WO2015064715A1 - ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去方法および該方法に用いられる合成ペプチド - Google Patents

ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去方法および該方法に用いられる合成ペプチド Download PDF

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徹彦 吉田
菜穂子 ベイリー小林
善紀 吉田
和久 蝶名林
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東亞合成株式会社
国立大学法人京都大学
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Definitions

  • the present invention relates to genome stability of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (hereinafter also referred to as “ES cells”) and induced pluripotent stem cells (hereinafter also referred to as “iPS cells”). And a synthetic peptide used in the method.
  • the present invention also relates to a method for removing genome unstable pluripotent stem cells from a culture containing pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells typically iPS cells, ES cells
  • regenerative medicine typically transplantation medicine
  • the establishment of a technique for producing the stem cells with high efficiency can be mentioned.
  • pluripotent stem cells such as genomically unstable iPS cells are unsuitable for transplantation into a living body
  • the target pluripotent stem cells There is a need to remove genomically unstable pluripotent stem cells from the population. In removing the genome-unstable pluripotent stem cells, naturally, it is necessary to evaluate the genome stability of the pluripotent stem cells.
  • the present invention was created to solve the conventional problems related to the use of such pluripotent stem cells, and provides a method capable of evaluating the genomic stability of pluripotent stem cells with high efficiency and high reliability. . Further, the present invention provides a method for removing pluripotent stem cells, which have been determined to be genomic instability by the above evaluation method, from the culture of the subject pluripotent stem cells. It is another object of the present invention to provide a peptide having a relatively short chain length that can be artificially synthesized and can be used to enhance the effects of the evaluation method and the removal method. Another object is to provide a composition containing such a peptide.
  • the present inventor has confirmed the localization in normal cells (typically in the endoplasmic reticulum), while immunogenic cell death is observed in cells infected with cancer cells or pathogens. Focuses on calreticulin protein (Calreticulin, also called “calreticulin”) known as an immunostimulatory protein (so-called eat-me signal) that is induced to express on the surface of the cell (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • calreticulin protein also called “calreticulin”
  • eat-me signal immunostimulatory protein
  • a culture of pluripotent stem cells such as iPS cells derived from humans or other mammals as a target is prepared, and pluripotent stem cells in the culture are prepared.
  • the expression level of calreticulin (the amount of calreticulin expressed on the cell surface (typically the surface of the cell membrane) of the target pluripotent stem cell) is examined, and the expression level of the calreticulin
  • a method for evaluating the genomic stability of the pluripotent stem cell (genome stability evaluation method) is provided.
  • the method for assessing genome stability of pluripotent stem cells disclosed herein comprises determining in the above discrimination that pluripotent stem cells having a calreticulin expression level exceeding a predetermined level are genomic instability.
  • the karyotype of pluripotent stem cells in a pluripotent stem cell culture typically in an iPS cell culture or ES cell culture.
  • the genome stability or genome instability of the stem cells can be determined by a simple operation of examining the expression level of ticulin. Therefore, it is possible to evaluate the genome stability of pluripotent stem cells such as iPS cells easily and efficiently.
  • Such a genome stability evaluation method can be particularly suitably used when evaluating the genome stability of a large amount of pluripotent stem cells (for example, iPS cell clone establishment or preparation of iPS cells contributing to regenerative medicine).
  • a preferred embodiment of the genomic stability evaluation method for pluripotent stem cells disclosed herein is to determine the genomic stability or instability of pluripotent stem cells based on the expression level of the calreticulin. It is characterized by an immunological technique using an antibody that specifically reacts with phosphorus or a fragment thereof (that is, an anti-calreticulin antibody). According to an immunological technique using an anti-calreticulin antibody, the calleti in pluripotent stem cells in the pluripotent stem cell culture of the subject (typically in iPS cell culture or ES cell culture). Curin expression can be examined specifically and with high sensitivity. Therefore, it is possible to determine the genomic stability or instability of pluripotent stem cells such as iPS cells with high accuracy and high reliability.
  • the evaluation of genome stability of pluripotent stems using immunological techniques is performed in a shorter time and with a simple operation compared to conventional methods for evaluating genome stability (for example, FISH method). It is preferable because the genomic stability of pluripotent stem cells can be evaluated.
  • the present inventor has particularly developed calreticulin in genome-unstable pluripotent stem cells (typically iPS cells or ES cells) in order to enhance the effect of the above-described method for evaluating the genomic stability of pluripotent stem cells.
  • genome-unstable pluripotent stem cells typically iPS cells or ES cells
  • a substance that increases the expression level of we searched for a substance that increases the expression level of.
  • the present inventor has designed an amino acid sequence that is translated from an RNA sequence that constitutes human-derived centrin 2 (centrin 2, a centrosome-related protein) siRNA (small interfering RNA).
  • a synthetic peptide prepared to contain the amino acid sequence is supplied to a target pluripotent stem cell (typically in a culture medium of a pluripotent stem cell culture such as an iPS cell). It has been found that a potent stem cell (typically iPS cell) has the ability to increase the amount of calreticulin expression or induce the expression of calreticulin (calreticulin expression inducing activity). . Based on the above findings, the present inventor, as another aspect of the present invention, has an artificial effect of inducing calreticulin expression inducing activity against genomically unstable pluripotent stem cells (typically iPS cells or ES cells). Has been completed (hereinafter referred to as “calreticulin expression-inducing peptide”).
  • the inventor has the following amino acid sequence: CRAKAGDPC (SEQ ID NO: 1); and CEQKQEIRC (SEQ ID NO: 2); Or any one of these amino acid sequences, or a modified amino acid sequence formed by substitution, deletion and / or addition of one or several (typically 2 or 3) amino acid residues in the amino acid sequence
  • a synthetic peptide comprising a calreticulin expression-inducing peptide sequence is provided.
  • the synthetic peptide disclosed herein can be easily produced artificially by chemical synthesis (or biosynthesis).
  • the substance itself has a simple structure (linear peptide chain), it is easy to handle, for example, in pluripotent stem cells such as iPS cells (typically in the medium of the stem cell culture).
  • pluripotent stem cells such as iPS cells (typically in the medium of the stem cell culture).
  • genome stability of pluripotent stem cells based on the degree of expression of calreticulin or Providing at least one calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein at least once in the subject pluripotent stem cell culture prior to determining instability, the synthetic peptide
  • an evaluation method characterized in that the discrimination is performed after culturing the pluripotent stem cell culture supplied with at least once for a predetermined time.
  • genome-unstable pluripotent stem cells typically iPS cells or ES cells
  • genome-unstable pluripotency It is possible to clarify the difference in calreticulin expression level between stem cells and genome-stable pluripotent stem cells. This makes it easier to determine the genomic stability or instability of pluripotent stem cells such as iPS cells based on the degree of calreticulin expression. Accuracy and reliability can be improved.
  • the modified amino acid sequence lacks the N-terminal and C-terminal cysteine residues (C) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • C N-terminal and C-terminal cysteine residues
  • the calreticulin expression-inducing peptide sequence comprising the modified amino acid sequence can also exhibit good calreticulin expression-inducing activity similar to the calreticulin expression-inducing peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. .
  • the calreticulin expression-inducing peptide of a preferred embodiment disclosed herein has a membrane-permeable peptide sequence on the N-terminal side or C-terminal side of the calreticulin expression-inducing peptide sequence.
  • the calreticulin expression-inducing peptide having such a membrane-penetrating peptide is capable of efficiently converting the calreticulin expression-inducing peptide sequence into pluripotent stem cells such as iPS cells (inside cell membrane and / or nuclear membrane). Therefore, it can be used suitably for implementation of this invention.
  • calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein has the following amino acid sequence as the membrane-permeable peptide sequence: KKRTLRKNDRKKR (SEQ ID NO: 5); Have The amino acid sequence disclosed herein as SEQ ID NO: 5 is a typical example of an amino acid sequence constituting a membrane permeable peptide, and particularly calreticulin in genome-unstable pluripotent stem cells (typically iPS cells). Expression can be induced with high efficiency.
  • the calreticulin expression-inducing peptide of a preferred embodiment disclosed herein has 30 or less total amino acid residues constituting the synthetic peptide.
  • Such a peptide having a short peptide chain is easy to chemically synthesize, is inexpensive and excellent in handleability, and therefore can be particularly suitably used in the practice of the present invention.
  • the calreticulin expression-inducing peptide has the following amino acid sequence: KKRTLRKNDRKRKRGCRAKAGDPC (SEQ ID NO: 10); KKRTLRKNDRKRKRGCEQKQEIRC (SEQ ID NO: 11); KKRTLRKNDRKKRGRAKAGDP (SEQ ID NO: 12); and KKRTLRKNDRKRKRGGEQKQEIR (SEQ ID NO: 13); One of the following.
  • Such a synthetic peptide exhibits calreticulin expression-inducing activity particularly on human-derived genomically unstable iPS cells.
  • the above-mentioned synthetic peptide for which human-derived iPS cells are suitable for application has extremely high utility value in the medical industry.
  • a method for removing genomically unstable pluripotent stem cells from a culture containing pluripotent stem cells derived from a target human or other mammal Determining the presence or absence or degree of genomic stability of pluripotent stem cells in the pluripotent stem cell culture of interest by any of the methods for assessing genome stability of pluripotent stem cells disclosed in, and the discrimination Removing a pluripotent stem cell that has been determined to be genomically unstable by the method from the pluripotent stem cell culture.
  • Genomic stability was determined by removing pluripotent stem cells that were determined to be genomically unstable from the target pluripotent stem cell culture (typically iPS cell culture or ES cell culture).
  • a pluripotent stem cell culture (for example, iPS cell culture) comprising pluripotent stem cells as a main body (preferably consisting of pluripotent stem cells determined to be genome stable) can be prepared. Therefore, the above-described method for removing genome-unstable pluripotent stem cells can be suitably used for preparing a pluripotent stem cell culture such as iPS cells that can be used for regenerative medicine. In addition, by determining the genomic stability or instability of the target pluripotent stem cell by the above-described method for evaluating the genomic stability of the pluripotent stem cell, the genome labile pluripotent stem cell (preferably iPS cells) can be removed.
  • iPS cell culture for example, iPS cell culture
  • the above-described method for removing genome-unstable pluripotent stem cells can be suitably used for preparing a pluripotent stem cell culture such as iPS cells that can be used for regenerative medicine.
  • the genome labile pluripotent stem cell
  • the pluripotent stem cells that have been identified as having the above-mentioned genome instability are removed using a cell sorter. It is characterized by doing.
  • a cell sorter pluripotent stem cells that have been identified as genomically unstable are efficiently removed from cultures containing pluripotent stem cells (typically iPS cells or ES cells). can do. Therefore, the method for removing genome unstable pluripotent stem cells using a cell sorter is particularly suitable for removing cells from a culture containing a large amount of pluripotent stem cells (typically iPS cells).
  • the pluripotent stem cells removed by the method for removing genome unstable pluripotent stem cells are pluripotent stem cells having chromosomal abnormalities.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells having chromosomal abnormalities (or cells, cell clusters, tissues, etc. obtained by inducing differentiation of the stem cells) may be a cause of tumor after transplanted in vivo
  • the above-mentioned method for removing pluripotent stem cells having chromosomal abnormalities can be suitably used as a method for preparing pluripotent stem cells (typically iPS cells) to contribute to regenerative medicine.
  • the removal method, wherein the removed cells are human-derived iPS cells having chromosomal abnormalities, is a preferred embodiment of the present invention.
  • a method for producing a culture containing pluripotent stem cells derived from a human or other mammal which is disclosed herein in the culture process of the pluripotent stem cells.
  • Any method of removing genomically unstable pluripotent stem cells provides a method comprising removing genomically unstable pluripotent stem cells from the pluripotent stem cell culture.
  • a pluripotent stem cell culture (typically iPS cell culture or ES cell culture) produced by such a production method is a pluripotent stem cell from which genome-unstable pluripotent stem cells have been removed by the above removal method.
  • pluripotent stem cell cultures that are genome-stable pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cell culture (typically pluripotent stem cells in the pluripotent stem cell culture) can be suitably used as a pluripotent stem cell for regenerative medicine with a low risk of tumorigenicity.
  • the above-mentioned method for producing a culture containing human-derived iPS cells is a preferred embodiment because of its extremely high utility value in the medical industry.
  • a calreticulin expression inducer for use in the present invention is provided.
  • the calreticulin expression inducer is at least one pharmaceutically acceptable carrier (for example, at least one base material that contributes to improving the stability of the peptide, or physiological saline or various kinds).
  • a liquid medium such as a buffer solution.
  • the calreticulin expression inducer contains a synthetic peptide having a simple structure (linear peptide chain) as an active ingredient, for example, pluripotent stem cells such as iPS cells (typically the stem cell culture)
  • pluripotent stem cells such as iPS cells (typically the stem cell culture)
  • the amount of expression of calreticulin in genomically unstable pluripotent stem cells can be increased by performing a simple treatment of supplying the calreticulin expression inducer to the medium.
  • a simple treatment of supplying the calreticulin expression inducer to the medium.
  • calreticulin expression inducer can be easily prepared.
  • the calreticulin expression inducer can be suitably used to increase the expression level of calreticulin in iPS cells derived from humans that are particularly unstable in the genome.
  • FIG. 1 is a fluorescence micrograph (image) of the expression state of calreticulin in genome-stable human iPS cells, a nuclear staining image by DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole), It is the image which overlap
  • FIG. 2 is a fluorescence micrograph showing the expression state of calreticulin in a human iPS cell culture containing genomically unstable cells (specifically, chromosome 12 is triploid (trisomy)).
  • FIG. 3 shows a calreticulin expression-inducing peptide according to one embodiment in a culture of human iPS cells containing cells that are genomically unstable (specifically, chromosome 12 is a triploid (trisomy)).
  • Example 1 is a fluorescence micrograph (image) in which the expression state of calreticulin in the iPS cells was examined after adding (cultured) so that the concentration in the medium was 10 ⁇ M, and a nuclear staining image by DAPI And an image obtained by superimposing (merging) with a fluorescence image showing a result of examination by an immunofluorescent antibody method using an anti-calreticulin antibody.
  • FIG. 4 shows a case in which a calreticulin expression-inducing peptide (sample 1) according to one embodiment is added to a genome-stable human iPS cell and cultured so as to have a concentration of 10 ⁇ M in the medium.
  • FIG. 5 is the same image as FIG. 2, and induces calreticulin expression in a culture of human iPS cells containing genomically unstable cells (specifically, chromosome 12 is a triploid (trisomy)).
  • FIG. 6 is the same image as FIG.
  • FIG. 7 shows anti-labeling with a fluorescent dye (Phycoerythrin) for a culture of human iPS cells containing cells that are genomically unstable (specifically, chromosome 12 is a triploid (trisomy)).
  • amino acids are represented by one-letter code (in the sequence table, three-letter code) based on the nomenclature related to amino acids shown in the IUPAC-IUB guidelines.
  • sequence table three-letter code
  • the term “synthetic peptide” does not mean that the peptide chain is present independently and stably in nature, but by artificial chemical synthesis or biosynthesis (ie, production based on genetic engineering). A peptide fragment that is manufactured and can exist stably in a predetermined composition (for example, a calreticulin expression inducer).
  • the “peptide” is a term indicating an amino acid polymer having a plurality of peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain, but typically the total number of amino acid residues. Is approximately 100 or less (preferably 60 or less, for example 50 or less) having a relatively low molecular weight.
  • amino acid residue is a term encompassing the N-terminal amino acid and the C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • the left side is always the N-terminal side and the right side is the C-terminal side.
  • modified amino acid sequence with respect to a predetermined amino acid sequence impairs the function of the predetermined amino acid sequence (for example, the calreticulin expression inducing activity of the calreticulin expression inducing peptide). Rather, it refers to an amino acid sequence formed by substitution, deletion and / or addition (insertion) of one or several (for example, two or three) amino acid residues.
  • sequences resulting from conservative ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ amino ⁇ acid replacement where one or several (typically two or three) amino acid residues are conservatively substituted Sequence substituted with a basic amino acid residue: for example, mutual substitution of a lysine residue and an arginine residue), or one or several (typically 2 or 3) amino acids for a given amino acid sequence
  • a sequence in which a residue is added (inserted) or deleted is a typical example included in the modified amino acid sequence referred to in the present specification. Therefore, the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein includes one or several amino acid sequences in each amino acid sequence in addition to a synthetic peptide composed of the same amino acid sequence as that in each SEQ ID NO.
  • An amino acid sequence in which typically (2 or 3) amino acid residues are substituted for example, the above-mentioned conservative substitutions), deleted and / or added, and similarly exhibiting calreticulin expression-inducing activity.
  • pluripotent stem cell refers to the ability to differentiate into various cell types that form one organism excluding extraembryonic tissues such as placenta (pluripotent stem cell) A stem cell having self-replication ability in an undifferentiated state. Examples include ES cells, iPS cells, and EG cells (embryonic germ cells). In particular, “induced pluripotent stem cells (iPS cells)” are pluripotent by artificially initializing (reprogramming) differentiated cells (typically somatic cells such as skin fibroblasts). And cells that have acquired self-renewal ability.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • a method for reprogramming differentiated cells for example, several kinds of reprogramming factors (for example, four genes of Oct3 / 4, klf4, c-Myc and Sox2, or four genes of Oct3 / 4, Sox2, Nanog and Lin28) Etc.) is introduced into the cells.
  • the iPS cell is a molecular biological manipulation (for example, introduction of a marker gene for introducing calreticulin expression, introduction of a reporter gene, fluorescent protein fusion protein as long as the properties of the pluripotent stem cell are maintained.
  • An expression vector may be introduced).
  • the origin of iPS cells is not particularly limited, but human-derived iPS cells are particularly preferable as targets for carrying out the present invention because of their high utility value in the medical industry.
  • gene stability and “genome instability” are terms that are interpreted broadly, and typically, the presence or absence of structural and / or functional abnormalities in the genome listed below. It is a term that can be used to distinguish between stable and unstable using degree as an index.
  • DNA base sequence for example, base substitution, point mutation, gene duplication, mixing of DNA regions between genes, horizontal propagation of genes, etc.
