JP3577459B2 - 細胞電位測定電極およびこれを用いた測定装置 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、典型的には、絶縁基板上に複数のマイクロ電極を有し、マイクロ電極を含む領域を囲む壁を有する低インピーダンス細胞電位測定電極アセンブリに関する。このデバイスは、マイクロ電極を使用して観察試料の電気生理学的活動を測定する一方で、マイクロ電極の領域内のそれらの細胞または組織を培養することが可能である。本発明は、個別の基準電極を利用して、システム全体のインピーダンスを低下させ、従って測定データ中にしばしば固有のノイズを低下させる。最適には、マイクロ電極は、観察される試料の周りの雰囲気を制御するために用いられる物理的壁により囲まれる。
【０００２】
（発明の背景）
細胞電位測定装置が、細胞内にガラス電極などを挿入することなく、神経細胞または他の細胞、あるいは組織の活動により生成される活動または電位を測定するために開発されている（例えば日本国公開第８−６２２０９号）。
【０００３】
ガラス電極などを細胞内に挿入することによる細胞電位の測定は、細胞を損傷し得る。長期間の細胞電位の測定は極めて困難である。さらに、複数の位置を同時に測定することは困難である。測定電極アレイに配置し得る電極の数は限定されており、測定電極に対する試料の位置を正確に決定することも同様に困難である。他方、（マイクロ電極を含む領域を囲むための壁を有する）基板上に複数のマイクロ電極を有する細胞電位測定電極の使用は、壁により囲まれた領域内での細胞の培養、およびそれらの細胞を損傷することない複数位置の電位の同時測定を可能にする。
【０００４】
細胞電位測定装置は、基準に対して細胞電位を測定する。そのような方法の１つを公開第８−６２２０９号を参照して説明する。６４のマイクロ電極が、８列および８行に配列されると、理論的には、１つのマイクロ電極を基準電位として（即ち、培地の電位に接続された共通の基準電極として）使用することにより、残りの６３のマイクロ電極を用いて他の６３位置の細胞電位が同時に測定され得る。
【０００５】
しかしながら、細胞電位など非常に低いレベル、すなわちマイクロ電位を測定するときには、ノイズが問題である。ノイズレベルは、基準電極の種類または位置の選択により、大きく変動する。上述のように、１つのマイクロ電極を基準電極として使用すると、残りの６３のマイクロ電極を使用することによる６３の位置での電位の同時測定は、高いノイズレベルのため不可能である。基準電極と測定電極とが１対１で対応するとき、電位は非常に低いノイズレベル状態で測定され得る。しかし、例えば６４のマイクロ電極が使用される場合、３２の基準電極を３２の測定電極に対応させることにより、わずか３２の位置しか同時に測定できない。
【０００６】
しかしながら、理論的には、可能な限り多くの位置での電位を同時に測定するために、基準電極の数を限定しなければならない。
【０００７】
図１２に示すように、１列の８つのマイクロ電極が基準電極として使用され、７つの測定電極が基準電極のそれぞれに相関されているので、７×８＝５６位置で同時に電位を測定し得る。５６のマイクロ電極が測定電極として使用される場合、即ち、１列の８つのマイクロ電極を基準電極として使用する場合、６４または６３本を測定電極として使用する場合に比べ、測定場所の損失は約１２％である。しかしながら、１つの基準電極に対し７つの測定電極を使用したときでさえ、ノイズはまだ極めて大きい。ノイズから細胞電位の小さな変化を検出するのは極めて困難である。
【０００８】
さらに、図１２に示すように、複数のマイクロ電極上に細胞または組織の切片Ｓを配置するとき、切片Ｓは、基準電極として使用されるマイクロ電極の列上に配置されるべきではない。そのような配置は、顕微鏡を介して切片Ｓを観察しながら切片Ｓをピンセットにより保持し、動かさなければならないので、熟練を要し、困難である。１列の８つのマイクロ電極が完全に露出し、残りの５６のマイクロ電極が切片で完全に覆われるように、切片Ｓを配置するのは極めて困難であり得る。１列の８つのマイクロ電極が完全に露出するように切片Ｓを配置したら、たいてい残りの５６のいくつかが露出し、従って、同時測定のための位置の数は減少する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明はそのような問題を解決することを意図する。本発明は、ノイズに影響されにくい細胞電位測定電極を提供し、かつ、測定される細胞または組織の切片を配置するときに配置があまり正確でない場合でも、利用できるすべてのマイクロ電極を効率よく利用することにより、多くの場所での電位の同時測定を可能にする。
