JPWO2018124119A1 - 染色体の異常の検出方法および誘発性を評価する方法 - Google Patents

染色体の異常の検出方法および誘発性を評価する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程、および前記工程で培養されたTリンパ球における染色体の異常を検出する工程を含むことを特徴とする、染色体の異常の検出方法を提供する。また、ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程、前記工程で培養されたTリンパ球に被験物質を添加する工程、被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、測定する工程、および染色体の異常の発生頻度を対照群の発生頻度基準値と比較して、染色体の異常の誘発性を評価する工程を含むことを特徴とする、被験物質による染色体の異常の誘発性の評価方法を提供する。

Description

本発明は、ヒト多能性幹細胞由来のＴリンパ球を用いた染色体の異常の検出方法および誘発性を評価する方法に関する。
染色体の異常とは、遺伝毒性の評価項目の１つであり、化学物質等によるヒト健康影響を見積もる上で最重要視される評価項目の１つである。
遺伝毒性の評価を目的として実施される安全性試験である、遺伝毒性試験では、例えば、ＤＮＡ損傷性、遺伝子突然変異誘発性、染色体異常誘発性などの指標に関する種々の試験が活用されている。遺伝毒性試験には、被験物質の遺伝毒性を簡便かつ早期に把握するスクリーニング試験、または被験物質の作用機作を把握する試験としての位置付けにある、細菌、細胞等を用いて試験管内で実施するin vitro遺伝毒性試験と、遺伝毒性の最終評価を行う確定試験としての位置付けにある、実験動物を用いるin vivo遺伝毒性試験とがある。莫大な数にのぼる化学物質等の全てについてin vivo遺伝毒性試験を実施することは期間およびコストの観点からも、また、動物愛護の観点からも困難であり、in vitro遺伝毒性試験を効率的に活用することが従来から求められてきた。
In vitroでの染色体の異常の評価には、in vitro染色体異常試験やin vitro小核試験、あるいは染色体を構成するＤＮＡに対する損傷の評価としてin vitroコメット試験等が汎用される。
In vitroでの染色体の異常の評価には種々の細胞が利用できるが、取り扱いが容易であり、検出感度が高いことから、チャイニーズハムスター肺由来の線維芽細胞株であるCHL/IUやV79、チャイニーズハムスターの卵巣由来細胞株であるCHO-K1等の、哺乳動物由来の不死化細胞が汎用されており、また、ヒト不死化細胞であるヒトリンパ芽球様細胞株TK6、およびヒト生体試料であるヒト新鮮血由来リンパ球(HuLy)が用いられることも報告されている（非特許文献１）。
Fowler P., Smith K., Young J., Jeffrey L., Kirkland D., Pfuhler S., Carmichael P.: Reduction of misleading ("false") positive results in mammalian cell genotoxicity assays. I. Choice of cell type. Mutation Research 742: p11-25, 2012. Kimura A., Miyata A., Honma M.: A combination of in vitro comet assay and micronucleus test using human lymphoblastoid TK6 cells. Mutagenesis 28(5): p583-590, 2013. Honma M., Hayashi M.: Comparison of In Vitro Micronucleus and Gene Mutation Assay Results for p53-Competent Versus p53-Deficient Human Lymphoblastoid Cells. Envitonmental and Molecular Mutagenesis 52: p373-384, 2011.
しかしながら、哺乳動物由来の不死化細胞を用いると偽陽性が頻発することが知られており（非特許文献１）、この原因としては、がん抑制遺伝子としても知られる細胞周期調節因子p53の機能異常等、細胞の遺伝子プロファイルが、生物個体とは異なる点が指摘されている（非特許文献２）。
さらに、ヒトリンパ芽球様細胞株TK6は、p53の機能が正常なヒト不死化細胞であるが、13番染色体のトリソミー、14番染色体と20番染色体の転座、3番染色体と21番染色体の転座などの染色体異常を有しており、加えて、長期間の継代培養により染色体数が変動する等、ゲノム不安定な性質が認められる。in vitro遺伝毒性試験における偽陽性の発生は、p53の機能のみが決定因子ではなく、種々の遺伝子の総合的なプロファイルや細胞の由来となる動物種等に依存する可能性を示唆する研究報告もなされており（非特許文献３）、このような異常細胞であるTK6では、ヒト生体内における反応を正確に反映した結果を必ずしも得ることができない。
そして、ヒト新鮮血由来リンパ球HuLyを用いる場合は、増殖能に限界があることから試験毎にヒト新鮮血を採取する必要があり、年齢や既往症、喫煙歴等の、種々の基準を満たすドナーを確保して安定的に細胞を供給することは困難である。また、HuLyは由来するドナー毎に性質、すなわち試験における応答性等が少しずつ異なることが知られており、加えて、同じドナーでも採取時のドナーの生理状態により細胞のプロファイルが異なることが想定される。しかし、新鮮血に由来するHuLyは同一ドナーから採取できる細胞数に限りがあるため、ドナー間の応答性の差異を検討するための比較実験や、同一ドナー由来細胞による均質な再現実験を、標準的に実施することは困難である。
従って、本発明の目的は、哺乳動物由来不死化細胞やTK6、HuLy等を用いた従来のin vitroにおける染色体異常の評価法が抱える上記の課題を解決するべく、安定的かつ均質に大量供給可能なヒト正常細胞種を用いた、染色体の異常の評価法を提供することである。
上述の課題を解決すべく、本発明者らは、ほぼ無制限に増殖可能で様々な細胞に分化可能な多能性幹細胞に着目し、ヒト多能性幹細胞由来のＴリンパ球を用いた染色体の異常の検出・試験を着想した。しかしながら、ヒトiPS細胞由来Ｔリンパ球を用いた場合、HuLyによる従来法で用いられるPHA（phytohemagglutinin）による増殖刺激では、該Ｔリンパ球が十分に分裂せず、染色体異常の検出・試験を実施することができなかった。そこで、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、抗CD3抗体を増殖刺激因子として用いるとヒトiPS細胞由来Ｔリンパ球が良好に分裂し、染色体異常の検出・試験が実施可能となることを見出した。
すなわち、本発明は、下記［１］〜［１４］を提供する。
［１］下記（１）〜（２）の工程を含むことを特徴とする染色体の異常の検出方法。
（１）ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程
（２）（１）の工程で培養されたTリンパ球における染色体の異常を検出する工程
［２］ヒト多能性幹細胞がヒトES細胞である、［１］記載の検出方法。
［３］ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、［１］記載の検出方法。
［４］染色体の異常を検出する工程が、小核頻度の測定により染色体の異常を検出する工程である、［１］〜［３］のいずれか記載の検出方法。
［５］染色体の異常を検出する工程が、染色体の形態観察により染色体の異常を検出する工程である、［１］〜［３］のいずれか記載の検出方法。
［６］染色体の異常を検出する工程が、ＤＮＡ損傷の評価により染色体の異常を検出する工程である、［１］〜［３］のいずれか記載の検出方法。
［７］［１］〜［６］のいずれか記載の検出方法に用いるための、抗CD3抗体およびヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球を含む検出キット。
［８］下記（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする、被験物質による染色体の異常の誘発性を評価する方法。
（１）ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程
（２）（１）の工程で培養されたTリンパ球に被験物質を添加する工程
（３）被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、測定する工程
（４）染色体の異常の発生頻度を基準値と比較して、染色体の異常の誘発性を評価する工程
［９］ヒト多能性幹細胞がヒトES細胞である、［８］記載の方法。
［１０］ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、［８］記載の方法。
［１１］（３）の工程が、被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、小核頻度の測定により測定する工程である、［８］〜［１０］のいずれか記載の方法。
［１２］（３）の工程が、被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、染色体の形態観察により測定する工程である、［８］〜［１０］のいずれか記載の方法。
［１３］（３）の工程が、被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、ＤＮＡ損傷の評価により測定する工程である、［８］〜［１０］のいずれか記載の方法。
［１４］［８］〜［１３］のいずれか記載の評価方法に用いるための、抗CD3抗体およびヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球を含む試験キット。
本発明によれば、安定的かつ均質に大量供給可能で、かつ染色体異常を検出・試験可能なヒト正常Tリンパ球を提供することができ、当該細胞を用いて染色体の異常を検出することにより、哺乳動物由来不死化細胞やTK6、HuLy等を用いた従来のin vitroにおける染色体の異常の評価法が持つ課題を解決することができる。
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）についての用量反応関係を示す。横軸にＭＭＣの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）（Replication Index）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）についての用量反応関係を示す。横軸にＡｒａＣの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）についての用量反応関係を示す。横軸にＥＭＳの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、ブレオマイシン硫酸塩（ＢＬＭ）についての用量反応関係を示す。横軸にＢＬＭの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）についての用量反応関係を示す。横軸にＭＮＮＧの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、コルヒチン（ＣＯＬ）についての用量反応関係を示す。横軸にＣＯＬの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により５％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊を、１％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、ビンブラスチン（ＶＢＬ）についての用量反応関係を示す。横軸にＶＢＬの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、シクロホスファミド一水和物（ＣＰＡ）についての用量反応関係を示す。横軸にＣＰＡの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。いずれの用量についても、また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により５％有意な小核頻度の増加を認めた用量に＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験（実施例２）で得られた、Ｄ（−）−マンニトール（ＭＡＮ）についての用量反応関係を示す。横軸にＭＡＮの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の小核頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩ（％）を取った。いずれの用量についても、統計学的に有意な小核頻度の増加は認められなかった。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro染色体異常試験（実施例５）で得られた、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）についての用量反応関係を示す。横軸にＭＭＣの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の染色体異常頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩＣＣ（％）（Relative increase in cell count）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な染色体異常頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro染色体異常試験（実施例５）で得られた、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）についての用量反応関係を示す。横軸にＥＭＳの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の染色体異常頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩＣＣ（％）を取った。また、棒グラフ上には、Fisherの直接確率検定により１％有意な染色体異常頻度の増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro染色体異常試験（実施例５）で得られた、Ｄ（−）−マンニトール（ＭＡＮ）についての用量反応関係を示す。横軸にＭＡＮの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量の染色体異常頻度（％）を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＩＣＣ（％）を取った。いずれの用量についても、統計学的に有意な染色体異常頻度の増加は認められなかった。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitroコメット試験（実施例６）で得られた、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）についての用量反応関係を示す。横軸にＥＭＳの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量における%tail DNAの中央値の平均値の３連での平均値を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＣＣ（％）（Relative cell count）を取った。また、棒グラフ上には、Dunnett’s testにより１％有意な%tail DNAの増加を認めた用量に＊＊を付した。 ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitroコメット試験（実施例６）で得られた、Ｄ（−）−マンニトール（ＭＡＮ）についての用量反応関係を示す。横軸にＭＡＮの処理用量を取り、縦軸には、棒グラフとして第１軸に各用量における%tail DNAの中央値の平均値の３連での平均値を、折れ線グラフとして第２軸に各用量の細胞毒性の指標としてＲＣＣを取った。いずれの用量についても、統計学的に有意な%tail DNAの増加は認められなかった。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