  • chromosomal abnormalities for example, partial duplication, Chromosome partial abnormalities such as inversions, deletions, translocations and truncations, chromosomal numerical abnormalities such as aneuploidy, or polynuclearization
  • epigenetic abnormalities changes in DNA methylation, changes in histone modifications
  • the chromosomal abnormality may include a so-called “karyotypic abnormality”.
  • genome stability or instability may be classified (evaluated) based on the presence or absence of aneuploid, preferably duplication abnormality, more preferably chromosome 12 duplication.
  • the method for evaluating the genomic stability of pluripotent stem cells can be used for various iPS cells and the like.
  • a culture containing pluripotent stem cells, and pluripotent stem cells in the culture for example, all or part of a pluripotent stem cell population contained in the culture, or individual pluripotent stem cells)
  • the abundance of calreticulin on the cell membrane of the subject's pluripotent stem cells and based on the degree of expression of the calreticulin, It is an evaluation method characterized by distinguishing genomic stability or genomic instability of a pluripotent stem cell.
  • pluripotent stem cells such as genomically unstable iPS cells have a markedly increased calreticulin expression level compared to genome-stable pluripotent stem cells
  • the calrety of pluripotent stem cells in the culture By examining the expression level of curin, the genome stability or instability of the stem cell can be determined.
  • the pluripotent stem cell (typically iPS cell or ES cell) in which the expression level of calreticulin exceeds a predetermined level in the above discrimination is regarded as genomic unstable. Determine.
  • calreticulin expression in iPS cells that have been confirmed to be genome-stable in advance (for example, 201B7 clone strain that is generally available as an iPS cell having a normal karyotype as a reference example for comparison)
  • Carrety in iPS cell cultures eg, 201B2 clone strain that is generally available as iPS cells in which normal chromosome 12 is triploid
  • the level of calreticulin expression level that can discriminate the genomic stability or instability of the iPS cell to be evaluated can be set.
  • the level of calreticulin expression level that can determine the genomic stability or instability of pluripotent stem cells varies depending on the sensitivity and accuracy of the measurement method of calreticulin expression level. Can be set. For example, preferably 1.2 times or more (for example, 1.5 times or more, compared to calreticulin expression level in a pluripotent stem cell (for example, iPS cell) which is a comparative target that has been confirmed to be genome-stable beforehand. More preferably, pluripotent stem cells expressing calreticulin that is 2 times or more, more preferably 5 times or more, for example 10 times or more) can be determined to be genomically unstable. In addition, it is preferable to set the level of the calreticulin expression level which can discriminate
  • the method (measuring method) for examining the calreticulin expression level in pluripotent stem cells such as iPS cells disclosed herein can be a method that can qualitatively or quantitatively grasp the level of calreticulin expression level. If it does not specifically limit.
  • Western blotting immunoantibody method (typically immunohistochemistry method, Immunohistochemistry, IHC, also referred to as “immunostaining method”), or methods that can directly grasp the degree of calreticulin expression level The method etc. which applied is mentioned.
  • a method for indirectly grasping the expression level of calreticulin from the expression state of the calreticulin gene for example, Northern blotting, RT-PCR method, real-time PCR method, in situ hybridization, or those The method etc. which applied is mentioned.
  • a label typically a transcription product or translation product of a transgene
  • a target pluripotent stem cell such as an iPS cell using a molecular biological technique
  • markers marker
  • Examples of a method that can grasp the level of ticulin expression level include reporter assay, measurement of fluorescent protein-fused calreticulin, and the like.
  • the measuring method of the calreticulin expression level is merely an example, and is not limited thereto. As a method for measuring the calreticulin expression level, one method may be used alone, or two or more methods may be used in combination.
  • Discrimination of genome stability or instability of the pluripotent stem cells is performed by immunology using an antibody (that is, an anti-calreticulin antibody) that specifically reacts with calreticulin or a fragment thereof. It can be suitably carried out by a technique (for example, Western blotting or immuno-antibody method).
  • An immunological technique using an anti-calreticulin antibody is preferable because the degree of calreticulin expression can be directly grasped with high specificity and high sensitivity.
  • the immunoantibody method typically immunostaining method
  • the level of expression can be examined, this is a particularly suitable measurement method when it is desired to grasp the level of calreticulin expression in individual pluripotent stem cells.
  • the immunoantibody method typically immunostaining method
  • only calreticulin existing on the cell surface (typically the surface of cell membrane) of pluripotent stem cells such as iPS cells (ie, intracellular) Without being affected by the expression level of calreticulin that is constantly expressed), so it is possible to determine the genomic stability or instability of pluripotent stem cells with high accuracy. Can be realized.
  • the immunological technique typically means an antibody-antibody reaction with an antibody that specifically reacts with an antigen (or a fragment thereof) to form an immune complex and detect (visualize) the antibody.
  • This is a method to grasp the antigen amount.
  • a method using an anti-calreticulin antibody labeled in advance (direct method) or a method using a labeled secondary antibody that specifically recognizes an anti-calreticulin antibody (indirect method) can be suitably used.
  • the indirect method is particularly preferable because it can grasp the degree of calreticulin expression level with higher sensitivity than the direct method.
  • Examples of the method for detecting (visualizing) the anti-calreticulin antibody include an immunofluorescent antibody method, an enzyme antibody method, autoradiography, and a gold colloid method.
  • the immunofluorescent antibody method the anti-calreticulin antibody or the secondary antibody is labeled with a fluorescent dye in advance, and the fluorescent dye is fluorescently colored by applying excitation light of the fluorescent dye after the antigen-antibody reaction, This is a method of detecting the fluorescent color development using a fluorescence microscope or the like.
  • the immunofluorescent antibody method is a particularly preferable method because the degree of calreticulin expression level can be grasped with high accuracy.
  • antibody includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and includes differences in immunity animals (antibody producing animals, Host, Source) and immunoglobulin constant regions (also referred to as isotypes and classes). It is not limited.
  • an anti-calreticulin antibody is reacted with an antigen antibody for iPS cells in an iPS cell culture, and then a fluorescently labeled secondary antibody against the anti-calreticulin antibody is reacted. Thereafter, the amount of calreticulin expression in iPS cells (typically the amount of calreticulin expression present on the cell surface of iPS cells) is determined by detecting the fluorescence emission of the fluorescent label with a fluorescence microscope or the like. be able to.
  • a method capable of examining the degree of calreticulin expression in the stem cells while the subject pluripotent stem cells (for example, iPS cells) remain alive (ie, without manipulation of cell fixation) It is suitable for carrying out a method for producing a culture containing pluripotent stem cells described later.
  • the expression of calreticulin in living pluripotent stem cells can be examined by applying an immunoantibody method or measurement of fluorescent protein-fused calreticulin.
  • the method of preparing a culture of pluripotent stem cells is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted. it can.
  • the same conditions as the ES cell culture conditions can be suitably employed.
  • the presence or absence of feeder cells is not particularly limited, but a calretic in pluripotent stem cells in pluripotent stem cell culture (for example, in iPS cell culture). From the viewpoint of examining the expression level of phosphorus, it is preferable to prepare a culture that does not require feeder cells.
  • the bottom surface of the culture vessel for culturing pluripotent stem cells is an adhesion substrate (for example, Matrigel, It is preferably treated (coated) with an extracellular matrix of decidua-derived cells, gelatin, cell adhesion protein, or the like.
  • an adhesion substrate for example, Matrigel, It is preferably treated (coated) with an extracellular matrix of decidua-derived cells, gelatin, cell adhesion protein, or the like.
  • a commercially available iPS cell culture medium is poured into a culture dish having a matrigel-coated bottom, and the iPS cells are seeded in the culture dish and then cultured for a predetermined time. A culture can be prepared.
  • the method for assessing genome stability of a pluripotent stem cell disclosed herein is prior to determining the genomic stability or instability of a target pluripotent stem cell (typically an iPS cell or ES cell).
  • a target pluripotent stem cell typically an iPS cell or ES cell.
  • the calreticulin expression-inducing peptide is supplied at least once to the stem cells (typically in the medium of the stem cell culture), and the stem cell culture supplied with the synthetic peptide at least once is cultured for a predetermined time. It is possible to carry out the present invention more suitably by performing the above-mentioned determination.
  • the expression level of calreticulin in the genomically unstable pluripotent stem cell is particularly increased. Can be made. This makes the difference in the expression level of calreticulin between genome-unstable pluripotent stem cells and genome-stable pluripotent stem cells clearer than when no calreticulin expression-inducing peptide is added. be able to. Therefore, discrimination of genome stability or instability of pluripotent stem cells based on the degree of expression of calreticulin can be realized with high accuracy and high reliability.
  • the calreticulin expression-inducing peptide can remarkably increase the calreticulin expression level of genomically unstable human-derived iPS cells. Therefore, the iPS cell genome stability evaluation method disclosed herein can be preferably carried out particularly for human-derived iPS cells.
  • the time for culturing the culture is calreticulin in genomically unstable pluripotent stem cells.
  • the culture is performed for several hours to several days.
  • the culture may be performed for 2 hours or more, preferably 24 hours or more, more preferably 48 hours or more.
  • the culture may be performed for 3 to 5 days, or 6 to 7 days, or 10 days from the start of the culture. .
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein has the following amino acid sequence: CRAKAGDPC (SEQ ID NO: 1); and CEQKQEIRC (SEQ ID NO: 2); Or a modified amino acid sequence formed by substitution, deletion, and / or addition of one, two, or three amino acid residues in the amino acid sequence.
  • a synthetic peptide comprising an expression-inducing peptide sequence.
  • the specific amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence obtained by translating an RNA sequence constituting human-derived centrin 2 siRNA (hereinafter also referred to as “centrin 2 siRNA-related sequence”).
  • centrin is a centrosome-related protein that exists in the centrosome of eukaryotes and is involved in centriole duplication and microtubule cleavage as one of the centrosome constituent proteins. It is one of the proteins belonging to the Centrin family (typically Centrin 1, Centrin 2, Centrin 3, etc.) (see Non-patent Document 3).
  • modified amino acid sequences of human-derived centrin 2 siRNA-related sequences the following amino acid sequences: RAKAGDP (SEQ ID NO: 3); and EQKQEIR (SEQ ID NO: 4); Is mentioned.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 is a sequence in which the N-terminal and C-terminal cysteine residues (C) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 are deleted.
  • the modified amino acid sequence of the centrin 2 siRNA-related sequence listed here also suitably functions as a calreticulin expression-inducing peptide sequence.
  • the above-mentioned modified amino acid sequence shown to sequence number 3 and sequence number 4 is an illustration to the last, and is not intending limiting the modified amino acid sequence of the centrin 2siRNA related sequence which can be used to such a sequence.
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein may be a calreticulin expression-inducing peptide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or a synthetic peptide consisting only of a modified amino acid sequence thereof. From the viewpoint of improving the calreticulin expression inducing activity, a synthetic peptide having a membrane-permeable peptide sequence on the N-terminal side or C-terminal side of the calreticulin expression-inducing peptide sequence is preferable.
  • a synthetic peptide having a membrane-permeable peptide sequence when it is supplied to a target pluripotent stem cell (for example, iPS cell), it can be rapidly introduced into the cell, thereby improving calreticulin expression inducing activity. Can do.
  • the above-mentioned membrane-permeable peptide sequence can be used without particular limitation as long as it is an amino acid sequence constituting a membrane-permeable peptide that can pass through the cell membrane and / or the nuclear membrane.
  • Many suitable membrane-permeable peptide sequences are known.
  • an amino acid sequence (including a modified amino acid sequence) related to NoLS (Nucleolar localization signal) is a calreticulin expression-inducing peptide.
  • the amino acid sequence of the membrane-permeable peptide sequence is preferred.
  • N protein nucleocapsid protein
  • IBV avian infectious bronchitis virus
  • SEQ ID NO: 6 avian infectious bronchitis virus
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of the membrane-permeable peptide sequence contained in TAT of HIV (Human Immunodeficiency Virus).
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of the membrane-permeable peptide sequence (PTD4) obtained by modifying the TAT.
  • SEQ ID NO: 9 shows the ANT-related amino acid sequence of Antennapedia, a mutant of Drosophila.
  • the above-mentioned membrane-permeable peptide sequences shown in the sequence listing are merely examples, and usable peptide sequences are not limited thereto.
  • Various membrane-permeable peptide sequences that can be used in the practice of the present invention are described in numerous publications published at the time of filing this application. The amino acid sequences of these membrane-permeable peptide sequences can be easily known by general search means.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 (including the modified amino acid sequence) described in Patent Document 1 is preferable as the membrane-permeable peptide sequence.
  • Synthesis showing high calreticulin expression-inducing activity by combining the membrane-permeable peptide sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the above-described calreticulin expression-inducing peptide sequence (SEQ ID NO: 1 or 2) or a modified amino acid sequence thereof. Peptides can be obtained.
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein has the following amino acid sequence: KKRTLRKNDRKRKRGCRAKAGDPC (SEQ ID NO: 10); KKRTLRKNDRKRKRGCEQKQEIRC (SEQ ID NO: 11); KKRTLRKNDRKKRGRAKAGDP (SEQ ID NO: 12); and KKRTLRKNDRKRKRGGEQKQEIR (SEQ ID NO: 13);
  • the amino acid sequence selected from any of the above or a modified amino acid sequence of the selected amino acid sequence is particularly preferably contained.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 is the human-derived centrin 2 siRNA-related sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence derived from NoLS of LIM kinase 2 shown in SEQ ID NO: 5. It is an amino acid sequence consisting of a total of 24 amino acid residues constructed by combining through a linker consisting of two glycine (G) residues.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 is a typical modified amino acid sequence of the human-derived centrin 2 siRNA-related sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, and the LIM kinase 2 shown in SEQ ID NO: 5 above. It is an amino acid sequence consisting of 22 amino acid residues in total, which is constructed by combining the amino acid sequences derived from NoLS with a linker consisting of two glycine (G) residues.
  • peptide chains (amino acid sequences) of the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein are appropriately combined with the above-described calreticulin expression-inducing peptide sequence and a membrane-permeable peptide sequence.
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein preferably has at least one amino acid residue amidated. By amidating the carboxyl group of an amino acid residue (typically the C-terminal amino acid residue of the peptide chain), the structural stability (eg, protease resistance) of the synthetic peptide can be improved.
  • the calreticulin expression-inducing peptide is a sequence (amino acid residue) other than the calreticulin expression-inducing peptide sequence and the amino acid sequence constituting the membrane-permeable peptide sequence, as long as the calreticulin expression-inducing activity is not lost. May include a portion. Although not particularly limited, such a partial sequence is preferably a sequence capable of maintaining the three-dimensional shape (typically a linear shape) of the calreticulin expression-inducing peptide sequence and the membrane-permeable peptide sequence portion.
  • the total number of amino acid residues constituting the peptide chain is suitably 100 or less, preferably 60 or less, and preferably 50 or less.
  • a synthetic peptide of 30 or less is particularly preferable.
  • Such a peptide having a short chain length is easy to chemically synthesize, and can easily provide a calreticulin expression-inducing peptide.
  • the conformation (steric structure) of the peptide is not particularly limited as long as it exhibits calreticulin expression-inducing activity in the environment used (in vitro or in vivo). From the viewpoint that it is difficult to become an (antigen), a linear or helical one is preferable.
  • the calreticulin expression-inducing peptide applied to the present invention is preferably a linear peptide having a relatively low molecular weight (typically 60 or less (particularly 30 or less) amino acid residues). It is.
  • Proportion of calreticulin expression-inducing peptide sequence and membrane-permeable peptide sequence with respect to the entire amino acid sequence Is not particularly limited as long as calreticulin expression-inducing activity is not lost, but the ratio is desirably 60% or more, and preferably 80% or more. 90% or more is particularly preferable.
  • Peptides consisting of a calreticulin expression-inducing peptide sequence and a membrane-permeable peptide sequence are a preferred form.
  • the calreticulin expression-inducing peptide of the present invention is preferably one in which all amino acid residues are L-type amino acids, but as long as the calreticulin expression-inducing activity is not lost, a part of the amino acid residues Alternatively, all of them may be substituted with D-type amino acids.
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein can be easily produced according to a general chemical synthesis method.
  • any conventionally known solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method may be employed.
  • a solid phase synthesis method in which Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) is applied as an amino-protecting group is preferred.
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed here is obtained by a solid-phase synthesis method using a commercially available peptide synthesizer (for example, available from Intavis AG, Protein Technologies, etc.).
  • Peptide chains having modified (C-terminal amidation, etc.) moieties can be synthesized.
  • a calreticulin expression-inducing peptide may be biosynthesized based on a genetic engineering technique. That is, a polynucleotide (typically DNA) of a nucleotide sequence (including an ATG start codon) encoding the amino acid sequence of a desired calreticulin expression-inducing peptide is synthesized. And it includes various regulatory elements (promoter, ribosome binding site, terminator, enhancer, and various cis elements that control the expression level) for expressing the synthesized polynucleotide (DNA) and the amino acid sequence in the host cell.
  • a recombinant vector having a gene construct for expression consisting of) is constructed according to the host cell.
  • This recombinant vector is introduced into a predetermined host cell (for example, yeast, insect cell, plant cell) by a general technique, and the host cell or a tissue or an individual containing the cell is cultured under a predetermined condition. Thereby, the target peptide can be expressed and produced in the cell. Then, the desired calreticulin expression-inducing peptide can be obtained by isolating the peptide from the host cell (in the medium if secreted) and performing refolding, purification, etc. as necessary.
  • a predetermined host cell for example, yeast, insect cell, plant cell
  • a method for constructing a recombinant vector and a method for introducing the constructed recombinant vector into a host cell a method conventionally used in the field may be employed as it is, and such a method itself is particularly characterized by the present invention. Since it is not attached, detailed description is omitted.
  • a fusion protein expression system can be used for efficient mass production in a host cell. That is, a gene (DNA) encoding an amino acid sequence of a target calreticulin expression-inducing peptide is chemically synthesized, and the synthesized gene is converted into an appropriate fusion protein expression vector (for example, pET series and Amersham provided by Novagen) It is introduced into a suitable site of GST (Glutathione S-transferase) fusion protein expression vector) such as pGEX series provided by Bioscience. A host cell (typically E. coli) is transformed with the vector. The obtained transformant is cultured to prepare the desired fusion protein. The protein is then extracted and purified.
