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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur nicht-invasiven Messung von Zellsignalen.
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Die
Kenntnis der exakten Signalform elektrisch aktiver Zellen ist von
Bedeutung für
die Evaluierung der Wirkungsweise von Testsubstanzen, wie z. B.
Medikamenten auf die Zellen.
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Die
Kenntnis der Signalform ist ebenso Vorraussetzung bei der Entwicklung
neuartiger Biosensoren und Implantate.
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Aus
dem Stand der Technik bekannt ist die sogenannte patch-clamp-Technik,
bei der die Leitfähigkeit
biologischer Membranen untersucht wird. Dabei wird die Membran einer
intakten Zelle mit Hilfe einer Mikropipette angesaugt und durch
den verwendeten Unterdruck an deren Rand versiegelt. Das Membranstück kann
aus der Zelle abgetrennt und in ein geeignetes Elektrolytbad eingetaucht
werden und die Leitfähigkeit
zwischen diesem und einer Elektrolytlösung innerhalb der Pipette
gemessen werden. Im inaktiven Zustand der Membran werden Widerstände im Gigaohm-Bereich
gefunden. In Abhängigkeit
von den in die Elektrolytlösung
zugesetzten Testsubstanzen oder einer angelegten Spannung können sich
Ionenkanäle öffnen, und
die Leitfähigkeit
steigt sprunghaft an.
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Die
Methode ermöglicht
den Nachweis der Wirkungsweise von Testsubstanzen auf spezifische Ionenkanäle.
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Aus
dem Stand der Technik sind ebenfalls nicht-invasive Messmethoden
bekannt. Die Zellen werden bei der Messung der Zellsignale mechanisch nicht
verletzt, so dass vorteilhaft Langzeitmessungen zur Wirkungsweise
der Testsubstanzen auf die Zellen ermöglicht werden.
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Elektrisch
spontan-aktive, aber auch zu elektrischer Aktivität stimulierbare
Zellen, wie z. B. Herzmuskelzellen, Skelettmuskelzellen oder Nervenzellen,
werden in einer Suspension mit den entsprechenden Nährmedien
auf eine oder mehrere Elektroden einer Messvorrichtung gegeben und
in einem Brutschrank unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Nach
einiger Zeit adhärieren
die Zellen auf den Elektrodenoberflächen.
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Zwischen
der Zellmembran der Zellen und den jeweiligen Elektrodenoberflächen liegt
ein mit Elektrolytlösung
gefüllter
Spalt geringen Volumens vor. Der Spalt steht mit der freien Elektrolytlösung, welche
die Zellen als Reservoir umgibt, in direktem Kontakt.
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Es
resultiert ein elektrisches Leitungsband im Adhäsionsbereich. Dieses Leitungsband
weist aufgrund des mit der Elektrolytlösung gefüllten Spaltes, die Eigenschaft
eines elektrischen Widerstandes RJ auf.
Die Leitfähigkeit
gJ des Leitungsbandes ergibt sich aus gJ = 1/RJ.
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Die
Elektrolytlösung
im Reservoir wird über einen
Metalldraht, z. B. mittels eines chlorierten Silber drahtes, mit
der Masse der Messvorrichtung verbunden und liegt somit auf Erdpotential.
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Die
elektrische Aktivität
der Zellen stellt unabhängig
von dem verwendeten Zelltyp und von der spontanen oder durch gezielte
Erregung ausgelösten elektrischen
Aktivität
den Fluss von Ionen wie z. B. Na+-, K+-, Ca2+- und anderen Ionen
durch die Ionenkanäle
der Zellmembran dar.
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Je
nach adhäriertem
Zelltyp und Testbedingungen wird zwischen einem Influx von Ionen
in bzw. einem Efflux von Ionen aus der Zelle unterschieden.
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Der
Ionenflux erfolgt durch die Ionenkanäle der Zellmembran, welche
in Wechselwirkung mit der die Zellen umgebenden Elektrolytlösung im
Reservoir steht. Die Ionenkanäle
werden durch Zugabe der Testsubstanzen aktiviert und ihre charakteristischen kinetischen
Eigenschaften, wie die Geschwindigkeit des Öffnens und Schließens oder
die Geschwindigkeit des Fluxes verändert.
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Die
Aktivität
der Zellen führt
spontan zur Änderung
der Ionenkonzentrationen in der Elektrolytlösung in der Umgebung der Zellen.
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Diese Änderung
fällt aufgrund
des geringen Volumens des Spaltes gegenüber dem großen Volumen des Reservoirs
im Spalt relativ stärker
aus. Die unterschiedlichen Ionenkonzentrationen im Spalt und in
der freien Elektrolytlösung
führen
zum Abfallen einer elektrischen Spannung über RJ.