＜共通する用語の説明＞
本明細書において、「遺伝毒性」とは、染色体の数や構造、あるいは染色体を構成するＤＮＡといった生物の遺伝情報に不可逆な変化、すなわち変異を引き起こす性質を意味する。
本明細書において、「偽陽性」とは、生体内で染色体の異常を誘発しないにもかかわらずin vitro試験でのみ認められる、生物学的意義に乏しい陽性反応を意味する。In vitro試験で陽性反応を認めた場合、in vivo試験を実施して生体内での染色体の異常の誘発の有無を確認することが必須であるため、偽陽性が頻発すると不必要なin vivo試験の実施数が増大する。すなわち、評価期間、コスト、動物愛護等、様々な観点から、in vitro試験の偽陽性を低減することが求められる。
一実施態様において、本発明は、
（１）ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程、および
（２）（１）の工程で培養されたTリンパ球における染色体の異常を検出する工程を含む、染色体の異常の検出方法（以下「本発明の検出方法」と略記する場合がある。）を提供する。
本発明において「幹細胞」とは、分裂して元の細胞と同じ細胞を作る能力、すなわち自己複製能と、別の種類の細胞に分化する能力とを持ち、持続的に増殖できる細胞を意味する。
本発明における「多能性幹細胞」とは、in vitroにおいて培養することが可能で、且つ、三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の組織に分化しうる能力、すなわち多能性(pluripotency)を有する幹細胞を意味する。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、または組織内幹細胞等から樹立することができる。本発明における「多能性幹細胞」のより具体的な例としては、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）、体細胞から誘導された人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、および胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などを挙げることができるが、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。
本発明における「ＥＳ細胞」とは、自己複製能を有し、多能性（pluripotency）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞を意味する。ＥＳ細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒトＥＳ細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。
本発明における「ｉＰＳ細胞」とは、体細胞から誘導された多能性幹細胞であり、体細胞を初期化することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞を意味し、具体的には、線維芽細胞等の分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の遺伝子の発現により初期化して樹立した多分化能を有する人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）を挙げることができる。2006年、山中らによりマウス線維芽細胞から人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2006, 126(4), p663-676）。2007年にはヒト線維芽細胞から、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2007, 131(5),p861-872; Science, 2007, 318(5858), p1917-1920; Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。本発明に用いるｉＰＳ細胞は、自体公知の方法により体細胞から作製してもよいし、既に樹立され、ストックされているｉＰＳ細胞であってもよい。また、本発明に用いるｉＰＳ細胞の由来となる体細胞に限定はないが、Ｔリンパ球への誘導効率の観点からは、好ましくはＴリンパ球である。ヒトＴリンパ球は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができ、ヒトの組織としては、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられるが、前記Ｔリンパ球を含む組織であれば特に限定はない。
本発明における「Ｔリンパ球」とは、Ｔ細胞とも呼ばれ、リンパ器官あるいは末梢血中等に認められる白血球の一種で、主に胸腺で分化成熟しＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現することを特徴とするリンパ球の一分類を意味する。Ｔリンパ球はその機能から更に複数の細胞種に分類され、主な細胞種としてはヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞等が知られている。Ｔリンパ球は、ヒト末梢血から採取が可能なヒト正常細胞であること、各種増殖因子により容易に増殖可能なこと等から、遺伝毒性試験をはじめとした、ヒト細胞における応答を調べる各種実験、検出系に頻用されている。本発明に用いることができるヒトＴリンパ球としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパーＴ細胞、ＣＤ８陽性細胞であるキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ−細胞）などが挙げられ、これらの細胞への分化途中の細胞も含まれる。好ましいＴリンパ球は、ＣＤ８ＳＰ（Single Positive）のキラーＴ細胞である。
本発明における「ヒト多能性幹細胞由来のＴリンパ球」とは、ヒト多能性幹細胞を分化誘導することにより作製されるＴリンパ球を意味する。ヒト多能性幹細胞をＴリンパ球へ分化誘導する方法としては、種々の公知の分化誘導方法を適宜選択して用いることができる。公知の分化誘導方法としては、例えば、「Timmermans, F. et al., J. Immunol., 2009, 182, 68879-6888」に記載のヒトＥＳ細胞からＴリンパ球を誘導する方法が挙げられる。また、例えば、「Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell, 2013, 12, 114-126」に記載の方法により、ヒト末梢血Ｔリンパ球より樹立したヒトｉＰＳ細胞をＴリンパ球に分化誘導することができる。本発明の評価方法に多能性幹細胞由来のＴリンパ球を用いる場合には、評価を行う際に、多能性幹細胞からＴリンパ球を作製して直ちに用いてもよいし、あらかじめ作製し、凍結保存等によりストックしたＴリンパ球（以下「ストック細胞」と省略する。）を用いてもよく、ストック細胞は、細胞特異的マーカーの発現、染色体の異常発生率や増殖能を評価することなどにより、事前に品質が評価されていることが好ましい。利便性や再現性の観点からは、品質が評価されたストック細胞を用いることが好ましい。
細胞の染色体の異常は、細胞分裂の際に固定されることから、本発明の評価方法に用いる多能性幹細胞由来のＴリンパ球は、良好な増殖能力を有することが必要である。細胞の増殖能力は、例えば、CytoBの処理期間における細胞分裂の程度を示す指標である、以下の式で示されるＣＢＰＩ(Cytokinesis-block proliferation index)により算出することができ、数値が大きいほど細胞が盛んに分裂したことを示す。ＣＢＰＩは、観察対象細胞が全て分裂しなかった場合には１、観察対象細胞が全て１回の分裂過程を経た場合には２となる。ＣＢＰＩは、CytoBを添加してin vitro小核試験を実施する際に被験物質による細胞分裂抑制作用を評価する指標として試験ガイドライン（OECD guidelines for the testing of chemicals 487: In vitro mammalian cell micronucleus test, adopted 26 September 2014）中に指定されている。小核あるいは染色体異常の検出には観察対象細胞の分裂が必須であり、また、CytoBを添加してin vitro小核試験を実施する際には２核細胞を観察対象とするため、染色体異常の検出、試験には細胞が良好な分裂状態にありＣＢＰＩが高い値を示すことが必要である。ＣＢＰＩはCytoBの処理時間に依存するため、良好な分裂状態を担保する基準値に関する明確なコンセンサスは無いが、一般に１．５以上であれば検出、試験系として十分に実用可能である。
本発明の評価方法に用いる多能性幹細胞由来のＴリンパ球は、染色体異常を誘発する既知化合物に対して適切な応答を示すことを事前に評価することが望ましい。前記既知化合物としては、染色体構造異常に由来する小核誘発化合物であるマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（例：ＣＡＳ番号５０−０７−７、協和発酵キリン）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（例：ＣＡＳ番号１４７−９４−４、nacalai tesque）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）（例：ＣＡＳ番号６２−５０−０、nacalai tesque）、ブレオマイシン硫酸塩（ＢＬＭ）（例：ＣＡＳ番号９０４１−９３−４、LKT laboratories）および１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（例：ＣＡＳ番号７０−２５−７、nacalai tesque）などが、染色体数的異常に由来する小核誘発化合物であるコルヒチン（ＣＯＬ）（例：ＣＡＳ番号６４−８６−８、Wako）およびビンブラスチン硫酸塩（ＶＢＬ）（例：ＣＡＳ番号１４３−６７−９、Wako）などが、生体内で代謝酵素による代謝活性化の後に小核を誘発する化合物であるシクロホスファミド一水和物（ＣＰＡ）（例：ＣＡＳ番号６０５５−１９−２、nacalai tesque）などが、小核を誘発しない化合物であるＤ（−）−マンニトール（ＭＡＮ）（例：ＣＡＳ番号６９−６５−８、Wako）、トリトンＸ−１００などが挙げられるが、これらの化合物に限定されない。前記化合物はいずれも多数の公知文献等（例えば、Mutat Res, 2006, 607, p37-60、Mutagenesis, 2011, 26(6), p763-770など）によりその反応性（染色体異常誘発性）が十分に評価された化合物である。
本発明において「ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程」（「Ｔリンパ球に増殖刺激を施す工程」）としては、該Ｔリンパ球に抗CD3抗体を培地に添加して培養する工程が挙げられる。増殖刺激を施すことにより、細胞塊が形成される。複数の細胞塊が形成されたことを観察することにより、増殖刺激が施されたことを確認することができる。被験物質の作用の細胞周期依存性を評価する目的で、増殖刺激を施さず休止期にある該Ｔリンパ球に被験物質を処理した後、増殖刺激を施してもよい。一般にＴリンパ球の増殖刺激因子としては、PHAをはじめとした各種レクチン分子等、種々の因子が知られているが、後述の実施例に示す通り、本発明におけるヒト多能性幹細胞由来Ｔリンパ球の増殖刺激因子としては抗CD3抗体を用いることが必須である。すなわち、HuLyによる従来法で用いられるPHAを用いた増殖刺激では、フィーダー細胞との共培養の有無によらず、十分な頻度で分裂したヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球細胞を観察することができず、検出・試験として実用できない。一方で、抗CD3抗体を増殖刺激因子として用いた場合には検出・試験が実施可能となる。
増殖刺激に用いる抗CD3抗体には多くのクローンが存在するが、例えば「OKT3」クローンを用いることができる。また、抗CD3抗体を用いて該Ｔリンパ球に増殖刺激を施す際には、抗CD28抗体、抗CD2抗体等の抗体や、IL-2、IL-7、IL-15等のサイトカインを更に加えてもよい。
増殖刺激因子を添加する培地としては、種々の公知の細胞培養用培地を適宜選択して用いることができるが、Ｔリンパ球の培養に適した培地の具体例としては、ＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。該培地には、増殖刺激因子以外にも、各種血清（例えば、ヒト血清や牛胎児血清）やアミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン）、抗生物質（例えば、ペニシリンやストレプトマイシン）、その他のサイトカイン等を添加して用いてもよい。
増殖刺激に用いる抗CD3抗体は、磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、また、前記抗CD3抗体を培地中に添加する代わりに、抗CD3抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で該Ｔリンパ球を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。
培地中に添加する抗CD3抗体の濃度は特に限定されないが、後述する該Ｔリンパ球の細胞密度の１〜１０倍であることが好ましい。また、該Ｔリンパ球に増殖刺激を施すために培養ディッシュ上に結合させた抗CD3抗体の濃度は特に限定されないが、コーティングの際の濃度は０．１〜１００μg/mＬであることが好ましく、０．５〜５０μg/mＬであることがより好ましい。本発明の一実施態様において、抗CD3抗体のコーティングの際の濃度は、０．５〜１．０μg/mＬである。
抗CD3抗体による増殖刺激を施す際の該Ｔリンパ球の播種密度は特に限定されないが、Ｔリンパ球の接触機会を増してクラスター化を促し、効率的な増殖刺激を施す目的で、高密度培養を行うことが好ましい。具体的には、１×１０５細胞/mＬ以上であることが好ましく、５×１０５細胞/mＬ以上であることがより好ましく、１×１０６細胞/mＬ以上であることが特に好ましい。
ここで、「抗CD3抗体による増殖刺激を施す際の該Ｔリンパ球の播種密度」とは、Ｔリンパ球を播種した後の、最終的なＴリンパ球の細胞密度を意味する（以下「最終的な細胞密度」と呼ぶことがある。）。
抗CD3抗体添加後の培養期間は、抗CD3抗体による増殖刺激を施すのに十分であれば特に制限はなく、例えば、６時間以上、好ましくは１２時間以上である。
抗CD3抗体による増殖刺激が長期的に持続するとactivation induced cell deathを誘導する可能性があるため、これを回避する目的で増殖刺激開始後一定期間の経過後に抗CD3抗体を培養系から除去してもよい。増殖刺激開始から除去までの期間は特に限定されないが、７２時間以内であることが好ましく、２４時間以内であることがより好ましい。
Ｔリンパ球の増殖を促すのに十分な期間培養を行った後は、抗CD3抗体の除去とともに、細胞同士の相互作用による増殖刺激の継続を防ぐべく、細胞密度を低下させることもできる。この際の細胞密度としては、染色体の異常の検出・試験が可能な程度の細胞増殖が可能であれば特に限定されないが、１×１０５〜１×１０６細胞／mLであることが好ましく、１×１０５〜６×１０５細胞／mLであることがより好ましい。本発明の一実施態様において、４×１０５細胞／mLの密度で細胞が培養される。