  • a gene DNA
  • encoding an amino acid sequence of a target calreticulin expression-inducing peptide is chemically synthesized, and the synthesized gene is converted into an appropriate fusion protein expression vector (for example, pET series and Amersham provided by Novagen) It is introduced into a
  • the obtained purified fusion protein is cleaved with a predetermined enzyme (protease), and the released target peptide fragment (designed calreticulin expression-inducing peptide) is recovered by a method such as affinity chromatography. Further, refolding is performed by an appropriate method as necessary.
  • a conventionally known fusion protein expression system for example, the GST / His system provided by Amersham Bioscience
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein is produced. be able to.
  • a template DNA for a cell-free protein synthesis system ie, a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a calreticulin expression-inducing peptide
  • various compounds ATP, RNA required for peptide synthesis
  • the target polypeptide can be synthesized in vitro (in vitro, in vitro) using a so-called cell-free protein synthesis system.
  • cell-free protein synthesis systems for example, Shimizu et al. (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001)), Madin et al. (Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein and / or a nucleotide sequence complementary to the sequence is easily produced by a conventionally known method. (Synthesis). That is, by selecting a codon corresponding to each amino acid residue constituting the designed amino acid sequence, a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the calreticulin expression-inducing peptide is easily determined and provided.
  • a polynucleotide (single strand) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like. Furthermore, using the obtained single-stranded DNA as a template, various enzymatic synthesis means (typically PCR) can be employed to obtain the desired double-stranded DNA.
  • the polynucleotide may be in the form of DNA or RNA (mRNA or the like). DNA can be provided as double-stranded or single-stranded. When provided as a single strand, it may be a coding strand (sense strand) or a non-coding strand (antisense strand) having a sequence complementary thereto.
  • the polynucleotide thus obtained is for constructing a recombinant gene (expression cassette) for producing calreticulin expression-inducing peptide in various host cells or in a cell-free protein synthesis system as described above. Can be used as material.
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein may be in the form of a salt as long as the calreticulin expression-inducing activity in the pluripotent stem cells (typically iPS cells or ES cells) is not impaired.
  • a salt for example, an acid addition salt of the peptide that can be obtained by addition reaction of an inorganic acid or an organic acid usually used according to a conventional method can be used.
  • other salts for example, metal salts
  • the “peptide” described in the present specification and claims includes such a salt form.
  • the calreticulin expression-inducing agent disclosed herein can be used depending on the form of use as long as the calreticulin expression-inducing peptide, which is an active ingredient, can be retained without losing the calreticulin expression-inducing activity.
  • Various carriers can be included. Carriers generally used in peptide medicine as diluents, excipients and the like are preferred.
  • the calreticulin expression inducer may be appropriately varied depending on the use and form of the calreticulin expression inducer, and typically includes water, a physiological buffer, and various organic solvents. It can be a non-drying oil such as an aqueous solution of alcohol (such as ethanol) of a suitable concentration, glycerol, olive oil.
  • a liposome may be sufficient.
  • the secondary component that can be contained in the calreticulin expression inducer include various fillers, extenders, binders, moisturizers, surfactants, dyes, and fragrances.
  • the form of the calreticulin expression inducer includes solutions, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, ointments, aqueous gels and the like.
  • the calreticulin expression inducer disclosed here can be used in a method or dosage depending on its form and purpose.
  • a calreticulin expression inducer ie, calreticulin expression
  • pluripotent stem cells typically iPS cells or ES cells
  • An appropriate amount of the inducing peptide may be added to the medium at any stage of the culturing process (preferably before the evaluation of genome stability).
  • the addition amount and the number of additions are not particularly limited because they may vary depending on conditions such as the type and state of pluripotent stem cells, cell density (cell density at the start of culture), passage number, culture conditions, medium type, and the like. Typically, it is added one or more times so that the peptide concentration in the medium is generally within the range of 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably within the range of 0.5 ⁇ M to 20 ⁇ M (eg, 1 ⁇ M to 10 ⁇ M) (eg, It is preferable to add them at the start of culture and at the time of cell passage or medium exchange).
  • the calreticulin expression-inducing agent disclosed herein is another feature of pluripotent stem cells (ie, calreticin that can be used for evaluation of genome stability). It is also possible to use in combination with other compounds capable of enhancing the characteristics of pluripotent stem cells that are not the amount of phosphorus expression) and / or methods for enhancing the other characteristics.
  • the method of removing genome unstable pluripotent stem cells from the pluripotent stem cell culture disclosed here is the pluripotent stem cell described above.
  • the genome stability or instability of pluripotent stem cells such as iPS cells contained in the target pluripotent stem cell culture is determined by the method for assessing genome stability of The obtained pluripotent stem cells are removed from the stem cell culture.
  • a pluripotent stem cell culture mainly composed of genome-stable pluripotent stem cells by removing pluripotent stem cells such as iPS cells that have been identified as genomically unstable from the target pluripotent stem cell culture (Eg, iPS cell culture) can be produced.
  • a pluripotent stem cell culture in which the majority of the pluripotent stem cells contained in the culture (for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more) is occupied by genome-stable pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells comprised of genome-stable pluripotent stem cells (typically, genome-stable pluripotent stem cells account for substantially 100%).
  • Stem cell culture is a preferred embodiment.
  • human-derived iPS cells have high utility value in the medical industry, they are suitable examples of the pluripotent stem cells of interest.
  • pluripotent stem cell cultures such as iPS cell cultures obtained by carrying out the above-described method for removing genome-unstable pluripotent stem cells (that is, genome-unstable from the target pluripotent stem cell culture).
  • substantially all pluripotent stem cells contained in the culture are living cells (for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more)
  • a pluripotent stem cell culture has high industrial utility value.
  • a pluripotent stem cell culture in which the pluripotent stem cells contained in the culture are living cells (that is, the living cells substantially account for 100%) is a particularly preferable embodiment.
  • Pluripotent stem cells that have been determined to be genomically unstable by the above-described method for assessing genome stability of pluripotent stem cells are cultured in the target pluripotent stem cell culture (typically in iPS cell culture or ES cells).
  • the pluripotent stem cell characteristics (markers, markers, landmarks) that can be used for removal from () include, for example, calreticulin expression state, calreticulin gene expression state, calreticulin expression Protein or RNA expression state that is highly correlated with it, transgene expression state previously introduced into pluripotent stem cells by molecular biological techniques, chromosomal state (eg, chromosomal abnormalities, multinucleation, etc.), genome The expression state of protein or RNA that is known to change the expression level in unstable cells, or the physiological properties specific to genomically unstable pluripotent stem cells (increased Gender, adhesion, migration resistance, characteristics of cell division, auxotrophy or the like) and the like.
  • the characteristics of the pluripotent stem cells are merely examples, and the pluripotent stem cells (for example, iPS cells) determined to be genomically unstable by the evaluation method are removed from the target pluripotent stem cell culture. Therefore, it is not particularly limited as long as it is a feature of pluripotent stem cells that can be used.
  • the characteristics of the pluripotent stem cells one characteristic can be used alone, or two or more characteristics can be used in combination.
  • the expression state of calreticulin in a pluripotent stem cell (for example, iPS cell) in the pluripotent stem cell culture of interest is the genomic stability of the pluripotent stem cell in the genome stability evaluation method of the pluripotent stem cell or Since it has the same characteristics as the characteristics of pluripotent stem cells used as a criterion for determining genomic instability, pluripotent stem cells targeted for pluripotent stem cells such as iPS cells determined to be genomic unstable by the above evaluation method It can be suitably used from the viewpoint of accurately removing it from the culture (for example, iPS cell culture).
  • pluripotent stem cells typically iPS cells
  • pluripotent stem cells typically iPS cells
  • the landmark (marker, label, feature) used for grasping the calreticulin expression level of the pluripotent stem cell typically iPS cell or ES cell
  • the label of the antibody used to measure the expression level of calreticulin can be used as it is in the removal method. It is preferable to use the mark used in the genome stability evaluation method as it is because the operation necessary for removing pluripotent stem cells such as iPS cells determined to be genomically unstable can be simplified.
  • the expression state of calreticulin is determined to be genomically unstable because it can be identified with high specificity by an immunological technique (antigen-antibody reaction) using an anti-calreticulin antibody.
  • an anti-calreticulin antibody or a secondary antibody that specifically recognizes the anti-calreticulin antibody is preliminarily labeled with some label, and the target pluripotent stem cell culture is used as a marker. It is possible to remove pluripotent stem cells such as iPS cells determined to be genomically unstable from the inside (for example, in iPS cell culture).
  • the antibody label for example, fluorescent dyes, magnetic beads, various affinity tags such as GST tag and His tag can be used.
  • calreticulin is fluorescently labeled by an immunofluorescent antibody method using a fluorescently labeled anti-calreticulin antibody or a fluorescently labeled secondary antibody, and the fluorescent label is used as a marker.
  • Pluripotent stem cells such as iPS cells determined to be stable can be removed from a target pluripotent stem cell culture with high accuracy and high efficiency.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells that have been determined to be genomically unstable even if the transcript or translation product of the transgene that has been introduced in advance by molecular biology is used as a landmark. It can be efficiently removed from the sex stem cell culture. For example, by introducing a fluorescent protein-fused calreticulin vector into the target iPS cells and using the fluorescent coloration of the fluorescent protein-fused calreticulin whose expression level is increased in genomically unstable iPS cells as a mark, It is possible to remove iPS cells determined to be genomically unstable from the target iPS cell culture.
  • the method for removing pluripotent stem cells determined to be genomically unstable from the target pluripotent stem cell culture solution is characterized in that the characteristics (markers, markers, landmarks) of the pluripotent stem cells used for the removal are at a predetermined level.
  • This can be achieved by removing excess pluripotent stem cells (for example, iPS cells).
  • the level of the above-mentioned characteristics in pluripotent stem cells such as iPS cells determined to be genome stable by the above-described genomic stability evaluation method for pluripotent stem cells, and iPS cells determined to be genome unstable
  • a predetermined level of the characteristic of the pluripotent stem cell that can be used for the removal can be set.
  • the predetermined level varies depending on the characteristics of the pluripotent stem cells to be employed, the method for examining (measuring) the characteristics, and the sensitivity and accuracy of the measurement method, and thus must be set as appropriate. For example, by removing pluripotent stem cells in which the expression level of calreticulin exceeds a predetermined level from the target pluripotent stem cell culture (typically in iPS cell culture or ES cell culture). It is possible to remove pluripotent stem cells that have been identified as genomically unstable.
  • the level of expression of calreticulin that can be used to remove genomically unstable pluripotent stem cells from a target pluripotent stem cell culture is the removal of pluripotent stem cells that have been identified as genomically unstable.
  • an expression level comparable to that of calreticulin in the genome stability evaluation method can be used.
  • it is preferably 1.2 times or more (for example, 1.5 times or more, more preferably 2 times or more, more preferably compared to the calreticulin expression level in pluripotent stem cells (comparison subjects) such as genome stable iPS cells)
  • the expression level of calreticulin preferably 5 times or more, for example 10 times or more, can be used as a standard for removing genome-unstable pluripotent stem cells.
  • the expression level of calreticulin that can be used to remove genomically unstable pluripotent stem cells from the pluripotent stem cell culture to be evaluated is set using pluripotent stem cells of the same origin It is preferable.
  • the method of removing pluripotent stem cells discriminated as having genomic instability disclosed herein from a target pluripotent stem cell culture typically in an iPS cell culture or ES cell culture
  • a target pluripotent stem cell culture typically in an iPS cell culture or ES cell culture
  • various cell sorting methods can be used. For example, cell sorting using a fluorescence-labeled cell sorter (FACS), cell sorting using a magnetic cell separator (MACS (registered trademark)), cell sorting under a microscope, optical tweezers Cell selection using various cells, cell selection using various columns, cell selection using an immunological technique (antigen-antibody reaction), cell selection using cell staining, cell selection using a label with a specific transgene, cell physiology Cell selection using specific properties (proliferation, adhesion, migration, cell division characteristics, auxotrophy, etc.).
  • a cell sorting method using an immunological technique using an anti-calreticulin antibody is particularly preferable because cell sorting can be performed with high specificity and high reliability.
  • a cell sorting method using FACS, MACS and various columns is preferable because cells can be sorted with high efficiency.
  • the removal of pluripotent stem cells such as iPS cells determined to be genomically unstable is the determination of the genomic stability or genomic instability of pluripotent stem cells in the subject pluripotent stem cell culture. You may do it at the same time. It is preferable to perform the determination and the removal at the same time because the operations necessary for removing the genome-unstable pluripotent stem cells can be simplified.
  • the pluripotent stem cells discriminated as genome unstable disclosed here are removed from the target pluripotent stem cell culture (typically in iPS cell culture or ES cell culture).
  • the cell sorter used for this purpose is not particularly limited, and various cell sorters can be used.
  • FACS, MACS (registered trademark) a cell sorter using optical tweezers, and a cell sorter using various columns can be used.
  • Cell sorter using FACS, MACS and optical tweezers removes pluripotent stem cells such as iPS cells that have been determined to be highly genomically unstable by automation from the target pluripotent stem cell culture Therefore, it can be suitably used for the implementation of the present invention.
  • FACS and MACS are preferable because discrimination of genome stability or genome instability of pluripotent stem cells based on the above-described calreticulin expression level and removal of genome labile pluripotent stem cells can be performed simultaneously.
  • Anti-calreticulin antibody is reacted with an antigen-antibody against iPS cells in a subject iPS cell culture, and then a fluorescently labeled secondary antibody against the anti-calreticulin antibody is reacted. Thereafter, the fluorescence emission of the fluorescent label is analyzed using FACS, and the iPS cells whose fluorescence emission intensity exceeds a predetermined level are removed from the target iPS cell culture to remove genome unstable iPS cells. can do.
  • the iPS cells whose fluorescence emission intensity exceeds a predetermined level are typically cells having stronger fluorescence intensity than iPS cells (for example, the 201B7 strain) that have been confirmed to be genome-stable in advance, It is a cell having a fluorescence intensity equal to or higher than that of a genome unstable cell in a culture of iPS cells (for example, 201B2 strain described above) which has been confirmed to contain a genome unstable cell.
  • a pluripotent stem cell having chromosomal abnormality and / or multinucleation is used as a typical example of the pluripotent stem cell removed by the method for removing the genome unstable pluripotent stem cell (for example, iPS cell or ES cell).
  • the above pluripotent stem cells (including cells, cell masses, tissues, etc. obtained by inducing differentiation of the pluripotent stem cells) may cause tumors after being transplanted in vivo.
  • Genomic unstable iPS cells that are particularly desired to be removed from the pluripotent stem cell culture of interest. Removal of human-derived iPS cells, particularly those having chromosomal abnormalities and / or multinucleation, is a preferred embodiment of the present invention.
  • iPS cells were used as examples of pluripotent stem cells.
  • Specific test cells include a genome-stable (specifically, no chromosomal abnormality) human-derived iPS cell line (clone name: 201B7, hereinafter simply referred to as 201B7), and genomically unstable (specifically, Used a human-derived iPS cell line (clone name: 201B2, hereinafter also simply referred to as 201B2), which contains cells whose chromosome 12 is triploid (trisomy).
  • 201B7 and 201B2 are iPS cell clones established from the same human fibroblasts (Source: Takahashi K et al., Cell, 131, 861-872 (2007)).
  • the iPS cells used were those provided by the Kyoto University iPS Cell Research Institute. Moreover, when subculturing the iPS cells, mouse fetal fibroblasts (cell line: SNL76 / 7) licensed from Baylor-College-of-Medicine were used as feeder cells.
  • Example 1 Preparation of iPS cell culture (iPS cell passage maintenance)> A culture of iPS cells was prepared by maintaining the above iPS cells (201B7 and 201B2) by the following method. Details are as follows.
  • iPS cell 1-4 days before seeding each iPS cell (201B7 and 201B2), SNL76 / 7 cells inactivated by treatment with mitomycin C were seeded in a culture vessel (culture dish having a diameter of 10 cm) coated with gelatin. The SNL76 / 7 cells were cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. until just before seeding with iPS cells.
  • ES medium Primary ES Cell Medium: ReproCELL, hereinafter also referred to as ES medium.
  • CTK 0.1 mg / mL collagenase IV (Life Technologies), 1 mM calcium chloride, 0.25% trypsin solution containing 20% KSR (knockout serum replacement)
  • the CTK solution was washed away with PBS ( ⁇ ), ES medium was added, and iPS cell colonies were completely detached using a cell scraper.
  • the ESC medium in the culture container in which the iPS cell colonies were suspended in the 15 mL tube was transferred, and the iPS cell colonies remaining in the culture container were washed with the ESC medium and collected in the 15 mL tube.
  • the 15 mL tube was allowed to stand for 5 minutes to precipitate iPS cell colonies, and after removing the supernatant, the iPS cell colonies were dispersed and suspended in fresh ES medium by pipetting to prepare an iPS cell suspension. .
  • Appropriate amount of iPS cell suspension obtained in this way (for example, about 1/3 to 1/8 of the total amount of cell suspension when subcultured using the same volume of culture vessel) It seed
  • the culture vessel was placed in an incubator and cultured under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • the medium was changed every 1 to 2 days, and the culture was continued until iPS cells accounted for 80-90% of the bottom of the culture vessel (ie, 80-90% confluent).
  • the subculture of the iPS cells that became 80-90% confluent was repeated by the above method. In this way, a culture of iPS cells was prepared.
  • Example 2 Evaluation test of calreticulin expression level in iPS cells> Calreticulin expression was examined in genome stable iPS cells and genome unstable iPS cells. The above two iPS cells (201B7 and 201B2) were used as test cells. Details of the evaluation test are as follows.
  • Each iPS cell (201B7 and 201B2) prepared by the method described in Example 1 was collected in a 15 mL tube by the same method as in the above subculture and allowed to stand for 5 minutes. Thereafter, the supernatant was removed, and iPS cell colonies were dispersed and suspended in fresh mTeSR (registered trademark) 1 medium (manufactured by STEMCELL Technologies) by pipetting. Then, the iPS cell suspension was seeded in an 8-well (well) slide coated with Matrigel so as to have a density of about 1 ⁇ 10 4 cells per well. The culture vessel was placed in an incubator and cultured overnight under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. After the overnight culture, the medium was replaced with fresh mTeSR (registered trademark) 1 medium, and further cultured for 5 days under the same conditions. During the culture period of 5 days, the medium was changed every day.