【００１０】
本発明の細胞電位測定電極は、好適には、絶縁基板上の複数のマイクロ電極と、マイクロ電極をマイクロ電極の領域外のいくつかの領域に接続するための導電性パターンと、導電性パターンの終端に接続された電気接点と、導電性パターンの表面を覆う絶縁フィルムと、絶縁膜の表面上のマイクロ電極を含む領域を囲む壁と、を含む。本発明の基準電極は、測定マイクロ電極のインピーダンスよりも比較的低いインピーダンスを有する。それらは、壁により囲まれた領域内の複数の位置に、しばしばマイクロ電極から特定の距離をおいて、それぞれ配置される。電極接点は通常、各基準電極を配線するための導電性パターンと導電性パターンの終端との間にさらに接続される。基準電極の配線のための導電性パターンの表面は、典型的には絶縁膜で覆われている。
【００１１】
本発明によれば、複数の測定マイクロ電極の領域から離れた複数の位置に専用基準電極が備えられているので、すべてのマイクロ電極を覆い、かつ基準電極には接触しないように細胞試料の切片を配置することが容易である。基準電極は、典型的には、例えば、測定マイクロ電極よりも広い面積を有し、従ってインピーダンスは小さい。従って、測定位置に対して複数の基準電位に共通に接続される場合でも、ノイズレベルは小さい。従って、共通の基準電極が複数の測定マイクロ電極とともに使用され得る。さらに、複数の基準電極のそれぞれが複数の測定マイクロ電極に対応するので、細胞電位は、すべてのマイクロ電極を同時に使用して容易に測定し得る。
【００１２】
好適には、複数の基準電極が、複数のマイクロ電極領域からほぼ同じ距離、かつほぼ同じ角度の間隔で配置される。ここで、「ほぼ同じ角度の間隔」とは、複数のマイクロ電極領域を上から見たとき、複数の基準電極がその領域から等角線で延長するという意味である。より好適には、複数のマイクロ電極が矩形行列に配置され、４つの基準電極が矩形行列を保持する領域の対角線の延長上に備えられる。そのような対称配置では、各マイクロ電極に対するノイズレベルが平均化される。
【００１３】
特定の例としては、マイクロ電極が、例えば０．８〜２．２ｍｍ（３００μｍのマイクロ電極ピッチの場合）または０．８〜３．３ｍｍ（４５０μｍのマイクロ電極ピッチの場合）の辺を有する矩形内の行列配列に置かれる。４つの基準電極は、１辺が５〜１５ｍｍの矩形の４角に置かれる。より好適には、６４のマイクロ電極が、約１００〜４５０μｍ、好適には１００〜３００μｍの中心ピッチで、８行および８列で配置される。
【００１４】
基準電極のインピーダンスをマイクロ電極のインピーダンスよりも十分低く設定するためには、基準電極の面積は、好適には、マイクロ電極の面積の４〜２５倍（特に好適には１６倍）である。特定の例として、マイクロ電極のそれぞれの面積は、好適には、約４×１０^２〜４×１０^４μｍ^２の間であり、基準電極のそれぞれの面積は、好適には、約６４×１０^２〜６４×１０^４μｍ^２の間である。
【００１５】
好適には、製造プロセスを簡略化し、かつコストの利点を獲得するために、マイクロ電極および基準電極は同一の材料から形成される。好適には、マイクロ電極および基準電極は、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）膜上のニッケル鍍金、金鍍金、および白金黒を積層することにより形成される。白金をかぶせた後では、基準電極のインピーダンスは、好適には２〜３キロオームの間である。
【００１６】
絶縁基板（例えば、ガラス基板）は、ほぼ正方形であり得る。複数の電気接点が導電性パターンの終端に接続され得、好適には、絶縁基板の４辺に配置される。その結果、複数のマイクロ電極および基準電極の配線パターンのレイアウトは容易である。電極接点のピッチは比較的大きく形成され得るので、外部ユニットを備える電気接点を介した電気接続も容易である。
【００１７】
マイクロ電極領域は、通常非常に小さい。顕微鏡で試料を観察するとき、位置と垂直および水平方向の両方とを区別するのは困難である。マイクロ電極領域の近傍に指標マイクロマークを配置し、顕微鏡を介して方向、軸および位置の多様な視覚的識別可能にすることが望ましい。
【００１８】