また、抗CD3抗体除去から被検物質添加までの培養期間についても、上記目的を達することができれば、特に限定されないが、４８時間以内であることが好ましく、３〜２４時間がより好ましい。
培地のｐＨは、好ましくは約６〜約８であり、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養温度は、通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
本発明において「染色体の異常を検出する」方法としては、例えば、小核頻度の測定による染色体の異常の検出する方法、染色体の形態観察による染色体の異常の検出する方法、ＤＮＡ損傷の評価による染色体の異常の検出する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明における「小核」とは、分裂後期から間期あるいは休止期の細胞の細胞質内に認められる、主核よりも小さな異常核酸構造を意味する。小核は、染色体の構造異常に由来する無動原体染色体断片、または、有糸分裂期に染色体分配異常により極へ移動できなかった染色体全体を原因として生じることが知られており、細胞分裂時に発生した染色体異常の指標となる。小核頻度、すなわち、観察対象とする全細胞に占める小核を有する細胞の割合は、一定の培養期間における細胞分裂によって染色体の構造異常、または数的異常が起こる頻度を示す。すなわち、後述するin vitro小核試験の手順を利用して小核頻度を測定することで、細胞分裂時に生じた染色体異常を検出することができる。
本発明における「小核頻度」による染色体の異常の検出には、in vitro小核試験の手順を利用することができる。in vitro小核試験は、分裂後期から間期の細胞の細胞質内における、主核よりも小さな核様構造、すなわち小核の出現頻度を測定する遺伝毒性試験である。小核は、染色体の構造異常に由来する無動原体染色体断片、または有糸分裂期に染色体分配異常により極へ移動できなかった染色体全体を原因として生じることが知られており、細胞分裂時に発生した染色体異常の指標となる。in vitro小核試験は、in vitro染色体異常試験と同等の感度で被験物質による染色体異常誘発能を評価できる試験として登録申請、規制用途で汎用されつつあり、標準的な試験法がＯＥＣＤの試験ガイドライン（OECD guidelines for the testing of chemicals 487: In vitro mammalian cell micronucleus test, adopted 26 September 2014）に規定されているが、この試験方法に限定されず、種々の公知の方法が利用できる。
本発明における「染色体の形態観察」とは、対象細胞を一定期間培養し、コルセミド等の分裂阻害剤を添加して分裂中期細胞をエンリッチさせたものから染色体標本を作製し、１細胞中の染色体に染色を施した後にそれぞれの染色体を顕微鏡下で観察することで、対象細胞の染色体の構造や数に異常、すなわち染色体異常がないかを評価する解析方法を意味する。染色体異常の発生頻度、すなわち観察対象とする全分裂中期細胞に占める染色体異常を有する細胞の割合は、一定の培養期間における細胞分裂によって染色体の構造異常、または数的異常が起こる頻度を示す。すなわち、後述するin vitro染色体異常試験の手順を利用して染色体異常の発生頻度を測定することで、細胞分裂時に生じた染色体異常を検出することができる。
本発明における「染色体の形態観察」による染色体の異常の検出には、in vitro染色体異常試験の手順を利用することができる。in vitro染色体異常試験は、分裂中期細胞中に認められる染色体の形態を顕微鏡下で観察して染色体の切断等の染色体異常の出現頻度を測定する遺伝毒性試験である。標準的な試験法としてはＯＥＣＤの試験ガイドライン（OECD guidelines for the testing of chemicals 473: In vitro mammalian chromosomal aberration test, adopted 26 September 2014）に規定されており、被験物質による処理を行った細胞中に認められる染色体異常の出現頻度を陰性対照群、すなわち未処理群と比較することで、被験物質による染色体異常誘発能を評価することができるが、この試験方法に限定されず、種々の公知の方法が利用できる。
本発明における「ＤＮＡ損傷の評価」とは、対象細胞を一定期間培養し、対象細胞のＤＮＡに損傷がないかを評価する解析方法を意味する。例えば、一定期間培養した対象細胞をアガロースゲル等に包埋してアルカリ条件下で電気泳動を施すことで標本を作製し、核酸を蛍光染色した後にそれぞれの細胞核を顕微鏡下で観察し、細胞核全体の蛍光輝度に占める尾部の蛍光輝度の割合（%tail DNA）等をＤＮＡ損傷の指標値とすることができる。
観察対象とした細胞核群における%tail DNA等の指標値は、一定の培養期間において細胞の染色体を構成するＤＮＡに生じた切断等の損傷の定量的指標となる。すなわち、後述するin vitroコメット試験の手順を利用して% tail DNAを測定することで、染色体の異常としてＤＮＡ損傷を検出することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖切断のマーカー（例えば、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ））を遺伝毒性の指標として、該マーカーの発現を免疫染色やウエスタンブロッティングなどにより検出、解析することで、染色体の異常としてＤＮＡ損傷を評価してもよい。また、ＤＮＡ付加体の生成を遺伝毒性の指標として、該付加体を質量分析器等による機器分析や放射性同位元素による標識を利用して直接的に検出、解析することで、染色体の異常としてＤＮＡ損傷を評価することもできる。
あるいは、ＤＮＡ損傷応答反応（例えば、不定期ＤＮＡ合成（ＵＤＳ；Unscheduled DNA synthesis）反応）を遺伝毒性の指標として、該反応の程度を定量化（例えば、オートラジオグラフィーによってトリチウム標識チミジンの取り込み量を決定することによるＵＤＳ反応の定量化）することで、染色体の異常としてＤＮＡ損傷を評価してもよい。
本発明における「ＤＮＡ損傷の評価」による染色体の異常の検出には、in vitroコメット試験の手順を利用することができる。in vitroコメット試験は、単細胞ゲル電気泳動法（ＳＣＧＥ：single cell gel electrophoresis）とも呼ばれ、細胞核をアルカリ条件下で電気泳動した後に核酸染色下で細胞核の形状を観察することで、ＤＮＡ損傷の結果生じるＤＮＡ断片を検出する遺伝毒性試験である。ＤＮＡは本来負電荷を有し、電場の存在下で陽極側に移動する性質を持つが、損傷を受けていないＤＮＡは高次構造を取るために電気泳動下でもほとんど移動せず、細胞核は円形の形状を保持する。一方、ＤＮＡ損傷の結果生じるＤＮＡ断片は高次構造を取らないために電場の存在下で陽極側に移動する。その結果、ＤＮＡ損傷を受けた細胞核はその損傷の程度に応じて尾部（テール）を持つ彗星様構造（コメット）を取る。すなわち、被験物質処理後の細胞核に電気泳動を施し、核酸の蛍光染色下で細胞核全体の蛍光輝度に占める尾部の蛍光輝度の割合（%tail DNA）等の指標値を測定することで、被験物質のＤＮＡ損傷性を見積もることができる。In vitroコメット試験には、ＯＥＣＤの試験ガイドラインのような国際的に標準化されたプロトコールは整備されていないが、各種の公知文献（例えば、Kimura A., Miyata A., Honma M.: A combination of in vitro comet assay and micronucleus test using human lymphoblastoid TK6 cells. Mutagenesis 28(5): p583-590, 2013. など）に記載の方法に従って実施することができる。本発明においてin vitroコメット試験の実施手順は特に限定されないが、種々の公知の方法（例えば、Mutagenesis, 2013, 28(5): p583-590など）に倣って実施することができる。
小核頻度の測定による染色体の異常を検出する方法、染色体の形態観察による染色体の異常を検出する方法、ＤＮＡ損傷の評価による染色体の異常を検出する方法のより具体的な態様については、下記の「本発明の評価方法」において、より詳細に説明する。
別の実施態様において、本発明は、
（１）ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程、
（２）（１）の工程で培養されたTリンパ球に被験物質を添加する工程、
（３）被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を測定する工程、および
（４）染色体の異常の発生頻度を基準値と比較して、染色体の異常の誘発性を評価する工程
を含む、被験物質による染色体の異常の誘発性を評価する方法（以下「本発明の評価方法」と略記する場合がある。）を提供する。
工程（１）については、上記の「本発明の検出方法」と同様に実施することができる。
また、工程（２）、（３）および（４）については、上記の「本発明の検出方法」において例示された種々の「染色体の異常を検出する」方法により実施することができる。以下、各種方法について具体的に説明する。
（Ａ）＜小核頻度の測定による染色体の異常の検出＞
本発明における「小核頻度」による染色体の異常の検出には、in vitro小核試験の手順を利用することができる。例えば、
（Ａ１）前記抗CD3抗体を用いてヒト多能性幹細胞由来Ｔリンパ球に増殖刺激を施す工程、
（Ａ２）増殖刺激が施されたＴリンパ球に被験物質あるいは陰性対照として用いる媒体を添加し、被験物質処理を行う工程、
（Ａ３）被験物質処理後の細胞を回収し、培地を細胞固定液で置換して細胞を固定し、固定後の細胞懸濁液を、懸濁液がわずかに白濁する程度の細胞密度に調製した後スライドグラス上に滴下、風乾して小核標本を作製する工程、及び
（Ａ４）小核標本に染色を施し、染色法に対応した光学系を備えた顕微鏡下で細胞を観察して小核頻度を測定し、被験物質処理群における小核頻度を、陰性対照群、すなわち媒体処理群（未処理群）と比較することで被験物質の小核誘発性、すなわち染色体異常誘発性を評価する工程、
により、染色体の異常を検出する方法が挙げられる。
工程（Ａ１）については、上記の「本発明の検出方法」と同様に実施することができる。
（Ａ２）被験物質処理を行う工程
被験物質の処理期間は特に限定されず、また、該Ｔリンパ球の細胞周期にも依存するが、典型的には短時間処理として３〜６時間、長時間処理として２０〜７２時間を挙げることができる。短時間処理条件においては通常、処理終了後、標本作製までの間、被験物質処理液を培地で置換して培養を継続する。また、代謝酵素による代謝活性化を経て染色体異常あるいは小核を誘発する被験物質を検出するために、被験物質処理時に代謝活性化因子を添加してもよい。代謝活性化因子としてはラット肝ホモジネート由来物であるＳ９に補酵素等を添加したＳ９ｍｉｘが汎用されるが、これに限定されるものではない。Ｓ９ｍｉｘの添加濃度は特に限定されないが、細胞に対して顕著な毒性あるいは小核誘発性を示さない濃度で使用し、培地中１〜１０％（v/v）であることが好ましい。
細胞分裂動態に関する情報や、ＮＰＢやＮＢＵＤ等の小核以外の染色体の異常を示唆する指標を得る目的で、細胞を回収する前に細胞質分裂阻害剤を添加してもよい。細胞質分裂阻害剤は細胞に対して顕著な毒性あるいは小核誘発性を示さない濃度および処理時間で使用する。細胞質分裂阻害剤としては３〜６μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（CytoB）希釈液が頻用されるが、これに限定されるものではない。CytoBの処理時間は特に限定されず、また、該Ｔリンパ球の分裂動態に依存するが、例えば１８〜４８時間である。
（Ａ３）小核標本を作製する工程
小核標本の調製に用いる細胞固定液の組成は特に限定されないが、エタノール、メタノール、エタノールと酢酸との混合液、メタノールと酢酸との混合液、あるいはパラホルムアルデヒド希釈液等が挙げられる。
また、細胞質を良好に保持し観察を容易にする目的で固定前に低張処理を行ってもよい。低張液の組成は特に限定されないが、例えば７５ｍＭ ＫＣｌ溶液等が挙げられる。
（Ａ４）小核異常頻度測定について
小核標本の染色法は特に限定されないが、例えばアクリジンオレンジによる核および細胞質の二重染色法やギムザ染色法、DAPI（2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine）、Hoechst 33342、Hoechst 33258、PI（Propidium Iodide）、臭化エチジウム、SYBR(登録商標) Gold、SYBR(登録商標) Greenあるいはその他の核酸染色試薬を利用した核染色法等が挙げられる。
また、小核の誘発メカニズム等を評価する目的で、セントロメアプローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法や抗キネトコア抗体を用いた免疫染色法等の染色を施し、動原体を可視化してもよい。
観察対象とする細胞数は特に限定されないが、統計学的精度を担保する観点から、１条件あたり５００細胞以上であることが好ましく、１条件あたり１０００細胞以上であることがより好ましい。染色標本の観察工程は、イメージングサイトメーター等の画像解析装置を用いて自動化することもできる。
また、多検体の試験を容易に実施する目的で、細胞を回収せずに96ウェルプレート等の培養器材上で直接細胞を固定して培養器材表面に小核標本を作製してもよく、前述の画像解析装置を用いることで多検体の高速自動解析が可能となる。画像解析装置の適用例としては、「Mutat Res 2013, 751(1), p1-11」等が報告されているが、これに限定されるものではない。
あるいは、回収した細胞懸濁液に適切な染色を施し、フローサイトメーターやレーザースキャニングサイトメーター等の流路系での細胞解析装置を用い、多数の細胞を自動解析することもできる。フローサイトメーターの活用例としては、「Mutat Res 2010, 703(2), p191-199」等が報告されているが、これに限定されるものではない。
被験物質による小核誘発性の判定にあたっては、被験物質群における小核頻度と陰性対照群における小核頻度の間で種々の統計学的検定を実施することができる他、陰性対照群における小核頻度の過去の実績の範囲（ヒストリカルコントロールデータ）と被験物質群における小核頻度との比較により判定することもできる。用いる統計学的検定方法は特に限定されないが、Fisherの直接確率検定による対比較やCochran-Armitageの傾向検定による増加傾向の検定等が頻用される。
小核頻度は、例えば、小核を有する２核細胞数を総２核細胞数で除することで算出することができる。小核頻度を比較する場合には、例えば、被験物質処理群における小核頻度と対応する陰性対照群における小核頻度との間でFisherの直接確率検定により、有意確率両側５％〜１％にて有意な増加の有無を検定してもよい。
被験物質による細胞分裂阻害作用、すなわち細胞毒性の指標として、例えば、上記と同様にＣＢＰＩを算出し、以下の式に従ってＲＩ（Replication index）により算出することができる。
ＲＩを用いて染色体の異常の誘発性を評価する場合、例えば、それぞれの被験物質について、ＲＩが４０％以上となる全ての処理用量において小核頻度に５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩが４０％以上となる処理用量において小核頻度に５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定することができる。この場合、ＲＩが４０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい小核頻度の増加を認める可能性が高いため、染色体の異常の誘発性の判定から除外してもよい。該方法は、染色体の異常の誘発性を評価する方法の例示であり、該方法に限定されるものではない。