  • mTeSR registered trademark
  • the primary antibody dilution prepared to a final concentration of 4 ⁇ 10 ⁇ 3 mg / mL with PBS ( ⁇ )) was added to the iPS cell culture vessel and allowed to stand at 4 ° C. overnight or at room temperature for 2 hours. . After a predetermined time of the antigen-antibody reaction, the primary antibody diluted solution was removed and washed with PBS ( ⁇ ). Subsequently, an anti-mouse IgG antibody (goat: Life Technologies, A11001) labeled with a fluorescent dye (Alexa (registered trademark) 488) as a secondary antibody was diluted with 1% BSA / PBS ( ⁇ ) to a final concentration of 10 ⁇ 10 ⁇ .
  • a secondary antibody diluted solution prepared to 3 mg / mL was added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After the predetermined time, the secondary antibody diluted solution was removed and washed with PBS ( ⁇ ). Thereafter, encapsulation was performed using a DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole) -containing encapsulating solution (Life Technologies) and a cover glass, and fluorescence observation was performed using a confocal laser microscope.
  • DAPI ′, 6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 1 or FIG. These drawings are fluorescent micrographs showing the expression state of calreticulin in each iPS cell (201B7 or 201B2), and show the results of examining the expression state of calreticulin by the immunofluorescent antibody method. It is an image obtained by superimposing (merging) an image and a nuclear staining image by DAPI.
  • FIG. 1 shows the result of 201B7
  • FIG. 2 shows the result of 201B2.
  • the strong color development of the fluorescent label for detecting calreticulin was confirmed as compared with the fluorescent micrograph of 201B7 in FIG. That is, it was recognized that the expression level of calreticulin was significantly increased in the genome unstable iPS cells (201B2) compared to the genome stable iPS cells (201B7). In addition, it was considered that the weak color development of the fluorescent label for detecting calreticulin confirmed in 201B7 detected calreticulin constantly expressed in the cells. In addition, in FIG. 1, several cells in which the fluorescent label for detecting calreticulin is strongly colored were confirmed.
  • the cells were iPS cells with unstable genome, it was considered that the cells were iPS cells whose genome was unstable by subculture. This is because the expression level of calreticulin is examined for the pluripotent stem cells in the culture of the subject pluripotent stem cell, and the genome stability or genome anxiety of the stem cell is determined based on the degree of the calreticulin expression level. It shows that qualitativeness can be determined. It also shows that an immunological technique can be suitably used for the discrimination.
  • Example 3 Peptide synthesis> A synthetic peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10 to 13 was produced using a peptide synthesizer described below. In the following description, the synthetic peptides are referred to as samples 1 to 4 corresponding to the sequence numbers. Table 1 lists information such as amino acid sequences of these synthetic peptides.
  • the peptides according to samples 1 to 4 have an amino acid sequence derived from LIM kinase 2 (SEQ ID NO: 5) on the N-terminal side of the peptide chain, and two glycine ( G) It has a calreticulin expression-inducing peptide sequence (SEQ ID NOs: 1 to 4) via a linker region consisting of residues.
  • the peptide according to sample 1 or sample 2 (SEQ ID NO: 10 or 11) is a peptide consisting of a total of 24 amino acid residues each having the centrin 2 siRNA-related sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 as the calreticulin expression-inducing peptide sequence. .
  • the peptide according to sample 3 or sample 4 (SEQ ID NO: 12 or 13) has a total of 22 amino acid residues each having a typical modified sequence of the centrin 2 siRNA-related sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 as the calreticulin expression-inducing peptide sequence.
  • the synthetic peptide is a linear peptide in which the carboxyl group (—COOH) of the C-terminal amino acid is amidated (—CONH 2 ).
  • the synthetic peptide was synthesized by performing a solid phase synthesis method (Fmoc method) according to the manual using a commercially available peptide synthesizer (product of Intavis AG). In addition, since the usage mode itself of the peptide synthesizer does not characterize the present invention, detailed description thereof is omitted.
  • the synthesized peptides according to samples 1 to 4 were dissolved in PBS ( ⁇ ) to prepare a peptide stock solution.
  • Example 4 Evaluation of calreticulin expression-inducing activity of synthetic peptide>
  • the peptides according to Samples 1 to 4 obtained in Example 3 were examined for calreticulin expression inducing activity.
  • the iPS cells (201B7 and 201B2) were used as test cells. Details of the evaluation test are as follows.
  • each iPS cell (201B7 and 201B2) was seeded in a Matrigel-coated 8-well (well) slide so that there were about 1 ⁇ 10 4 cells per well, and 5% CO 2 , The culture was performed overnight at 37 ° C. After the overnight culture, the medium was replaced with mTeSR (registered trademark) 1 medium containing the peptide according to Samples 1 to 4 in an amount of 10 ⁇ M peptide concentration, and cultured for 5 days. During the culture period of 5 days, the medium was changed to a mTeSR (registered trademark) 1 medium containing the peptide according to Samples 1 to 4 in an amount of 10 ⁇ M peptide concentration every day. From the viewpoint of comparison, a peptide-free group was provided for each iPS cell as a control group. The conditions for the peptide-free group were the same as those in Example 2.
  • FIGS. The results of fluorescence observation with a confocal laser microscope are shown in FIGS. As in FIG. 1 or FIG. 2, these drawings are fluorescent micrographs showing the expression state of calreticulin in each test group, and the expression state of calreticulin in iPS cells by the immunofluorescent antibody method described above. It is the image which overlap
  • FIG. 3 shows the result of the sample 1 addition section in 201B2
  • FIG. 4 shows the result of the sample 1 addition section in 201B7.
  • 5 and 6 are the same as FIGS. 2 and 1, respectively, and show the results of the peptide-free group in 201B2 and 201B7.
  • calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein that is, the calreticulin expression-inducing agent containing the peptide as an active ingredient
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed here ie, a calreticulin expression-inducing agent containing the peptide as an active ingredient
  • the target pluripotent stem cell typically iPS cell
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein that is, the calreticulin expression-inducing agent containing the peptide as an active ingredient
  • the target pluripotent stem cell typically, iPS cell.
  • Example 5 Removal test of genomically unstable iPS cells from iPS cell culture> Using the iPS cells (201B7 and 201B2) as test cells, it was tested whether genomically unstable iPS cells could be removed from the culture of the iPS cells. Details are as follows.
  • iPS cell cultures were prepared as follows. Each iPS cell (201B7 and 201B2) prepared by the method described in Example 1 was approximately 1 ⁇ 10 per well in a 10 mm diameter culture dish (10 mm dish) previously coated with GelTrex (product of Life Technologies). It seed
  • Essential 8 (registered trademark) medium product of Life Technologies was used. The culture vessel was placed in an incubator and cultured for 5 days under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. During the culture period of 5 days, the medium was changed every day.
  • calreticulin expressed in each iPS cell is fluorescently labeled, and the fluorescence intensity of the fluorescent label for detecting the calreticulin is used as an index, from the culture of each iPS cell using FACS. Genomically unstable cells were removed.
  • the specific test method is as follows.
  • each iPS cell after completion of the culture for 5 days was treated with a ROCK (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase / Rho-binding kinase) inhibitor.
  • ROCK Rho-associated coiled-coil containing protein kinase / Rho-binding kinase
  • Y-27632 which is a ROCK inhibitor
  • Y-27632 was added to the medium of each iPS cell after the completion of the culture for 5 days, so that the concentration in the medium would be 10 ⁇ M, and then 5% CO 2 , 37 It left still in the incubator at 0 degree for 1 hour.
  • the medium in the culture vessel was removed and washed once with PBS.
  • each iPS cell treated with the ROCK inhibitor was collected in a predetermined test tube. Specifically, for each iPS cell, PBS ( ⁇ ) containing 0.5 mM EDTA (hereinafter, also referred to as “EDTA / PBS ( ⁇ )”) was added in an amount of 3 mL to each culture vessel, and 5% was allowed to stand for 15 minutes to CO 2, 37 ° C. in the incubator. Next, EDTA / PBS ( ⁇ ) in the culture container was removed, 4 mL of PBS ( ⁇ ) was added to each culture container, and pipetting was performed. By such pipetting, iPS was peeled from the culture vessel, and iPS cells were dispersed in the PBS ( ⁇ ).
  • PBS ( ⁇ ) containing 0.5 mM EDTA hereinafter, also referred to as “EDTA / PBS ( ⁇ )”
  • EDTA / PBS ( ⁇ ) 0.5 mM EDTA
  • a 15 mL tube in which each iPS is collected is 120 ⁇ g (where “ ⁇ g” indicates centrifugal force, which means relative centrifugal acceleration relative to the Earth's gravitational acceleration. For example, 120 ⁇ g is the Earth's gravitational acceleration.
  • iPS cell was dispersed in an incubation buffer containing 10 ⁇ M Y-27632 (hereinafter also referred to as “Y-27632 (10 ⁇ M) -containing incubation buffer”), and the cell density is approximately 1 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ L. The dispersion was adjusted. A part of the iPS cell dispersion was dispensed into 1.5 mL tubes prepared separately and used for the following tests.
  • calreticulin present on the cell surface of iPS cells in each test group was fluorescently labeled by the following fluorescent immunostaining (immunofluorescence antibody method).
  • an anti-calreticulin antibody an anti-calreticulin monoclonal [FMC75] -Phycoerythrin antibody (antibody labeled with Phycoerythrin (hereinafter, this fluorescent dye is also referred to as “PE”) (that is, a fluorescent PE-labeled antibody) ( Mouse origin, Abcam, Cat No. ab83220, Lot No. GR177933-2) was used.
  • Mouse IgG1 (PE) -Isotype control mouse derived, Abcam, Cat No. ab81200, Lot No GR183088-1 was used as an isotype control of the anti-calreticulin monoclonal [FMC75] -Phycoerythrin antibody.
  • An antibody dilution prepared by adding such an anti-calreticulin antibody (or the above isotype control) with an incubation buffer containing Y-27632 (10 ⁇ M) to a final concentration of 10 ⁇ g / mL is added to each test tube, and placed in the dark at 4 ° C. It was left for 1.5 hours.
  • centrifugation is performed at 130 ⁇ g for 5 minutes, the antibody dilution is removed, and each iPS cell is washed twice with 1 mL of incubation buffer (centrifuging conditions: 130 ⁇ g, 5 minutes). Subsequently, each iPS cell was washed once with 300 ⁇ L of On-Chip Sample Buffer (manufactured by On-Chip Biotechnology) (centrifugation conditions: 260 ⁇ g, 5 minutes). Each iPS cell was dispersed in an On-Chip Sample Buffer, and a cell dispersion having a cell density of at least 5 ⁇ 10 5 cells / 100 ⁇ L or more was prepared. As described above, the above-described fluorescent immunostaining did not fix and permeabilize cells. In other words, the cell surface calreticulin was specifically fluorescent immunostained with an anti-calreticulin antibody.
  • the abundance of calreticulin on the cell surface is analyzed using FACS for the iPS cells of each test section subjected to the fluorescent immunostaining, and genome unstable iPS cells are selected based on the analysis results. did. That is, the intensity of fluorescence coloring (excitation wavelength: 488 nm, maximum fluorescence wavelength: 575 nm) of the fluorescent dye (Phycoerythrin) for detecting calreticulin is analyzed, and iPS cells are selected based on the fluorescence coloring intensity of the fluorescent label. (Removal of genome unstable iPS cells) was performed. As FACS, On-Chip Sort manufactured by On-Chip Biotechnology was used.
  • FIG. 7 shows the results of analyzing (measuring) the intensity of fluorescence development (excitation wavelength: 488 nm, maximum fluorescence wavelength: 575 nm) of Phycoerythrin using FACS.
  • FIG. 7 and FIG. 8 show the results of analyzing (measuring) the intensity of fluorescence development (excitation wavelength: 488 nm, maximum fluorescence wavelength: 575 nm) of Phycoerythrin using FACS.
  • the peak of the fluorescence intensity histogram confirmed in the negative control section is presumed to be the detection of autofluorescence of the cell.
  • the fluorescence intensity histogram in the negative control group was compared with the fluorescence intensity histogram of the test group in which fluorescent immunostaining was performed using the isotype control, and either 201B2 or 201B7 was detected. It was confirmed that the histogram peaks were almost the same in the iPS cells. That is, it was confirmed that the anti-calreticulin antibody (anti-calreticulin monoclonal [FMC75] -Phycoerythrin antibody) used in this test had very little non-specific antigen-antibody reaction against iPS cells.
  • anti-calreticulin antibody anti-calreticulin monoclonal [FMC75] -Phycoerythrin antibody
  • a fluorescence intensity histogram of the anti-calreticulin antibody-stained group and a fluorescence intensity histogram of the negative control group of the cells are obtained.
  • the right side of the peak top of the fluorescence intensity histogram of the anti-calreticulin antibody staining section is gentler than the peak confirmed by the fluorescence intensity histogram of the negative control section, It was confirmed that the phase was shifted.
  • a cell population having a strong fluorescence intensity was present in the cells in the anti-calreticulin antibody-stained group compared with the cells in the negative control group.
  • Such a cell population with strong fluorescence intensity is a cell population that expresses a large amount of calreticulin on the cell surface.
  • the cell population with higher fluorescence intensity than the cells in the negative control group is selected from the cells in the anti-calreticulin antibody-stained group.
  • Genomic unstable cells can be removed from the cell culture of iPS cells (201B2).
  • the fluorescence intensity histogram of the anti-calreticulin antibody-stained group is compared with the fluorescence intensity histogram confirmed in the negative control group of the cell.
  • the peak position and the peak shape were almost the same. That is, it was confirmed that the expression amount of calreticulin on the cell surface of the genome stable iPS cell (201B7) was extremely low.
  • the amount of calreticulin expression in each iPS cell (typically the cell surface) in the iPS cell culture was examined, and the iPS cell in which the amount of calreticulin expression exceeded a predetermined level was identified as genomic anxiety. It was confirmed that it could be identified as qualitative. Further, it was confirmed that genomically unstable iPS cells could be removed from the subject iPS cell culture based on the level of expression of calreticulin in iPS cells. The evaluation of the genomic stability of the iPS cells and the removal of the genomically unstable iPS cells could be performed simultaneously using the same label (typically a fluorescent label of an antibody) as a landmark.
  • the same label typically a fluorescent label of an antibody
  • the calreticulin expression-inducing peptide (that is, the calreticulin expression-inducing agent containing the peptide as an active ingredient) is examined before the degree of expression of calreticulin is examined. ) Is added to the iPS cell culture and cultured for a predetermined time, so that the expression of calreticulin on the cell surface of genome-unstable cells can be increased, and removal of genome-unstable iPS cells can be achieved. It was confirmed that it can be realized with high accuracy and high reliability.
  • Example 6 Preparation of granules> 50 mg of the synthetic peptide (calreticulin expression-inducing peptide) according to Samples 1 to 4, 50 mg of crystallized cellulose, and 400 mg of lactose were mixed, and 1 mL of a mixed solution of ethanol and water was added and kneaded. This kneaded product was granulated according to a conventional method to obtain a granule (granular composition) mainly composed of the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein.
  • the genomic stability of pluripotent stem cells is highly efficient and highly reliable. Since it can be discriminated by sex, it can be used, for example, for chromosomal examination of pluripotent stem cells (preferably iPS cells).
  • a pluripotent stem cell culture typically iPS cell culture
  • ES cell culture can be provided (manufactured).
  • the pluripotent stem cell culture can be used, for example, as a medical material suitable for regenerative medical purposes.
  • the calreticulin expression-inducing peptide disclosed herein and the calreticulin expression-inducing agent containing the peptide as an active ingredient are calretici in genomically unstable pluripotent stem cells (typically iPS cells).
  • the pluripotency can be suitably used in a method for removing genome-unstable pluripotent stem cells from a sexual stem cell culture and a method for producing a pluripotent stem cell culture from which genome-unstable pluripotent stem cells have been removed.

