DE69528859T2

DE69528859T2 - Zellpotentialmessvorrichtung mit mehreren Mikroelektroden

Info

Publication number: DE69528859T2
Application number: DE69528859T
Authority: DE
Inventors: Akihito Kamei; Yasushi Kobayashi; Tadayasu Mitsumata; Hirokazu Sugihara; Makoto Taketani
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1994-06-13
Filing date: 1995-06-09
Publication date: 2003-08-28
Anticipated expiration: 2015-06-10
Also published as: EP0689051A3; DE69528859D1; KR960000159A; CN1131744A; EP0689051B1; USRE38323E1; KR0150390B1; US5563067A; EP0689051A2

Description

Die Erfindung betrifft eine Zellpotentialmeßvorrichtung, die auf dem Gebiet der Elektroneurophysiologie zum Messen von Potentialänderungen im Zusammenhang mit Aktivitäten von Nervenzellen oder Nervenorganen zum Einsatz kommt.
In jüngerer Zeit wurden medizinische Untersuchungen zu Nervenzellen und zur möglichen Verwendung von Nervenzellen als elektrische Elemente aktiv durchgeführt. Sind Nervenzellen aktiv, wird ein Aktionspotential erzeugt. Dieses Aktionspotential entsteht aus einer Änderung der Ionenkonzentration innerhalb und außerhalb der Zellmembran, die mit einer Änderung der Ionenpermeabilität in Nervenzellen einhergeht, und somit aus der damit einhergehenden Änderung des Zellmembranpotentials. Daher kann man durch Messen dieser von der Ionenkonzentrationsänderung begleiteten Potentialänderung (d. h. des Ionenstroms) nahe den Nervenzellen mit Elektroden Aktivitäten von Nervenzellen oder Nervenorganen detektieren.
Zum Messen des o. g. Potentials als Ergebnis von Zellaktivitäten ist es z. B. möglich, eine Glas aufweisende Elektrode in einen Bereich von Zellen einzuführen, um das extrazelluläre Potential zu messen. Bei der Messung des evozierten. Potentials infolge von Stimulation wird eine Metallelektrode zur Stimulation zusammen mit einer Glaselektrode zur Aufzeichnung eingeführt. Jedoch werden beim Messen durch Einführen dieser Elektroden die Zellen möglicherweise verletzt, und eine Messung über eine lange Zeitspanne ist schwierig durchzuführen. Ferner sind infolge von räumlichen Beschränkungen und der notwendigen Handhabungsgenauigkeit auch gleichzeitige Mehrpunktmessungen schwierig durchzuführen.
Daher entwickelten die Erfinder eine Planarelektrode mit einem Isoliersubstrat und zahlreichen Mikroelektroden, deren Leitmuster unter Verwendung eines leitfähigen Materials darauf gebildet waren, wobei eine Zellkultur auf dieser Oberfläche plaziert werden konnte (offenbart in den JP-A-6-78889 und JP-A-6-296595). Mit dieser Planarelektrode können zeitgleiche Mehrpunktmessungen der Potentialänderung durchgeführt werden, ohne durch räumliche Beschränkungen an mehreren Punkten mit kurzem Abstand zwischen Elektroden beeinträchtigt zu sein. Zudem können mit dieser Elektrode Langzeitmessungen erfolgen.
Eine Vorrichtung zur Zellpotentialmessung ist in BIOSEN- SORS & BIOELECTRONICS, Band 9, Nr. 1994, 1994, Amsterdam, NL, Seiten 737-741, W. Nisch, et al., "A thin film microelectrode array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro" beschrieben. Diese Vorrichtung nutzt eine Mikroelektrodenanordnung, die auf einem Glassubstrat vorgesehen ist. Durch Verwendung dieser Vorrichtung läßt sich die neuronale elektrische Aktivität aufzeichnen und analysieren.
In der EP-A-0585933 ist eine Planarelektrode beschrieben. Diese Planarelektrode ermöglicht die gleichzeitige Mehrpunktstimulation und -messung von Nervenzellen sowie die Signalübertragung und -beobachtung über insgesamt zahlreiche Zellen.
Starker Bedarf besteht aber an einer Meßvorrichtung, die diese Art von Planarelektrode rationell verwenden, Messungen genau und effizient durchführen und die Anzeige von Meßergebnissen verbessern kann. Daher besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, eine Zellpotentialmeßvorrichtung bereitzustellen, die diese technischen Bedürfnisse zu erfüllen vermag.
Zur Lösung und Realisierung dieser und anderer Aufgaben und Vorteile weist eine Zellpotentialmeßvorrichtung der Erfindung die Merkmale nach Anspruch 1 auf.
Bevorzugt ist, daß die Zellpotentialmeßvorrichtung der Erfindung ferner eine optische Beobachtungseinrichtung zum optischen Beobachten der Zellen aufweist. Außerdem ist bevorzugt, daß die Zellpotentialmeßvorrichtung der Erfindung ferner eine Zellkultivierungseinrichtung zum Aufrechterhalten einer Umgebung zum Kultivieren von Zellen aufweist, die auf dem integrierten Zellhalteinstrument plaziert sind. Durch diese Konfiguration kann eine Messung über eine lange Zeitspanne erfolgen.
Allgemein wird die Messung mit Hilfe der wie oben konfigurierten Vorrichtung der Erfindung z. B. in den folgenden Schritten durchgeführt: Probezellen werden in einem Zellhalteteil eines integrierten Zellhalteinstruments plaziert, und mehrere Mikroelektroden kontaktieren die Zellen.
Ein Bild der Zellen erhält man durch eine optische Beobachtungseinrichtung. Ein Stimulationssignal wird zwischen einem Paar Elektroden, die optional aus den mehreren Mikroelektroden ausgewählt sind, durch eine Stimulationssignal-Zufuhreinrichtung über eine elektrische Verbindungseinrichtung angelegt. Eine zeitliche Änderung des evozierten Potentials, die man in jeder der anderen Elektroden erhält, wird über die elektrische Verbindungseinrichtung zu einer Signalverarbeitungseinrichtung geführt, die dann nach der notwendigen Signalverarbeitung z. B. zu einem Anzeigegerät usw. geführt wird. Die Messung des spontanen Potentials, die nicht mit einem Stimulationssignal erfolgt, wird ähnlich durchgeführt.
Diese elektrochemische Messung von Zellen muß in einem Zustand durchgeführt werden, in dem die Zellen leben. Daher werden gewöhnlich kultivierte Zellen verwendet, und das Zellhalteteil des integrierten Zellhalteinstruments kann mit einem Kulturmedium ausgestattet sein. Da das integrierte Zellhalteinstrument von der Meßvorrichtung lösbar ist, kann jedes integrierte Zellhalteinstrument in einem gewöhnlichen Brutschrank für Zellkulturen plaziert und dann aus dem Brutschrank herausgenommen und in der Meßvorrichtung plaziert werden. Ist ferner eine Zellkultivierungseinrichtung vorgesehen, um eine Umgebung zum Kultivieren der Zellen auf dem integrierten Zellhalteinstrument zu wahren, können Langzeitmessungen erfolgen. Diese Zellkultivierungseinrichtung verfügt über eine Temperatureinstelleinrichtung zum Aufrechterhalten einer konstanten Temperatur, eine Einrichtung zum Zirkulierenlassen einer Kulturlösung und eine Einrichtung zum Zuführen eines Mischgases aus Luft und Kohlendioxid (z. B. 5% CO&sub2;).
Vorzugsweise verfügt das integrierte Zellhalteinstrument über mehrere Mikroelektroden, die in Matrixform (als Gitter) auf der Oberfläche einer Glasplatte angeordnet sind, Leitmuster zum Herausführen dieser Mikroelektroden, elektrische Kontaktpunkte, die mit Kantenteilen dieser Leitmuster verbunden sind, und eine Isolierbeschichtung als Abdeckung der Oberfläche dieser Leitmuster, und das Zellhalteteil ist in einem Bereich angeordnet, der die mehreren Mikroelektroden aufweist.