Diese Spannungssignale werden mit der Elektrode, die im Spalt der
adhärierten
Zellmembran gegenüberliegt,
abgegriffen.
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Durch
Einsatz vieler Elektroden in Elektrodenarrays oder in parallelen
Reaktionsgefäßen, wird der
Messdurchsatz erhöht.
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Messtechnisch
betrachtet stellen die immobilisierten Zellen eine Stromquelle Isig und der mit Elektrolytlösung gefüllte Spalt
zwischen Zellmembran und Elektrodenoberfläche den Widerstand RJ = 1/gJ dar.
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Es
ist aus dem Stand der Technik bekannt, die Messvorrichtungen so
auszugestalten, dass die von der Elektrode abgegriffenen Signale über eine Anordnung
aus Kondensator mit einer Kapazität Cin und
einem Widerstand Rin an einen Verstärker gesendet
werden.
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Hiermit
wird vorteilhaft erreicht, dass der Biasstrom des Operationsverstärkers nicht
zur Elektrode fließt.
Zum anderen wird eine Filterung der Signale in Abhängigkeit
von deren Frequenz erhalten. In Abhängigkeit von den elektrischen
Eigenschaften des verwendeten Kondensators Cin und
des Widerstands Rin ist es möglich, bestimmte
Frequenzanteile aus den Signalen gemäß der Formel foff =
1/(Cin·Rin) als sogenannte cut-off-Frequenz herauszufiltern.
Bei gegebenen Werten von Ci n ≈ 1000 pF und
Rin ≈ 50 MΩ resultiert
eine nominelle Grenzfrequenz von 20 Hz.
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Nachteilig
ist es bisher mit derartigen Messvorrichtungen noch nicht gelungen,
derartig niederfrequente Anteile der Signale zu erfassen und mit
bestimmten Testsubstanzen in Beziehung zu setzen, obwohl dies an
Hand der Grenzfrequenz möglich sein
sollte.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Erfassung der von auf
Elektroden immobilisierten Zellen ausgehenden elektrischen Signale
bereit zu stellen, mit der breitbandig die Frequenzgänge der
von den Zellen ausgehenden Signale und auch deren niederfrequente
Signalanteile erfasst werden können.
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Die
Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Hauptanspruch gelöst. Vorteilhafte
Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf jeweils rückbezogenen
Patentansprüchen.
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Die
Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch
gekennzeichnet, dass die mit Zellen behaftete Elektrode zur Übertragung
induzierter Signale unmittelbar, das heißt direkt mit einem Verstärker verbunden
ist. Die Signale werden also nicht zunächst über eine Anordnung aus Kondensator
Cin und Widerstand Rin an
den Verstärker
geleitet.
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Hierdurch
wird vorteilhaft bewirkt, dass die Signale in einem vorhersehbaren
und breitbandigen Frequenzbereich verstärkt werden, der auch die niederfrequenten
Signalanteile umfasst. Breitbandig bedeutet, dass Frequenzanteile
größer 0,01
Hz ermittelt werden können.
Die Messung des Frequenzgangs zu hohen Frequenzen ist nicht limitiert.
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Es
wurde erkannt, dass die im Stand der Technik angegebenen Werte zum
verstärkten
Frequenzbereich nicht der Realität
entsprechen. Die tatsächliche
Grenzfrequenz beträgt
stattdessen mehr als 200 Hz. Die elektrischen Zellsignale in Form
zeitabhängiger
Spannungen darunter werden nicht erfasst.
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Gerade
dieser Frequenzbereich ist aber zum Nachweis der Wirksamkeit bestimmter
Testsubstanzen von besonderem Interesse, da sich die Zellsignale
aus dem zeitlichen Zusammenspiel aller beteiligten Ionenkanälen mit
ihren jeweiligen charakteristischen Eigenschaften zusammensetzen,
die zum Teil langsame und lang anhaltende, niederfrequente Signalanteile
verursachen. Die mit dem Stand der Technik ermittelten Signalformen
sind daher nicht aussagekräftig.
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Im
Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die Elektrode als Wachstumsoberfläche für die Zellen
eine Parallelschaltung, bestehend aus einer Kapazität Ce und einem Widerstand Re darstellt.
Deren Größe ist vom
Material der Elektrode aus z. B. Gold oder Platin, der Fläche, der
Form, der Oberflächenstruktur
und dem Kontakt zwischen den adhärierten
Zellen und der Elektrode abhängig.