（Ｂ）＜染色体の形態観察による染色体の異常の検出＞
本発明における「染色体の形態観察」による染色体の異常の検出には、in vitro染色体異常試験の手順を利用することができる。例えば、
（Ｂ１）前記抗CD3抗体を用いてヒト多能性幹細胞由来Ｔリンパ球に増殖刺激を施す工程、
（Ｂ２）増殖刺激が施されたＴリンパ球に被験物質あるいは陰性対照として用いる媒体を添加し、被験物質処理を行い、処理終了に先立って分裂阻害剤を添加して一定期間培養し、分裂中期細胞をエンリッチさせる工程、
（Ｂ３）処理後の細胞を回収し、培地を細胞固定液で置換して細胞を固定し、固定後の細胞懸濁液を、懸濁液がわずかに白濁する程度の細胞密度に調製した後スライドグラス上に滴下、風乾して染色体標本を作製する工程、及び
（Ｂ４）染色体標本に染色を施し、染色法に対応した光学系を備えた顕微鏡下で細胞を観察して染色体異常頻度を測定し、被験物質処理群における染色体異常の発生頻度を、陰性対照群、すなわち媒体処理群（未処理群）と比較することで被験物質の染色体異常誘発性を評価する工程
を有する方法が挙げられる。
工程（Ｂ１）については、上記の「本発明の検出方法」と同様に実施することができる。
（Ｂ２）被験物質処理を行う工程
被験物質の処理期間は特に限定されず、また、該Ｔリンパ球の細胞周期にも依存するが、典型的には短時間処理として３〜６時間、長時間処理として２０〜７２時間を挙げることができる。短時間処理条件においては通常、処理終了後、標本作製までの間、被験物質処理液を培地で置換して培養を継続する。また、代謝酵素による代謝活性化を経て染色体異常あるいは小核を誘発する被験物質を検出するために、被験物質処理時に代謝活性化因子を添加してもよい。代謝活性化因子としてはラット肝ホモジネート由来物であるＳ９に補酵素等を添加したＳ９ｍｉｘが汎用されるが、これに限定されるものではない。Ｓ９ｍｉｘの添加濃度は特に限定されないが、培地中１〜１０％（v/v）であることが好ましい。分裂中期細胞をエンリッチさせるための分裂阻害剤としては０．１０μｇ／ｍＬのコルセミド希釈液が頻用されるが、これに限定されるものではない。分裂阻害剤の処理時間は特に限定されず、また、該Ｔリンパ球の細胞周期にも依存するが、典型的には１〜２時間である。
（Ｂ３）染色体標本を作製する工程
染色体標本の調製に用いる細胞固定液としては、メタノール：酢酸＝３：１（v/v）の混合液が頻用されるがこれに限定されるものではなく、具体例としては、エタノール、メタノール、エタノールと酢酸との混合液、メタノールと酢酸との混合液、あるいはパラホルムアルデヒド希釈液等が挙げられる。また、細胞を膨潤させ観察を容易にする目的で固定前に低張処理を行ってもよい。低張液の組成は特に限定されないが、例えば７５ｍＭ ＫＣｌ溶液等が挙げられる。
（Ｂ４）染色体異常頻度を測定する工程
染色体標本の染色法としてはギムザ染色法が頻用されるがこれに限定されるものではなく、種々の核酸染色試薬を用いることができる。また、染色体異常をより詳細に検出する目的で、Ｇバンド法やＱバンド法、染色体特異的ＤＮＡプローブを用いたＦＩＳＨ法等を用いて個々の染色体を区別し得る染色を施してもよい。
観察対象とする分裂中期細胞数は特に限定されないが、一般には、統計学的精度を担保するために１条件あたり１００細胞以上の分裂中期細胞を観察する。
染色標本の観察工程の一部は、画像解析装置を用いて半自動化することもできる。被験物質による染色体異常誘発性の判定にあたっては、被験物質群における染色体異常の発生頻度と陰性対照群における染色体異常の発生頻度の間で種々の統計学的検定を実施することができる他、陰性対照群における染色体異常の発生頻度の過去の実績の範囲（ヒストリカルコントロールデータ）と被験物質群における染色体異常の発生頻度との比較により判定することもできる。用いる統計学的検定方法は特に限定されないが、Fisherの直接確率検定による対比較やCochran-Armitageの傾向検定による増加傾向の検定等が頻用される。
染色体異常頻度は、例えば、いずれかの染色体異常を有する分裂中期細胞数を観察した総分裂中期細胞数で除することで算出することができる。また、例えば、被験物質処理群における染色体異常頻度と対応する陰性対照群における染色体異常頻度との間でFisherの直接確率検定により、有意確率両側５％〜１％にて有意な増加の有無を検定してもよい。
被験物質による細胞増殖抑制作用、すなわち細胞毒性の指標として、例えば、測定する被験物質処理開始時および培養完了時の細胞数に基づき、以下の式に従ってＲＩＣＣ（Relative increase in cell count）を算出することができる。
あるいは、測定する被験物質処理開始時および培養完了時の細胞数に基づき、以下の式に従ってＲＣＣ（Relative cell count）を算出してもよい。
ＲＩＣＣを用いて染色体の異常の誘発性を評価する場合、例えば、それぞれの被験物質について、ＲＩＣＣが４０％以上となる全ての処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩＣＣが４０％以上となる処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定することができる。この場合、ＲＩＣＣが４０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい染色体異常頻度の増加を認める可能性が高いため、染色体の異常の誘発性の判定から除外してもよい。あるいは、それぞれの被験物質について、ＲＩＣＣが３０％以上となる全ての処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩＣＣが３０％以上となる処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定することができる。この場合、ＲＩＣＣが３０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい染色体異常頻度の増加を認める可能性が高いため、染色体の異常の誘発性の判定から除外してもよい。これらの方法は、染色体の異常の誘発性を評価する方法の例示であり、該方法に限定されるものではない。
ＲＣＣを用いて染色体の異常の誘発性を評価する場合、例えば、それぞれの被験物質について、ＲＣＣが３０％以上となる全ての処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＣＣが３０％以上となる処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定することができる。この場合、ＲＣＣが３０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい染色体異常頻度の増加を認める可能性が高いため、染色体の異常の誘発性の判定から除外してもよい。
（Ｃ）＜ＤＮＡ損傷の評価による染色体の異常の検出＞
本発明における「ＤＮＡ損傷の評価」による染色体の異常の検出には、in vitroコメット試験の手順を利用することができる。例えば、
（Ｃ１）前記抗CD3抗体を用いてヒト多能性幹細胞由来Ｔリンパ球に増殖刺激を施す工程、
（Ｃ２）増殖刺激が施されたヒト多能性幹細胞由来Ｔリンパ球に被験物質あるいは陰性対照として用いる媒体を添加し、被験物質処理を行う工程、
（Ｃ３）処理後の細胞を回収し、ゲルに包埋してスライドグラス上に固定化し、スライドグラス上の細胞を溶解緩衝液で処理して細胞膜や核膜を除去し、ＤＮＡを露出させ、更に強アルカリ条件下に曝すことでＤＮＡ損傷により生じたＤＮＡ断片等を遊離させ、ゲル中の細胞核ＤＮＡに電気泳動を施してコメット標本を作製する工程、及び
（Ｃ４）コメット標本に核酸染色を施し、染色法に対応した光学系を備えた顕微鏡下で細胞を観察して染色輝度を測定し、%tail DNA等の指標値を算出し、被験物質処理群における指標値を、陰性対照群、すなわち媒体処理群（未処理群）と比較することで被験物質のＤＮＡ損傷誘発性、すなわち染色体を構成するＤＮＡに対する異常の誘発性を評価する工程
を有する方法が挙げられる。
あるいは、上記の工程（Ｃ２）の後に、
（Ｃ’３）処理後の細胞を固定化し、ＤＮＡ二本鎖切断のマーカーを免疫染色する工程、及び
（Ｃ’４）免疫染色の結果を、陰性対照群、すなわち媒体処理群（未処理群）と比較することで被験物質のＤＮＡ損傷誘発性、すなわち染色体を構成するＤＮＡに対する異常の誘発性を評価する工程
を有する方法が挙げられる。
工程（Ｃ’３）において、処理後の細胞は、例えば、スライドグラス上で固定化してもよいし、マルチウェルプレート上で固定化してもよい。
また、工程（Ｃ’４）において、免疫染色の結果の確認は、蛍光顕微鏡下で行ってもよいし、イメージングサイトメーター等の画像解析装置を用いてもよい。あるいは、固定化・免疫染色した細胞懸濁液を、フローサイトメーター等の流路系での細胞解析装置を用いて解析してもよい。
工程（Ｃ１）については、上記の「本発明の検出方法」と同様に実施することができる。
（Ｃ２）被験物質処理を行う工程
被験物質の処理期間は特に限定されないが、典型的には１〜６時間を挙げることができる。In vitroコメット試験で検出するＤＮＡ損傷は、その多くが生体内の恒常性維持機能により速やかに修復されるため、一般に長時間処理は感度の向上に寄与しない。代謝酵素による代謝活性化を経てＤＮＡ損傷を誘発する被験物質を検出するために、被験物質処理時に代謝活性化因子を添加してもよい。代謝活性化因子としてはラット肝ホモジネート由来物であるＳ９に補酵素等を添加したＳ９ｍｉｘが汎用されるが、これに限定されるものではない。Ｓ９ｍｉｘの添加濃度は特に限定されないが、細胞に対して顕著な毒性あるいはＤＮＡ損傷性を示さない濃度で使用し、培地中１〜１０％（v/v）であることが好ましい。
（Ｃ３）コメット標本作製を行う工程
細胞を包埋するゲルとしては低融点アガロースゲルが汎用されるが、これに限定されるものではない。細胞の細胞膜や核膜の除去に用いる溶解緩衝液の組成は特に限定されないが、界面活性剤と高濃度塩の混合緩衝液が汎用され、例えばトリトンＸ−１００、塩化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、トリヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合緩衝液を挙げることができる。細胞核ＤＮＡを強アルカリ条件下に曝す条件は特に限定されないが、一般にｐＨ１３以上であることが好ましく、水酸化ナトリウム水溶液が汎用される。
（Ｃ４）異常誘発性の評価を行う工程
コメット標本の核酸染色にはSYBR(登録商標) Goldが汎用されるが、これに限定されるものではなく、種々の公知の核酸染色試薬が利用できる。また、細胞毒性に由来するＤＮＡ断片化を識別する目的で、カスパーゼ活性の測定等、公知のアポトーシス評価方法を組み合わせることもできる。観察対象とする細胞数は特に限定されないが、統計学的精度を担保する観点から、１条件あたり５０細胞以上であることが好ましく、１条件あたり１００細胞以上であることがより好ましい。染色されたコメット標本の観察工程は、画像解析装置を用いて自動化することもできる。画像解析装置の適用例としては、「Toxicol In Vitro 2009, 23(8), p1570-1575」等が報告されているが、これに限定されるものではない。
また、多検体の試験を容易に実施する目的で、細胞を回収せずに96ウェルプレート等の培養器材上でコメット標本を作製してもよく、前述の画像解析装置を用いることで多検体の高速自動解析が可能となる。被験物質によるＤＮＡ損傷誘発性の判定にあたっては、被験物質群における%tail DNA等の指標値と陰性対照群における指標値の間で種々の統計学的検定を実施することができる他、陰性対照群における指標値の過去の実績の範囲（ヒストリカルコントロールデータ）と被験物質群における指標値との比較により判定することもできる。用いる統計学的検定方法は特に限定されないが、Dunnett’s testによる多重比較やCochran-Armitageの傾向検定による増加傾向の検定等が頻用される。In vitroコメット試験の実施にあたっては、ＤＮＡ損傷の誘発メカニズムを詳細に解析する目的で、endonuclease-III（Endo III）やformamidopyrimidine-DNA glycosylase（FPG）、8-oxoguanine DNA gycosylase（OGG1）等のＤＮＡ修復酵素を利用してもよく、修正コメット試験として「Mutat Res 2011, 726(2), p242-250」等が報告されているが、これに限定されるものではない。
%tail DNAは、細胞核全体の蛍光輝度に占める尾部（tail）の蛍光輝度の百分率として算出できる。標本１枚ごとに総観察細胞核（５０個以上）の%tail DNAの中央値を取り、１条件２枚の標本から得た%tail DNAの中央値の平均値（mean of median of %tail DNA）を当該条件における%tail DNAの測定値とし、被験物質によるＤＮＡ損傷性の指標とすることができる。また、被験物質による細胞毒性によるアポトーシスの兆候として認められる釣り鐘様の細胞核（hedgehog）は%tail DNAの算出対象から除外してもよい。
例えば、被験物質処理群における%tail DNAと対応する陰性対照群における%tail DNAとの間でDunnett’s testを行い、有意確率両側５％〜１％にて有意な増加の有無を検定してもよい。
被験物質による細胞増殖抑制作用、すなわち細胞毒性の指標として、被験物質処理開始時および培養完了時の細胞数に基づき、上記のＲＩＣＣ（Relative increase in cell count）を算出することができる。ＲＩＣＣを用いて染色体の異常の誘発性を評価する場合、例えば、それぞれの被験物質について、ＲＩＣＣが４０％以上となる全ての処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩＣＣが４０％以上となる処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定することができる。ＲＩＣＣが４０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい%tail DNAの増加を認める可能性が高いため、DNA損傷性の判定から除外してもよい。該方法は、染色体の異常の誘発性を評価する方法の例示であり、該方法に限定されるものではない。
あるいは、被験物質による細胞増殖抑制作用、すなわち細胞毒性の指標として、被験物質処理開始時および培養完了時の細胞数に基づき、上記のＲＣＣ（Relative cell count）を算出することができる。ＲＣＣを用いて染色体の異常の誘発性を評価する場合、例えば、それぞれの被験物質について、ＲＣＣが３０％以上となる全ての処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＣＣが３０％以上となる処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定することができる。ＲＣＣが３０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい%tail DNAの増加を認める可能性が高いため、DNA損傷性の判定から除外してもよい。該方法は、染色体の異常の誘発性を評価する方法の例示であり、該方法に限定されるものではない。
（Ｃ’３）免疫染色を行う工程
免疫染色は、自体公知の方法により行うことができる。また、ＤＮＡ二本鎖切断のマーカーは、ＤＮＡの二本鎖切断を検出できるマーカーであれば特に限定されないが、γＨ２ＡＸをマーカーとして用いることが好ましい。従って、例えば、一次抗体として抗γＨ２ＡＸ抗体を用い、二次抗体としてHRP-conjugated anti−rabbit/mouse IgG抗体を用いて、免疫染色を行うことができる。
（Ｃ’４）異常誘発性の評価を行う工程
観察対象とする細胞数は特に限定されないが、統計学的精度を担保する観点から、１条件あたり５０細胞以上であることが好ましく、１条件あたり１００細胞以上であることがより好ましい。免疫染色された標本の観察工程は、画像解析装置を用いて自動化することもできる。