本発明の最も好適な細胞電位測定装置は、細胞電位測定電極を有する細胞配置デバイスと、電気接点に接触するための接触場所と、上下から挟むことにより絶縁基板を固定するための電極ホルダーと、から形成される。本発明の変形では、信号プロセッサがマイクロ電極行列または領域の近傍に配置され得る。細胞電位測定電極は細胞配置アセンブリデバイスに電気的に接続され得、試料により生成され、そのようなマイクロ電極および基準電極のそれぞれの間で測定される電圧信号の処理を可能にする。細胞電位測定アセンブリは通常、試料細胞または組織を培養するための壁で覆われた領域を含む。また、壁により囲まれた領域内で培養される細胞または組織を拡大し光学的に観察するための光学デバイスも好適に含む。本細胞電位測定装置は、好適には、光学デバイスにより獲得された拡大画像を格納するための画像メモリデバイスをさらに含む。
【００１９】
（発明の説明）
図１は、本発明により作製された細胞電位測定電極および基準電極を用いた細胞電位測定装置の全体の典型例である。この細胞電位測定装置は、本発明の細胞電位測定電極と、細胞配置デバイス１に配置された試料または細胞を光学的に測定するための倒立顕微鏡２１を含む光学観測デバイス２０と、細胞に刺激信号を印加し、細胞からの出力信号を処理するためのコンピュータ３０と、試料に関する培養雰囲気を維持するための細胞培養システム４０と、を含む集積細胞配置デバイス１を含む。
【００２０】
光学観察デバイス２０は、細胞配置デバイス１が設けられる倒立顕微鏡２１に加え、顕微鏡２１のためのＳＩＴカメラ２２、高解像度ディスプレイ２３、および画像メモリデバイス２４を含み得る。高解像度ディスプレイ２３は、コンピュータ３０のためのディスプレイとしても使用され得る。
【００２１】
コンピュータ３０は通常、測定ソフトウェアがインストールされたパーソナルコンピュータ（ＰＣ）である。コンピュータ３０および細胞配置デバイス１は、測定のためにＩ／Ｏボードを介して接続されている。Ｉ／Ｏボードは、Ａ／Ｄコンバータ３１およびＤ／Ａコンバータ３２を含む。Ａ／Ｄコンバータ３１は通常、生成された電位を測定し変換するためであり、Ｄ／Ａコンバータ３２は、試料に対する刺激信号のためである。例えば、Ａ／Ｄコンバータ３１は１６ビット、６４チャネルを有し得、Ｄ／Ａコンバータ３２は１６ビット、８チャネルを有する。
【００２２】
コンピュータ３０にインストールされる測定ソフトウェアは、刺激信号を印加し、刺激信号を生成し、獲得された検出信号を記録するための条件を設定するためのソフトウェアを含み得る。そのような測定ソフトウェアを使用することにより、コンピュータ３０は、細胞に刺激信号を印加するための手段、および細胞から検出された信号を処理する手段を含み得る。コンピュータ３０は、光学観察デバイス（ＳＩＴカメラおよび画像メモリデバイス）および細胞培養システムをも制御し得る。
【００２３】
望ましい測定ソフトウェアの機能の概略を画面毎に以下に説明する。
【００２４】
パラメータ設定画面では、キーボードまたはマウスを用いて画面上に刺激波形を描くことにより、複雑な刺激条件が設定され得る。記録条件の設定が６４入力チャネルおよび１０ｋＨｚのサンプリング速度を有する場合、コンピュータは、数時間の連続記録を処理し得る。さらに、マウスまたはペンにより画面上に表示される顕微鏡画像を指示することにより、刺激信号を印加する電極と細胞から検出信号を集める電極とが指定され得る。細胞培養システム４０の温度、ｐＨ、および他の条件は、望ましくはキーボードから設定される。
【００２５】
記録画面では、自発的活動電位または細胞から検出される誘導電位が実時間で表示され得る。さらに、記録された自発的活動電位、または誘導電位は、細胞の顕微鏡画像に重ねることにより表示し得る。誘導電位を測定するときは、記録された波形全体が表示される。自発的活動電位を測定するときは、ウィンドウ弁別器または波形弁別器を用いたスパイク検出機能により、自発的活動の生成が検出されたときのみ、記録された波形が表示される。記録された波形の表示とともに、測定パラメータ（例えば、刺激条件、記録条件、温度、ｐＨ等）の表示も実時間で表示され得る。温度またはｐＨが許容範囲から外れたときの警告のために、アラーム機能も提供される。
【００２６】
データ分析または処理に関しては、フーリエ関数変換（ＦＦＴ）分析、コヒーレンス分析、および相関分析も望ましい。使用可能な機能は、波形弁別を用いた単一スパイク分割機能、時間プロフィル表示機能、トポグラフィー表示機能、および電流ソース密度分析機能を含み得る。これらの分析結果は、画像メモリデバイスにおいて格納される顕微鏡画像に重ねることにより表示され得る。
【００２７】
刺激信号がコンピュータ３０から発信されるとき、この刺激信号はＤ／Ａコンバータ３２およびアイソレータ３３を介して細胞配置デバイスに送られる。細胞配置デバイス１は、行列形式でガラス基板上に６４のマイクロ電極から後述するように形成され得る細胞電位測定電極およびマイクロ電極および培養液と接触する試料（例えば、細胞または組織の切片）を保持するための包囲壁を有する。細胞配置デバイス１に送られる刺激信号は、６４のマイクロ電極の任意の電極に印加され、次に単一または複数の試料に印加される。