Es wurde auch erkannt, dass in Schaltungen gemäß Stand der Technik der Widerstand
der Elektrode Re größer als der Widerstand Rin ist (Re > Rin).
Ebenfalls wurde erkannt, dass die Kapazität Ce der
Elektrode wesentlich kleiner als die Kapazität Cin ist
(Ce << Cin).
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Somit
stellt die Schaltung gemäß Stand
der Technik einen effektiven Hochpassfilter dar, dessen Grenzfrequenz
von der Kapazität
Ce der Elektrode und dem Widerstand Rin abhängig
ist, da Ce << Cin gilt. Bei Werten von Ce ≈ 100 pF und
Rin ≈ 50
MΩ resultiert
eine Grenzfrequenz von foff = 1/(Cin·Rin) = 200 Hz.
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Vorteilhaft
weist die erfindungsgemäße Vorrichtung
einen Operationsverstärker
OP mit einem Eingangswiderstand ROP > 1012 Ω auf.
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Bei
einer Kapazität
Ce der Elektrode von Ce = 100
pF wird vorteilhaft ein effektiver Hochpassfilter mit einer Grenzfrequenz
von 0,01 Hz bereit gestellt. Dies ermöglicht eine um den Faktor 20000
verbesserte niederfrequente Signalerfassung im Vergleich zum Stand
der Technik mit foff = 200 Hz, mit den bekannten
Auswirkungen auf die erweiterte Auswahl der Testsubstanzen und Aussagekräftigkeit
der Messergebnisse.
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Besonders
vorteilhaft wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung auch das Systemrauschen
drastisch verkleinert.
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Die
Rauschamplitude ist definiert durch den Term
mit k = Boltzmann-Konstante
(1,38 × 10
–23 J/K),
bei T = 293 K.
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Es
können
sämtliche
nicht-invasiv erfassten Signale der elektrischen Zellaktivität auf Elektroden mit
dieser extrem breitbandigen und zudem rauscharmen Schaltung ausgelesen
und verstärkt
werden.
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Ein
Elektrodenarrray, Biosensor oder Implantat umfasst hierzu mindestens
eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
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Im
Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und den beigefügten Figuren näher beschrieben.
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1 zeigt
eine Vorrichtung gemäß Stand der
Technik.
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2 zeigt
die erfindungsgemäße Vorrichtung.
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3 zeigt
beispielhaft ein mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgeleitetes
Zellsignal.
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4 bis 6 zeigen
den nachteiligen Einfluss eines zusätzlichen Widerstandes Rg, der dem Widerstand Rin gemäß Stand
der Technik entspricht auf die induzierten Signale im Vergleich
zu den durch die erfindungsgemäße Vorrichtung
gemessenen Signale.
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Gemäß 1 ist
die Elektrode über
eine Schaltung aus Kondensator mit Cin und
einem Widerstand Rin mit dem Verstärker verbunden.
Diese Anordnung bildet einen Hochpassfilter mit der Grenzfrequenz
foll = 1/(Cin·Rin) = 20 Hz, bei Cin ~ 1000pF und Ri n ~ 50MΩ.
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Frequenzen
mit einem geringeren Wert sollen durch die Vorrichtung herausgefiltert
werden.
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Die
Anordnung aus Kondensator Cin und Widerstand
Rin bildet, wie erläutert, zusammen mit dem auf
der Elektrode immobilisierten Zellen einen effektiven Hochpassfilter,
dessen Grenzfrequenz von der Elektrodenkapazität Ce und
dem Eingangswiderstand Rin abhängig ist,
da die Kapazität
der Elektrode Ce viel kleiner ist, als die
Kapazität
Ci n des dem Verstärker OP
vorgeschalteten Kondensators. Bei Werten von Ce =
100 pF und Rin = 50 MΩ resultiert ein tatsächlicher
Wert der Grenzfrequenz von foff = 200 Hz.
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Niederfrequente
Signale der elektrischen Zellaktivität werden herausgefiltert. Es
werden falsch negative Ergebnisse in Bezug auf die getesteten Substanzen
erzeugt.
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2 zeigt
die erfindungsgemäße Vorrichtung,
in der auf die Verwendung des Eingangswiderstandes Rin und
des Kondensators Cin verzichtet wurde, mit
Ce = 100 pF und ROP = 1012Ω.
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3 zeigt
exemplarisch ein mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgeleitetes
Signal einer Herzmuskelzelle einer embryonalen Ratte, die auf einer
Elektrode gewachsen ist.