Durch Gebrauch einer durchsichtigen Glasplatte als Substrat erleichtern sich optische Beobachtungen der Zellen. Daher ist bevorzugt, daß die Leitmuster oder die Isolierbeschichtung auch im wesentlichen durchsichtig oder durchscheinend sind. Sind weiterhin die mehreren Mikroelektroden in Matrixform angeordnet, ist es leichter, Positionen von Elektroden festzulegen, an denen Stimulationssignale anliegen, oder Elektroden, an denen aus Zellaktivitäten entstehende Spannungssignale detektiert werden. Beispielsweise ist bevorzugt, 64 Mikroelektroden in 8 Spalten und 8 Reihen anzuordnen. Zusätzlich sollte die Oberfläche jeder Elektrode zur Verringerung von Oberflächenwiderstand und Erhöhung der Detektionsempfindlichkeit möglichst groß sein. Angesichts von Einschränkungen usw. als Ergebnis des Abstands zwischen Elektroden und der räumlichen Meßauflösung ist aber bevorzugt, daß jede Elektrode eine Oberfläche von 4 · 10² um² bis 4 · 10&sup4; um² hat.
Gemäß der Konfiguration der Erfindung kann das Fixieren der Glasplatte und Herausführen der Mikroelektroden nach außen leicht und genau erfolgen. Ferner ist bevorzugt, daß die elektrische Verbindungseinrichtung nicht nur den Halter fixiert, sondern auch eine Leiterplatte mit einem Außenverbindungsmuster aufweist, das mit dem Kontakt des Halters über einen Verbinder verbunden ist. Dadurch erleichtert sich die Verbindung mit Außeninstrumenten, d. h. mit einer Stimulationssignal-Zufuhreinrichtung und einer Signalverarbeitungseinrichtung. Für die Übertragung von Stimulationssignalen oder Detektionssignalen mit möglichst geringer Dämpfung und Verzerrung liegen der Kontaktwiderstand des elektrischen Kontaktpunkts mit dem Kontakt sowie der Kontaktwiderstand des Kontakts mit dem Verbinder beide vorzugsweise unter 30 mΩ.
Zusätzlich ist bevorzugt, daß die optische Beobachtungseinrichtung ein optisches Mikroskop sowie ein Bildaufnahmegerät und ein Bildanzeigegerät aufweist, die mit dem optischen Mikroskop verbunden sind. Anders ausgedrückt wird das durch ein Mikroskop vergrößerte Bild der Zellen durch ein Bildaufnahmegerät (z. B. eine Videokamera) aufgenommen und dann auf einem Bildanzeigegerät (z. B. einer Präzisionsanzeige) angezeigt, so daß es leichter ist, die Messung unter Beobachtung der Zellen und der Elektrodenposition durchzuführen. Weist stärker bevorzugt die optische Beobachtungseinrichtung ein Bildspeichergerät auf, lassen sich Meßergebnisse aufzeichnen.
Bei Verwendung eines Impulssignalgenerators als Stimulationssignal-Zufuhreinrichtung können zudem verschiedene Wellenformen als Stimulationssignale an den Zellen angelegt werden. Bevorzugt ist, daß die Signalverarbeitungseinrichtung einen Mehrkanalverstärker, der ein aus Zellaktivitäten herrührendes Detektionssignal verstärkt, und ein Mehrkanalanzeigegerät aufweist, das eine verstärkte Signalwellenform in Echtzeit anzeigt, und daß von mehreren Elektroden erhaltene Signalwellenformen (zeitliche Zellpotentialänderung) gleichzeitig angezeigt werden können.
Bevorzugt ist, daß ein Rechner vorgesehen ist, um das Stimulationssignal über einen D/A-Wandler auszugeben und gleichzeitig ein Ausgangssignal infolge von elektrophysiologischen Aktivitäten der Zellen über einen A/D-Wandler zu empfangen und zu verarbeiten. Dadurch kann das Stimulationssignal als optionale Wellenform auf dem Bildschirm bestimmt werden, oder eine Wellenform eines Detektionssignals kann auf dem Bildschirm angezeigt werden. Zusätzlich zu diesen Operationen ist es einfacher, diese Signale nach Verarbeitung in verschiedenen Formen anzuzeigen oder sie zu einem Plotter auszugeben oder zu speichern. Mit diesem Rechner lassen sich ferner die optische Beobachtungseinrichtung und die Zellkultivierungseinrichtung steuern.
Fig. 1 ist eine Perspektivansicht eines integrierten Zellhalteinstruments, das für eine Zellpotentialmeßvorrichtung in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet wird.
Fig. 2 ist eine Zusammenstellungszeichnung eines integrierten Zellhalteinstruments.
Fig. 3 ist eine Draufsicht auf 64: Mikroelektroden und Leitmuster, die in der Mitte einer Planarelektrode angeordnet sind, die ein integriertes Zellhalteinstrument aufweist.
Fig. 4 ist eine modellhafte Querschnittansicht einer Planarelektrode.
Fig. 5(A) und 5(B) sind eine Draufsicht bzw. eine Seitenquerschnittansicht eines Zustands, in dem eine Planarelektrode durch Halten zwischen einem oberen und einem unteren Halter fixiert ist.
Fig. 6 ist eine Perspektivansicht der Planarelektrode sowie des oberen und unteren Halters von Fig. 5(A) und 5(B).
Fig. 7 ist eine Seitenansicht eines an einem oberen Halter befestigten Kontakts.
Fig. 8 ist eine Zusammenstellungszeichnung eines integrierten Zellhalteinstruments im Blick aus der Gegenrichtung zu Fig. 2.
Fig. 9 ist ein Blockdiagramm einer Zellpotentialmeßvorrichtung in einer Ausführungsform der Erfindung.
Fig. 10(A) und 10(B) sind Diagramme eines Vergleichsbeispiels für eine Spannungswellenform als Ergebnis von Aktivitäten kultivierter Zellen in der Messung mit Hilfe eines in der Erfindung verwendeten integrierten Zellhalteinstruments bzw. einer Spannungswellenform in der Messung mit Hilfe einer herkömmlichen Allzweck-Glaselektrode (Elektrode zur extrazellulären Potentialmessung).
Fig. 11(A) bis 11(C) sind Darstellungen von Meßergebnissen des spontanen Potentials kultivierter Zellen in der Messung mit einer Vorrichtung der Erfindung.
Fig. 12(A) bis 12(C) sind Darstellungen von Meßergebnissen des evozierten Potentials kultivierter Zellen in der Messung mit einer Vorrichtung der Erfindung.
Die Erfindung wird nun anhand der beigefügten Zeichnungen und der folgenden Beispiele näher beschrieben. Die Beispiele dienen zur Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung der Erfindung auf irgendeine Weise zu verstehen.
Zunächst wird ein integriertes Zellhalteinstrument erläutert, das für eine Zellpotentialmeßvorrichtung der Erfindung zum Einsatz kommt. Das als Perspekaivansicht in Fig. 1 und als Zusammenstellungszeichnung in Fig. 2 gezeigte integrierte Zellhalteinstrument 1 verfügt über eine Planarelektrode 2, die mit mehreren Mikroelektroden und ihren Leiterstrukturen auf der Oberfläche einer Glasplatte angeordnet ist, geteilte Halter 3, 4 zum Fixieren der Planarelektrode durch Halten von oben und unten sowie eine Leiterplatte 5, an der diese Halter befestigt sind.
Die Planarelektrode 2 ist etwa die gleiche wie die in der JP-A-6-78889 u. a. offenbarte. Beispielsweise verfügt die Planarelektrode 2 über ein aus durchsichtigem Plexiglas hergestelltes Substrat mit 1,1 mm Dicke und 50 mm · 50 mm Größe, und in der Mitte dieses Substrats sind 64 Mikroelektroden 11 in 8 · 8-Matrixform angeordnet, wobei jede Mikroelektrode mit einem Leitmuster 12 verbunden ist (vgl.. Fig. 3). Jede der Elektroden 11 hat eine quadratische Größe von 50 um · 50 um (Fläche 25 · 10² um²), und der Mittenabstand zwischen benachbarten Elektroden beträgt 150 um. Ferner hat jede Seite des Substrats 16 elektrische Kontaktpunkte 7, was insgesamt 64 Punkte ergibt (vgl. Fig. 2). Diese elektrischen Kontaktpunkte 7 sind mit den in der Mitte des Substrats angeordneten 64 Mikroelektroden 11 so verbunden, daß sie den Leitmustern 12 1 : 1 entsprechen. Die 16 elektrischen Kontaktpunkte 7 auf jeder Seite sind mit einer Teilung von 1,27 mm angeordnet. Im folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung dieser Planarelektrode 2 anhand ihrer Querschnittansicht von Fig. 4 erläutert. Der Zweckmäßigkeit halber ist jedes Teil in Fig. 4 in vergrößertem Maßstab gezeigt.