前記抗CD3抗体および多能性幹細胞由来Ｔリンパ球を含有するキットは、本発明の検出あるいは試験方法を適用することで、放射線等の環境因子や各種化学物質等がもつ染色体の異常の誘発ポテンシャルの評価や、染色体の異常を誘発しない化学物質のスクリーニング等に利用可能である。好ましい多能性幹細胞由来Ｔリンパ球としては、ヒト由来のＴリンパ球が挙げられる。当該キットには、前記抗CD3抗体および多能性幹細胞由来Ｔリンパ球以外に、必要に応じて、その他の器材や試薬等を添付してもよい。その他の器材や試薬としては、例えば、核酸染色剤や細胞質分裂阻害剤、Ｓ９ｍｉｘ等の代謝活性化試薬、凍結された細胞の復元や培養に用いられる培地、96ウェルプレート等の細胞培養器材等が挙げられる。また、主として生体内の環境をより精緻に模倣するために、マイクロ流体デバイス上に多能性幹細胞由来Ｔリンパ球や肝細胞等を配置した培養器材（オーガンオンチップ）をキットの構成要素とすることもできる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本実施例における培養条件は、培地を中性域とし、ＣＯ２濃度を５％、温度を３７℃とした。
実施例１ 抗CD3抗体刺激によるヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球の分裂動態
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
京都大学ｉＰＳ細胞研究所金子研究室にて、「Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, p114-126」に記載の方法に従ってヒト末梢血Ｔリンパ球より樹立したヒトｉＰＳ細胞株「２」あるいは「１２」について、「Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, p114-126」に記載の方法に従ってＣＤ８ＳＰ（Single Positive）となるＴリンパ球への分化誘導を行った。
得られたＣＤ８ＳＰ Ｔリンパ球（当該細胞を、以下、再分化Ｔリンパ球と記す）に（２）に示す６条件の増殖刺激を施した。増殖刺激後、細胞質分裂阻害剤CytoBを添加して標本を作製し（標本ｂ〜ｇ）、１細胞あたりの核の数の分布を測定することで、その分裂動態を評価した。増殖刺激因子を添加する培地には、L-glutamine含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（Wako）に、１０％ human serum AB（Nova Biologics）、１％ Penicillin-Streptomycin（nacalai tesque）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７（Wako）、及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５（R&D SYSTEMS）が添加された培地（以下、Ｒｈ培地と記す）を用いた。
また、比較対照として、増殖刺激を施さずにＲｈ培地による維持培養のみを行った細胞についても同様に分裂動態を評価した。
（２）増殖刺激条件
＜維持培養条件＞
（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「２」に由来する再分化Ｔリンパ球を１．１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ培地に懸濁し、９６ウェルプレート（Techno Plastic Products AG）上に１００μＬ播種した。約４６時間の培養の後、培養上清５μＬを、１２０μｇ／ｍＬ CytoB（Wako）を添加したＲｈ培地５μＬに置換した（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）。CytoB添加後、更に約３０時間の培養の後、（３）に記載の手順に従って標本を作製した。当該標本を以下、標本ａと記す。
＜磁性ビーズ結合抗CD3抗体による増殖刺激条件＞
磁性ビーズ結合抗CD3抗体としては、Dynabeads(登録商標) Human T-Activator CD3/CD28（VERITAS）を用いた。（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「２」に由来する再分化Ｔリンパ球１．１×１０５細胞にDynabeads(登録商標) Human T-Activator CD3/CD28を３倍量加え、１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２（Wako）を添加したＲｈ培地（以下、Ｒｈ−２培地と記す）１００μＬ中に懸濁した。懸濁液を約６ｒｐｍ、室温にて約１時間混和した後、全量を９６ウェルプレート（Techno Plastic Products AG）上に播種した（最終的な細胞密度：１．１×１０６細胞／ｍＬ）。約４５時間の培養の後、培養上清５μＬを、１２０μｇ／ｍＬ CytoBを添加したＲｈ−２培地５μＬに置換した（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）。CytoB添加後、更に約３０時間の培養の後、（３）に記載の手順に従って標本を作製した。すなわち、抗CD3抗体添加後の培養期間を約７５時間とした。当該標本を以下、標本ｂと記す。
＜抗CD3抗体結合プレートによる増殖刺激条件１＞
抗CD3抗体結合プレートとしては、BioCoatTM Ｔ細胞活性化、抗ヒトCD3 96ウェル平底アッセイプレート（Corning）を用いた。
（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「２」に由来する再分化Ｔリンパ球を５．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地に懸濁し、抗CD3抗体結合プレートの３ウェルに、それぞれ約１６０μＬ播種した（最終的な細胞密度：５．０×１０５細胞／ｍＬ）。約４３時間の培養の後、培養上清１６μＬを、６０μｇ／ｍＬ CytoBを添加したＲｈ−２培地１６μＬに置換した（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）。更に約２４時間、約２９時間、あるいは約４８時間の培養の後、（３）に記載の手順に従って標本を作製した。すなわち、抗CD3抗体添加後の培養期間を、それぞれ約６７時間、約７２時間、約９１時間とした。以下、CytoB添加後の培養期間が約２４時間の標本を標本ｃ、約２９時間の標本を標本ｄ、約４８時間の標本を標本ｅと記す。
＜抗CD3抗体結合プレートによる増殖刺激条件２＞
抗CD3抗体結合プレートとしては、９６ウェルプレート（nunc）に抗CD3抗体を用時にコートして用いた。０．５μｇ／ｍＬあるいは１．０μｇ／ｍＬ Anti-Human CD3 Functional Grade Purified（eBioscience）を９６ウェルプレートに５０μＬ添加し、室温下７時間静置して抗体をプレート表面にコートした。各ウェルを１００μＬのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、日水製薬）で２度洗浄した後、４０μＬのＲｈ−２培地に置換した。
（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「１２」に由来する再分化Ｔリンパ球を２．１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地に懸濁し、各ウェルに４０μＬ藩種した（最終的な細胞密度：１．０×１０６細胞／ｍＬ）。約１６時間の培養の後、各ウェルをピペッティングして細胞懸濁液を全量回収した。すなわち、抗CD3抗体添加後の培養期間（抗CD3抗体添加（増殖刺激開始）後、培養系から抗CD3抗体を除去するまでの期間）を約１６時間とした。細胞懸濁液を５．６×１０５細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地で希釈した後、抗体をコートしていない９６ウェルプレートに添加した。更に各ウェルにＲｈ−２培地を７０μＬ添加し、総量を１５０μＬとして培養を継続した。約３時間後、培養上清１５μＬを、６０μｇ／ｍＬ CytoBを添加したＲｈ−２培地１５μＬに置換した（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）。CytoB添加から約３３時間の培養の後、（３）に記載の手順に従って標本を作製した。以下、抗CD3抗体のコーティング時の抗体濃度が０．５μｇ／ｍＬの標本を標本ｆ、１．０μｇ／ｍＬの標本を標本ｇと記す。
以上の標本ａ〜ｇの増殖刺激条件を表１に示した。
（３）標本作製方法および分裂動態の評価方法
（２）で培養完了後のプレートを遠心分離（１５００ｒｐｍ、２分間）し、上清をＰＢＳで置換した。当該操作は２回反復し、細胞懸濁液を十分に洗浄した。洗浄後、プレートを再度遠心分離（１５００ｒｐｍ、２分間）して上清を除去し、３７℃に加温した７５ｍＭ ＫＣｌ（Wako）を添加して５分間の低張処理を行った。低張後の細胞懸濁液に１／５容の固定液（メタノール（nacalai tesque）：氷酢酸（nacalai tesque）＝３：１）を添加し、遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、５分間）しながら細胞を半固定した。遠心分離後、上清を新鮮な固定液に置換し、遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、５分間）しながら細胞を固定した。当該操作は２回反復し、細胞を十分に固定した。上清をメタノールに置換した後、十分にピペッティングして細胞懸濁液をエッペンチューブに回収し、遠心分離（４℃、１００００ｒｐｍ、５分間）した。上清を除去した後、懸濁液がわずかに白濁する程度の細胞密度となるようにメタノール中に再懸濁してスライドグラス上に滴下、風乾して標本を作製した。作製した標本は４０μｇ／ｍＬアクリジンオレンジ（Wako）溶液で染色し、蛍光顕微鏡下で広帯域Ｂｌｕｅ励起のフィルターを用いて観察した。細胞を、細胞質中に主核を１個有する単核細胞、２個有する２核細胞、３個以上有する多核細胞に分類して計数した。１標本あたり１０００個以上の再分化Ｔリンパ球を観察して単核細胞数、２核細胞数および多核細胞数を測定した。
分裂動態の指標として、以下の式に従ってＣＢＰＩ（Cytokinesis-block proliferation index）を算出した。ＣＢＰＩはCytoBの処理時間に依存するため、良好な分裂状態を担保する基準値に関する明確なコンセンサスは無いが、一般に１．５以上であれば検出、試験系として十分に実用可能である。
（４）結果
結果を表２に示した。
増殖刺激を施さなかった標本ａでのＣＢＰＩが１．０９であった一方で、標本ｂ〜ｇでのＣＢＰＩが１．５３〜１．９２であったことから、再分化Ｔリンパ球は増殖刺激因子無しではほとんど分裂しないが、抗CD3抗体を用いたいずれの増殖刺激条件によっても、染色体異常の検出、試験系として十分に実用可能な程度の細胞分裂が誘導されることが実証された。
実施例２ ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球として、実施例１（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「１２」由来の再分化Ｔリンパ球を用いた。
（２）被験物質
被験物質としては、染色体構造異常に由来する小核誘発化合物としてマイトマイシンＣ（ＭＭＣ、ＣＡＳ番号５０−０７−７、協和発酵キリン）、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、ＣＡＳ番号１４７−９４−４、nacalai tesque）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ、ＣＡＳ番号６２−５０−０、nacalai tesque）、ブレオマイシン硫酸塩（ＢＬＭ、ＣＡＳ番号９０４１−９３−４、LKT laboratories）および１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ、ＣＡＳ番号７０−２５−７、nacalai tesque）の５化合物を、染色体数的異常に由来する小核誘発化合物としてコルヒチン（ＣＯＬ、ＣＡＳ番号６４−８６−８、Wako）およびビンブラスチン硫酸塩（ＶＢＬ、ＣＡＳ番号１４３−６７−９、Wako）の２化合物を、生体内で代謝酵素による代謝活性化の後に小核を誘発する化合物としてシクロホスファミド一水和物（ＣＰＡ、ＣＡＳ番号６０５５−１９−２、nacalai tesque）を、小核を誘発しない化合物としてＤ（−）−マンニトール（ＭＡＮ、ＣＡＳ番号６９−６５−８、Wako）を用いた。以上の９化合物はいずれも多数の公知文献等（例えば、Mutat Res, 2006, 607, p37-60、Mutagenesis, 2011, 26(6), p763-770など）によりその反応性（染色体異常誘発性）が十分に評価された化合物である。被験物質は表３に記載の処理用量（培地中の最終濃度）で用い、処理にあたっては被験物質を生理食塩液（塩化ナトリウム（Wako）を超純水で溶解後、オートクレーブ滅菌して調製）あるいはＤＭＳＯ（同仁化学）に培地中の最終濃度の１００倍濃度にて溶解し、１％（v/v）添加とした。ＣＰＡは代謝活性化系としてラット肝ホモジネートＳ９の存在下で処理した。被験物質の処理は（４）に記載の手順に従って実施した。
（３）増殖刺激方法
再分化Ｔリンパ球の増殖刺激には、１２ウェルプレートに抗CD3抗体を用時にコートして用いた。１．０μｇ／ｍＬ Anti-Human CD3 Functional Grade Purifiedを１２ウェルプレート（nunc）に１ｍＬ添加し、室温下約６時間静置して抗体をプレート表面にコートした。ウェルを１ｍＬのＰＢＳで２度洗浄した後、（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「１２」に由来する再分化Ｔリンパ球を１．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地に懸濁してウェルに播種した（最終的な細胞密度：１．０×１０６細胞／ｍＬ）。１７時間の培養の後、ピペッティングにより細胞懸濁液を全量回収した。すなわち、抗CD3抗体添加後の培養期間（抗CD3抗体添加（増殖刺激開始）後、培養系から抗CD3抗体を除去するまでの期間）を約１７時間とした。細胞懸濁液を４．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地で希釈した後、抗体をコートしていない９６ウェルプレートにウェルあたり１５０μＬ再播種して培養を継続した。
（４）被験物質処理方法
ＣＰＡ以外の８化合物の処理は以下に記載の方法に従って実施した。すなわち、（３）での再播種より約２３時間（抗CD3抗体除去から被験物質添加までの培養期間）の後、培養上清１５μＬを、６０μｇ／ｍＬ CytoBを添加したＲｈ−２培地１５μＬに置換した（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）。更に、生理食塩液あるいはＤＭＳＯ中に表３に記載の最終濃度の１００倍濃度にて溶解した被験物質液を１．５μＬ添加し、３３時間の処理を行った。
被験物質処理群とは別に、ＤＭＳＯ１．５μＬを添加して同様に３３時間の処理を行い、陰性対照群とした。
ＣＰＡの処理は以下に記載の方法に従って実施した。すなわち、（３）での再播種より約２１時間（抗CD3抗体除去から被験物質添加までの培養期間）の後、６％（v/v） Ｓ９（rat liver 9000×g supernatant fraction induced with phenobarbital and 5,6-benzoflavone、オリエンタル酵母）、０．８ｍＭ ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid、nacalai tesuque）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２（Wako）、６．６ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ Glucose-6-phosphate（オリエンタル酵母）、０．８ｍＭ ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母）を添加したＲｈ−２培地３０μＬをウェルに添加した（Ｓ９の最終濃度：１％（v/v））。更に、生理食塩液中に表３に記載の最終濃度の１００倍濃度にて溶解したＣＰＡ液を１．８μＬ添加し、３時間の処理を行った。