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Das
Signal setzt sich zusammen aus einem sehr schnellen positiven Peak 1,
der der Depolarisation der Zellmembran entspricht. Hierauf folgt
ein sehr schneller negativer Peak 2, der auf den Na+-Influx durch die nur wenige Millisekunden
geöffneten, spannungsabhängigen Na+-Kanäle
zurückzuführen ist.
Hierauf folgt ein langsam abfallender und wieder ansteigender negativer
Signalanteil 3, der dem Ca2+-Influx
durch die mehrere Hundert Millisekunden geöffneten Ca2+-Kanäle entspricht.
Ein langsam ansteigender und wieder abfallender positiver Signalanteil 4 ist
auf den K+-Efflux durch die zeitlich verzögert, langanhaltend
geöffneten
K+-Kanäle
zurückzuführen.
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Die
Herzmuskelzellen zeigen charakteristische Aktionspotentiale. Sobald
ein Schrittmacherpotential aus dem Sinusknoten an den Zellen ankommt, laufen
die erläuterten,
zeitlich aufeinander folgenden Ereignisse ab. Erst bei Erreichen
des Schwellenpotentials öffnen
sich sehr schnell die spannungsgesteuerten Na+-Kanäle. Der
Na+-Einstrom
in die Zelle verursacht die schnelle Depolarisation der Zellmembran.
Dieser Vorgang ist in den extrazellulären Abteilungen als schneller
Peak 1 zu Beginn des Aktionspotentials zu sehen. Durch
Inaktivieren der Na+-Kanäle und Depolarisation werden
die Ca2+-Kanäle geöffnet. Durch
Ca2+-Einstrom wird die Kontraktion des Herzmuskels
ausgelöst
und das Membranpotential auf positive Werte gehalten. Während dieser
lang anhaltenden Depolarisation bleiben die Na+-Kanäle inaktiviert.
Mit Verzögerung öffnen lang
anhaltend die K+-Kanäle. Der resultierende K+-Ausstrom aus der Zelle repolarisiert die
Zellmembran.
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Zum
Nachweis der Funktionsweise der erfindungsgemäßen Schaltung gemäß der 2 bis 6 und
der Vorteile. gegenüber
dem Stand der Technik gemäß 1 wurde
in die erfindungsgemäße Schaltung
gemäß 2 ein
Nebenwiderstand RS mit unterschiedlicher
Größe (RS = 100MΩ,
10MΩ oder
1MΩ) eingefügt, der
in 4 mit dem Zustand K2 angegeben ist und Rin in 1 entspricht.
Die Schaltung K1 entspricht hingegen der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ohne Nebenwiderstand.
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Auf
den Elektroden wurden Herzmuskelzellen embryonaler Ratten ausplattiert
und inkubiert. Nach einigen Tagen wurde die spontane elektrische Aktivität dieser
Herzmuskelzellen mit Hilfe der Elektroden gemessen.
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In 5 und 6 sind
beispielhaft Spuren aus einer Messserie aufgeführt. Es ist die Signalamplitude
gegen die Zeit aufgetragen.
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In
der ersten Spur gemäß der 5A sind Messungen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ohne
den Nebenwiderstand abgebildet.
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Die
Zellsignale weisen deutlich sichtbar sowohl sehr schnelle, hochfrequente
Anteile, als auch sehr langsame, niederfrequente Anteile auf.
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Die
Einführung
des Nebenwiderstandes RS = 100MΩ (K2 in 4 und 5B) wie aus dem Stand der Technik bekannt,
führt zu
deutlichen Veränderungen
der aufgezeichneten Zellsignale. Niederfrequente Signalanteile sind
nicht nachweisbar. Es werden nachteilig nur hochfrequente Komponenten
in Form schmaler Peaks gemessen. Das Rauschen der Messanordnung,
erkennbar an der breiten Basislinie, ist im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Anordnung nachteilig
deutlich erhöht.
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Nebenwiderstände unterschiedlicher
Größe (vgl. 5C: R9 = 10MΩ, 5D: R3= 1 MΩ) haben neben
dem völligen
Verschwinden langsamer Signalkomponenten auch eine Verkleinerung
der Amplituden der hochfrequenten Signalanteile zur Folge. Durch
den Nebenwiderstand wird der Frequenzgang der Schaltung verändert. Der
Nebenwiderstand mit RS = 100 MΩ hat eine
Veränderung
von fo ff = 0,01
Hz (5A, Zustand K1) auf foff =
100 Hz zur Folge (vgl. 5C: foff = 1000 Hz, 5D:
foff = 10000 Hz). In 5B und 5C werden etwa die Signale wiedergegeben,
die mit dem Stand der Technik gemessen werden.