Zum Beispiel wird ITO (Indium-Zinn-Oxid) so aufgebracht, daß es eine 150 nm dicke Schicht auf der Oberfläche einer Glasplatte 13 bildet, wonach diese zu den Leitmustern 12 mit Hilfe von Photoresist und Ätzen ausgebildet wird. Auf die Oberseite dieser Schicht wird ein negatives lichtempfindliches Polyimid in einer 1,4 um dicken Schicht aufgebracht, die dann zu einem Isolierfilm 14 auf ähnliche Weise ausgebildet wird. Die ITO-Schicht liegt an den Mikroelektroden und elektrischen Kontaktpunkten frei, und Nickel 15 mit 500 nm Dicke sowie Gold 16 mit 50 nm Dicke werden auf diese Teile aufgebracht. Ein zylindrischer Polystyrolrahmen 6 (vgl. Fig. 2) mit 22 mm Innendurchmesser, 26 mm Außendurchmesser und 8 mm Höhe wird (über ein Leitmuster 8 und einen Isolierfilm 9) mit einem Silikonkleber auf die Glasplatte 13 geklebt. Dieser zylindrische Polystyrolrahmen 6 ist so fixiert, daß seine Mitte der Mitte der Glasplatte 13 entspricht, d. h. dem Mittelteil der 64 Mikroelektroden, und das Innere des Polystyrolrahmens 6 zu einem Zellhalteteil wird. Das Innere dieses Polystyrolrahmens 6 wird mit Lösung gefüllt, die 1 Gew.-% Chlorplatinsäure, 0,01 Gew.-% Bleiacetat und 0,0025 Gew.-% Salzsäure aufweist. Ein elektrischer Strom von 20 mA/cm² wird 1 Minute erzeugt, um Platinschwarz 11a auf die Oberfläche der Goldplattierung der Mikroelektroden abzuscheiden.
Als nächstes werden die geteilten Halter 3, 4 zum Fixieren der Planarelektrode 2 durch Halten von oben und unten erläutert. Gemäß Fig. 2 sind die z. B. aus Harz hergestellten Halter 3, 4 mit einem Bühnenteil zum Halten eines Rahmenteils der Planarelektrode 2 und mit einer rechtwinkligen Öffnung im Mittelteil versehen. Der obere Halter 3 ist mit einem Paar Spannvorrichtungen 8 sowie 16 · 4 Kontaktpaaren 9 versehen.
Eine Draufsicht auf die Halter 3, 4, die die Planarelektrode 2 halten und fixieren, ist in Fig. 5(A) gezeigt, ihre Seitenansicht (Querschnittansicht B-B) zeigt Fig. 5(B), und ihre Perspektivansicht von unten ist in Fig. 6 gezeigt. Wie aus diesen Zeichnungen klar hervorgeht, ist die Spannvorrichtung 8 an zwei gegenüberliegenden Seiten des oberen Halters 3 durch einen Achsstift 8a schwenkbar. Ferner ist eine Nut 4a auf zwei gegenüberliegenden Seiten des unteren Halters 4 in der Unterseite gebildet. Durch Einpassen eines konvexen Teils 8b der Spannvorrichtung 8 in die Nut 4a werden der obere und untere Halter 3, 4 mit der dazwischen gehaltenen Planarelektrode 2 sicher fixiert.
Die 64 Kontakte 9, die im oberen Halter 3 so angeordnet sind, daß sie den elektrischen Kontaktpunkten 7 der Planarelektrode 2 entsprechen, werden durch Bearbeiten eines elastischen, leitenden Metallblechs gebildet, z. B. eines Blechs, das mit Ni und Au beschichtetes BeCu aufweist, und der Kontakt 9 hat eine Form gemäß Fig. 7. Anders ausgedrückt verfügt der Kontakt 9 über ein Stiftteil 9a und dessen Basisteil 9b sowie ein bewegliches Kontaktteil 9d, das sich vom Basisteil 9b über ein gekrümmtes Teil 9c erstreckt. Gemäß diesem Aufbau kann sich das bewegliche Kontaktteil 9d elastisch gegen das Basisteil 9b verschieben. Der obere Halter 3 hat 64 (16 · 4) Löcher, in denen die Teile 9a der Kontakte 9 eingesetzt sind, und die gleiche Anzahl von Nuten ist ebenfalls gebildet, in die sich die Basisteile 9b einpassen.
Gemäß Fig. 2 und Fig. 5(B) steht das Stiftteil 9a vom oberen Halter 3 an dem Punkt vor, wo der Kontakt 9 in das o. g. Loch und die Nut eingesetzt und fixiert ist. Durch abwechselndes Anordnen der Kontakte 9 mit zwei unterschiedlichen Längen des Basisteils 9b sind 16 vom oberen Halter 3 vorstehende Stiftteile 9a in zwei versetzten Reihen anordnet. Dieses Stiftteil 9a ist mit einem Verbinder verbunden, der auf einer Leiterplatte 5 angeordnet ist, die zur Verbindung nach außen dient.
Andererseits steht das bewegliche Kontaktteil 9d des Kontakts 9 von der Unterseite des oberen Halters 3 an dem Punkt vor, wo der Kontakt 9 in den Halter und die Nut des oberen Halters 3 eingesetzt und fixiert ist. Diese Anordnung zeigt Fig. 8, die eine Zusammenstellungszeichnung im Blick von der Gegenseite zur Zusammenstellungszeichnung von Fig. 2 ist. In diesem Zustand ist die Planarelektrode 2 zwischen den Haltern 3, 4 fixiert, das bewegliche Kontaktteil 9d jedes Kontakts 9 berührt den elektrischen Kontaktpunkt 7 der Planarelektrode 2, und ein vorbestimmter Kontaktdruck wird infolge der elastischen Verformung des gekrümmten Teils 9c auf das Kontaktteil ausgeübt. Dadurch ist der elektrische Kontaktpunkt 7, der mit der Mikroelektrode 11 der Planarelektrode 2 über das Leitmuster 12 verbunden ist, mit einem kleinen Kontaktwiderstand (unter 30 mΩ) mit dem Kontakt 9 verbunden.
Im folgenden wird die Leiterplatte 5 erläutert. Diese Leiterplatte 5 dient nicht nur zum Fixieren der Zusammenstellung aus der Planarelektrode 2 und den Haltern 3, 4, sondern auch zum Herausführen einer elektrischen Verbindung über den Verbinder beginnend von der Mikroelektrode 11 der Planarelektrode 2 über das Leitmuster 12 und den elektrischen Kontaktpunkt 7 zum Kontakt 9. Ferner erleichtert diese. Leiterplatte 5 Verfahrensabläufe zur Handhabung, z. B. zum Anbau an die Meßvorrichtung.
Diese Leiterplatte 5 weist ein Glas-Epoxidharz-Substrat auf, das mit doppelseitigen Mustern versehen ist, und gemäß Fig. 8 ist auf der Rückseite ein Verbinder 5a an vier Teilen angeordnet, die eine in der Mitte gebildete kreisförmige Öffnung umgeben. Durch Einstecken der 16 Stiftteile 9a, die in zwei versetzten Reihen von den vier Oberflächenteilen des oberen Halters 3 vorstehen, in jeden entsprechenden Verbinder 5a wird die Zusammenstellung aus der Planarelektrode 2 und den Haltern 3, 4 an der Leiterplatte 5 fixiert und gleichzeitig elektrisch verbunden.
An einem Kantenteil 5b auf beiden Seiten der Leiterplatte 5 sind elektrische Kontaktpunkte in einer Teilung von 2,54 mm gebildet, die für eine doppelseitige Verbinderkante verwendet werden, und diese elektrischen Kontaktpunkte und die Verbinder 5a im Mittelteil sind durch Leitmuster 5c verbunden. Eine Innenreihe des doppelseitigen Verbinders 5a ist durch ein Oberflächenmuster gebildet, während eine Außenreihe durch ein Rückseitenmuster gebildet ist, und jedes der Kantenteile 5b ist mit 32 elektrischen Kontaktpunkten versehen, die für beide Seiten gemeinsam gebildet sind, was insgesamt 64 elektrische Kontaktpunkte ergibt. Zur Gewährleistung mechanischer Fixierung kann der obere Halter 3 an der Leiterplatte 5 mit einem Spannrahmen befestigt sein.