【００２８】
各マイクロ電極と（培養液の電位である）基準電位との間に発生する誘導電位、誘発電位、または自発的電位は、６４チャネル高感度増幅器３４およびＡ／Ｄコンバータ３１を通してコンピュータ３０に入る。例えば、約０．１〜１０ｋＨｚ、または〜２０Ｈｚの周波数帯において、増幅器３４の増幅係数は、例えば約８０〜１００ｄＢであり得る。しかしながら、刺激信号により誘導された電位を測定するときは、低域遮断フィルタを使用することにより、周波数帯は１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚである。自発的電位は通常１００Ｈｚ〜２０Ｈｚの範囲である。
【００２９】
細胞培養システム４０は通常、温度制御器４１、培養液循環デバイス４２、および、例えば空気と二酸化炭素の混合ガスを供給するフィーダ４３を含む。細胞培養システム４０は、代わりに、市販のマイクロインキュベータ、温度制御器、およびＣＯ_２シリンダから構成されてもよい。マイクロインキュベータは、ペルティエ素子を用いることにより０から５０℃の温度範囲で制御するのに使用され、３．０ｍｌ／分以下の液体供給速度および１．０リットル／分以下のガス流量に適用できる。また、温度制御器を組み込んだマイクロインキュベータが使用されてもよい。
【００３０】
（図１に示す）細胞配置デバイス１の構造を、図２に観られる分解図を参照して、より詳細に説明する。好適な細胞配置デバイス１は、透明ガラス基板上に備えられる円筒状の壁６および内部領域に複数のマイクロ電極を有する細胞電位測定電極（集積多電極またはマイクロ電極アセンブリとも称する）２と、上下から挟み込むことにより細胞電位測定電極２を固定するために２つの部分に分割されたホルダー３、４と、ホルダーを固定するためのプリント配線ボード５とで構成され得る。
【００３１】
図３は、ガラス基板の詳細を示す。細胞電位測定電極（集積多電極）２を構成するためのガラス基板のサイズは、厚さ１．１ｍｍで、約５０ｍｍ平方であり得る。ガラス基板の中心部分には、６４のマイクロ電極１１が８×８の行列形式で形成される。マイクロ電極は互いに絶縁され、かつ基準電極から絶縁されている。配線のための導電性パターン１２は、各マイクロ電極１１に接続される。マイクロ電極１１は約５０ミクロン平方であり得、隣接する電極の中心間の距離は約１５０ミクロンである。従って、図示された６４のマイクロ電極１１は、８×８の行列形式で示され、形成された矩形領域の１辺は１．１ｍｍである。
【００３２】
本発明の説明は、特定の寸法および面積に対する多くの特定的言及を含んでいるが、本発明はこれに限定されない。それらは単に例示目的で提供されており、断りのない場合は本発明を限定するものではない。
【００３３】
また、図４に示されるように、基準電極１０は、マイクロ電極が配置されるガラス基板の中心部分における矩形領域の対角線から延長された線上の４つの位置に形成される。基準電極は互いに絶縁され、マイクロ電極からも絶縁される。これらの基準電極１０もマイクロ電極１１と同様、配線のための導電性パターン１２によりガラス基板の４辺に置かれた電気接点７に接続される。基準電極１０は、後述する、マイクロ電極１１と同様のプロセスで形成されるが、その寸法は一般的にマイクロ電極１１よりかなり大きく、例えば、１辺が２００ミクロンの矩形である。従って、約５０ミクロン平方のマイクロ電極１１の１つと比較すると、矩形面積はより広く、好適には、１６倍の広さであり、このため基準電極１０のインピーダンスはマイクロ電極１１のインピーダンスよりも小さい。
【００３４】
基準電極１０の位置は、好適には、マイクロ電極１１が配置されるガラス基板の中心部分における矩形領域の対角線から延長された線上である。この変形例における基準電極１０は、矩形領域の中心から約６ｍｍに位置する。換言すれば、基準電極１０は一辺約８．５ｍｍの正方形の４角に配置される。
【００３５】
さらに、図４に示すように、ガラス基板の４辺のそれぞれの上には、１７の電気接点７がある。これらの電気接点７は、導電性パターン１２を介して６４のマイクロ電極１１および４つの基準電極１０のそれぞれに（１対１で）取り付けられている。１７の電気接点のピッチは、望ましくは、１．２７ｍｍの汎用コネクタのピッチで間隔を取る。この集積多電極２の製造プロセスを図５の断面図を参照しながら以下に説明する。図５の描写は、説明の便宜上、一定の拡大比ではない。
