　複数の配向性ファイバーシートと、該複数の配向性ファイバーシート上で培養された複数の心筋細胞層を含み、配向性ファイバーシートが同一配向方向にて心筋細胞層間に介在している、請求項１～１０いずれかに記載の心筋組織片。
  12. 　さらに培養用チャンバー部分を有し、該心筋細胞が、該配向性ファイバーシート上の培養用チャンバー中にある、請求項１～４、６および７いずれかに記載の心筋組織片。
  13. 　該心筋細胞のβ-MHCの発現量が成人の正常心筋細胞の１０％以上である、請求項１～１２いずれかに記載の心筋組織片。
  14. 　細胞の機能評価に用いるための、請求項１～１３いずれかに記載の心筋組織片。
  15. 　移植に用いるための、請求項６、８～１１および１３いずれかに記載の心筋組織片。
  16. 　複数の心筋組織片を配向性ファイバーシートの配向が同一となるよう重ねて培養する工程を含む、請求項１１に記載の心筋組織片の製造方法。
  17. 　得られた心筋組織片の電気信号を、該心筋組織片と接触させた多電極アレイにより検出して心筋細胞の機能を評価する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 　請求項１４に記載の心筋組織片を多電極アレイに接触させて電気信号を検出することを含む、心筋細胞の機能評価方法。
  19. 　細胞機能を指標に医薬候補物質の有効性の評価を行う、請求項１８に記載の方法。
  20. 　細胞機能を指標に物質の安全性の評価を行う、請求項１８に記載の方法。
  21. 　滅菌された包装材および、その中に封入されている請求項１～１５いずれかに記載の心筋組織片を含む製品。
  22. 　多電極アレイおよび、該多電極アレイ上の配向性ファイバーシートを含む、心筋細胞機能評価用デバイス。
  23. 　該配向性ファイバーシート上に培養用チャンバー部分をさらに有する、請求項２２に記載の心筋細胞機能評価用デバイス。
  24. 　該培養用チャンバー部分の中に培養心筋細胞をさらに含む、請求項２３に記載の心筋細胞機能評価用デバイス。
  25. 　請求項２４記載のデバイスの培養心筋細胞の電気信号を多電極アレイにより検出する工程を含む、心筋細胞機能評価方法。
  26. 　シート状細胞培養部と該細胞培養部の周囲にフレームを含む、細胞培養用シート。
  27. 　該シート状細胞培養部がファイバーシートである、請求項２６に記載の細胞培養用シート。
  28. 　シート状細胞培養部とフレームが同一素材で構成されている、請求項２６または２７に記載の細胞培養用シート。
  29. 　該シート状細胞培養部とフレームが異なる素材で構成されている、請求項２６または２７に記載の細胞培養用シート。
  30. 　該ファイバーシートにおいて、ファイバーがランダムな構造を有する、請求項２７～２９いずれかに記載の細胞培養用シート。
  31. 　該ファイバーシートにおいて、ファイバーが配向性の構造を有する、請求項２７～２９いずれかに記載の細胞培養用シート。
  32. 　該ファイバーシートが生体内分解性の素材で構成されている、請求項２７～３１いずれかに記載の細胞培養用シート。
  33. 　該ファイバーシートが分解されにくい素材で構成されている、請求項２７～３１いずれかに記載の細胞培養用シート。
  34. 　フレーム上に、スペーサーをさらに備える、請求項２６～３３いずれかに記載の細胞培養用シート。
  35. 　請求項２６～３４何れかに記載の細胞培養用シートと、該細胞培養用シート上の培養細胞を含む、組織片。
  36. 　複数の細胞培養用シートが培養細胞層間に介在している、請求項３５記載の組織片。
  37. 　滅菌された包装材および、その中に封入されている請求項３５または３６に記載の組織片を含む製品。
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