ＣＰＡ処理群とは別に、生理食塩液１．８μＬを添加して同様に３３時間の処理を行い、陰性対照群とした。
３時間の処理の後、プレートを遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）し、上清をＲｈ−２で置換した。当該操作は３回反復し、細胞懸濁液を十分に洗浄した。洗浄後、プレートを再度遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）して上清を除去し、Ｒｈ−２培地を添加して総量を１３５μＬとした。更に６０μｇ／ｍＬ CytoBを添加したＲｈ−２培地１５μＬを添加し（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）、３３時間の培養を行った。
（５）標本作製方法および小核誘発性の評価方法
（４）で処理、培養完了後のプレートを遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）し、上清をＰＢＳで置換した。当該操作は２回反復し、細胞懸濁液を十分に洗浄した。洗浄後、プレートを再度遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）して上清をAccutase（Innovative cell technologies）で置換し、十分にピペッティングしてＴリンパ球の凝集塊をほぐした。
更にプレートを遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）して上清を除去し、３７℃に加温した７５ｍＭ ＫＣｌを添加して５分間の低張処理を行った。低張後の細胞懸濁液に１／５容の固定液（メタノール：氷酢酸＝３：１）を添加し、遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、３分間）しながら細胞を半固定した。遠心分離後、上清を新鮮な固定液に置換し、遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、３分間）しながら細胞を固定した。当該操作は２回反復し、細胞を十分に固定した。上清をメタノールに置換して遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、３分間）した後、少量のメタノール中に細胞を懸濁してスライドグラス上に滴下、風乾して標本を作製した。
ＡｒａＣ ０．５μｇ／ｍＬおよび１．０μｇ／ｍＬ処理群、ＶＢＬ ２５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬ処理群については、顕著な細胞毒性により細胞数が著しく少なく、標本を作製できなかった。
作製した標本は４０μｇ／ｍＬアクリジンオレンジ溶液で染色し、蛍光顕微鏡下で広帯域Ｂｌｕｅ励起のフィルターを用いて観察した。１条件あたり５００個以上の細胞を観察して単核細胞数、２核細胞数、多核細胞数を測定した。加えて、１条件あたり５００個以上の２核細胞を観察して小核を有する２核細胞数を測定した。ただし、被験物質による細胞毒性により５００個の細胞あるいは２核細胞を観察できない条件については、スライドグラス上の全細胞あるいは全２核細胞を観察した。小核の判定基準としては、半径が主核の１／３以下である円形の核様構造の内、蛍光強度が主核と同等のものを小核とした。また、小核を４個以上有する２核細胞や、複数の主核間で大きさや蛍光強度が大きく異なる細胞、主核あるいは小核の形状が著しくいびつな細胞については、細胞死などの非生理的な状態にある可能性が高いため、観察対象から除外した。
被験物質による小核誘発性の指標として、小核を有する２核細胞数を総２核細胞数で除することで小核頻度とした。また、被験物質処理群における小核頻度と対応する陰性対照群における小核頻度との間でFisherの直接確率検定を行い、有意確率両側５％あるいは１％にて有意な増加の有無を検定した。
被験物質による細胞分裂阻害作用、すなわち細胞毒性の指標として、実施例１（３）と同様にＣＢＰＩを算出し、ＲＩ（Replication index）を算出した。
それぞれの被験物質について、ＲＩが４０％以上となる全ての処理用量において小核頻度に５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩが４０％以上となる処理用量において小核頻度に５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定した。ＲＩが４０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい小核頻度の増加を認める可能性が高いため、小核誘発性の判定から除外した。
（６）結果
９化合物の被験物質について、本実施例で得た判定結果および公知の情報（Kirkland, D. et al. Mutation Research 2016, 795, 7-30; Lasne, C. et al. Mutation Research 1984, 130(4), 273-282; Aardema MJ. et al. Mutation Research 2006, 607(1), 61-87）から期待される判定結果を表４に示した。また、被験物質ごとの用量反応関係を図１〜図９に示した。
表４および図１〜図９に示した通り、構造異常誘発化合物、数的異常誘発化合物、代謝活性化を要する構造異常誘発化合物、小核非誘発化合物からなる９化合物の被験物質全てについて、公知の情報から期待される反応性を正しく検出できた。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験は被験物質の小核誘発性の評価に実用できることが立証された。
実施例３ ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro染色体異常試験
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球として、京都大学ｉＰＳ細胞研究所金子研究室にて、「Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, 114-126」に記載の方法に従ってヒト末梢血リンパ球より樹立するヒトｉＰＳ細胞株について、「Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, 114-126」に記載の方法に従って分化誘導を行った再分化Ｔリンパ球を用いる。
（２）被験物質
被験物質としては、染色体構造異常を誘発する化合物としてＥＭＳを、染色体異常を誘発しない化合物としてＭＡＮを用いる。被験物質は表５に記載の処理用量（培地中の最終濃度）で用い、処理にあたっては被験物質を生理食塩液に培地中の最終濃度の１００倍濃度にて溶解し、１％（v/v）添加とする。被験物質の処理は（４）に記載の手順に従って実施する。
（３）増殖刺激方法
再分化Ｔリンパ球の増殖刺激には、１２ウェルプレートに抗CD3抗体を用時にコートして用いる。１．０μｇ／ｍＬ Anti-Human CD3 Functional Grade Purifiedを１２ウェルプレートに１ｍＬ添加し、室温下約６時間静置して抗体をプレート表面にコートする。ウェルを１ｍＬのＰＢＳで２度洗浄した後、（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株に由来する再分化Ｔリンパ球を１．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地に懸濁してウェルに添加する。約１７時間の培養の後、ピペッティングにより細胞懸濁液を全量回収する。細胞懸濁液を４．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地で希釈した後、抗体をコートしていない１２ウェルプレートにウェルあたり１ｍＬ再播種して培養を継続する。
（４）被験物質処理方法
ＥＭＳおよびＭＡＮの処理は以下に記載の方法に従って実施する。すなわち、（３）での再播種より約２３時間の後、更に、生理食塩液中に表５に記載の最終濃度の１００倍濃度にて溶解した被験物質液を１０μＬ添加し、３３時間の処理を行う。被験物質処理群とは別に、生理食塩液１０μＬを添加して同様に３３時間の処理を行い、陰性対照群とする。処理終了の約２時間前に、ウェルにKaryoMAX(登録商標) ColcemidTM Solution in HBSS（Life technologies）１０μＬを添加して（培地中最終濃度：０．１μｇ／ｍＬ）細胞周期を停止させ、分裂中期細胞をエンリッチさせる。
被験物質処理開始時に、陰性対照群の細胞懸濁液の一部を分取し、血球計算盤を用いて細胞数を測定する。
（５）標本作製方法および染色体異常誘発性の評価方法
（４）で処理、培養完了後の細胞懸濁液の一部を分取し、血球計算盤を用いて細胞数を測定する。残余の細胞懸濁液の入ったプレートは遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）し、上清をＰＢＳで置換する。当該操作は２回反復し、細胞懸濁液を十分に洗浄する。洗浄後、プレートを再度遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）して上清をAccutase（Innovative cell technologies）で置換し、十分にピペッティングしてＴリンパ球の凝集塊をほぐす。更にプレートを遠心分離（１５００ｒｐｍ、３分間）して上清を除去し、３７℃に加温した７５ｍＭ ＫＣｌを添加して５分間の低張処理を行う。低張後の細胞懸濁液に１／５容の固定液（メタノール：氷酢酸＝３：１）を添加し、遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、３分間）しながら細胞を半固定する。遠心分離後、上清を新鮮な固定液に置換し、遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、３分間）しながら細胞を固定する。当該操作は３回反復し、細胞を十分に固定した後、再度遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、３分間）して、少量の固定液中に細胞を懸濁してスライドグラス上に滴下、風乾して標本を作製する。
作製した標本はギムザ染色を施し、実体顕微鏡下１０００倍の倍率で観察する。１条件あたり５０個以上の染色体のよく広がった分裂中期細胞を対象として染色体を観察し、染色体の構造異常の有無を判定する。ただし、被験物質による細胞毒性により５０個の分裂中期細胞を観察できない条件については、スライドグラス上の全分裂中期細胞を観察する。
染色体異常は、染色分体型切断、染色体型切断、染色分体型交換、染色体型交換、その他の構造異常に分類して計数する。染色分体型あるいは染色体型切断の内、無染色部位が染色分体の幅より小さく、かつ、染色分体の軸線からずれていない場合には、該無染色部位は染色分体型あるいは染色体型ギャップとし、染色体異常に含めない。
被験物質による染色体異常誘発性の指標として、いずれかの染色体異常を有する分裂中期細胞数を観察した総分裂中期細胞数で除することで染色体異常頻度とする。また、被験物質処理群における染色体異常頻度と対応する陰性対照群における染色体異常頻度との間でFisherの直接確率検定を行い、有意確率両側５％あるいは１％にて有意な増加の有無を検定する。
被験物質による細胞増殖抑制作用、すなわち細胞毒性の指標として、（４）で測定する被験物質処理開始時および培養完了時の細胞数に基づき、以下の式に従ってＲＩＣＣ（Relative increase in cell count）を算出する。
それぞれの被験物質について、ＲＩＣＣが４０％以上となる全ての処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩＣＣが４０％以上となる処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定する。
ＲＩＣＣが４０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい染色体異常頻度の増加を認める可能性が高いため、染色体異常誘発性の判定から除外する。
実施例４ ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitroコメット試験
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球として、京都大学ｉＰＳ細胞研究所金子研究室にて、「Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, 114-126」に記載の方法に従ってヒト末梢血リンパ球より樹立するヒトｉＰＳ細胞株について、「Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, 114-126」に記載の方法に従って分化誘導を行った再分化Ｔリンパ球を用いる。
（２）被験物質
被験物質としては、ＤＮＡ損傷を誘発する化合物としてＥＭＳ、ＤＮＡ損傷を誘発しない化合物としてＭＡＮを用いる。被験物質は表６に記載の処理用量（培地中の最終濃度）で用い、処理にあたっては被験物質をＤＭＳＯに培地中の最終濃度の１００倍濃度にて溶解し、１％（v/v）添加とする。被験物質の処理は（４）に記載の手順に従って実施する。
（３）増殖刺激方法
再分化Ｔリンパ球の増殖刺激には、１２ウェルプレートに抗CD3抗体を用時にコートして用いる。１．０μｇ／ｍＬ Anti-Human CD3 Functional Grade Purifiedを１２ウェルプレートに１ｍＬ添加し、室温下約６時間静置して抗体をプレート表面にコートする。ウェルを１ｍＬのＰＢＳで２度洗浄した後、（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株に由来する再分化Ｔリンパ球を１．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地に懸濁してウェルに添加する。１７時間の培養の後、ピペッティングにより細胞懸濁液を全量回収する。細胞懸濁液を４．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−２培地で希釈した後、抗体をコートしていない１２ウェルプレートにウェルあたり１ｍＬ再播種して培養を継続する。
（４）被験物質処理方法
ＥＭＳおよびＭＡＮの処理は以下に記載の方法に従って実施する。すなわち、（３）での再播種より約２３時間の後、更に、ＤＭＳＯ中に表６に記載の最終濃度の１００倍濃度にて溶解した被験物質液を１０μＬ添加し、４時間の処理を行う。被験物質処理群とは別に、ＤＭＳＯ１０μＬを添加して同様に４時間の処理を行い、陰性対照群とする。
コメット標本作製用のサンプルとは別に、細胞毒性評価用のサンプルとして、同様にＥＭＳ、ＭＡＮおよびＤＭＳＯによる４時間処理を行う。細胞毒性評価用のサンプルについては、４時間処理の後、細胞をＰＢＳで洗浄して再播種し、３３時間の追加培養を行う。
被験物質処理開始時、処理完了時（洗浄時）および追加培養完了時に、細胞懸濁液の一部を分取し、血球計算盤を用いて細胞数を測定する。
（５）標本作製方法およびＤＮＡ損傷誘発性の評価方法