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Abstract

　多能性幹細胞のゲノム安定性を高効率かつ高い信頼性で評価し得る方法と、該評価方法によりゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を評価対象とする多能性幹細胞の培養物中から除去する方法と、これら方法に利用可能な合成ペプチドを提供する。　本発明によって提供される方法は、対象とする多能性幹細胞の培養物を準備し、当該培養物中の多能性幹細胞のカルレティキュリンの発現量を調べ、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別することを包含する。

Description

ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去方法および該方法に用いられる合成ペプチド
　本発明は、胚性幹細胞（embryonic stem cell；以下「ＥＳ細胞」ともいう）、誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；以下「ｉＰＳ細胞」ともいう）等の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法と該方法に用いる合成ペプチドに関する。また、多能性幹細胞を含む培養物中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法に関する。
　なお、本出願は２０１３年１０月３０日に出願された日本国特許出願２０１３－２２５９２２号に基づく優先権を主張しており、当該日本国出願の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
　ヒト又はヒト以外の哺乳動物由来の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）を再生医療（典型的には移植医療）に応用する際の一つの課題として、医療に利用可能な当該幹細胞を高効率に生産する技術の確立が挙げられる。
　例えば、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は生体内への移植に不適なため、再生医療に利用可能なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を得るためには対象の多能性幹細胞集団の中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する必要がある。上記ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去に際しては、当然、多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する必要がある。
　しかしながら、現在までに報告されている多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法（例えば、染色体分染法や蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ hybridization：ＦＩＳＨ）法等）は、煩雑な操作が必要であったり、或いは熟練の技術を要するものであった。そのため、より簡便で高効率に多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法が求められている。また、従来の評価方法の多くは対象細胞の固定を必要とするため、実際に再生医療に用いる多能性幹細胞（即ち生きた状態の該細胞）自身のゲノム安定性を直接評価することが困難であった。
国際公開第ＷＯ２００９／０９３６９２号
セル・サイクル（Cell Cycle）、８巻（６号）、２００９年、ｐｐ．８６０－８６９ キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、６７巻（１７号）、２００７年、ｐｐ．７９４１－７９４４ カレント・バイオロジー（Current Biology）、１２巻、２００２年、ｐｐ．１２８７－１２９２
　そこで本発明は、かかる多能性幹細胞の利用に関する従来の課題を解決するべく創出されたものであり、多能性幹細胞のゲノム安定性を高効率且つ高い信頼性で評価し得る方法を提供する。また、上記評価方法によりゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞の培養物中から除去する方法を提供する。さらに、上記評価方法および上記除去方法の効果を高めるために利用可能な、人為的に合成可能な比較的短い鎖長のペプチドの提供を他の目的とする。また、そのようなペプチドを含む組成物の提供を他の目的とする。
　本発明者は、正常な細胞においては細胞内（典型的には小胞体内）にその局在が確認される一方で、がん細胞や病原体に感染した細胞においては免疫原性の細胞死を起こす際に該細胞の表面に発現誘導される免疫賦活性タンパク質（いわゆるイートミーシグナル、eat-me signal）として知られるカルレティキュリンタンパク質（Calreticulin、以下「カルレティキュリン」ともいう）に着目した（非特許文献１、２）。
　そして、種々の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現量を調べたところ、驚くべきことに、ゲノム不安定な多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）はゲノム安定な同種の幹細胞と比較してカルレティキュリンの発現量が顕著に増大していることを見出し、本発明を完成するに至った。
　上記の目的を実現すべく、本発明によると、対象となるヒト又は他の哺乳動物由来のｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の培養物を準備することと、該培養物中の多能性幹細胞についてカルレティキュリンの発現量（対象とする多能性幹細胞の細胞表面（典型的には細胞膜の表面）に発現するカルレティキュリンの存在量）を調べ、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて該多能性幹細胞のゲノム安定性若しく不安定性を判別することと、を包含する多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法（ゲノム安定性評価方法）を提供する。そして、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法は、上記判別において、カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞をゲノム不安定性であると判別することを特徴とする。
　ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法を用いると、多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）の多能性幹細胞のカルレティキュリンの発現量を調べるという簡便な操作によって、該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別することができる。したがって、簡便且つ高効率にｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価することが可能である。このようなゲノム安定性評価方法は、多量の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する場合（例えば、ｉＰＳ細胞のクローン確立や再生医療に資するｉＰＳ細胞の準備等）に特に好適に利用できる。
　ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法の好ましい一態様は、上記カルレティキュリンの発現量に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性の判別を、カルレティキュリン又はその断片と特異的に反応する抗体（即ち、抗カルレティキュリン抗体）を用いた免疫学的手法で行うことを特徴とする。
　抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法によると、対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現を、特異的かつ高感度に調べることができる。したがって、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を高精度且つ高い信頼性をもって判別することが可能となる。また、免疫学的手法を用いた多能性幹細のゲノム安定性の評価は、従来のゲノム安定性を評価する方法（例えばＦＩＳＨ法）と比較して短時間かつ簡便な操作でｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価し得るため好ましい。
　また本発明者は、上記多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法の効果を高めるため、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）において特にカルレティキュリンの発現量を増大させる物質を模索した。鋭意検討の結果、本発明者は、ヒト由来のセントリン２（centrin 2、中心体関連タンパク質）のｓｉＲＮＡ（small interfering RNA、低分子干渉ＲＮＡ）を構成するＲＮＡ配列から翻訳されるアミノ酸配列を設計し、当該アミノ酸配列を含むように作製した合成ペプチドが、対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞培養物の培地中）に供給された際にゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）において特にカルレティキュリン発現量を増大し得る或いはカルレティキュリンの発現を誘導し得る能力（カルレティキュリン発現誘導活性）を有することを見出した。
　本発明者は上記知見に基づき、本発明の他の側面として、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）に対してカルレティキュリン発現誘導活性を奏する人為的に合成されたペプチド（以下、「カルレティキュリン発現誘導ペプチド」という）を完成するに至った。
　具体的には、本発明者は、以下のアミノ酸配列：
　　　ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
　　　ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
　のうちのいずれか若しくは該アミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチドを提供する。
　ここで開示される合成ペプチドは、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。また、物質自体が単純な構造（直鎖状のペプチド鎖）であるため、取扱いが容易であり、例えば、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（典型的には当該幹細胞培養物の培地中）に該カルレティキュリン発現誘導ペプチドを供給するという簡易な処理を行うことによって、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を増大させることができる。
　また、本発明によると、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法の好ましい一態様として、上記カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性の判別を行うより前に、ここで開示される少なくとも1種のカルレティキュリン発現誘導ペプチドを対象の多能性幹細胞培養物中に少なくとも１回供給することをさらに含み、該合成ペプチドを少なくとも一回供給した当該多能性幹細胞培養物を所定時間培養した後に上記判別を行うことを特徴とする評価方法が提供される。
　上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを用いてゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量を増大させることで、ゲノム不安定な多能性幹細胞とゲノム安定な多能性幹細胞とのカルレティキュリン発現量の差を明確にすることができる。これにより、カルレティキュリンの発現の程度に基づいてｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別がいっそう容易となるため、多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法の精度向上と信頼性向上を実現することができる。
　また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記改変アミノ酸配列が配列番号１又は２のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基(Ｃ）を欠失したものである。
　上記改変アミノ酸配列からなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列もまた、配列番号１又は２に示すカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と同様に良好なカルレティキュリン発現誘導活性を発揮することができる。
　また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する。
　このような膜透過性ペプチドを有する上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を高効率にｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞内（細胞膜及び／又は核膜の内側）に移入することができるため、本発明の実施に好適に用いることができる。
　また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号５）；
を有する。
　配列番号５としてここで開示されるアミノ酸配列は、膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列の典型例であり、特にゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現を高効率に誘導することができる。
　また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、該合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下である。
　このような短いペプチド鎖のペプチドは化学合成が容易であり、且つ、安価で取扱い性に優れるため、本発明の実施に特に好適に用いることができる。
　また、ここで開示される好ましい一態様のカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）；
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
のうちのいずれかを有する。
　かかる合成ペプチドは、特に、ヒト由来のゲノム不安定なｉＰＳ細胞に対してカルレティキュリン発現誘導活性を奏する。ヒト由来のｉＰＳ細胞を好適な適用対象とする上記合成ペプチドは、医療産業上の利用価値が極めて高い。
　また、本発明によると、他の側面として、対象となるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法であって、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法のいずれかによって対象の多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞のゲノム安定性の有無又はその程度を判別すること、および、該判別方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を該多能性幹細胞培養物中から除去すること、を包含する方法が提供される。
　対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）からゲノム不安定と判別された多能性幹細胞を除去することで、ゲノム安定と判別された多能性幹細胞を主体とする（好ましくはゲノム安定と判別された多能性幹細胞からなる）多能性幹細胞培養物（例えばｉＰＳ細胞培養物）を作製することができる。そのため、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法は、再生医療に利用可能なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞培養物の作製に好適に採用できる。また、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法によって対象の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別することにより、高効率且つ高精度にゲノム不安定な多能性幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞）の除去を実現することができる。
　ここで開示される好ましい一態様のゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法は、上記ゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を、細胞選別機（セルソーター）を使用して除去することを特徴とする。
　細胞選別機（セルソーター）を使用することで、多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）を含む培養物中からゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を効率よく除去することができる。そのため、細胞選別機を使用したゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法は、特に、多量の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）を含む培養物からの細胞除去に好適である。
　典型的には、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法によって除去される多能性幹細胞は、染色体異常を有する多能性幹細胞である。染色体異常を有するｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（或いは該幹細胞を分化誘導して得られる細胞、細胞塊、組織等）は生体内に移植された後で腫瘍の原因となる虞があるため、染色体異常を有する多能性幹細胞を除去する上記方法は、再生医療に資するための多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）を準備する方法として好適に利用できる。特に、上記除去される細胞が染色体異常を有するヒト由来のｉＰＳ細胞である上記除去方法は、本発明の好適な一実施形態である。
　また、本発明によると、他の側面として、ヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物を製造する方法であって、該多能性幹細胞の培養過程において、ここで開示されるゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法のいずれかによって、ゲノム不安定な多能性幹細胞を該多能性幹細胞培養物中から除去することを包含する方法が提供される。
　かかる製造方法により製造された多能性幹細胞培養物（典型的にはｉＰＳ細胞培養物若しくはＥＳ細胞培養物）は、上記除去方法によりゲノム不安定な多能性幹細胞が除去された多能性幹細胞培養物であるため、当該培養物中に含まれる実質的に全ての多能性幹細胞がゲノム安定な多能性幹細胞である多能性幹細胞培養物として把握され得る。該多能性幹細胞培養物（典型的には該多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞）は、腫瘍化のリスクが低い再生医療用多能性幹細胞として好適に利用することができる。特にヒト由来のｉＰＳ細胞を含む培養物を製造する上記方法は、医療産業上の利用価値が極めて高いため好ましい一実施形態である。
　また、本発明によると、他の側面として、ここで開示される少なくとも1種のカルレティキュリン発現誘導ペプチドを含む、ゲノム不安定な多能性幹細胞のカルレティキュリン発現量を増大するために用いられるカルレティキュリン発現誘導剤が提供される。
　また、典型的には、上記カルレティキュリン発現誘導剤は、薬学上許容され得る少なくとも１種の担体（例えば上記ペプチドの安定性向上に資する少なくとも１種の基材、或いは生理食塩水や各種の緩衝液等の液状媒体）を含む。
　かかるカルレティキュリン発現誘導剤は、単純な構造（直鎖状のペプチド鎖）の合成ペプチドを有効成分として含むため、例えば、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（典型的には当該幹細胞培養物の培地中）に該カルレティキュリン発現誘導剤を供給するという簡易な処理を行うことによって、ゲノム不安定な多能性幹細胞のカルレティキュリン発現量を増大させることができる。これにより、上記幹細胞におけるカルレティキュリンの発現の程度に基づいて、当該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を高精度且つ高信頼性に判別可能となる。また、化学合成（若しくは生合成）によって容易に人為的に製造され得る合成ペプチドを有効成分として含むため、所望量のカルレティキュリン発現誘導剤を容易に調製することができる。なお、上記カルレティキュリン発現誘導剤は、特にゲノム不安定なヒト由来のｉＰＳ細胞のカルレティキュリンの発現量を増大させるために好適に用いることができる。
図１は、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図２は、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞培養物におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図３は、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞の培養物中に一実施形態に係るカルレティキュリン発現誘導ペプチド（サンプル１）を培地中の濃度が１０μＭとなるように添加して培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図４は、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞に一実施形態に係るカルレティキュリン発現誘導ペプチド（サンプル１）を培地中の濃度が１０μＭとなるように添加して培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図５は図２と同じ画像であり、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞の培養物をカルレティキュリン発現誘導ペプチド無添加で培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図６は図１と同じ画像であり、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞をカルレティキュリン発現誘導ペプチド無添加で培養した後、当該ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真（画像）であり、ＤＡＰＩによる核染色画像と、抗カルレティキュリン抗体を使用した免疫蛍光抗体法で調べた結果を示す蛍光画像とを重ねた（マージした）画像である。 図７は、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒトｉＰＳ細胞の培養物について、蛍光色素（フィコエリトリン、Phycoerythrin）で標識された抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、該蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色の強度をＦＡＣＳを用いて分析した結果を示すヒストグラムである。横軸に蛍光強度を示し、縦軸に細胞数を示す。なお、対照試験区（ネガティブコントロール区）として、蛍光免疫染色を行っていないｉＰＳ細胞（Unstained cells）を、上記Phycoerythrinの蛍光発色強度測定と同様の条件で分析した結果を重ねて示す。 図８は、ゲノム安定なヒトｉＰＳ細胞について、蛍光色素（Phycoerythrin）で標識された抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行い、該蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色の強度をＦＡＣＳを用いて分析した結果を示すヒストグラムである。横軸に蛍光強度を示し、縦軸に細胞数を示す。なお、対照試験区（ネガティブコントロール区）として、蛍光免疫染色を行っていないｉＰＳ細胞（Unstained cells）を、上記Phycoerythrinの蛍光発色強度測定と同様の条件で分析した結果を重ねて示す。
　以下、本発明の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばここで開示される合成ペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成法、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬学的組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をIUPAC-IUBガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。
　また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
　また、本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみ独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の組成物（例えばカルレティキュリン発現誘導剤）中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
　また、本明細書において「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは６０以下、例えば５０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
　また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
　なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
　本明細書において所定のアミノ酸配列に対して「改変アミノ酸配列」とは、当該所定のアミノ酸配列が有する機能（例えば上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドが有するカルレティキュリン発現誘導活性）を損なうことなく、１個又は数個（例えば２個又は３個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加（挿入）されて形成されたアミノ酸配列をいう。例えば、１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が保守的に置換したいわゆる同類置換（conservative amino acid replacement）によって生じた配列（例えば塩基性アミノ酸残基が別の塩基性アミノ酸残基に置換した配列：例えばリジン残基とアルギニン残基との相互置換）、或いは、所定のアミノ酸配列について１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が付加（挿入）した若しくは欠失した配列等は、本明細書でいうところの改変アミノ酸配列に包含される典型例である。従って、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドには、各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基が置換（例えば上記同類置換）、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列であって、同様にカルレティキュリン発現誘導活性を示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドを包含する。