【００３６】
ガラス基板１３の表面上に、厚さ１５０ｎｍのＩＴＯ（インジウム錫酸化物）膜が付与され、導電性パターン１２が、フォトレジストおよびエッチングにより形成される。厚さ約１．４ミクロンのネガ型感光ポリイミド膜がその上に付与され、絶縁膜１４が形成される。マイクロ電極１１（または、代わりに基準電極１０）および電気接点７の部分で、ＩＴＯ膜が露出しており、そして厚さ５００ｎｍのニッケル鍍金１５、厚さ５０ｎｍの金鍍金１６が付与される。
【００３７】
次に、内径約２２ｍｍ、外径約２５ｍｍ、および高さ８ｍｍの壁に相当するポリスチレンまたはガラスの円筒部材６が、シリコーン接着剤を用いることによりガラス基板の中心部分に配置される（図２および図４参照）。とみに好ましい接着剤は、ＲＴＶ（室温加硫）シリコーンゴムであり、特に酸硬化系を用いるものである。これらは、硬化工程で酢酸を生成するので、低レベルの毒性を生み出す。２つの有用な変形例は、ＫＥ４２Ｔ（Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ）およびＳｉｌａｓｔｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｔｙｐｅ Ａ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含む。円筒形の壁部材６を示すが、壁は試料への向上した接近を可能にするために楕円形でもよい。壁部材６は、ガラス基板の中心、即ち６４のマイクロ電極が配置される矩形領域の中心部分に整列する状態で取り付けられる。この円筒形部材６により囲まれた領域で、細胞または組織が培養される。この円筒形部材６は、例えば、１重量％の塩化白金酸、０．０１重量％の酢酸鉛、および０．００２５重量％の塩酸を含む水溶液で満たされ、２０ｍＡ／ｃｍ^２の電流を１分間通すことにより、白金黒１１ａ（または代わりに、基準電極白金黒１０ａ）がマイクロ電極１１および基準電極１０の表面に沈殿する。
【００３８】
円筒形部材６内の領域は、ときに「測定領域」とも呼ばれ、マイクロ電極１１および基準電極１０の両方を含む面積を含む。さらに、基準電極が円筒形部材６の内部表面に配置されることも本発明の範囲内である。
【００３９】
集積多電極２の１角に、方向を示す指標または矢印マーク１７が備えられる。この矢印マーク１７は、マイクロ電極１１および基準電極１０と同じ製造プロセスにおいて形成され得る。しかしながら、表面は金鍍金のみで覆われ、白金黒は形成されない。矢印マーク１７の長さおよび幅は、ともに５ｍｍである。さらに、マイクロ電極１１を配置する矩形領域の１角の近傍に、小さな指標マーク、例えば、矢印マークに似たマイクロマーク１８を備える。このマイクロマーク１８は、肉眼では見えないが、測定装置の光学観察デバイスによる拡大図では矢印マーク１７と同じパターンが認識され、これにより、方向、位置、軸などが識別され得る。矢印マーク１７と同様に、マイクロマーク１８も、マイクロ電極１１および基準電極１０と同じ製造プロセスにおいて形成され得る。
【００４０】
図２では、集積多電極２が、ホルダー３と４との間に挟み込まれる。電気的接続が同様に形成される。ホルダー３、４は、典型的には重合体である。集積多電極２の縁を保持するのに階段部が用いられ、矩形の開口部が中心部に形成される。上部ホルダー３は、ファスナー対８、および１７ピース×４対の接触金属エリア９を備える。集積多電極２を挟み込んで固定するホルダー３、４の上面図を図６（Ａ）に、その側面図（断面Ｂ−Ｂ）を図６（Ｂ）に、背面斜視図を図７に示す。これらの図から明らかなように、ファスナー８は、上部ホルダー３の２つの対向する面のシャフトピン８ａにより支えられ、この周囲を回転する。図７に示すように、溝４ａが、下部ホルダー４の背面の２つの対向する面内に形成される。ファスナー８の突起８ｂは、溝４ａに嵌合され、上部および下部ホルダー３、４は、集積多電極２を挟み込む状態で堅固に固定される。
【００４１】
集積多電極２の電気接点７に対応する上部ホルダー３上に備えられた合計６８の接触金属継ぎ手９は、ＮｉおよびＡｕで鍍金されたＢｅ／Ｃｕスプリング合金のような弾力性で導電性の金属板を処理することにより形成され得る。金属継ぎ手９は、図８に示すような断面形状を有する。即ち、ピン９ａと、その基部９ｂと、基部９ｂから湾曲部９ｃを通って延長する可動接触部９ｄと、を含む。そのような構造では、可動接点部９ｄは、基部９ｂから弾性的に移動され得る。上部ホルダー３には、接触金属継ぎ手９のピン９ａを挿入する穴、および基部９ｂを嵌合するための溝が、６８（１７×４）箇所形成される。