Eine bevorzugte Konfiguration einer Zellpotentialmeßvorrichtung unter Verwendung des wie oben konfigurierten integrierten Zellhalteinstruments 1 zeigt Fig. 9. Die Meßvorrichtung dieser Ausführungsform verfügt über das o. g. integrierte Zellhalteinstrument 1, eine optische Beobachtungseinrichtung 20 mit einem umgekehrten Mikroskop 21 für optische Beobachtungen von Zellen, die in diesem integrierten Zellhalteinstrument 1 plaziert sind, einen Rechner 30 mit einer Einrichtung zum Führen eines Stimulationssignals zu den Zellen und einer Einrichtung zum Verarbeiten eines Ausgangssignals von den Zellen und einer Zellkultivierungseinrichtung 40 zum Beibehalten eines geeigneten Kulturmediums für die Zellen.
Neben dem umgekehrten Mikroskop (z. B. "IMT-2-F" oder "IX70", hergestellt von Olympus Optical Co., Ltd.), in dem das integrierte Zellhalteinstrument 1 eingebaut ist, verfügt die optische Beobachtungseinrichtung 20 auch über eine für ein Mikroskop verwendete SIT-Kamera 22 (z. B. "C2400-08", hergestellt von Hamamatsu Photonics K. K.), eine Präzisionsanzeige 23 und ein Bilddatenpeichergerät 24 (z. B. "TQ-2600" oder "FTQ-3100", hergestellt von Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.). Eine SIT-Kamera bezeichnet allgemein Kameras, die einen statischen Induktionstransistor auf eine Bildaufnahmeröhre anwenden, wobei eine SIT-Kamera ein repräsentatives Beispiel für empfindliche Kameras ist. Die Präzisionsanzeige 23 kann aber auch als Anzeige für den Rechner 30 genutzt werden. Die zuvor in Klammern genannten spezifischen Geräte sind veranschaulichende Beispiele, und die Erfindung ist nicht nur auf diese Geräte beschränka. Dies gilt auch für die nachfolgend aufgeführten Beispiele.
Für den Rechner 30 kommt ein Personalcomputer (z. B. Windows-kompatibel) zum Einsatz, der mit einer A/D-Wandlerplatine und Meßsoftware ausgestattet ist. Die A/D-Wandlerplatine weist einen A/D-Wandler 31 und einen D/A-Wandler 32 gemäß Fig. 9 auf. Der A/D-Wandler 31 hat 16 Bit und 64 Kanäle, und der D/A-Wandlers 32 hat 16 Bit und 8 Kanäle.
Die Meßsoftware verfügt über Software zum Bestimmen notwendiger Bedingungen zur Zuführung eines Stimulationssignals oder Aufzeichnen von Bedingungen eines erhaltenen Detektionssignals. Mit dieser Art von Software kann der Rechner 30 nicht nur die Einrichtung zum Führen eines Stimulationssignals zu den Zellen und die Einrichtung zum Verarbeiten des Detektionssignals von den Zellen strukturieren, sondern auch die optische Beobachtungseinrichtung (die SIT-Kamera und das Bildspeichergerät) oder die Zellkultivierungseinrichtung steuern.
Im folgenden werden besonders brauchbare Spezifikationen für die Meßsoftware erläutert. Auf einem Rechnerbildschirm zur Parametereinstellung lassen sich komplizierte Stimulationsbedingungen durch Zeichnen einer Stimulationswellenform auf dem Bildschirm mit einer Tastatur oder. Maus bestimmen. Ferner werden Aufzeichnungsbedingungen so bestimmt, daß 64 Eingangskanäle, eine Abtastrate von 10 kHz und kontinuierliche Aufzeichnung über mehrere Stunden aktiviert werden. Festlegen läßt sich außerdem die Elektrode, die ein Stimulationssignal zuführt, oder die Elektrode, die ein Detektionssignal von den Zellen herausführt, indem man mit einer Maus oder einem Stift auf ein Mikroskopbild zeigt, das auf dem Bildschirm angezeigt ist. Daneben lassen sich verschiedene Bedingungen, z. B. Temperatur oder pH-Wert der Zellkultivierungseinrichtung 40, über die Tastatur bestimmen.
Ein Aufzeichnungsbildschirm zeigt ein spontanes Aktionspotential oder ein evoziertes Potential, das von den Zellen detektiert wird, in Echtzeit mit maximal 64 Kanälen an. Ferner kann das aufgezeichnete spontane Aktionspotential oder evozierte Potential über dem Mikroskopbild von Zellen angezeigt werden. Bei Messung des evozierten Potentials wird die gesamte Aufzeichnungswellenform angezeigt. Bei Messung des spontanen Aktionspotentials wird die Aufzeichnungswellenform nur angezeigt, wenn eine auftretende spontane Aktion durch eine Spike-Detektionsfunktion unter Verwendung eines Fensterdiskriminators oder Wellenformdiskriminators detektiert wird. Bei Anzeige der Aufzeichnungswellenform werden Meßparameter (z. B. Stimulationsbedingungen, Aufzeichnungsbedingungen, Temperatur, pH-Wert) zur Aufzeichnungszeit gleichzeitig in Echtzeit angezeigt. Außerdem ist eine Alarmfunktion für den Fall vorgesehen, daß eine Temperatur oder ein pH-Wert zulässige Grenzwerte überschreitet.
Auf einem Rechnerbildschirm zur Datenanalyse lassen sich FFT-Analysen, Kohärenzanalysen und Korrelationsanalysen durchführen. Zudem hat dieser Bildschirm andere Funktionen, z. B. eine Single-Spike-Trennfunktion unter Verwendung eines Wellenformdiskriminators, eine Temperaturprofil-Anzeigefunktion, eine Topographieanzeigefunktion, eine Analysefunktion für die elektrische Stromquellendichte. Ergebnisse dieser Analysen können dem im Bildspeichergerät gespeicherten Mikroskopbild überlagert angezeigt werden.
Bei Ausgabe eines Stimulationssignals vom wie zuvor konfigurierten Rechner 30 wird dieses Stimulationssignal über den D/A-Wandler 32 und einen Trenner 33 (z. B. "BSI-2", hergestellt von BAK Electronics Co., Ltd.) zu den Zellen weitergeleitet. Anders ausgedrückt wird das Stimulationssignal zwischen zwei Punkten angelegt, die aus den 64 Mikroelektroden 11 im integrierten Zellhalteinstrument 1 ausgewählt sind. Danach wird ein zwischen jeder der Mikroelektroden und einem Massepegel (Potential der Kulturlösung) entstehendes evoziertes Potential in den Rechner 30 über 64 Kanäle eines empfindlichen Verstärkers 34 (z. B. "AB-610J", hergestellt von Nihon Koden Co., Ltd.) und den A/D-Wandler 31 eingegeben. Der Verstärkungsfaktor des Verstärkers 34 beträgt 100 dB, und das Frequenzband beträgt 0 bis 10 kHz. Bei Messung eines evozierten Potentials durch ein Stimulationssignal ist dagegen das Frequenzband auf 100 Hz bis 10 kHz mit einem tiefenbeschneidenden Filter festgelegt.
Außerdem ist die Zellkultivierungseinrichtung 40 mit einem Temperatureinsteller 41, einer Zirkulationseinrichtung 42 für Kulturlösung und einer Einrichtung 43 zum Zuführen eines Mischgases aus Luft und Kohlendioxid versehen. Im Grunde kann die Zellkultivierungseinrichtung 40 ein Produkt in Äquivalenz zu einem Kleinbrutschrank, z. B. "PDMI-2" und ein Produkt in Äquivalenz zu einer Temperatursteuerung, z. B. "TC-202", (beide Produkte von Medical Systems Co., Ltd.) aufweisen, und es kommt z. B. eine CO&sub2;-Bombe zum Einsatz. Dieser Kleinbrutschrank kann die Temperatur im Bereich von 0 bis 50ºC durch ein Peltier-Element steuern, und dieser Kleinbrutschrank kann eine Flüssigkeitsabgabegeschwindigkeit unter 3,0 ml/min und eine Luftzufuhrgeschwindigkeit unter 1,0 l/min handhaben. Alternativ kann ein Kleinbrutschrank mit integrierter Temperatursteuerung (z. B. "IMT2-IBSV", hergestellt von Olympus Optical Co., Ltd.) verwendet werden.
Zuvor wurde eine bevorzugte Ausführungsform der Zellpotentialmeßvorrichtung der Erfindung erläutert. Allerdings ist die Zellpotentialmeßvorrichtung der Erfindung nicht nur auf diese Ausführungsform beschränkt und kann z. B. in verschiedenen, nachfolgend beschriebenen Formen realisiert sein.