　本明細書において「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胎盤などの胚体外組織を除いた一つの生物体を形成する種々の細胞種へ分化可能な能力（多分化能、多能性）を有し、さらに、未分化状態で自己複製能を有する幹細胞をいう。例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＧ細胞（胚性生殖細胞；embryonic germ cell）が挙げられる。特に「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、分化した細胞（典型的には体細胞、例えば皮膚の線維芽細胞等）を人為的に初期化（リプログラミング）することで多分化能と自己複製能を獲得させた細胞をいう。分化細胞を初期化する方法としては、例えば数種の初期化因子（例えばOct3/4、klf4、c-Myc及びSox2の4種の遺伝子又はOct3/4、Sox2、Nanog及びLin28の４種の遺伝子等）を当該細胞内に導入する方法が挙げられる。なお、上記ｉＰＳ細胞は、上記多能性幹細胞の性質を維持する限り分子生物学的操作（例えば、カルレティキュリン発現を標識するためのマーカー遺伝子の導入、レポーター遺伝子の導入、蛍光タンパク質融合タンパク質発現ベクターの導入等）をされてもよい。
　なお、本明細書においてｉＰＳ細胞の由来は特に限定されないが、特にヒト由来のｉＰＳ細胞は医療産業上の利用価値が高いため本発明の実施対象として特に好ましい。
　本明細書において「ゲノム安定性」、「ゲノム不安定性」とは、広義に解釈される用語であり、典型的には以下に挙げるゲノムの構造的な及び／又は機能的な異常の有無又はその程度を指標として安定か不安定かで区分するために用られ得る用語である。例えば、ＤＮＡ塩基配列の局部的な異常（例えば、塩基置換、点変異、遺伝子重複、遺伝子間のＤＮＡ領域の混ぜ合わせ、又は遺伝子の水平伝播等）、染色体の異常（例えば、部分的な重複、逆位、欠失、転座、切断といった染色体の部分的異常、異数体といった染色体の数的異常、又は多核化等）、或いはエピジェネティックな異常（ＤＮＡメチル化の変化、ヒストン修飾の変化、クロマチン構造の変化、又は非翻訳ＲＮＡの変化等）の有無又はその程度に基づいて、ゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別することが可能であるが、本発明の実施に好適なゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の区分として、染色体異常を指標としてゲノム安定性かゲノム不安定性かを区分することができる。ここで、染色体異常とは、いわゆる「核型異常」を包含してもよい。染色体異常のなかでも特に、異数体、好ましくは重複異常、さらに好ましくは１２番染色体の重複、の有無又はその程度でゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を区分け（評価）してもよい。
　ここで開示されるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞培養物若しくはＥＳ細胞培養物）のゲノム安定性を評価する方法は、対象となるｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を含む培養物を準備することと、該培養物中の多能性幹細胞（例えば、培養物中に含まれる多能性幹細胞集団の全部若しくは一部、又は、個々の多能性幹細胞）のカルレティキュリンの発現量（典型的には対象の多能性幹細胞の細胞膜上のカルレティキュリン存在量）を調べ、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて対象の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別することと、を特徴とする評価方法である。ゲノム不安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞はゲノム安定な多能性幹細胞と比較してカルレティキュリン発現量が顕著に増大しているため、培養物中の多能性幹細胞のカルレティキュリンの発現量を調べることで当該幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別することができる。
　上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法は、上記判別において、カルレティキュリンの発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）をゲノム不安定と判別する。例えば、予めゲノム安定であることが確認されたｉＰＳ細胞（例えば、比較対象の基準例として正常な核型を有するｉＰＳ細胞として一般に入手可能な２０１Ｂ７クローン株等が挙げられる）におけるカルレティキュリン発現量及び／又は予めゲノム不安定な細胞を含むことが確認されたｉＰＳ細胞培養物（例えば、正常な１２番染色体が３倍体であるｉＰＳ細胞として一般に入手可能な２０１Ｂ２クローン株等）におけるカルレティキュリン発現量を比較することで、評価対象のｉＰＳ細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し得るカルレティキュリン発現量のレベルを設定することができる。多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し得るカルレティキュリン発現量のレベルは、カルレティキュリン発現量の測定方法の感度や精度等によって異なるため、採用する測定方法に応じて設定することができる。例えば、予めゲノム安定であることが確認された比較対象である多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量に比べて好ましくは１．２倍以上（例えば１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上、例えば１０倍以上）のカルレティキュリンを発現する多能性幹細胞をゲノム不安定と判別することができる。なお、上記評価対象の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し得るカルレティキュリン発現量のレベルは、由来が同じ多能性幹細胞を用いて設定することが好ましい。
　ここで開示されるｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞におけるカルレティキュリン発現量を調べる方法（測定方法）は、カルレティキュリン発現量の程度が定性的もしくは定量的に把握可能な方法であれば特に限定されない。例えば、カルレティキュリン発現量の程度を直接把握し得る方法として、ウエスタンブロッティング、免疫抗体法（典型的には免疫組織化学法、Immunohistochemistry、IHC、なお「免疫染色法」ともいう）、又はそれらを応用した方法等が挙げられる。また、カルレティキュリン遺伝子の発現状態からカルレティキュリンの発現程度を間接的に把握し得る方法としては、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション、又はそれらを応用した方法等が挙げられる。或いは、対象のｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に分子生物学的手法を用いて予め導入しておいた標識（典型的には導入遺伝子の転写産物或いは翻訳産物等）をマーカー（目印）にカルレティキュリン発現量の程度を把握し得る方法として、例えば、レポーターアッセイ法、蛍光タンパク質融合カルレティキュリンの測定等が挙げられる。なお、上記カルレティキュリン発現量の測定方法はあくまでも例示であり、これに限定されない。上記カルレティキュリン発現量の測定方法は、１つの方法を単独で用いてもよいし、２つ以上の方法を組み合わせて使用してもよい。
　上記多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）のゲノム安定性若しくは不安定性の判別は、カルレティキュリン又はその断片と特異的に反応する抗体（即ち抗カルレティキュリン抗体）を用いた免疫学的手法（例えば、ウエスタンブロッティングや免疫抗体法等）によって好適に実施することができる。抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法は、カルレティキュリン発現量の程度を高特異的且つ高感度に直接的な把握が可能なため好ましい。特に、免疫抗体法（典型的には免疫染色法）は、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の形態を保ったまま（即ち、細胞破砕、細胞溶解をすることなく）当該幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度を調べ得るため、個々の多能性幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度を把握したい場合に特に好適な測定方法である。また、免疫抗体法（典型的には免疫染色法）によると、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の細胞表面（典型的には細胞膜の表面）に存在するカルレティキュリンのみ（即ち、細胞内に恒常的に発現するカルレティキュリンの発現量の影響を受けることなく）を特異的に識別することができるため、上記多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別を高精度に実現することができる。
　なお、免疫学的手法とは、典型的には、抗原（又はその断片）と特異的に反応する抗体とを抗原抗体反応させて免疫複合体を形成し、該抗体を検出（可視化）することで抗原量を把握する方法である。本発明においては、予め何らかの標識をした抗カルレティキュリン抗体を用いる方法（直接法）、又は、抗カルレティキュリン抗体を特異的に認識する標識二次抗体抗を用いる方法（間接法）のどちらの方法も好適に使用できる。間接法は直接法に比べて高感度にカルレティキュリン発現量の程度を把握し得るため特に好ましい。抗カルレティキュリン抗体を検出（可視化）する方法としては、例えば、免疫蛍光抗体法、酵素抗体法、オートラジオグラフィー、金コロイド法等が挙げられる。例えば、免疫蛍光抗体法は、抗カルレティキュリン抗体若しくは二次抗体を予め蛍光色素で標識しておき、抗原抗体反応の後に当該蛍光色素の励起光を当てることで蛍光色素を蛍光発色させ、蛍光顕微鏡等を用いて当該蛍光発色を検出する方法である。免疫蛍光抗体法は、高精度にカルレティキュリン発現量の程度を把握し得るため特に好ましい方法である。なお、本明細書において「抗体」とは、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のどちらも包含し、免疫動物（抗体産生動物、Host、Source）や免疫グロブリンの定常領域の違い（アイソタイプ、クラスともいう）に限定されない。
　典型的には、ｉＰＳ細胞培養物中のｉＰＳ細胞に対して抗カルレティキュリン抗体を抗原抗体反応させ、次いで該抗カルレティキュリン抗体に対する蛍光標識二次抗体を反応させる。その後、該蛍光標識の蛍光発光を蛍光顕微鏡等で検出することにより、ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリン発現量（典型的にはｉＰＳ細胞の細胞表面に存在するカルレティキュリン発現量）を把握することができる。
　或いはまた、対象の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）が生きたままの状態で（即ち、細胞固定の操作をすることなく）該幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度を調べ得る方法は、後述の多能性幹細胞を含む培養物の製造方法の実施に好適である。例えば、免疫抗体法や蛍光タンパク質融合カルレティキュリンの測定を応用することで、生きたままの多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量を調べ得る。
　ここで開示されるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）の培養物を準備する方法は特に限定されず、従来公知の方法を採用することができる。例えば、ＥＳ細胞の培養条件と同様の条件を好適に採用し得る。フィーダー細胞（例えば、ＳＮＬ７６／７細胞、ＳＴＯ細胞、ＭＥＦ細胞等）の有無についても特に限定されないが、多能性幹細胞培養物中（例えばｉＰＳ細胞培養物中）の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現量を調べる観点からは、フィーダー細胞を必要としない培養物を準備することが好ましい。なお、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の接着性向上の観点から、多能性幹細胞を培養する培養容器の底面（典型的には多能性幹細胞の接着面）は接着基質（例えば、マトリゲル、脱落膜由来細胞の細胞外マトリクス、ゼラチン、細胞接着タンパク質等）で処理（コート）しておくことが好ましい。例えば、底面をマトリゲルコートした培養皿中に一般的に市販されているｉＰＳ細胞用培地を注入し、当該培養容皿中に対象のｉＰＳ細胞を播種した後、所定時間培養することで該ｉＰＳ細胞培養物を準備することができる。
　或いはまた、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法は、対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別するより前に、当該幹細胞（典型的には当該幹細胞培養物の培地中）に上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを少なくとも一回供給し、該合成ペプチドを少なくとも一回供給した該幹細胞培養物を所定時間培養した後に上記判別を行うことでより好適に実施できる。
　上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを対象の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）に供給し、所定時間培養することで、ゲノム不安定な多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現量を特に増大させることができる。これにより、ゲノム不安定な多能性幹細胞とゲノム安定な多能性幹細胞とのカルレティキュリン発現量の差を、カルレティキュリン発現誘導ペプチドを添加しない場合と比較してより明確にすることができる。そのため、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別を高精度且つ高い信頼性で実現可能となる。
　なお、上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、ゲノム不安定なヒト由来のｉＰＳ細胞のカルレティキュリン発現量を顕著に増大し得る。そのため、ここで開示されるｉＰＳ細胞のゲノム安定性評価方法は、特にヒト由来のｉＰＳ細胞について好適に実施することができる。
　上記カルレティキュリン発現誘導ペプチドを対象の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）の培養物中に添加した後に当該培養物を培養する時間は、ゲノム不安定な多能性幹細胞においてカルレティキュリンの発現を誘導可能或いはカルレティキュリンの発現量を増大可能な時間であれば、特に限定されない。典型的には数時間から数日間の培養を行う。例えば、２時間以上、好ましくは２４時間以上、より好ましくは４８時間以上の培養がよく、例えば培養開始から３日～５日間、あるいは６日～７日間、あるいは１０日間程度の培養を行うとよい。
　上述のとおり、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
　　　ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
　　　ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
　のうちのいずれか若しくは該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチドである。配列番号１又は配列番号２に示される具体的なアミノ酸配列は、ヒト由来のセントリン２のｓｉＲＮＡを構成するＲＮＡ配列を翻訳して得られるアミノ酸配列（以下「セントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列」ともいう）であることに加え、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞におけるカルレティキュリンの発現を誘導する或いはカルレティキュリンの発現量を増大させることが本発明者によって新たに見出された配列である。
　ここで、セントリンとは、真核生物の中心体に存在し、中心子の構成タンパク質の一つとして中心子の複製や微小管の切断に関与する中心体関連タンパク質であり、セントリン２とは、セントリンファミリー（典型的には、セントリン１、セントリン２、セントリン３等）に属するタンパク質のうちの一つである（非特許文献３参照）。
　また、ヒト由来のセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の典型的な改変アミノ酸配列として、以下のアミノ酸配列：
　　　ＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号３）；および
　　　ＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号４）；
が挙げられる。配列番号３又は配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基（Ｃ）を欠失した配列である。ここに挙げるセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の改変アミノ酸配列もまた、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列として好適に機能する。なお、配列番号３および配列番号４に示した上述の改変アミノ酸配列はあくまでも例示であり、使用可能なセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の改変アミノ酸配列をかかる配列に限定することを意図するものではない。
　或いはまた、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、配列番号１又は配列番号２に示すカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列又はその改変アミノ酸配列のみから成る合成ペプチドであってもよいが、カルレティキュリン発現誘導活性を向上する観点からは、当該カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側もしくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドが好ましい。膜透過性ペプチド配列を有する合成ペプチドであれば、目的の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）に供給した際、細胞内に速やかに導入され得ることによりカルレティキュリン発現誘導活性を向上させることができる。
　上記膜透過性ペプチド配列は、細胞膜及び／又は核膜を通過し得る膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列であれば特に限定なく使用することができる。多くの好適な膜透過性ペプチド配列が知られているが、例えばＮｏＬＳ（核小体局在シグナル、Nucleolar localization signal）に関連するアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）がカルレティキュリン発現誘導ペプチドの膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列として好ましい。例えば、配列番号５に示すＬＩＭキナーゼ２（LIM Kinase 2）に含まれるＮｏＬＳ並びに配列番号６に示すＩＢＶ（トリ伝染性気管支炎ウイルス：avian infectious bronchitis virus）のＮタンパク質（nucleocapsid protein）に含まれるＮｏＬＳのアミノ酸配列が挙げられる。また、他の膜透過性ペプチド配列の例として、配列番号７～９に示すアミノ酸配列およびそれらの改変アミノ酸配列（膜透過性を保持しているものに限られる）が挙げられる。配列番号７は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：Human Immunodeficiency Virus）のＴＡＴに含まれる膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列を示している。配列番号８は、上記ＴＡＴを改変した膜透過性ペプチド配列（ＰＴＤ４）のアミノ酸配列を示している。配列番号９は、ショウジョウバエ（Drosophila）の変異体であるAntennapediaのＡＮＴ関連アミノ酸配列を示している。
　なお、配列表に示した上述の膜透過性ペプチド配列はあくまでも例示であり、使用可能なペプチド配列はこれに限定されない。本発明の実施に使用可能な様々な膜透過性ペプチド配列が本願出願当時に出版されている数々の文献に記載されている。それら膜透過性ペプチド配列のアミノ酸配列は一般的な検索手段によって容易に知ることができる。
　特に、特許文献１にも記載されている配列番号５に示すアミノ酸配列（改変アミノ酸配列を含む）が膜透過性ペプチド配列として好ましい。かかる配列番号５に示す膜透過性ペプチド配列と上記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列（配列番号１若しくは２）又はその改変アミノ酸配列とを組み合わせることにより、高いカルレティキュリン発現誘導活性を示す合成ペプチドを得ることができる。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）；
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
　のうちから選択されるいずれかのアミノ酸配列または該選択されたアミノ酸配列の改変アミノ酸配列を特に好ましく含有する。配列番号１０又は配列番号１１に示すアミノ酸配列は、上記配列番号１又は配列番号２に示すヒト由来のセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列と、上記配列番号５に示すＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ由来のアミノ酸配列とを、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカーを介して組み合わせることにより構築された合計２４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。また、配列番号１２又は配列番号１３に示すアミノ酸配列は、上記配列番号３又は配列番号４に示すヒト由来のセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の典型的な改変アミノ酸配列と、上記配列番号５に示すＬＩＭキナーゼ２のＮｏＬＳ由来のアミノ酸配列とを、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカーを介して組み合わせることにより構築された合計２２アミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドのペプチド鎖（アミノ酸配列）のうちの幾つかは、上述したようなカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と、膜透過性ペプチド配列とを適宜組み合わせることにより構築することができる。カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の何れが相対的にＣ末端側（Ｎ末端側）に配置されてもよい。また、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とは隣接して配置されるのが好ましい。即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間には、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しないか或いは存在していても該残基数が１～３個程度が好ましい。例えば、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列との間にリンカーとして機能する１個又は数個（典型的には２個又は３個）のアミノ酸残基（例えば１個又は数個のグリシン（G）残基）を含むものであり得る。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸残基がアミド化されているものが好ましい。アミノ酸残基（典型的にはペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残基）のカルボキシル基のアミド化により、合成ペプチドの構造安定性（例えばプロテアーゼ耐性）を向上させることができる。
　カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記カルレティキュリン発現誘導活性を失わない限りにおいて、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸配列以外の配列（アミノ酸残基）部分を含み得る。特に限定するものではないが、かかる部分配列としてはカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列部分の３次元形状（典型的には直鎖形状）を維持し得る配列が好ましい。該カルレティキュリン発現誘導ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が１００以下が適当であり、６０以下が望ましく、５０以下が好ましい。例えば３０以下の合成ペプチドが特に好ましい。
　このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易にカルレティキュリン発現誘導ペプチドを提供することができる。なお、ペプチドのコンホメーション（立体構造）については、使用する環境下（生体外若しくは生体内）でカルレティキュリン発現誘導活性を発揮する限りにおいて、特に限定されるものではないが、免疫原（抗原）になり難いという観点から直鎖状又はヘリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。かかる観点から、本発明に適用するカルレティキュリン発現誘導ペプチドとしては、直鎖状であり比較的低分子量（典型的には６０以下（特に３０以下）のアミノ酸残基数）のものが好適である。
　全体のアミノ酸配列に対するカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列の占める割合（即ちペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数に占めるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列を構成するアミノ酸残基数の個数％）は、カルレティキュリン発現誘導活性を失わない限り特に限定されないが、当該割合は概ね６０％以上が望ましく、８０％以上が好ましい。９０％以上が特に好ましい。カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列と膜透過性ペプチド配列とから成る（即ち、これらの配列が全アミノ酸配列の１００％を占める）ペプチドは好適な一形態である。
　なお、本発明のカルレティキュリン発現誘導ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、カルレティキュリン発現誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部又は全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、一般的な化学合成法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法又は液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）或いはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、市販のペプチド合成機（例えば、Intavis AG社、Protein Technologies社等から入手可能である。）を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
　或いは、遺伝子工学的手法に基づいてカルレティキュリン発現誘導ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望するカルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
　一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のカルレティキュリン発現誘導ペプチドを得ることができる。
　なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
　例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的のカルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクター（例えばノバジェン社から提供されているｐＥＴシリーズ及びアマシャムバイオサイエンス社から提供されているｐＧＥＸシリーズのようなＧＳＴ(Glutathione S-transferase)融合タンパク質発現用ベクター）の好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出し、精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計したカルレティキュリン発現誘導ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。また、必要に応じて適当な方法によってリフォールディングする。このような従来公知の融合タンパク質発現システム（例えばアマシャムバイオサイエンス社により提供されるＧＳＴ／Ｈｉｓシステムを利用し得る。）を用いることによって、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドを製造することができる。