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In
den jeweils oberen Spuren der 6A und 6D (jeweils Zustand K1) sind Messungen
mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ohne den Nebenwiderstand dargestellt. Embryonale Rattenherzzellen wurden
auf den Elektroden kultiviert. Es ist erkennbar, dass sich die verschiedenen
Spuren in den Signalformen deutlich voneinander unterscheiden. 6A (Zustand K1) zeigt ausschließlich das
abgeleitete Signal der Membrandepolarisation. 6B und 6C (Zustand K1) zeigen neben der Depolarisation
zeitaufgelöst
die Aktivität
der Na+-, Ca2+-
und K+-Kanäle, wobei das Signal des Na+-Influxes in 6C nur
schwach aufgezeichnet wurde. Das Signal in 6D (Zustand
K1) besteht hingegen nur aus der Depolarisation und dem K+-Efflux. Die Unterschiede hinsichtlich der
Signalzusammensetzung ist darauf zurückzuführen, dass die Zellen in den
verschiedenen Versuchsansätzen
unterschiedlich auf den Elektroden adhäriert sind und somit die Signalübertragung
im Spalt zwischen Zelle und Elektrode verschieden ausgeprägt ist.
Die jeweiligen unteren Spuren der 6A–6D (Zustand K2) zeigen die aufgezeichneten
Signale nach Einführen
eines Nebenwiderstandes RS = 100MΩ. Unabhängig von
der ursprünglichen
Signalform sind nach Einführen
des Nebenwiderstandes ausschließlich
die schnellen, hochfrequenten Signalanteile erfasst. Sämtliche
langsamen, niederfrequenten Anteile des Ca2+-Influx
und K+-Efflux sind aus den Signalen vollständig herausgefiltert.
Ebenso hat das Signalrauschen durch den Nebenwiderstand zugenommen,
erkennbar an der breiteren Basislinie, im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Anordnung.
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Die
Verminderung der Amplitude, vor allem jedoch das Fehlen der niederfrequenten
Signalanteile hat nachteilig zur Folge, dass sich mit dem Stand der
Technik der Einfluss unterschiedlicher Testsubstanzen, die von größter pharmakologischer
Bedeutung sind, auf die Kinetik eines Teiles der an den Signalen
beteiligten Ionenkanäle
nicht nachvollziehen lässt,
da die langsamen, niederfrequenten Signalanteile der K+-
und Ca2+-Kanäle messtechnisch
nicht auflösbar
sind.
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Exemplarisch
seien an dieser Stelle verschiedene Testsubstanzen aufgeführt, die
einen Einfluss auf die Kinetik der Ionenkanäle besitzen und insofern die
niederfrequenten Signale beeinflussen.
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Noradrenalin
erhöht
beispielsweise die Offen-Wahrscheinlichkeit
der spannungsabhängigen Ca2+-Kanäle.
Dies hat eine erhöhte
Kontraktilität
des Herzens, eine erhöhte
Herzfrequenz und eine erhöhte
Erregungsleitung zur Folge.
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Verapamil
unterbindet den Ca2+-Influx durch Hemmung
der langsamen Ca2+-Kanäle, während zumindest im therapeutischen
Konzentrationsbereich der schnelle Na+-Einstrom
nicht beeinflusst wird. Carbachol aktiviert über den K+-Efflux
aus den Zellen. Dies hemmt vor allem die spontane Erregungsausbreitung
im Sinusknoten. Zugleich ist eine Inhibierung des Ca2+-Influxes
in die Zellen zu beobachten.
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Der
Einfluss derartiger Testsubstanzen lässt sich erst mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
erfassen.
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Die
nur beispielhaft dargestellten Signale ohne einen Nebenwiderstand
zeigen ein deutlich vermindertes Rauschen auf im Vergleich zu den
Messungen mit dem Nebenwiderstand. Dies ist daran zu erkennen, dass
die peak-to-peak-Breite der mit dem Nebenwiderstand gemessenen Signale
etwa 50–100%
größer ist,
als bei den Vergleichsmessungen ohne den Nebenwiderstand.
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Die
Vorrichtung ist somit zur breitbandigen und rauscharmen Signalwidergabe
besonders geeignet. Mit der Vorrichtung können Signale ab einer Grenzfrequenz
von insbesondere 0,01 Hz aufwärts breitbandig
aufgezeichnet werden. Das Rauschen der aufgezeichneten Signale liegt
je nach Güte
der Adhäsion
zwischen 10 μV
und 20 μV
oder kleiner.