Obwohl eine Einrichtung zum Zuführen eines Stimulationssignals einen Rechner und einen D/A-Wandler in der o. g. Ausführungsform aufweist, kann diese Einrichtung über einen Allzweck- oder Spezialimpulssignalgenerator verfügen. Hierbei ist das Stimulationssignal vorzugsweise als bipolarer konstanter Spannungsimpuls mit einem Paar aus einem positiven und negativen Impuls zum Beseitigen von Artefakten festgelegt, d. h. zum Verhindern, daß Gleichspannungskomponenten fließen. Zusätzlich ist bevorzugt, ihn in einen konstanten elektrischen Stromimpuls umzuwandeln, um übermäßigen elektrischen Stromfluß zu verhindern. Zum Beispiel weist das Stimulationssignal vorzugsweise einen positiven Impuls mit einer Impulsbreite von 100 us, ein Intervall von 100 us und einen negativen Impuls von 100 us auf, und vorzugsweise liegt der elektrische Spitzenstrom des Positiv-Negativ-Impulses im Bereich von 30 bis 200 uA.
Durch Einbau der Zellkultivierungseinrichtung 40 in die Meßvorrichtung sind ferner kontinuierliche Messungen über lange Zeitspannen möglich. Alternativ läßt sich die Vorrichtung so konfigurieren, daß Probezellen in einem integrierten Zellhalteinstrument plaziert und in einem Brutschrank kultiviert werden, der getrennt von der Meßvorrichtung vorgesehen ist, und so, daß das integrierte Zellhalteinstrument nur für eine vergleichsweise kurze Messung aus dem Brutschrank entnommen wird, um in die Meßvorrichtung eingebaut zu werden. In diesem Fall ist die Zellkultivierungseinrichtung 40 nicht unbedingt in der Meßvorrichtung vorgesehen.
Unter Verwendung dieser Zellpotentialmeßvorrichtung wurden Nervenzellen oder -organe wirklich auf dem integrierten Zellhalteinstrument kultiviert, und es wurde die Potentialänderung gemessen, die mit Aktivitäten der Nervenzellen oder Nervenorgane einhergeht. Im folgenden wird ein Beispiel für diese Messung beschrieben. Hirnrindenschnitte von Ratten wurden als Nervenorgane verwendet, die gemäß einem Verfahren kultiviert wurden, das später in einer Ausführungsform beschrieben wird.
Zunächst werden Vergleichsergebnisse einer Spannungswellenform in der Messung mit einem integrierten Zellhalteinstrument der Erfindung und einer Spannungswellenform in der Messung mit einer herkömmlichen Allzweckglaselektrode (Elektrode zur extrazellulären Potentialmessung) beschrieben. Als Probe kamen Nervenorgane zum Einsatz, die 14 Tage kultiviert wurden. Ein Stimulationssignal wurde zwischen zwei benachbarten Elektroden einer Planarelektrode mit dem integrierten Zellhalteinstrument angelegt, und eine Wellenform der evozierten Potentialänderung wurde als Funktion der Zeit gemessen, die an 8 Elektroden nahe den beiden Elektroden induziert wurde. Zum Vergleich wurden Glaselektroden nacheinander in die Umgebung der o. g. acht Elektroden unter Verwendung eines dreidimensionalen Mikromanipulators transferiert, und die gleiche Spannungswellenform wurde gemessen.
Als Vergleichsergebnis der Spannungswellenform in der Messung mit einer Planarelektrode (integriertes Zellhalteinstrument) und der Wellenform in der Messung mit der Glaselektrode an acht Teilen wurde deutlich, daß beide Wellenformen an allen Teilen sehr ähnlich waren. In Fig. 10(A) und Fig. 10(B) sind repräsentative Beispiele für diese Wellenformen gezeigt. Fig. 10(A) zeigt eine mit Planarelektrode gemessene Wellenform, und Fig. 10(B) zeigt eine mit Glaselektrode gemessene Wellenform. Beim Vergleich beider Wellenformen wird klar, daß ein geringfügiger Unterschied in den Frequenzkennwerten vorliegt. Verglichen mit der Messung mit Planarelektrode zeigt die Messung mit Glaselektrode eine kleine Beeinträchtigung der Nachlaufeigenschaft bei schneller Potentialänderung. Als Grund dafür gilt eine Kapazitätsdifferenz zwischen Glaselektrode und Planarelektrode.
Als nächstes wurde ein Experiment durchgeführt, um die Beziehung zwischen aufeinanderfolgenden Kultivierungstagen von Nervenorganen auf einem integrierten Zellhalteinstrument und der sich aus Zellaktivitäten ergebenden Potentialverteilung zu untersuchen. Vor dem Kultivieren der Zellen wurde die Oberfläche einer Planarelektrode mit Kollagengel zum Erhöhen des Haftvermögens jeder Elektrode in der Planarelektrode an den Zellen abgedeckt. Anders ausgedrückt wurde Kollagengel in einer Dicke unter 50 um auf der Oberfläche jeder mit Platinschwarz beschichteten Elektrode und auch auf der Oberfläche einer Isolierbeschichtung in ihrer Umgebung gemäß der vorstehenden Beschreibung gebildet. Danach wurde auf die Oberseite des Kollagengels und auch dort, wo eine Mikroelektrode vorhanden war, ein Rattenhirnrindenschnitt (Dicke unter 500 um) plaziert und kultiviert. Meßergebnisse des spontanen Potentials sind in Fig. 11(A) bis 11(C) gezeigt, und Meßergebnisse des evozierten Potentials bei Zuführung eines Stimulationssignals sind in Fig. 12 dargestellt.
Fig. 11(A) zeigt ein mikroskopisches Bild der Probezellen und. Mikroelektroden, und Wellenformen des spontanen Potentials in der Messung an sieben mit 1 bis 7 in diesem Bild bezeichneten Elektrodenteilen sind in Fig. 11(B) und Fig. 11(C) dargestellt. Fig. 11(B) ist eine Wellenform in der Messung am sechsten Tag nach Kultivierung, und Fig. 11(C) ist eine Wellenform in der Messung am zehnten Tag nach Kultivierung. Der Maßstab des mikroskopischen Bilds, die Zeit der Meßwellenformen und der Spannungsmaßstab sind in der Zeichnung angegeben. Anhand der Meßergebnisse bestätigt sich z. B., daß am sechsten Tag nach Kultivierung die an jeder Elektrode gemessenen spontanen Aktivitäten der Zellen schwach sind und sich synchrone Eigenschaften der Elektroden kaum beobachten lassen, während am zehnten Tag nach Kultivierung eine große Anzahl von Zellen gleichzeitig aktiv werden, was darauf Verweist, daß die synchronen Elektrodeneigenschaften zunahmen.
Fig. 12(A) zeigt ebenfalls eine mikroskopische Ansicht der Probezellen und Mikroelektroden. Durch Bildverarbeitung, die zur Meßsoftware im o. g. Rechner gehört, wurden eine Kontur der Zellen und die Positionen jeder Elektrode aus dem mikroskopischen Bild auf dem Bildschirm dargestellt. Ferner wurde darauf die an jeder Elektrode gemessene Spannungswellenform angezeigt, was Fig. 12(B) und Fig. 12(C) zeigen. Fig. 12(B) zeigt eine Verteilung des evozierten Potentials am fünften Tag nach Kultivierung, und Fig. 12(C) zeigt sie am zehnten Tag nach Kultivierung. Ein Elektrodenpaar, das oben rechts mit "+" und "-" dargestellt ist, sind Elektroden, an denen ein Stimulationssignal angelegt wurde. Genau über einem kleinen Quadrat als Positionsdarstellung jeder Elektrode ist eine durch diese Elektrode gemessene Wellenform angezeigt. In diesen Wellenformen ist ein Teil, in dem man den großen senkrechten Ausschlag am linken Ende beobachtet, ein direkt dem Stimulationssignal entsprechendes Artefakt, und die Potentialänderung nach dem Artefakt zeigt wirkliche Zellaktivitäten an. Als Ergebnis dieser Messungen bestätigte sich z. B., daß am fünften Tag nach Kultivierung die Zellaktivitäten auf eine Stelle begrenzt sind, die vergleichsweise nahe an den Elektrodenpositionen liegt, an denen das Stimulationssignal anliegt, aber am zehnten Tag nach Kultivierung die Zellaktivitäten in einem breiten Bereich beobachtet werden können und ihr Ausmaß (Amplitude) größer wird.
Im folgenden werden Beispiele für ein geeignetes Kulturverfahren für Hirnrindenschnitte erläutert.