　或いは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ちカルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ（生体外、in vitro）合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の東洋紡績（株）から入手可能なPROTEIOS（商標）Wheat germ cell-free protein synthesis kit）が市販されている。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、カルレティキュリン発現誘導ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
　こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、カルレティキュリン発現誘導ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドは、上記多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現誘導活性を損なわない限りにおいて塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、上記多能性幹細胞におけるカルレティキュリン発現誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤は、有効成分であるカルレティキュリン発現誘導ペプチドのカルレティキュリン発現誘導活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。カルレティキュリン発現誘導剤の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、カルレティキュリン発現誘導剤に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
　カルレティキュリン発現誘導剤の形態に関して特に限定はない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ、即ちリン酸緩衝生理食塩水）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
　なお、カルレティキュリン発現誘導ペプチド（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本発明を特徴づけるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修，Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
　ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤（即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド）は、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。
　例えば、インビトロで培養（継代）している多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）に対し、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤（即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド）の適当量を、培養過程のいずれかの段階（好ましくはゲノム安定性の評価を行うより前の段階）で培地に添加するとよい。添加量及び添加回数は、多能性幹細胞の種類や状態、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。典型的には、培地中のペプチド濃度が概ね０．１μＭ～１００μＭの範囲内、好ましくは０．５μＭ～２０μＭ（例えば１μＭ～１０μＭ）の範囲内となるように、１～複数回添加する（例えば培養開始時並びに細胞の継代時や培地交換時に合わせて追加添加する）ことが好ましい。
　また、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導剤（即ち、カルレティキュリン発現誘導ペプチド）は、ゲノム安定性の評価に利用可能な多能性幹細胞の他の特徴（即ち、カルレティキュリン発現量ではない多能性幹細胞の特徴）を増強し得る他の化合物及び／又は該他の特徴を増強する方法と併用することも可能である。
　ここで開示される多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法は、上述の多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法によって対象の多能性幹細胞培養物中に含まれるｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別し、該判別方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を当該幹細胞培養物中から除去することを特徴とする。
　ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から除去することで、ゲノム安定な多能性幹細胞を主体とする多能性幹細胞培養物（例えばｉＰＳ細胞培養物）を製造することができる。例えば、培養物中に含まれる多能性幹細胞の大部分（例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上）をゲノム安定な多能性幹細胞が占める多能性幹細胞培養物を製造することができる。培養物中に含まれる実質的に全ての多能性幹細胞がゲノム安定な多能性幹細胞からなる（典型的には、ゲノム安定な多能性幹細胞が実質的に１００％を占める）多能性幹細胞培養物は、好適な一態様である。特に、ヒト由来のｉＰＳ細胞は医療産業上の利用価値が高いため、上記対象の多能性幹細胞の好適例である。
　また、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法を実施することで得られるｉＰＳ細胞培養物等の多能性幹細胞培養物（即ち、対象の多能性幹細胞培養物中からゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を除去した後の当該幹細胞培養物）において、該培養物中に含まれる実質的に全ての多能性幹細胞が生細胞である（例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）多能性幹細胞培養物は、産業上の利用価値が高い。特に、上記培養物中に含まれる多能性幹細胞が生細胞である（即ち、生細胞が実質的に１００％を占める）多能性幹細胞培養物は特に好適な一態様である。
　上述の多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞中）から除去するために利用可能な多能性幹細胞の特徴（マーカー、標識、目印）としては、例えば、カルレティキュリンの発現状態、カルレティキュリン遺伝子の発現状態、カルレティキュリンの発現と相関性の高いタンパク質若しくはＲＮＡの発現状態、分子生物学的手法により多能性幹細胞に予め導入しておいた導入遺伝子の発現状態、染色体の状態（例えば、染色体異常、多核化等）、ゲノム不安定な細胞において発現量が変化することが知られているタンパク質若しくはＲＮＡの発現状態、又はゲノム不安定な多能性幹細胞特異的な生理的性質（増殖性、接着性、遊走性、細胞分裂の特徴、栄養要求性等）等が挙げられる。なお、上記多能性幹細胞の特徴はあくまでも例示であり、上記評価方法によりゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を対象の多能性幹細胞培養物中から除去するために利用可能な多能性幹細胞の特徴であれば、特にこれに限定されない。また、上記多能性幹細胞の特徴は、１つの特徴を単独で利用することもできるし、２つ以上の特徴を組み合わせて利用することもできる。
　対象の多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリンの発現状態は、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法における多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別基準として用いた多能性幹細胞の特徴と同じ特徴であるため、上記評価方法によってゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（例えばｉＰＳ細胞培養物中）から正確に除去する観点で好適に利用することができる。特に、多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）の細胞表面に存在するカルレティキュリンの存在状態は、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を精度よく除去できるため、好ましい。
　また、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法で多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を把握するために用いた目印（マーカー、標識、特徴）、例えばカルレティキュリン発現量を測定するために用いた抗体の標識等、を当該除去方法においてもそのまま利用することができる。ゲノム安定性評価方法で用いた目印をそのまま利用すれば、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の除去に必要な操作を簡便化することができるため好ましい。
　或いはまた、カルレティキュリンの発現状態は、抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法（抗原抗体反応）による特異性の高い識別が可能であるため、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を高精度かつ高信頼性に除去する観点で特に好適に利用することができる。典型的には、抗カルレティキュリン抗体若しくは抗カルレティキュリン抗体を特異的に認識する二次抗体に予め何らかの標識をしておき、該標識を目印として、対象の多能性幹細胞培養物中（例えばｉＰＳ細胞培養物中）からゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を除去することができる。
　上記抗体の標識としては、例えば、蛍光色素、マグネティックビーズ、ＧＳＴタグやＨｉｓタグといった各種のアフィニティータグ等を利用することができる。典型的には、蛍光標識した抗カルレティキュリン抗体若しくは蛍光標識した二次抗体を用いた免疫蛍光抗体法によりカルレティキュリンを蛍光標識し、該蛍光標識を目印とすることで、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から高精度かつ高効率に除去することができる。
　或いはまた、予め分子生物学的手法により導入しておいた導入遺伝子の転写産物或いは翻訳産物を目印としても、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から効率よく除去することができる。例えば、蛍光タンパク質融合カルレティキュリンベクターを対象のｉＰＳ細胞に導入しておき、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞において発現量が増加した蛍光タンパク質融合カルレティキュリンの蛍光発色を目印とすることで、対象のｉＰＳ細胞培養物中からゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞を除去することができる。
　上記ゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養液から除去する方法は、上記除去に用いる多能性幹細胞の特徴（マーカー、標識、目印）が所定レベルを上回った多能性幹細胞（例えばｉＰＳ細胞）を除去することで実現することができる。例えば、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法でゲノム安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞における上記特徴のレベルと、ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞における上記特徴のレベルとを比較することで、上記除去に利用可能な多能性幹細胞の特徴の所定レベルを設定することができる。なお、当該所定レベルは、採用する多能性幹細胞の特徴、該特徴を調べる（測定する）方法、該測定方法の感度や精度によって異なるため、適宜設定する必要がある。
　例えば、カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）から除去することで、ゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を除去することができる。ゲノム不安定な多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から除去する際に利用可能なカルレティキュリンの発現レベルは、ゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞の除去が可能であれば特に限定されない。典型的には、ゲノム安定性評価方法におけるカルレティキュリンの発現レベルと同程度の発現レベルを利用することができる。例えば、ゲノム安定なｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞（比較対象）におけるカルレティキュリン発現量に比べて好ましくは１．２倍以上（例えば１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上、例えば１０倍以上）のカルレティキュリン発現量をゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する基準とすることができる。なお、ゲノム不安定な多能性幹細胞を評価対象の多能性幹細胞培養物中から除去する際に利用可能なカルレティキュリンの発現レベルは、由来が同じ多能性幹細胞を用いて設定することが好ましい。
　ここで開示されるゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）から除去する方法は、特に限定されず、種々の細胞選別方法を利用することができる。例えば、蛍光標識式細胞分取器（ＦＡＣＳ、fluorescence-activated cell sorter）を用いた細胞選別、磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ（登録商標））を用いた細胞分別、顕微鏡下での細胞選別、光ピンセットを利用した細胞選別、各種カラムを用いた細胞選別、免疫的手法（抗原抗体反応）を利用した細胞選別、細胞染色を応用した細胞選別、特定導入遺伝子による標識を利用した細胞選別、細胞の生理的性質（増殖性、接着性、遊走性、細胞分裂の特徴、栄養要求性等）を利用した細胞選別などが挙げられる。特に、抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫学的手法を利用した細胞選別方法は、高特異的かつ高い信頼性をもって細胞選別を行い得るため、特に好ましい。また、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳおよび各種カラムを用いた細胞分別方法は、高効率に細胞を選別可能であるため好ましい。
　なお、上記ゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の除去は、上記対象の多能性幹細胞培養物中の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別と同時に行ってもよい。上記判別と上記除去を同時に行うと、ゲノム不安定な多能性幹細胞の除去に必要な操作を簡便化することができるため好ましい。
　また、ここで開示されるゲノム不安定であると判別された多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中（典型的にはｉＰＳ細胞培養物中若しくはＥＳ細胞培養物中）から除去するために用いられる細胞選別機は、特に限定されず、種々の細胞選別機を利用することができる。例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ（登録商標）、光ピンセットを応用した細胞選別装置、各種カラムを応用した細胞選別装置が挙げられる。ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ並びに光ピンセットを応用した細胞選別装置は、自動化により高効率にゲノム不安定であると判別されたｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を対象の多能性幹細胞培養物中から除去することができるため、本発明の実施に好適に用いることができる。特にＦＡＣＳおよびＭＡＣＳは、上記カルレティキュリン発現量に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性の判別とゲノム不安定な多能性幹細胞の除去とを同時に行い得るため、好ましい。
　例えば、ＦＡＣＳを使用したゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去方法としては、以下の方法が挙げられる。対象のｉＰＳ細胞培養物中のｉＰＳ細胞に対して抗カルレティキュリン抗体を抗原抗体反応させ、次いで該抗カルレティキュリン抗体に対する蛍光標識二次抗体を反応させる。その後、該蛍光標識の蛍光発光をＦＡＣＳを用いて分析し、蛍光発光の強度が所定レベルを上回ったｉＰＳ細胞を対象のｉＰＳ細胞培養物中から除去することで、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞を除去することができる。上記蛍光発光の強度が所定レベルを上回ったｉＰＳ細胞とは、典型的には、予めゲノム安定であることが確認されたｉＰＳ細胞（例えば上記２０１Ｂ７株）よりも蛍光強度が強い細胞、若しくは、予めゲノム不安定な細胞を含むことが確認されたｉＰＳ細胞（例えば上記２０１Ｂ２株）培養物中のゲノム不安定な細胞の蛍光強度と同程度もしくはそれ以上の蛍光強度の細胞である。
　なお、上記ゲノム不安定な多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）の除去方法で除去される多能性幹細胞の典型例としては、染色体異常及び／又は多核化を有する多能性幹細胞が挙げられる。上記多能性幹細胞（該多能性幹細胞を分化誘導して得られる細胞、細胞塊、組織等を含む）は、生体内に移植された後で腫瘍の原因となる虞があるため、再生医療目的の多能性幹細胞培養物中からの除去が特に望まれるゲノム不安定なｉＰＳ細胞である。特に染色体異常及び／又は多核化を有するヒト由来のｉＰＳ細胞の除去は、本発明の好適な一実施形態である。
　以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
　以下の実施例においては、多能性幹細胞の例としてｉＰＳ細胞を用いた。具体的な供試細胞としては、ゲノム安定な（具体的には染色体異常のない）ヒト由来のｉＰＳ細胞株（クローン名：２０１Ｂ７、以下単に２０１Ｂ７ともいう）と、ゲノム不安定な（具体的には、１２番染色体が３倍体（トリソミー）である）細胞を含むヒト由来のｉＰＳ細胞株（クローン名：２０１Ｂ２、以下単に２０１Ｂ２ともいう）とを用いた。２０１Ｂ７と２０１Ｂ２はどちらも同じヒト線維芽細胞から樹立されたｉＰＳ細胞のクローンである（出典：Takahashi K et al., Cell, 131, 861-872(2007)）。なお、上記ｉＰＳ細胞は、京都大学ｉＰＳ細胞研究所から供与されたものを使用した。また、上記ｉＰＳ細胞の継代培養を行う際、フィーダー細胞としてBaylor College of Medicineよりライセンス供与されたマウス胎児線維芽細胞（細胞株：ＳＮＬ７６／７）を使用した。
　＜実施例１：ｉＰＳ細胞培養物の準備（ｉＰＳ細胞の継代維持）＞
　以下の方法で上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を継代維持することで、ｉＰＳ細胞の培養物を準備した。詳細は以下のとおりである。
　先ず、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を播種するより１～４日前に、マイトマイシンＣ処理して不活化したＳＮＬ７６／７細胞をゼラチンコートした培養容器（直径１０ｃｍの培養ディッシュ）に播種した。当該ＳＮＬ７６／７細胞は、５％ＣＯ２、３７℃条件下でｉＰＳ細胞を播種する直前まで培養した。そして、ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に播種する直前に該フィーダー細胞をＰＢＳ（－）（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、４ｎｇ/ｍＬの組み換えｂＦＧＦ（Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor：和光純薬社製）を含む霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地（Primate ES Cell Medium：ReproCELL社製、以下ＥＳ培地とも呼ぶ）に交換することによって、フィーダー細胞を作製した。
　次に、各ｉＰＳ細胞をそれぞれＣＴＫ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼIV（Life Technologies社製品）、１ｍＭの塩化カルシウム、２０％のＫＳＲ（knockout serum replacement）を含む０．２５％トリプシン溶液）を用いて、ｉＰＳ細胞のコロニー辺縁部が剥離する程度に剥離処理した。ＣＴＫ溶液をＰＢＳ（－）で洗浄除去し、ＥＳ培地を添加した後、セルスクレーパーを用いてｉＰＳ細胞コロニーを完全に剥離した。１５ｍＬ容チューブ中にｉＰＳ細胞コロニーが懸濁した培養容器中のＥＳＣ培地を移し、さらに、培養容器に残ったｉＰＳ細胞コロニーをＥＳＣ培地で洗い込んで該１５ｍＬ容チューブに回収した。上記１５ｍＬ容チューブを５分間静置してｉＰＳ細胞コロニーを沈殿させ、上澄みを取り除いた後、新鮮なＥＳ培地中にピペッティングにてｉＰＳ細胞コロニーを分散懸濁し、ｉＰＳ細胞懸濁液を用意した。
　このようにして得られたｉＰＳ細胞の懸濁物の適量（例えば、同容量の培養容器を用いて継代培養する場合は細胞懸濁液の全量の１／３～１／８量程度）を上記のとおり作製しておいた培養容器中のフィーダー細胞上に播種した。そして培養容器をインキュベータに入れ、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養した。１～２日毎に培地交換を行い、ｉＰＳ細胞が培養容器底面の８０～９０％を占める状態（即ち、８０～９０％コンフルエント）になるまで培養を継続した。上記８０～９０％コンフルエントになったｉＰＳ細胞を上記の方法で継代培養することを繰り返した。このようにして、ｉＰＳ細胞の培養物を準備した。
　＜実施例２：ｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリン発現量の評価試験＞
　ゲノム安定なｉＰＳ細胞とゲノム不安定なｉＰＳ細胞について、カルレティキュリンの発現を調べた。供試細胞として、上記２種のｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
　実施例１に記載の方法で準備した各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を、それぞれ上記継代培養と同様の方法で１５ｍＬ容チューブに回収し、５分間静置した。その後、上澄み液を除去し、新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（STEMCELL Technologies 社製）中にピペッティングにてｉＰＳ細胞コロニーを分散懸濁させた。そして、該ｉＰＳ細胞懸濁液を、マトリゲルコートした８穴（ウェル）スライド中に、１ウェルあたり凡そ１×１０４個の細胞密度となるように播種した。そして培養容器をインキュベータに入れ、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩培養を行った。その一晩培養後、培地を新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に交換し、同条件でさらに５日間培養した。上記５日間の培養期間中は毎日培地交換を行った。
　上記培養終了後、以下の免疫蛍光抗体法（蛍光免疫染色ともいう）により、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２及び２０１Ｂ７）におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた。
　具体的には、まず、各ｉＰＳ細胞の培養容器中の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。次いで、メタノール１容量とアセトン１容量とを混和した溶液（メタノール／アセトン＝１：１溶液）を添加し、氷上に１５分静置してｉＰＳ細胞を固定した。その後、メタノール／アセトン＝１：１溶液を除去し、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ（－））を添加して室温で１時間のブロッキングを行った。所定時間経過後、３％のＢＳＡ含有ＰＢＳ（－）を除去し、ＰＢＳ（－）にて洗浄した。
　そして、一次抗体として抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab22683、Lot No. GR56669-4）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（－）（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（－））で最終濃度：４×１０－３ｍｇ／ｍＬに調製した一次抗体希釈液を上記ｉＰＳ細胞の培養容器中に添加し、４℃で一晩若しくは室温で２時間静置した。かかる抗原抗体反応の所定時間経過後、一次抗体希釈液を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。次いで、二次抗体として蛍光色素（Alexa（登録商標）４８８）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ：Life Technologies社製品、A11001）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（－）で最終濃度：１０×１０－３ｍｇ／ｍＬに調製した二次抗体希釈液を添加し、室温で２時間静置した。上記所定時間経過後、二次抗体希釈液を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄した。その後、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）含有封入液（Life Technologies社製）とカバーガラスを用いて封入を行い、共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った。
　結果を図１又は図２に示す。これらの図面は、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７又は２０１Ｂ２）におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。図１は２０１Ｂ７の結果を示し、図２には２０１Ｂ２の結果を示す。
　図２に示すように、２０１Ｂ２の蛍光免疫顕微鏡写真では、図１の２０１Ｂ７の蛍光顕微鏡写真と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識の強い発色を確認した。即ち、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２）は、ゲノム安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）と比較してカルレティキュリンの発現量が顕著に増大していることが認められた。なお、２０１Ｂ７において確認されるカルレティキュリンを検出する蛍光標識の弱い発色は、細胞内に恒常的に発現しているカルレティキュリンを検出したものと考察した。また、図１中にカルレティキュリンを検出する蛍光標識が強く発色している細胞を幾つか確認した。詳細なデータは示していないが、当該細胞はゲノム不安定なｉＰＳ細胞であったため、継代培養によってゲノムが不安定となったｉＰＳ細胞であると考察した。