（４）で処理完了後のコメット標本作製用サンプルの入ったプレートは遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）し、上清を２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ＤＭＳＯを含むHanks’ Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ）（当該溶液を以下ホモジナイズ液と記述する）で置換する。プレートは再度遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）し、上清をホモジナイズ液で置換する。細胞懸濁液を９倍容（v/v）の低融点アガロース溶液（０．５％ NuSieve GTG Agaroseを含むＰＢＳ）と混合し、ＭＡＳコートスライドに添加して広げ、固化する。
スライドは細胞溶解液（２．５Ｍ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％ ＤＭＳＯ、１％ トリトン−Ｘ１００水溶液（ｐＨ１０））に４℃、一晩浸漬して細胞膜および核膜を溶解させる。溶解後のスライドを泳動液（０．３Ｍ 水酸化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ＞１３））中で２０分間静置した後、定電圧２６Ｖ（０．７Ｖ／ｃｍ）、３００ｍＡ、４℃にて２０分間の電気泳動を施す。泳動後のスライドを０．４Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ７．５）中に浸漬して中和した後、エタノール中で十分に脱水し、風乾して標本を作製する。標本は１条件あたり２枚作製する。
作製した標本はSYBR(登録商標) Goldを用いて核酸染色を施し、蛍光顕微鏡下２００倍の倍率で観察する。標本１枚あたり５０個以上、１条件あたり１００個以上の細胞核を撮像し、画像解析装置Comet Assay IVを用いて%tail DNAを算出し、ＤＮＡ損傷性を判定する。ただし、被験物質による細胞毒性により１００個の細胞核を観察できない条件については、スライドグラス上の全細胞核を観察する。
%tail DNAは、細胞核全体の蛍光輝度に占める尾部（tail）の蛍光輝度の百分率として算出する。標本１枚ごとに総観察細胞核（５０個以上（例：７５個））の%tail DNAの中央値を取り、１条件２枚の標本から得た%tail DNAの中央値の平均値（mean of median of %tail DNA）を当該条件における%tail DNAの測定値とし、被験物質によるＤＮＡ損傷性の指標とする。
また、被験物質による細胞毒性によるアポトーシスの兆候として認められる釣り鐘様の細胞核（hedgehog）は%tail DNAの算出対象から除外する。
被験物質処理群における%tail DNAと対応する陰性対照群における%tail DNAとの間でDunnett’s testを行い、有意確率両側５％あるいは１％にて有意な増加の有無を検定する。
被験物質による細胞増殖抑制作用、すなわち細胞毒性の指標として、（４）で測定する被験物質処理開始時および培養完了時の細胞数に基づき、以下の式に従ってＲＩＣＣ（Relative increase in cell count）を算出する。
それぞれの被験物質について、ＲＩＣＣが４０％以上となる全ての処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩＣＣが４０％以上となる処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定する。ＲＩＣＣが４０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい%tail DNAの増加を認める可能性が高いため、DNA損傷性の判定から除外する。
実施例５ ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro染色体異常試験
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球として、実施例１（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「２」由来の再分化Ｔリンパ球を用いた。
（２）被験物質
被験物質としては、染色体構造異常を誘発する化合物としてＭＭＣおよびＥＭＳを、染色体異常を誘発しない化合物としてＭＡＮを用いた。被験物質は表７に記載の処理用量（培地中の最終濃度）で用い、処理にあたっては被験物質をＰＢＳに培地中の最終濃度の１００倍濃度にて溶解し、１％（v/v）添加とした。被験物質の処理は（４）に記載の手順に従って実施した。
（３）増殖刺激方法
再分化Ｔリンパ球の増殖刺激には、２４ウェルプレートに抗CD3抗体を用時にコートして用いた。０．５μｇ／ｍＬ Anti-Human CD3 Functional Grade Purifiedを２４ウェルプレートに０．５ｍＬ添加し、室温下約９時間静置して抗体をプレート表面にコートした。ウェルを１ｍＬのＰＢＳで２度洗浄した後、（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株に由来する再分化Ｔリンパ球を２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度となるよう、L-glutamine含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（Wako）に、５％ human serum AB（Nova Biologics）、１％ Penicillin-Streptomycin（nacalai tesque）、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−７（Wako）、及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−１５（R&D SYSTEMS）が添加された培地（以下、Ｒｈ−５培地と記す）に懸濁してウェルに添加した。約１４時間の培養の後、ピペッティングにより細胞懸濁液を全量回収した。細胞懸濁液を２．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−５培地で希釈した後、抗体をコートしていない１２ウェルプレートにウェルあたり２ｍＬ再播種して培養を継続した。
（４）被験物質処理方法
ＭＭＣ、ＥＭＳおよびＭＡＮの処理は以下に記載の方法に従って実施した。すなわち、（３）での再播種より約２４時間の後、更に、ＰＢＳ中に表５に記載の最終濃度の１００倍濃度にて溶解した被験物質液を２０μＬ添加し、約２７時間の処理を行った。被験物質処理群とは別に、ＰＢＳ２０μＬを添加して同様に約２７時間の処理を行い、陰性対照群とした。処理終了の約２時間前に、ウェルにKaryoMAX(登録商標) ColcemidTM Solution in HBSS（Life technologies）２０μＬを添加して（培地中最終濃度：０．１μｇ／ｍＬ）細胞周期を停止させ、分裂中期細胞をエンリッチさせた。
被験物質処理開始時に、陰性対照群の細胞懸濁液の一部を分取し、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。
（５）標本作製方法および染色体異常誘発性の評価方法
（４）で処理、培養完了後の細胞懸濁液の一部を分取し、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。残余の細胞懸濁液は全て遠心管に回収し、ＰＢＳを添加して総量を５ｍＬとした後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）した。上清を除去し、３７℃に加温した７５ｍＭ ＫＣｌを添加して５分間の低張処理を行った。低張後の細胞懸濁液に１／５容の固定液（メタノール：氷酢酸＝３：１）を添加し、遠心分離（４℃、１０００ｒｐｍ、３分間）しながら細胞を半固定した。遠心分離後、上清を新鮮な固定液に置換し、遠心分離（４℃、１０００ｒｐｍ、３分間）しながら細胞を固定した。当該操作は３回反復し、細胞を十分に固定した後、再度遠心分離（４℃、１０００ｒｐｍ、３分間）して、少量の固定液中に細胞を懸濁してスライドグラス上に滴下、風乾して標本を作製した。
作製した標本はギムザ染色を施し、実体顕微鏡下１０００倍の倍率で観察した。１条件あたり３００個の染色体のよく広がった分裂中期細胞を対象として染色体を観察し、染色体の構造異常の有無を判定した。
染色体異常は、染色分体型切断、染色体型切断、染色分体型交換、染色体型交換、その他の構造異常に分類して計数した。染色分体型あるいは染色体型切断の内、無染色部位が染色分体の幅より小さく、かつ、染色分体の軸線からずれていない場合には、該無染色部位は染色分体型あるいは染色体型ギャップとし、染色体異常に含めなかった。
被験物質による染色体異常誘発性の指標として、いずれかの染色体異常を有する分裂中期細胞数を観察した総分裂中期細胞数で除することで染色体異常頻度とした。また、被験物質処理群における染色体異常頻度と対応する陰性対照群における染色体異常頻度との間でFisherの直接確率検定を行い、有意確率両側５％あるいは１％にて有意な増加の有無を検定した。
被験物質による細胞増殖抑制作用、すなわち細胞毒性の指標として、（４）で測定した被験物質処理開始時および培養完了時の細胞数に基づき、以下の式に従ってＲＩＣＣ（Relative increase in cell count）を算出した。
それぞれの被験物質について、ＲＩＣＣが３０％以上となる全ての処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＩＣＣが３０％以上となる処理用量において染色体異常頻度に５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定した。
ＲＩＣＣが３０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい染色体異常頻度の増加を認める可能性が高いため、染色体異常誘発性の判定から除外した。
（６）結果
３化合物の被験物質について、本実施例で得た判定結果および公知の情報（Kirkland, D. et al. Mutation Research 2016, 795, 7-30; Lasne, C. et al. Mutation Research 1984, 130(4), 273-282）から期待される判定結果を表８に示した。また、被験物質ごとの用量反応関係を図１０〜図１２に示した。
表８および図１０〜図１２に示した通り、染色体異常誘発化合物、染色体異常非誘発化合物からなる３化合物の被験物質全てについて、公知の情報から期待される反応性を正しく検出できた。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro染色体異常試験は被験物質の染色体異常誘発性の評価に実用できることが立証された。
実施例６ ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitroコメット試験
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球として、実施例１（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「２」由来の再分化Ｔリンパ球を用いた。
（２）被験物質
被験物質としては、ＤＮＡ損傷を誘発する化合物としてＥＭＳ、ＤＮＡ損傷を誘発しない化合物としてＭＡＮを用いた。被験物質は表９に記載の処理用量（培地中の最終濃度）で用い、処理にあたっては被験物質をＰＢＳに培地中の最終濃度の１００倍濃度にて溶解し、１％（v/v）添加とした。被験物質の処理は（４）に記載の手順に従って実施した。
（３）増殖刺激方法
再分化Ｔリンパ球の増殖刺激には、２４ウェルプレートに抗CD3抗体を用時にコートして用いた。０．５μｇ／ｍＬ Anti-Human CD3 Functional Grade Purifiedを２４ウェルプレートに０．５ｍＬ添加し、室温下約１０時間静置して抗体をプレート表面にコートした。ウェルを１ｍＬのＰＢＳで２度洗浄した後、（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株に由来する再分化Ｔリンパ球を２．０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−５培地に懸濁してウェルに添加した。約１３時間の培養の後、ピペッティングにより細胞懸濁液を全量回収した。細胞懸濁液を２．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度となるようＲｈ−５培地で希釈した後、抗体をコートしていない２４ウェルプレートにウェルあたり１ｍＬ再播種して培養を継続した。
（４）被験物質処理方法
ＥＭＳおよびＭＡＮの処理は以下に記載の方法に従って実施した。すなわち、（３）での再播種より約２４時間の後、更に、ＰＢＳ中に表９に記載の最終濃度の１００倍濃度にて溶解した被験物質液を１０μＬ添加し、４時間の処理を行った。被験物質処理群とは別に、ＰＢＳ１０μＬを添加して同様に４時間の処理を行い、陰性対照群とした。以上のコメット標本作製用のサンプルについては１条件あたり３連で処理を行った。
コメット標本作製用のサンプルとは別に、細胞毒性評価用のサンプルとして、同様にＥＭＳ、ＭＡＮおよびＰＢＳによる４時間処理を行った。細胞毒性評価用のサンプルについては、４時間処理の後、細胞をＰＢＳで洗浄して再播種し、約２８時間の追加培養を行った。追加培養完了時に、細胞懸濁液の一部を分取し、血球計算盤を用いて細胞数を測定した。
（５）標本作製方法およびＤＮＡ損傷誘発性の評価方法
（４）で処理完了後のコメット標本作製用サンプルは全て遠心管に回収して遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）し、上清を２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ ＤＭＳＯを含むHanks’ Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ）（当該溶液を以下ホモジナイズ液と記述する）で置換した。再度遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）し、上清をホモジナイズ液で置換した。細胞懸濁液を９倍容（v/v）の低融点アガロース溶液（０．５％ NuSieve GTG Agaroseを含むＰＢＳ）と混合し、ＭＡＳコートスライドに添加して広げ、固化した。
スライドは細胞溶解液（２．５Ｍ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％ ＤＭＳＯ、１％ トリトン−Ｘ１００水溶液（ｐＨ１０））に４℃、一晩浸漬して細胞膜および核膜を溶解させた。溶解後のスライドを泳動液（０．３Ｍ 水酸化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ＞１３））中で２０分間静置した後、定電圧２６Ｖ（０．７Ｖ／ｃｍ）、３００ｍＡ、４℃にて２０分間の電気泳動を施した。泳動後のスライドを０．４Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液（ｐＨ７．５）中に浸漬して中和した後、エタノール中で十分に脱水し、風乾して標本を作製した。標本は１条件１連あたり３枚作製した。
作製した標本はSYBR(登録商標) Goldを用いて核酸染色を施し、蛍光顕微鏡下２００倍の倍率で観察した。標本１枚あたり７５個、１条件あたり標本２枚１５０個の細胞核を撮像し、画像解析装置Comet Assay IVを用いて%tail DNAを算出し、ＤＮＡ損傷性を判定した。
%tail DNAは、細胞核全体の蛍光輝度に占める尾部（tail）の蛍光輝度の百分率として算出した。標本１枚ごとに総観察細胞核（７５個）の%tail DNAの中央値を取り、１条件１連あたり２枚の標本から得た%tail DNAの中央値の平均値（mean of median of %tail DNA）を当該条件における%tail DNAの測定値とし、被験物質によるＤＮＡ損傷性の指標とした。また、被験物質による細胞毒性によるアポトーシスの兆候として認められる釣り鐘様の細胞核（hedgehog）は%tail DNAの算出対象から除外した。
被験物質処理群における%tail DNAと対応する陰性対照群における%tail DNAとの間でDunnett’s testを行い、有意確率両側５％あるいは１％にて有意な増加の有無を検定した。