1) Kulturmedium

Die im folgenden aufgeführten Zusatzstoffe wurden einem Kulturmedium zugegeben, in dem Dulbecco-modifiziertes Medium nach Eagle und HamF-12-Medium in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 gemischt waren (Medien hergestellt von Gibco Co., Ltd. 430-2500EB).
- Glucose, Gibco Co., Ltd. 820-5023IN, 2,85 mg/l (insgesamt 6 mg/l zusammen mit Glucose, die im o. g. Kulturmedium ursprünglich vorhanden war
- Putrescin, Sigma Co., Ltd. P5780, 100 uM
- Progesteron, Sigma Co., Ltd. P8783, 20 nM
- Hydrocortison, Sigma Co., Ltd. H0888, 20 nM
- Natriumselenit, Wako Co., Ltd. 198-0319, 20 nM
- Insulin, Sigma Co., Ltd. I6634, 5 mg/l
- Transferrin, Sigma Co., Ltd. T147, 100 mg/l
- Natriumbicarbonat, Sigma Co. Ltd., 2,438 g/l
- Zugabe einer geeigneten Menge von 1 N HCl oder 1 N NaOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.
Nach Zugabe der o. g. Zusatzstoffe erfolgten Filtration und Sterilisation, und das Kulturmedium wurde bei 4ºC und gebrauchsfertig konserviert. Im folgenden wird dieses Kulturmedium einfach als "Kulturmedium" bezeichnet.

2) Struktur einer Aufnahme auf einer Planarelektrode

Zum zweckmäßigen Kultivieren von Nervenzellen oder Nervenorganen auf einer Planarelektrode wurde ein Polystyrolzylinder mit 22 mm Innendurchmesser, 26 mm Außendurchmesser und 8 mm Höhe in den folgenden Schritten aufgeklebt:
(a) Auf die Unterseite eines Polystyrolzylinders (22 mm Innendurchmesser, 26 mm Außendurchmesser, 8 mm Höhe) wurde eine ausreichende Menge flüssiger Silikonkleber (Dow Corning Co., Ltd. 891 oder Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. KE-42RTV) aufgetragen.
(b) Die Mitte eines Glassubstrats in der Planarelektrode und die Mitte des Polystyrolzylinders wurden sorgfältig in Übereinstimmung gebracht und dann in diesem Zustand verklebt.
(c) Durch 24-stündiges Belassen in einer Umgebung, in die kaum Staub eindringt, wurde der Kleber verfestigt.
(d) Nach 5-minütigem Eintauchen in 70%iges Äthanol erfolgte die Sterilisation durch Lufttrocknung in einem Reinprüfstand, wonach der Aufbau zum Bearbeiten der Elektrodenoberfläche bereit ist.