【００４２】
図２および図６（Ｂ）に示すように、接触金属継ぎ手９を穴および溝に挿入し固定することにより、ピン９ａは上部ホルダー３から突出する。接触金属継ぎ手９は、基部９ｂの長さが異なる２種類である。２種類の寸法の継ぎ手９は、交互に配置され、１６のピン９ａが上部ホルダー３から突出して２つのジグザグ状の列で配列される。後述するように、これらのピン９ａは、外部との接続のため、プリント配線ボード５に載置されたコネクタに接続される。
【００４３】
接触金属継ぎ手９の可動接点部９ｄは、接触金属継ぎ手９が上部ホルダー３の穴および溝に挿入され取り付けられるとき、上部ホルダー３の下部から突出する。ホルダー３、４を集積多電極２の両面に固定することにより、各接触金属継ぎ手９の可動接点部９ｄは、集積多電極２の電気接点７と接触し、湾曲部９ｃの弾性変形により指定の接触圧が接触面に印加される。この方法により、導電性パターン１２を介して集積多電極２のマイクロ電極１１および基準電極１０を接続する電気接点７は、接触金属継ぎ手９の接触抵抗に比してより低い接触抵抗（３０ミリオーム以下）で電気的に接続される。
【００４４】
上述したように、集積多電極２を集積多電極２と電気的接触の状態で堅固に固定するホルダー３、４は、図２に示すようにプリント配線ボード５に電気的に接続され、かつ取り付けられている。集積多電極２のマイクロ電極１１および基準電極１０から導電性パターン１２、電気接点７、および接触金属継ぎ手９への電気的接続は、プリント配線ボード５を介して、上述の細胞電位測定装置にさらに接続される。測定装置上の集積多電極の取り扱いは、プリント配線ボード５の使用により容易となる。
【００４５】
また、図２に示すように、プリント配線ボード５は、例えばガラスエポキシ２面基板で構成され得る。コネクタ５ａが、プリント回路ボード５の中心に形成される円形の開口部の円周上の４箇所の背面に備えられる。上部ホルダー３の表面上の４箇所から２本のジグザグ状の列で突出した１６のピン９ａが個別に対応するコネクタ５ａに挿入されるので、集積多電極２およびホルダー３、４のアセンブリは、プリント配線ボード５に固定され、電気的に接続される。
【００４６】
プリント配線ボード５の両方のエッジ５ｂには、両方のエッジコネクタに対して２．５４ｍｍピッチの電気接点が設けられ得る。これらの電気接点および中央コネクタ５ａは、導電性パターン５ｃで接続される。両方のコネクタ５ａのうち、内側の列は表面パターンにより、外側の列は背面パターンにより、それぞれ配線され、両方のエッジ５ｂの表面および背面のそれぞれに３４あるので、即ち合計６８の電気接点が形成される。機械的固定を確実にするために、上部ホルダー３は、ネジで締結することによりプリント配線ボード５に取り付けられる。
【００４７】
図４を参照して集積多電極２の基準電極１０を説明する。基準電極１０は通常、各マイクロ電極に発生する電位を測定するための、基準電位としての培養液に浸漬されている。従って、各マイクロ電極１１は、増幅器３４（図１）の入力に接続され、基準電極１０は、各増幅器の基準電圧端子に接続される。６４チャネル増幅器は、各１６チャネルの４つの群に分割され、４つの基準電極のそれぞれが、１群１６チャネルの基準電圧端子に共通して接続される。
【００４８】
まず、図４から明らかなように、４つの基準電極１０をマイクロ電極１１を含む中心矩形領域の対角線の延長線上に配置することが好ましい。一般的には、これは、パターン配線の便宜上の問題である。さらに、６４のマイクロ電極のすべてを覆い、４つの基準電極を覆わないように、細胞または組織の切片を容易に配置するために、マイクロ電極１１および基準電極１０の中心矩形領域の間の距離は、常識的に可能な限り広くあるべきである。さらに、４つの基準電極１０を矩形領域の中心から等距離に配置することにより、各マイクロ電極で発生するノイズレベルが実質的に均一化される。基準電極の位置は上記ではかなり限定しているが、この数値は絶対ではなく、単に例示を意図している。
【００４９】
基準電極１０の寸法は、上述のマイクロ電極の面積の４〜６４倍であり、好適には約１６倍である。その結果、増幅器の測定電位入力側と基準電位入力側との間でインピーダンスが平衡化され、ノイズレベルが最小化される。例えば、マイクロ電極および基準電極を上述の同一プロセスで形成し、基準電極の面積をマイクロ電極の面積の１６倍に設定することにより、１６のマイクロ電極のインピーダンスと対応する１つの基準電極のインピーダンスは実質的に同一となる。
【００５０】
（実施例）