被験物質による細胞増殖抑制作用、すなわち細胞毒性の指標として、（４）で測定した培養完了時の細胞数に基づき、以下の式に従ってＲＣＣ（Relative cell count）を算出した。
それぞれの被験物質について、ＲＣＣが３０％以上となる全ての処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められない場合を陰性、ＲＣＣが３０％以上となる処理用量において%tail DNAに５％有意な増加が認められた場合を陽性と判定した。ＲＣＣが３０％未満となる処理用量については、細胞毒性により生物学的意義の乏しい%tail DNAの増加を認める可能性が高いため、DNA損傷性の判定から除外した。
（６）結果
ＥＭＳおよびＭＡＮについて、本実施例で得た判定結果および公知の情報（Kirkland, D. et al. Mutation Research 2016, 795, 7-30; Lasne, C. et al. Mutation Research 1984, 130(4), 273-282）から期待される判定結果を表１０に示した。また、被験物質ごとの用量反応関係を図１３および図１４に示した。
表１０、図１３および図１４に示した通り、ＤＮＡ損傷誘発化合物であるＥＭＳ、ＤＮＡ損傷非誘発化合物であるＭＡＮのいずれについても、公知の情報から期待される反応性を正しく検出できた。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitroコメット試験は被験物質のＤＮＡ損傷誘発性の評価に実用できることが立証された。
比較例１ 各種増殖刺激因子によるヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球の増殖性
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球として、実施例１（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「２」由来の再分化Ｔリンパ球を用いた。再分化Ｔリンパ球に各種増殖刺激因子による増殖刺激を施し、ＡＴＰ量を測定することでその増殖性を評価した。
（２）増殖性の評価方法
再分化Ｔリンパ球を１．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で９６ウェルプレート（nunc）上に１ウェルあたり１００μＬ播種し、以下の７種類の培地で培養した。すなわち、（ａ）増殖刺激因子未添加のＲｈ培地（刺激無し）、（ｂ）５μｇ／ｍＬ ＰＨＡ（Sigma-Aldrich）を添加したＲｈ培地、（ｃ）１μｇ／ｍＬ ＰＨＡを添加したＲｈ培地、（ｄ）１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２を添加したＲｈ培地、（ｅ）２５ｎｇ／ｍＬ phorbol 12-myristate 13-acetate（ＰＭＡ）（Wako）及び１μｇ／ｍＬ Ionomycin（Wako）を添加したＲｈ培地、（ｆ）５０ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡを添加したＲｈ培地、（ｇ）５μｇ／ｍＬ Con A（Sigma-Aldrich）を添加したＲｈ培地、以上７種類の培地中で再分化Ｔリンパ球を培養し、６６時間の増殖刺激を施した。刺激期間の完了後、各ウェルを十分にピペッティングして１ウェルあたり５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレート（nunc）に分取し、CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay Kit（Promega）を用いてＡＴＰ量を測定して生細胞数の指標とした。ＡＴＰ量の測定はKitの使用説明書に従って実施した。すなわち、CellTiter-Glo(登録商標) Bufferに溶解させたCellTiter-Glo(登録商標) Substrateを１ウェルあたり５０μＬ添加し、シェーカーを用いて遮光下室温で１５分間撹拌した。撹拌後、プレートリーダーEnVision（PerkinElmer）を用いて各ウェルの発光シグナルを測定した。再分化Ｔリンパ球の播種時に別途５０μＬの細胞懸濁液を白色９６ウェルプレートに分取し、CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assayを用いて同様にＡＴＰ量を測定した。
（３）結果
結果を表１１に示した。表１１には、各ウェルの発光シグナルとして、各ウェルについて測定した発光シグナルのカウント値から、同時にＲｈ培地について測定したバックグラウンド発光シグナルのカウント値を引いた値を記載した。また、増殖率として各発光シグナルの播種時の発光シグナルに対する百分率を記載した。
表１１から、本比較例で用いたいずれの増殖刺激条件によっても、再分化Ｔリンパ球は増殖せず、むしろ播種時よりも細胞数が減少することが示された。
比較例２ ＰＨＡ刺激によるヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球の分裂動態
（１）ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球
ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球として、実施例１（１）に記載のヒトｉＰＳ細胞株「２」由来の再分化Ｔリンパ球を用いた。再分化Ｔリンパ球にフィーダー細胞との共培養下、あるいはフィーダー細胞の非存在下でＰＨＡによる増殖刺激を施し、細胞質分裂阻害剤CytoBを添加して標本を作製し、１細胞あたりの核の数の分布を測定することで、その分裂動態を評価した。
（２）増殖刺激条件
＜フィーダー細胞との共培養下でのＰＨＡ刺激条件＞
フィーダー細胞として、３５ＧｙのＸ線照射により細胞分裂を停止させたヒト末梢血由来単核球細胞ＰＢＭＣ（peripheral blood mononuclear cells）を用いた。フィーダー細胞４．０×１０５細胞および再分化Ｔリンパ球５．０×１０４細胞を混合して５μｇ／ｍＬ ＰＨＡを添加したＲｈ培地１００μＬ中に懸濁した後、全量を９６ウェルプレート（Techno Plastic Products AG）上に播種した（細胞密度：フィーダー細胞４．０×１０６細胞／ｍＬ、再分化Ｔリンパ球５．０×１０５細胞／ｍＬ）。約４４時間の培養の後、６０μｇ／ｍＬ CytoBおよび５μｇ／ｍＬ ＰＨＡを添加したＲｈ培地１１．１μＬをウェルに添加した（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）。更に約２４時間の培養の後、（３）に記載の手順に従って標本を作製した。また、比較対照として、再分化Ｔリンパ球を混合していないフィーダー細胞４．０×１０５細胞（細胞密度：４．０×１０６細胞／ｍＬ）に同様にＰＨＡ刺激を施してCytoBを添加し、標本を作製した。
＜フィーダー細胞の非存在下でのＰＨＡ刺激条件＞
再分化Ｔリンパ球７．９×１０４細胞を３μｇ／ｍＬ ＰＨＡを添加したＲｈ培地１００μＬ中に懸濁した後、全量を９６ウェルプレート（Techno Plastic Products AG）上に播種した（細胞密度：７．９×１０５細胞／ｍＬ）。約４７時間の培養の後、６０μｇ／ｍＬ CytoBを添加したＲｈ培地１１．１μＬをウェルに添加した（CytoBの最終濃度：６μｇ／ｍＬ）。更に約２４時間の培養の後、（３）に記載の手順に従って標本を作製した。
（３）標本作製方法および分裂動態の評価方法
（２）で培養完了後のプレートを、実施例２（５）に記載の方法に従って固定し、スライドグラス上に標本を作製した。作製した標本は４０μｇ／ｍＬアクリジンオレンジ溶液で染色し、蛍光顕微鏡下で広帯域Ｂｌｕｅ励起のフィルターを用いて観察した。１標本あたり５００個の細胞を観察して単核細胞数、２核細胞数および多核細胞数を測定した。ただし、フィーダー細胞の非存在下でのＰＨＡ刺激を施した標本については細胞数が極端に少なく、５００個の観察細胞を確保できなかったため、スライドグラス上の全細胞４２６個を観察した。
分裂動態の指標として、実施例１（３）と同様にＣＢＰＩを算出した。
（４）結果
結果を表１２に示した。
フィーダー細胞におけるＣＢＰＩが１．０３であったことから、Ｘ線照射によりフィーダー細胞の細胞分裂が停止していることが確認できた。一方で、フィーダー細胞との共培養下でＰＨＡ刺激を施した再分化Ｔリンパ球のＣＢＰＩが１．１５であったことから、再分化Ｔリンパ球の細胞分裂が誘導されたことが示唆されるものの、混合したフィーダー細胞が多量に存在することにより、十分な頻度で分裂したヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球細胞を観察することができないことが示された。加えて、フィーダー細胞の非存在下でＰＨＡ刺激を施した再分化Ｔリンパ球のＣＢＰＩが１．３９であったことから、該ＰＨＡ刺激では細胞分裂が十分に誘導されないことが示された。
すなわち、ＰＨＡによる増殖刺激では、フィーダー細胞との共培養の有無によらず、十分な頻度で分裂したヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球細胞を観察することができず、染色体異常の検出、試験として実用できないことが示された。
以上の実施例より、比較例１から、ＰＨＡ、ＩＬ−２、phorbol 12-myristate 13-acetate（ＰＭＡ）およびIonomycin、Concanavalin A（Con A）のいずれの増殖刺激因子による６６時間の増殖刺激によっても、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球は増殖せず、むしろ生細胞数は刺激後に著しく低下することが示された。加えて、細胞質分裂阻害剤CytoBを用いて短期的な細胞分裂動態を確認した比較例２の結果から、ＰＨＡによる増殖刺激では、フィーダー細胞との共培養の有無によらず、十分な頻度で分裂したヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球細胞を観察することができず、染色体異常の検出、試験として実用できないことが示された。
一方で、実施例１から、抗CD3抗体による増殖刺激では、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球細胞が良好な分裂動態を示し、十分な頻度で分裂したヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球細胞を観察できることが示された。更に、実施例２から、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro小核試験により既知の小核誘発化合物および小核非誘発化合物についてその反応性を適切に評価できることが示された。加えて、実施例５から、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitro染色体異常試験により既知の染色体異常誘発化合物および染色体異常非誘発化合物についてその反応性を適切に評価できることが示された。更には、実施例６から、ヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球を用いたin vitroコメット試験により既知のＤＮＡ損傷誘発化合物およびＤＮＡ損傷非誘発化合物についてその反応性を適切に評価できることが示された。
すなわち、HuLyによる従来法で用いられるPHAを用いた増殖刺激ではヒトｉＰＳ細胞由来Ｔリンパ球が十分に分裂せず検出、試験を実施できないが、抗CD3抗体を増殖刺激因子として用いた場合にはＴリンパ球が良好に分裂し、検出、試験が実施可能となることを見出すと共に、ヒト多能性幹細胞由来Ｔリンパ球を用いた染色体の異常の検出、試験を確立した。
本出願は、２０１６年１２月２７日付で日本国に出願された特願２０１６−２５２６７３を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
以上の通り、ヒト多能性幹細胞由来のＴリンパ球を用いることで、安定的かつ均質に大量供給可能なヒト正常細胞種を用いて染色体異常を検出することができる。これにより、従来の細胞種が持つ課題を解決する次世代の標準試験系として化学物質等の染色体異常誘発性評価の精緻化・効率化が実現できる。更に、従来の技術では困難であった、細胞応答におけるヒト個人差の高精度解析など、におけるヒト安全性評価の高品質化が実現できる。

Claims (14)

  1. 下記（１）〜（２）の工程を含むことを特徴とする染色体の異常の検出方法。
    （１）ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程
    （２）（１）の工程で培養されたTリンパ球における染色体の異常を検出する工程
  2. ヒト多能性幹細胞がヒトES細胞である、請求項１記載の検出方法。
  3. ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、請求項１記載の検出方法。
  4. 染色体の異常を検出する工程が、小核頻度の測定により染色体の異常を検出する工程である、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
  5. 染色体の異常を検出する工程が、染色体の形態観察により染色体の異常を検出する工程である、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
  6. 染色体の異常を検出する工程が、ＤＮＡ損傷の評価により染色体の異常を検出する工程である、請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項記載の検出方法に用いるための、抗CD3抗体およびヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球を含む検出キット。
  8. 下記（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする、被験物質による染色体の異常の誘発性を評価する方法。
    （１）ヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球に抗CD3抗体を添加し、培養する工程
    （２）（１）の工程で培養されたTリンパ球に被験物質を添加する工程
    （３）被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、測定する工程
    （４）染色体の異常の発生頻度を基準値と比較して、染色体の異常の誘発性を評価する工程
  9. ヒト多能性幹細胞がヒトES細胞である、請求項８記載の方法。
  10. ヒト多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、請求項８記載の方法。
  11. （３）の工程が、被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、小核頻度の測定により測定する工程である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
  12. （３）の工程が、被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、染色体の形態観察により測定する工程である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
  13. （３）の工程が、被験物質添加後のTリンパ球における染色体の異常の発生頻度を、ＤＮＡ損傷の評価により測定する工程である、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
  14. 請求項８〜１３のいずれか１項記載の評価方法に用いるための、抗CD3抗体およびヒト多能性幹細胞由来のTリンパ球を含む試験キット。
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