3) Bearbeitung der Elektrodenoberfläche

Zur Erhöhung des Zellhaftvermögens an der Oberfläche einer Planarelektrode wurde Kollagengel auf der Oberfläche der Elektrode durch das nachfolgend beschriebene Verfahren gebildet. All diese Betriebsabläufe wurden in einer sterilisierten Atmosphäre durchgeführt.
(a) Lösungen A, B und C wurden hergestellt und eisgekühlt.
A. Kollagenlösung mit 0,3 Vol.-% verdünnter Salzsäure (pH-Wert 3,0, Nitta Gelatin Co., Ltd. Cellmatrix Type I-A).
B. Lösung mit einem Mischmedium aus Dulbecco-modifiziertem Medium nach Eagle und HamF-12-Medium, gemischt in einem Volumenverhältnis 1 : 1 (Gibco Co., Ltd. 430-2500EB), die nicht mit Natriumbicarbonat versehen und mit 10-fach höherer Konzentration als zum Normalgebrauch hergestellt ist, wonach Filtration und Sterilisation daran durchgeführt wurden.
C. 2,2 g Natriumbicarbonat und 4,77 g HEPES (hergestellt von Gibco Co., Ltd. 845-1344 IM) wurden in 100 ml 0,05 N Natriumhydroxidlösung gelöst, wonach Filtration und Sterilisation daran durchgeführt wurden.
(b) Beim Abkühlen wurden die Lösungen A, B und C in einem Volumenverhältnis von 8 : 1 : 1 gemischt. Hierbei wurden zunächst A und B gründlich gemischt, wonach C zum Einmischen zugegeben wurde.
(c) In eine Aufnahme einer Planarelektrode, die zuvor auf etwa 4ºC abgekühlt war, wurde 1 ml der Mischlösung von (b) nach und nach injiziert. Nachdem die gesamte Elektrodenoberfläche bedeckt war, wurde die Mischlösung mit einer Pasteur-Glaspipette möglichst weitgehend entfernt. Durch diesen Ablauf wurde eine Beschichtung aus der Mischlösung auf der Elektrodenoberfläche in einer Dicke unter 50 um gebildet.
(d) Durch 30-minütiges Erwärmen der mit der Mischlösungsbeschichtung bedeckten Planarelektrode bei 37ºC kam es zum Gelatinieren der Mischlösung, und es wurde eine Kollagengelmatrix gebildet.
(e) 1 ml sterilisiertes Wasser wurde in die Aufnahme der Plänarelektrode zugegeben, und etwa 5 Minuten später wurde das Wasser entfernt, wodurch gewaschen wurde.
(f) Der Ablauf von Schritt (e) wurde zwei mal wiederholt (insgesamt 3 mal)
(g) 1 ml des Kulturmediums (außer Insulin und Transferrin) wurde nach und nach in die Aufnahme der Planarelektrode injiziert und in einem CO&sub2;-Brutschrank unter folgenden Bedingungen konserviert: Temperatur 37ºC, relative Luftfeuchtigkeit mindestens 97%, CO&sub2;-Konzentration 5% und Luftkonzentration 95%, wonach die Gebrauchsbereitschaft hergestellt war.

4) Kultur aus Nervenzellen oder Nervenorganen

Allgemein lassen sich Kulturformen in zwei Arten unterteilen. Dabei handelt es sich um eine dissoziierte Zellkultur aus Nervenzellen und eine organtypische Schnittkultur eines Nervenorgans. Jede Form wird im folgenden erläutert.

4-1) Dissoziierte Hirnnervenzellenkultur aus der Sehrinde von Ratten

Die folgenden Abläufe wurden alle in einer sterilisierten Atmosphäre durchgeführt:
(a) Gehirne von SD-Rattenföten am 16.-18. Graviditätstag wurden entnommen und in vereistes Mineralsalzmedium nach Hanks (hergestellt von Gibco Co., Ltd. 450-1250EB) eingelegt.
(b) Aus den Gehirnen im vereisten Mineralsalzmedium nach Hanks wurden die Sehrinden herausgeschnitten und in minimal essentielle bzw. Minimalmediumflüssigkeit (hergestellt von Gibco Co., Ltd. 410-1100EB) überführt.
(c) In der Minimalmediumflüssigkeit wurden die Sehrinden in möglichst kleine Stücke mit maximal 0,2 mm² geschnitten.
(d) Die kleinstückig geschnittenen Sehrinden wurden in Reagenzgläser zur Zentrifugaltrennung gegeben, und nach dreimaligem Waschen mit calcium- und magnesiumfreiem Mineralsalzmedium nach Hanks wurden sie in einem geeigneten Volumen der gleichen Flüssigkeit dispergiert.
(e) In die Reagenzgläser zur Zentrifugaltrennung von Schritt (d) wurde calcium- und magnesiumfreies Mineralsalzmedium nach Hanks mit 0,25% gelöstem Trypsin zugegeben, um das Gesamtvolumen zu verdoppeln. Unter leichtem Rühren konnten enzymatische Prozesse ablaufen, während die Lösung 15 Minuten konstant auf 37ºC gehalten wurde.
(f) Zum Kulturmedium nach 1) (das Zusatzstoffe enthielt, im folgenden kurz Kulturmedium genannt) wurden 10 Vol.-% fötales Kälberserum zugegeben, wonach sie in die Schritt (e) unterzogenen Reagenzgläser zur Zentrifugaltrennung gegeben wurde, um das Gesamtvolumen weiter zu verdoppeln. Mit einer Pasteur-Glaspipette mit verringertem Durchmesser, hergestellt durch Feuerpolieren des Spitzenendes mit einem Brenner, wurden bei vorsichtiger Pipettierwiederholung (maximal etwa 20 mal) die Zellen getrennt.
(g) Es erfolgte ein 5-minütiges Zentrifugieren bei 9806,65 m/s2 (d. h. 1000 g). Nach Zentrifugierabschluß wurde der Überstand weggegossen, und der Niederschlag wurde im Kulturmedium suspendiert, das 5 Vol.-% fötales Kälberserum enthielt.
(h) Schritt (g) wurde weitere zweimal wiederholt (insgesamt 3 mal).
(i) Das abschließend erhaltene Präzipitat wurde im 5 Vol.-% fötales Kälberserum enthaltenden Kulturmedium suspendiert, und mit einem Erythrozytometer wurde die Zellkonzentration in der Suspensionsflüssigkeit gemessen. Nach der Messung wurde mit einem ähnlichen Kulturmedium die Zellkonzentration auf 2 bis 4 · 106 Zellen/ml eingestellt.
(j) Eine Planarelektrode, die in einem CO&sub2;-Brutschrank nach Durchlaufen des Verfahrens der o. g. Schritte 1)-3) konserviert war, wurde herausgenommen, das Kulturmedium (frei von Insulin und Transferrin) in der Aufnahme wurde entfernt, und 500 ul eines 5% fötales Kälberserum enthaltenden Kulturmediums wurden nach und nach neu injiziert. Ferner wurden 100 ul der Zellsuspensionsflüssigkeit mit der nach Schritt (i) eingestellten Zellkonzentration vorsichtig zugegeben und wieder im CO&sub2;-Brutschrank stehengelassen.
(k) Drei Tage nach Durchführung von Schritt (j) wurde die Hälfte des Kulturmediums durch neues ausgetauscht. Für das ausgetauschte Medium wurde das k Kulturmedium ohne fötales Kälberserum verwendet. Durch Reduzieren der Konzentration von fötalem Kälberserum kann das Wachstum anderer Zellen als Nervenzellen (z. B. Gliazellen) unterdrückt werden.
(1) Anschließend wurde die Hälfte des Mediums alle 1 bis 2 Tage auf ähnliche Weise ausgetauscht.