　このことは、対象の多能性幹細胞の培養物中の多能性幹細胞についてカルレティキュリン発現量を調べ、該カルレティキュリン発現量の程度に基づいて該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を判別できることを示している。また、上記判別には免疫学的手法が好適に使用できることも示している。
＜実施例３：ペプチド合成＞
　配列番号１０～１３のアミノ酸配列から成る合成ペプチドを後述のペプチド合成機を用いて製造した。なお、以下の説明では、当該合成ペプチドを配列番号の順番に対応してサンプル１～４と呼称する。表１には、これら合成ペプチドのアミノ酸配列等の情報を列挙している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、サンプル１～４に係るペプチドは、ペプチド鎖のＮ末端側にＬＩＭキナーゼ２由来のアミノ酸配列（配列番号５）を有し、そのＣ末端側に、２個のグリシン（Ｇ）残基から成るリンカー領域を介してカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列（配列番号１～４）を有している。
　サンプル１又はサンプル２に係るペプチド（配列番号１０又は１１）は、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列として配列番号１又は２に示すセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列をそれぞれ有する合計２４アミノ酸残基から成るペプチドである。
　サンプル３又はサンプル４に係るペプチド（配列番号１２又は１３）は、カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列として配列番号３又は４に示すセントリン２ｓｉＲＮＡ関連配列の典型的な改変配列をそれぞれ有する合計２２アミノ酸残基から成るペプチドである。
　なお、上記合成ペプチドはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）がアミド化（－ＣＯＮＨ２）されている、直鎖状のペプチドである。上記合成ペプチドは市販のペプチド合成機（Intavis AG社製品）を用いてマニュアルどおりに固相合成法（Ｆｍｏｃ法）を実施して合成した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本発明を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
　合成したサンプル１～４に係るペプチドは、ＰＢＳ（-）に溶かし、ペプチドストック液を調製した。
＜実施例４：合成ペプチドのカルレティキュリン発現誘導活性評価＞
　上記実施例３で得られたサンプル１～４に係るペプチドについて、カルレティキュリン発現誘導活性を調べた。供試細胞として、上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を用いた。評価試験の詳細は以下のとおりである。
　実施例２と同様にして、各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を、マトリゲルコートした８穴（ウェル）スライド中に１ウェルあたり凡そ１×１０４個となるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一晩培養を行った。その一晩培養後、培地をペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１～４に係るペプチドを含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に交換し、５日間培養した。上記５日間の培養期間中は、毎日ペプチド濃度１０μＭとなる量のサンプル１～４に係るペプチドを含有する含有ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地に培地交換をした。なお、比較対象の観点から、コントロール区として各ｉＰＳ細胞についてペプチド無添加区を設けたが、かかるペプチド無添加区の条件は実施例２と同じものである。
　上記培養終了後、実施例２と同様にして、各試験区におけるカルレティキュリンの発現を、抗カルレティキュリン抗体を用いた免疫蛍光抗体法により調べた。
　共焦点レーザー顕微鏡による蛍光観察を行った結果を図３～図６に示す。図１又は図２と同様に、これらの図面は各試験区におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた蛍光顕微鏡写真であり、上記免疫蛍光抗体法でｉＰＳ細胞におけるカルレティキュリンの発現状態を調べた結果を示す蛍光画像とＤＡＰＩによる核染色画像とを重ねた（マージした）画像である。図３には２０１Ｂ２におけるサンプル１添加区の結果を示し、図４には２０１Ｂ７におけるサンプル１添加区の結果を示す。また、図５及び図６は、それぞれ図２及び図１と同じであり、２０１Ｂ２及び２０１Ｂ７におけるペプチド無添加区の結果である。
　上記評価試験の結果、サンプル１に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現誘導ペプチド）を添加した２０１Ｂ２（図３）は、該細胞のペプチド無添加区（図５）と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識の強い発色が認められた。即ち、サンプル１に係る合成ペプチドは、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞においてカルレティキュリンの発現量を顕著に増大させることが認められた。また、ここには図示していないが、サンプル２～４に係る合成ペプチドもまた、サンプル１と同様に２０１Ｂ２におけるカルレティキュリンの発現量を顕著に増大させることが確認された。
　一方、２０１Ｂ７にサンプル１に係る合成ペプチドを添加して培養した場合（図４）は、当該細胞のペプチド無添加区（図６）と比較してカルレティキュリンを検出する蛍光標識の蛍光発色はほとんど増大しないことが確認された。即ち、ペプチド無添加区における２０１Ｂ７と２０１Ｂ２とのカルレティキュリン発現量を比較するよりも、サンプル１添加区における２０１Ｂ７と２０１Ｂ２とのカルレティキュリン発現量を比較した方が、ゲノム安定性の異なるｉＰＳ細胞間のカルレティキュリン発現量の差を明確に把握することができた。また、ここには図示していないが、サンプル２～４に係る合成ペプチドもまた、サンプル１と同様に２０１Ｂ７におけるカルレティキュリンの発現量をほとんど増大させず、当該ペプチドを対象のｉＰＳ細胞培養物に添加して所定時間培養することでゲノム安定性の異なるｉＰＳ細胞間のカルレティキュリン発現量の差を明確にし得ることが確認された。
　これらのことは、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）がゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）のカルレティキュリン発現量を顕著に増加させ得るペプチド（組成物）であることを示している。さらに、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）を対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）に添加することで、多能性幹細胞のゲノム安定性の違いに起因するカルレティキュリン発現量の違いを増強し、より明確とし得ることも示している。以上より、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ち該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）を対象の多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）に添加することで、該幹細胞におけるカルレティキュリン発現量の程度に基づいて該幹細胞のゲノム安定性若しくはゲノム不安定性を高感度かつ高精度に判別できることが示された。
＜実施例５：ｉＰＳ細胞培養物中からのゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去試験＞
　上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を供試細胞として用いて、該ｉＰＳ細胞の培養物中からゲノム不安定なｉＰＳ細胞を除去し得るか試験した。詳細は以下のとおりである。
　まず、ｉＰＳ細胞培養物を以下のとおりに準備した。実施例１に記載の方法で準備した各ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７及び２０１Ｂ２）を、予めＧｅｌＴｒｅｘ（Life Technologies社製品）でコートした直径１０ｍｍの培養皿（１０ｍｍディッシュ）中に、１ウェルあたり凡そ１×１０6個の細胞密度となるように播種した（即ち、フィーダー細胞フリー）。培地としては、Essential 8（登録商標）培地（Life Technologies社製品）を使用した。そして培養容器をインキュベータに入れ、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で５日間培養を行った。上記５日間の培養期間中は毎日培地交換を行った。
　上記培養終了後、各ｉＰＳ細胞に発現するカルレティキュリンを蛍光標識し、該カルレティキュリンを検出する蛍光標識の蛍光発色強度を指標とし、ＦＡＣＳを用いて各ｉＰＳ細胞の培養物中からゲノム不安定な細胞を除去した。具体的な試験方法は、以下のとおりである。
　まず、上記５日間の培養終了後の各ｉＰＳ細胞をROCK(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase/Rho結合キナーゼ)阻害剤で処理した。具体的には、上記５日間の培養終了後の各ｉＰＳ細胞の培地中に、ROCK阻害剤であるY-27632を培地中の濃度が１０μＭとなるように添加し、その後５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ内に１時間静置した。かかるROCK阻害剤存在下での培養（ROCK阻害剤での処理）が終了した各ｉＰＳ細胞について、培養容器中の培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。
　次に、上記ROCK阻害剤処理をした各ｉＰＳ細胞を所定の試験管にそれぞれ回収した。具体的には、まず、各ｉＰＳ細胞について、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（－）（以下、「ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）」ともいう）を各培養容器内に３ｍＬずつ添加し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ内に１５分間静置した。次に、培養容器中のＥＤＴＡ／ＰＢＳ（－）を除去し、各培養容器内に４ｍＬのＰＢＳ（－）を添加し、ピペッティングした。かかるピペッティングにより、培養容器からｉＰＳを剥離し、上記ＰＢＳ（－）内にｉＰＳ細胞を分散させた。そして、上記ｉＰＳ細胞が分散した状態のＰＢＳ（－）を１５ｍＬ容チューブに回収し、該１５ｍＬ容チューブ内にさらに４ｍＬの霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地（Primate ES Cell Medium：ReproCELL社製）を添加した。かかる各ｉＰＳを回収した１５ｍＬ容チューブを１２０×ｇ（ここで、「×ｇ」は遠心力を示しており、地球の重力加速度に対する相対遠心加速度を意味する。例えば１２０×ｇは地球の重力加速度の１２０倍の相対加速度（遠心力）である。以下同じ。）で５分間の遠心処理を行い、上清（ＰＢＳ（－）および霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培地）を除去し、２％のＦＢＳを含むＰＢＳ（以下、該ＦＢＳ含有ＰＢＳを「インキュベーションバッファー」ともよぶ）で１回洗浄（遠心処理条件：１２０×ｇ、５分間）した。そして、各ｉＰＳ細胞を１０μＭのY-27632を含むインキュベーションバッファー（以下、「Y-27632（１０μＭ）含有インキュベーションバッファー」ともいう）中に分散し、細胞密度が凡そ１×１０６細胞／１００μＬの細胞分散液を調整した。そして、かかるｉＰＳ細胞分散液のうちの一部を、それぞれ別に準備した１．５ｍＬチューブに分注し、以下の試験に用いた。
　次に、以下の蛍光免疫染色（免疫蛍光抗体法）により、各試験区のｉＰＳ細胞の細胞表面に存在するカルレティキュリンを蛍光標識した。
　抗カルレティキュリン抗体として、Phycoerythrin（以下、かかる蛍光色素を「ＰＥ」ともいう）で標識した抗体（即ち、蛍光ＰＥ標識抗体）である、抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]－Phycoerythrin抗体（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab83220、Lot No. GR177933-2）を用いた。また、上記抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]－Phycoerythrin抗体のアイソタイプコントロールとして、蛍光ＰＥ標識抗体である、Mouse IgG1(PE)-Isotype control（マウス由来、Abcam社製、Cat No. ab81200、Lot No. GR183088-1）を用いた。かかる抗カルレティキュリン抗体（或いは上記アイソタイプコントロール）をY-27632（１０μＭ）含有インキュベーションバッファーで最終濃度：１０μｇ／ｍＬに調製した抗体希釈液を各試験管に添加し、４℃の暗所に１．５時間静置した。かかる所定時間の抗原抗体反応を行った後、１３０×ｇで５分間の遠心処理を行い、抗体希釈液を除去し、各ｉＰＳ細胞を１ｍＬのインキュベーションバッファーで２回洗浄（遠心処理条件：１３０×ｇ、５分間）した。次いで、各ｉＰＳ細胞を３００μＬのOn-Chip Sample Buffer（オンチップバイオテクノロジーズ社製）で１回洗浄（遠心処理条件：２６０×ｇ、５分間）した。そして、各ｉＰＳ細胞を、On-Chip Sample Buffer中に分散し、細胞密度が少なくとも５×１０５細胞／１００μＬ以上の細胞分散液を調整した。
　上述のとおり、上記の蛍光免疫染色では、細胞の固定および透過処理を行わなかった。即ち、抗カルレティキュリン抗体によって、細胞表面のカルレティキュリンを特異的に蛍光免疫染色した。
　次に、上記蛍光免疫染色を行った各試験区のｉＰＳ細胞について、細胞表面におけるカルレティキュリンの存在量をＦＡＣＳを用いて分析し、該分析結果に基づいてゲノム不安定なｉＰＳ細胞を選別した。即ち、上記カルレティキュリンを検出する蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色（励起波長：４８８ｎｍ、最大蛍光波長：５７５ｎｍ）の強度を分析し、該蛍光標識の蛍光発色強度に基づいてｉＰＳ細胞の選別(ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去)を行った。なお、ＦＡＣＳとしては、オンチップバイオテクノロジーズ社製のOn-Chip Sortを用いた。
　上記抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行った各試験区(抗カルレティキュリン抗体染色区)のｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２又は２０１Ｂ７）について、上記カルレティキュリンを検出する蛍光色素（Phycoerythrin）の蛍光発色（励起波長：４８８ｎｍ、最大蛍光波長：５７５ｎｍ）の強度をＦＡＣＳを用いて分析（測定）した結果を、図７（２０１Ｂ２の結果）および図８（２０１Ｂ７の結果）に示す。図７および図８では、かかる試験区(抗カルレティキュリン抗体染色区)の結果を、「PE-Anti-Calreticulin antibody-stained cells」として示す。これらの図面は、各細胞の蛍光強度を示すヒストグラムであり、横軸に蛍光強度を示し、縦軸に細胞数を示す。
　また、対照試験区（ネガティブコントロール区）として、蛍光免疫染色を行っていない各ｉＰＳ細胞（Unstained cells）を、上記Phycoerythrinの蛍光強度測定と同様の条件で分析した。かかるUnstained cellsの分析結果を、上記抗カルレティキュリン抗体を用いて蛍光免疫染色を行った試験区の蛍光強度を示すヒストグラム（図７および図８）に重ねて示す。図７および図８中では、かかる試験区(ネガティブコントロール区)の結果を、「Unstained cells (Negative control)」として示す。
　上記ネガティブコントロール区において確認された蛍光強度ヒストグラムのピークは、該細胞の自家蛍光を検出したものと推察される。ここでは詳細なデータは示していないが、かかるネガティブコントロール区における蛍光強度ヒストグラムと、上記アイソタイプコントロールを用いて蛍光免疫染色を行った試験区の蛍光強度ヒストグラムとを比較したところ、２０１Ｂ２および２０１Ｂ７のいずれのｉＰＳ細胞においても、ヒストグラムのピークがほぼ同じであることを確認した。即ち、本試験で用いた抗カルレティキュリン抗体（抗カルレティキュリンモノクローナル[ＦＭＣ７５]－Phycoerythrin抗体）は、ｉＰＳ細胞に対する非特異的な抗原抗体反応が極めて少ないことを確認した。
　図７に示すように、ゲノム不安定な細胞を含むｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２）の培養物について、抗カルレティキュリン抗体染色区の蛍光強度ヒストグラムと、該細胞のネガティブコントロール区の蛍光強度ヒストグラムとを比較すると、上記抗カルレティキュリン抗体染色区の蛍光発色強度ヒストグラムのピークトップの右側（即ち、高蛍光強度側）が、ネガティブコントロール区の蛍光強度ヒストグラムで確認されるピークよりもなだらかであり、位相がずれていることを確認した。即ち、抗カルレティキュリン抗体染色区の細胞中には、ネガティブコントロール区の細胞と比較して、蛍光強度が強い細胞集団が存在することを確認した。かかる蛍光強度の強い細胞集団は、カルレティキュリンを細胞表面に多く発現している細胞集団である。本試験に用いたＦＡＣＳに搭載されるセルソータの機能を使用して、抗カルレティキュリン抗体染色区にかかる細胞中から上記ネガティブコントロール区の細胞よりも蛍光強度が強い細胞集団を選別することで、上記ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２）の細胞培養物からゲノム不安定な細胞を除去することができる。
　一方で、図８に示すように、ゲノム安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、抗カルレティキュリン抗体染色区の蛍光発色強度ヒストグラムが、該細胞のネガティブコントロール区において確認された蛍光強度ヒストグラムと比較して、ピーク位置およびピーク形状がほぼ同一であった。即ち、上記ゲノム安定なｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）の細胞表面でのカルレティキュリンの発現量は極めて低いことを確認した。
　以上の結果より、ｉＰＳ細胞培養物中の各ｉＰＳ細胞（典型的には細胞表面）におけるカルレティキュリン発現量を調べ、該カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回ったｉＰＳ細胞をゲノム不安定性であると判別できることを確認した。また、ｉＰＳ細胞のカルレティキュリンの発現量の程度に基づいて、対象のｉＰＳ細胞培養物中からゲノム不安定なｉＰＳ細胞を除去し得ることを確認した。上記ｉＰＳ細胞のゲノム安定性の評価とゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去は、同一の標識（典型的には抗体の蛍光標識）を目印として同時に行うことができた。
　なお、ここでは詳細なデータは示していないが、上記カルレティキュリンの発現量の程度を調べるより前にカルレティキュリン発現誘導ペプチド（即ちペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤）を該ｉＰＳ細胞培養物中に添加し所定時間培養することで、ゲノム不安定な細胞の細胞表面でのカルレティキュリンの発現を増大することができ、ゲノム不安定なｉＰＳ細胞の除去を高精度かつ高い信頼性に実現し得ることを確認した。
＜実施例６：顆粒剤の調製＞
　上記サンプル１～４に係る合成ペプチド（カルレティキュリン発現誘導ペプチド）５０ｍｇと結晶化セルロース５０ｍｇ及び乳糖４００ｍｇとを混合した後、エタノールと水の混合液１ｍＬを加え混練した。この混練物を常法に従って造粒し、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドを主成分とする顆粒剤（顆粒状組成物）を得た。
　上述のように、ここで開示される多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法によると、多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞若しくはＥＳ細胞）のゲノム安定性を高効率かつ高い信頼性で判別することができるため、例えば、多能性幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞）の染色体検査に利用することができる。また、ここで開示されるゲノム不安定な多能性幹細胞の除去方法によると、ゲノム不安定と判別された多能性幹細胞が除去された多能性幹細胞培養物（典型的にはｉＰＳ細胞培養物若しくはＥＳ細胞培養物）を提供（製造）することができる。上記多能性幹細胞培養物は、例えば、再生医療目的に好適な医療用資材として利用することができる。また、ここで開示されるカルレティキュリン発現誘導ペプチドおよび該ペプチドを有効成分として含むカルレティキュリン発現誘導剤は、ゲノム不安定な多能性幹細胞（典型的にはｉＰＳ細胞）におけるカルレティキュリン発現量を増大させる（あるいはカルレティキュリンの発現を誘導する）カルレティキュリン発現誘導活性を有しているため、例えば、上記多能性幹細胞のゲノム安定性評価方法、上記多能性幹細胞培養物からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法、ならびにゲノム不安定な多能性幹細胞を除去した多能性幹細胞培養物の製造方法に好適に利用することができる。
配列番号１～１３　　合成ペプチド

Claims (19)

  1. 　対象となるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞のゲノム安定性を評価する方法であって、
    　前記多能性幹細胞の培養物を準備すること、および
    　該培養物中の多能性幹細胞についてカルレティキュリンの発現量を調べ、該カルレティキュリンの発現量の程度に基づいて該多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別すること、
    を包含し、
    　ここで、前記判別において、カルレティキュリン発現量が所定レベルを上回った多能性幹細胞をゲノム不安定性であると判別する、評価方法。
  2. 　前記カルレティキュリンの発現量の程度に基づいた多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性の判別は、カルレティキュリン又はその断片と特異的に反応する抗体を用いた免疫学的手法で行う、請求項１に記載の評価方法。
  3. 　前記判別の前に、前記対象の多能性幹細胞培養物中に以下のアミノ酸配列：
    　　　ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
    　　　ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
    　のうちのいずれか若しくは該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成された改変アミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチドを少なくとも１回供給することをさらに含み、該合成ペプチドを少なくとも一回供給した当該多能性幹細胞培養物を所定時間培養した後に前記判別を行うことを特徴とする、請求項１又は２に記載の評価方法
  4. 　前記改変アミノ酸配列は、配列番号１又は２のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基(Ｃ）を欠失したものである、請求項３に記載の評価方法。
  5. 　前記合成ペプチドは、前記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項３又は４に記載の評価方法。
  6. 　前記合成ペプチドは、前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号５）；
    を有する、請求項５に記載の評価方法。
  7. 　前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項３～６のいずれか一項に記載の評価方法。
  8. 　前記合成ペプチドは、以下のアミノ酸配列：
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）； 
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
    のうちのいずれかを有する、請求項７に記載の評価方法。
  9. 　対象となるヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物中からゲノム不安定な多能性幹細胞を除去する方法であって、
    　請求項１～８のいずれか一項に記載の評価方法によって該培養物中の多能性幹細胞のゲノム安定性若しくは不安定性を判別すること、および
    　該判別方法によりゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を該培養物中から除去すること、
    を包含する、除去方法。
  10. 　前記ゲノム不安定性であると判別された多能性幹細胞を、細胞選別機（セルソーター）を使用して除去する、請求項９に記載の除去方法。
  11. 　前記ゲノム不安定な多能性幹細胞が、染色体異常を有する多能性幹細胞である、請求項９又は１０に記載の除去方法。
  12. 　ヒト又は他の哺乳動物由来の多能性幹細胞を含む培養物を製造する方法であって、
    　該多能性幹細胞の培養過程において、請求項９～１１のいずれか一項に記載の除去方法によってゲノム不安定な多能性幹細胞を該多能性幹細胞の培養物中から除去することを包含する、製造方法。
  13. 　ゲノム不安定な多能性幹細胞に対してカルレティキュリン発現誘導活性を奏する人為的に合成されたペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
    　　　ＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１）；および
    　　　ＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号２）；
    のうちのいずれか若しくは該アミノ酸配列において１個、又は２個、又は３個のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されて形成されたアミノ酸配列のいずれかからなるカルレティキュリン発現誘導ペプチド配列を含む合成ペプチド。
  14. 　前記改変アミノ酸配列は、配列番号１又は２のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のシステイン残基(Ｃ）を欠失したものである、請求項１３に記載の合成ペプチド。
  15. 　前記カルレティキュリン発現誘導ペプチド配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に膜透過性ペプチド配列を有する、請求項１３又は１４に記載の合成ペプチド。
  16. 　前記膜透過性ペプチド配列として、以下のアミノ酸配列：
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲ（配列番号５）；
    を有する、請求項１５に記載の合成ペプチド。
  17. 　前記合成ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が３０以下である、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
  18. 　以下のアミノ酸配列：
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＲＡＫＡＧＤＰＣ（配列番号１０）；
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＣＥＱＫＱＥＩＲＣ（配列番号１１）；
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＲＡＫＡＧＤＰ（配列番号１２）；および
    　　　ＫＫＲＴＬＲＫＮＤＲＫＫＲＧＧＥＱＫＱＥＩＲ（配列番号１３）；
    のうちのいずれかを有する、請求項１７に記載の合成ペプチド。
  19. 　ゲノム不安定な多能性幹細胞のカルレティキュリン発現量を増大するために用いられるカルレティキュリン発現誘導剤であって、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む、カルレティキュリン発現誘導剤。
     
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