この実施例は、上述のような集積多電極と、５０ミクロン平方および２００ミクロン平方の基準電極とを含むシステムの間のノイズレベルの差を示す。図９および図１０は、それらの比較ノイズレベルを示す。
【００５１】
（図４に示すような）、それぞれ５０ミクロン平方の基準電極および２００ミクロン平方の基準電極を有する集積多電極を製造した。集積多電極はそれぞれ円筒形部材６を有した。組織培養に通常使用されているのと同一の培地を円筒形部材６の中に配置した。生成される信号をノイズに限定するために、マイクロ電極上には細胞または組織を配置しなかった。図１１に示すように、６４のマイクロ電極のうち、中心の７位置（チャネル１〜５、７、８）が測定された。
【００５２】
図９は５０ミクロン平方の基準電極のノイズ波形を示し、図１０は２００ミクロン平方のものである。各図において、縦軸の電圧は０．０２ｍＶ／目盛りであり、横軸の時間は５．０ｍｓ／目盛りである。図９および図１０の比較から明らかなように、基準電極が２００ミクロン平方であるとき（図１０）の方が、５０ミクロン平方の基準電極（図９）と比較して、ノイズレベルは明らかに小さい。ちなみに、従来技術を参照して説明したように、６４のマイクロ電極の１つを基準電極として、１６のマイクロ電極に対応するように用いた場合では、ノイズレベルは図９に示すのと同等の大きさであった。
【００５３】
本明細書に記載したように、本発明の細胞電位測定電極および装置によれば、ノイズの影響は小さく、測定される細胞または組織の切片を置くときに位置決めがあまり正確でない場合でも、すべてのマイクロ電極が効率よく利用され、複数位置での電位が同時に測定され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による細胞電位測定装置の全体構造を示すブロック図である。
【図２】本発明による細胞電位測定電極を含む細胞配置デバイスの展開図である。
【図３】細胞電位測定装置の中心部分におけるマイクロ電極、および配線のための導電性パターンの例を示す平面図である。
【図４】細胞電位測定電極の全体構造を示す平面図である。
【図５】細胞電位測定電極の断面の模式図である。
【図６】上下のホルダーで挟むことにより細胞電位測定電極を固定した状態を示す平面図および側断面図である。
【図７】図６の細胞電位測定電極ならびに上部および下部ホルダーの斜視図である。
【図８】上部ホルダーに備えられる接触金属継ぎ手の側面図である。
【図９】細胞電位測定電極に５０ミクロン平方の寸法の基準電極を備えた場合のノイズレベルを示す波形図である。
【図１０】細胞電位測定電極に５０ミクロン平方の寸法の基準電極を備えた場合のノイズレベルを示す波形図である。
【図１１】細胞電位測定電極に２００ミクロン平方の寸法の基準電極を備えた場合のノイズレベルを示す波形図である。
【図１２】従来の細胞電位測定電極を使用することによる細胞電位の測定方法の例を示すブロック図である。

Claims (24)

1. ａ．互いに絶縁され、測定領域内の絶縁基板上に位置づけられた複数の測定マイクロ電極と、
   ｂ．該測定領域内で互いに分離された複数の基準電極であって、該測定領域を１ｋＨｚ、５０ｍｖで覆う電解質中で測定されるとき、該複数の基準電極のそれぞれが、該測定電極の該それぞれよりも小さなインピーダンスを有する、複数の基準電極と、
   を含む、神経試料において電位を測定するのに適した細胞電位測定電極アセンブリ。
2. 前記複数の基準電極のそれぞれの面積が、前記複数の測定マイクロ電極のそれぞれの面積よりも広い、請求項１に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
3. 前記複数の基準電極のそれぞれの面積が、前記複数の測定マイクロ電極のそれぞれの面積の４〜２５倍である、請求項２に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
4. 前記複数の測定マイクロ電極のそれぞれの面積が４×１０^２〜４×１０^４μｍ^２の間であり、前記複数の基準電極のそれぞれの面積が６４×１０^２〜６４×１０^４μｍ^２の間である、請求項２に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
5. 前記複数の測定マイクロ電極のそれぞれが、前記測定領域内にアレイ状に配置される、請求項１に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