4-2) Kulturverfahren eines Rattenhirnrindenschnitts

(a) Gehirne von 2 Tage alten SD-Ratten wurden entnommen und in vereistes Mineralsalzmedium nach. Hanks eingelegt, das 0,25 Vol.-% D-Glucose enthielt.
(b) Im 0,25 Vol.-% D-Glucose enthaltenden vereisten Mineralsalzmedium nach Hanks wurden am Gehirn haftende Hirnhäute mit einer scharfen Pinzette sehr sorgfältig entfernt, um die Hirnrinde nicht zu verletzten.
(c) In etwa 500 um Entfernung von einem Kallus wurde eine Halbkugel der Hirnrinde ohne die Hirnhäute aus der Okzipitallappenseite zur Frontallappenseite entlang dem Kallus mit Hilfe einer Mikroschere herausgeschnitten, die für chirurgische Augeneingriffe verwendet wird.
(d) Anschließend wurde mit der für chirurgische Augeneingriffe dienende Mikroschere eine Hirnrinde senkrecht zum Querschnitt von Schritt (c) in einer Dicke von 200 bis 300 um herausgeschnitten, um einen Schnitt zu erzeugen.
(e) Die für chirurgische Augeneingriffe dienende Mikroschere diente ferner dazu, eine Größe des Schnitts auf etwa 1 mm · 1 mm einzustellen.
(f) Die im o. g. Punkt 3) "Bearbeitung der Elektrodenoberfläche" vorbereitete Planarelektrode wurde aus dem CO&sub2;- Brutschrank entnommen, und der Hirnrindenschnitt, dessen Größe eingestellt war, wurde mit einer Pipette mit einem Durchmesser von mindestens 2 mm sehr vorsichtig angesaugt, um den Schnitt nicht zu verletzen, und dann in eine Kulturaufnahme der Planarelektrode überführt.
(g) Mit einer Pasteur-Pipette, deren Spitzenende mit einem Brenner feuerpoliert war, wurde das Material auf der Elektrode so angeordnet, daß die Schichtstruktur des Kortex nach oben weist und auf der Elektrode plaziert ist, wobei darauf geachtet wurde, den Hirnrindenschnitt nicht zu verletzen.
(h) Nachdem der Hirnrindenschnitt auf der Planarelektrode plaziert war, wurde die Menge des Kulturmediums so eingestellt, daß eine Basis des Schnitts das Kulturmedium berührte, während die Oberseite Außenluft ausgesetzt war.
(i) Nach Einstellen der Menge des Kulturmediums wurde die Planarelektrode in eine sterilisierte Petrischale gegeben, und etwa 5 ml sterilisiertes Wasser mit 37ºC wurden nach und nach in die Petrischale injiziert, um das Austrocknen des Kulturmediums zu verhindern, wonach es wieder im Co&sub2;- Brutschrank bebrütet wurde.
(j) Danach wurde das Medium einmal täglich durch neues ausgetauscht, während die Menge von Kulturmedium beachtet wurde. Die Menge von Kulturmedium wurde so bestimmt, daß sie die gleiche wie im Schritt (h) war.

Claims

1. Zellpotentialmeßvorrichtung zur Messung elektrophysiologischer Kennwerte von Zellen mit:

(A) einem integrierten Zellhalteinstrument (1), versehen mit mehreren Mikroelektroden (11) auf einer Substratplatte (2), einem Zellhalteteil (6) zum Plazieren von Zellen darauf und einer elektrischen Verbindungseinrichtung (3, 4, 5) zum Zuführen eines elektrischen Signals zu den Mikroelektroden und zum Herausführen eines elektrischen Signals von den Mikroelektroden;

(B) einer Stimulationssignal-Zufuhreinrichtung (30, 32, 33), die mit der elektrischen Verbindungseinrichtung des integrierten Zellhalteinstruments (1) zu verbinden ist, zum elektrischen Stimulieren der Zellen; und

(C) einer Signalverarbeitungseinrichtung (30, 31, 34), die mit der elektrischen Verbindungseinrichtung des integrierten Zellhalteinstruments zu verbinden ist, zum Verarbeiten eines Ausgangssignals als Ergebnis elektrophysiologischer Aktivitäten der Zellen, wobei die elektrische Verbindungseinrichtung einen geteilten Halter (3, 4) aufweist, der einen Kontakt (9) hat, der einen elektrischen Kontaktpunkt (7) infolge von elastischer Verformung berührt, und die Substratplatte (2) durch Halten der Platte an der Plattenoberseite und -unterseite fixiert.

2. Zellpotentialmeßvorrichtung nach Anspruch 1, ferner mit einer optischen Beobachtungseinrichtung (20) zum optischen Beobachten der Zellen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, ferner mit einer Zellkultivierungseinrichtung (40) zum Aufrechterhalten einer Umgebung zum Kultivieren von Zellen, die auf dem integrierten Zellhalteinstrument (1) plaziert sind.

4. Zellpotentialmeßvorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Zellkultivierungseinrichtung (40) aufweist: eine Temperatureinstelleinrichtung (41) zum Aufrechterhalten einer konstanten Temperatur, eine Einrichtung (42) zum Zirkulierenlassen einer Kulturlösung und eine Einrichtung (43) zum Zuführen eines Mischgases aus Luft und Kohlendioxid.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das integrierte Zellhalteinstrument (1) aufweist: mehrere Mikroelektroden (11), die in Matrixform auf der Oberfläche einer Glasplatte (13) angeordnet sind, Leitmuster (12) zum Herausführen der Mikroelektroden, elektrische Kontaktpunkte (7), die mit Kantenteilen dieser Leitmuster (12) verbunden sind, und eine Isolierbeschichtung (14), die die Oberfläche der Leitmuster (12) abdeckt, wobei das Zellhalteteil (6) in einem Bereich angeordnet ist, der die mehreren Mikroelektroden (11) aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mehreren Mikroelektroden (11) 64 Mikroelektroden aufweisen, die in 8 Spalten und 8 Reihen angeordnet sind.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Mikroelektroden (11) jeweils eine Elektrodenfläche von 4 · 10² um² bis 4 · 10&sup4; um² haben.

8. Zellpotentialmeßvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die elektrische Verbindungseinrichtung den geteilten Halter (3, 4) fixiert und ferner eine Leiterplatte (5) mit einem Außenverbindungsmuster aufweist, das mit dem Kontakt des Halters über einen Verbinder verbunden ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Kontaktwiderstand des elektrischen Kontaktpunkts (7) mit dem Kontakt (9) und der Kontaktwiderstand des Kontakts (9) mit dem Verbinder (5) beide unter 30 mΩ liegen.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die optische Beobachtungseinrichtung (20) aufweist: ein optisches Mikroskop (22) sowie ein Bildaufnahmegerät und ein Bildanzeigegerät (23), die mit dem optischen Mikroskop verbunden sind.

11. Zellpotentialmeßvorrichtung nach Anspruch 10, wobei die optische Beobachtungseinrichtung ferner ein Bildspeichergerät (24) aufweist.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Stimulationssignal-Zufuhreinrichtung (30) einen Impulssignalgenerator aufweist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Signalverarbeitungseinrichtung (30) aufweist: einen Mehrkanalverstärker (34), der ein Detektionssignal als Ergebnis von Zellaktivitäten verstärkt, und ein Mehrkanal-Anzeigegerät, das eine verstärkte Signalwellenform in Echtzeit anzeigt.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, ferner mit einem Rechner (30), der das Stimulationssignal über einen D/A-Wandler (32) ausgibt sowie ein Ausgangssignal als Ergebnis elektrophysiologischer Aktivitäten der Zellen über einen A/D-Wandler (31) empfängt und verarbeitet, wobei der Rechner (30) die optische Beobachtungseinrichtung (20) und die Zellkultivierungseinrichtung (40) steuert.