6. ６４のマイクロ電極が、８行および８列で、中心ピッチ１００〜４５０ミクロンで配置される、請求項５に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
7. 前記複数の測定マイクロ電極のそれぞれと、前記複数の基準電極のそれぞれとが、前記測定領域の外側の位置に接続可能である、請求項１に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
8. 前記測定領域が壁により包囲されている、請求項１に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
9. 前記壁が円形である、請求項８に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
10. 前記壁が楕円形である、請求項８に記載の細胞電位測定電極アセンブリ。
11. 絶縁基板上に配置された複数のマイクロ電極と、該マイクロ電極を配線するための導電性パターンと、該導電性パターンの終端に接続された電気接点と、該導電性パターンの表面を覆う絶縁膜と、該絶縁膜の表面上の該マイクロ電極を含む領域を囲む壁と、を含む細胞電位測定電極であり、電気生理学的活動の測定に使用される細胞電位測定電極であって、該壁により囲まれた領域内で細胞または組織を培養し、
    該マイクロ電極のインピーダンスよりも小さなインピーダンスを有する基準電極が、該壁により囲まれた該領域内で、該マイクロ電極の配置の該領域から特定の距離をおいた複数の位置にそれぞれ配置され、各基準電極を配線するための該導電性パターンと該導電性パターンの終端との間に電気接点がさらに接続され、該基準電極を配線するための導電性パターンの該表面が該絶縁膜により覆われている、
    細胞電位測定電極。
12. 前記複数の基準電極が、前記複数のマイクロ電極の配置の前記領域から実質的に等しい距離で、ほぼ等しい角度の間隔で配置される、請求項１１に記載の細胞電位測定電極。
13. 前記複数のマイクロ電極が、矩形領域内の行列に配置され、前記基準電極４つが該矩形領域の対角線の延長上に備えられる、請求項１２に記載の細胞電位測定電極。
14. 前記マイクロ電極は、１辺が０．８〜３．３ｍｍの矩形領域に行列で配列され、前記４つの基準電極は、１辺が５〜１５ｍｍの矩形形状の４角に配置される、請求項１３に記載の細胞電位測定電極。
15. ６４のマイクロ電極が、１００〜４５０μｍの中心ピッチで、８行および８列で配置される、請求項１４に記載の細胞電位測定電極。
16. 前記基準電極の面積が、前記マイクロ電極の面積の４〜２５倍である、請求項１１に記載の細胞電位測定電極。
17. 前記基準電極の面積が、前記マイクロ電極の面積の１６倍である、請求項１６に記載の細胞電位測定電極。
18. 前記マイクロ電極のそれぞれの面積が４×１０^２〜４×１０^４μｍ^２の間であり、前記基準電極のそれぞれの面積が６４×１０^２〜６４×１０^４μｍ^２の間である、請求項１１に記載の細胞電位測定電極。
19. 前記マイクロ電極および前記基準電極が同一の材料で形成される、請求項１１に記載の細胞電位測定電極。
20. 前記マイクロ電極および前記基準電極が、インジウム錫酸化物膜上にニッケル鍍金、金鍍金、および白金黒を積層することにより形成される、請求項１９に記載の細胞電位測定電極。
21. 前記絶縁基板が実質的に正方形であり、前記導電性パターンの前記終端に接続された複数の電気接点が該絶縁基板の４辺に分散され配置される、請求項１１に記載の細胞電位測定電極。
22. 拡大したときに視覚的に方向を識別するための指標マイクロマークが、前記マイクロ電極の配置の前記領域の近傍に備えられる、請求項１１に記載の細胞電位測定電極。
23. 請求項１１〜２２のいずれかに記載の細胞電位測定電極および電気接点に接触するための接触金属であって、上下から挟み込むことにより前記絶縁基板を固定するための電極ホルダーを含む接触金属を有する細胞配置デバイスと、
    該細胞配置デバイスに電気的に接続され、壁により囲まれた領域において培養される細胞または組織の活動により該細胞電位測定電極のそれぞれのマイクロ電極と基準電極との間に生成される電圧信号を、処理する信号プロセッサと、
    該壁により囲まれた該領域において培養された該細胞または組織を拡大し光学的に観察するための光学デバイスと、
    を含む、細胞電位測定装置。
24. 前記光学デバイスにより獲得された拡大画像を格納するための画像メモリデバイスをさらに含む、請求項２３に記載の細胞電位測定装置。

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