EP1810022A1 - Vorrichtung zur nicht -invasiven messung von zellsignalen - Google Patents

Vorrichtung zur nicht -invasiven messung von zellsignalen

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Publication number
EP1810022A1
EP1810022A1 EP05804560A EP05804560A EP1810022A1 EP 1810022 A1 EP1810022 A1 EP 1810022A1 EP 05804560 A EP05804560 A EP 05804560A EP 05804560 A EP05804560 A EP 05804560A EP 1810022 A1 EP1810022 A1 EP 1810022A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
signals
cells
electrode
frequency
cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05804560A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yi Zhang
Günter Wrobel
Norbert Wolters
Sven Ingebrandt
Hans-Joachim Krause
Ralph Otto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1810022A1 publication Critical patent/EP1810022A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the invention relates to a device for non-invasive measurement of cell signals.
  • B. heart muscle cells, skeletal muscle cells or nerve cells are placed in a suspension with the appropriate nutrient media on one or more electrodes of a measuring device and incubated in an incubator under suitable conditions Be ⁇ . After some time, the cells adhere to the electrode surfaces.
  • the gap is in direct contact with the free electrolyte solution surrounding the cells as a reservoir.
  • This conduction band has the property of electrical resistance Rj due to the gap filled with the electrolyte solution.
  • the conductivity g ⁇ of the conduction band results in an electrical conduction band in the adhesion area.
  • the electrolyte solution in the reservoir is via a Me ⁇ talldraht, z. B. by means of a chlorinated Silberdrah ⁇ tes, connected to the mass of the measuring device and is thus at ground potential.
  • the electrical activity of the cells irrespective of the type of cell used and of the spontaneous or triggered by targeted excitation electrical Akti ⁇ vity the flow of ions such. B. Na + -, K + -, Ca 2+ - and other ions through the ion channels of the cell membrane.
  • ion flux takes place through the ion channels of the cell membrane, which interacts with the electrolyte solution surrounding the cells in the reservoir.
  • the ion channels are activated by addition of the test substances and their characteristic kinetic properties, such as the speed of opening and closing or the speed of the flux, are changed.
  • the activity of the cells leads spontaneously to change the ion concentrations in the electrolyte solution in the vicinity of the cells.
  • the immobilized cells provide a current source I s i g and the gap between the cell membrane and the electrode surface filled with electrolyte solution represents.
  • the object of the invention is to make available a device for detecting the electrical signals emanating from electrodes immobilized on electrodes, with which the frequency responses of the signals emanating from the cells and also their low-frequency signal components can be detected over a broadband range.
  • the device according to the invention is characterized gekenn ⁇ characterized in that the electrode afflicted with cells for the transmission of induced signals directly, that is directly connected to an amplifier.
  • the signals are thus not first supplied to the amplifier via an arrangement of capacitor Ci n and resistor R ⁇ n .
  • the electrode as the growth surface for the cells represents a parallel circuit consisting of a capacitance C e and a resistance R e .
  • Their size is the material of the electrode z. As gold or platinum, the area, the shape, the surface structure and the Kon ⁇ clock between the adhered cells and the electrode dependent.
  • the resistance of the electrode R e is greater than the resistance R i n (R e > R in ).
  • the capacitance C e of the electrode is considerably smaller than the capacitance Ci n (C e ⁇ Ci n ).
  • the circuit according to the prior art represents an effective high-pass filter whose cut-off frequency depends on the capacitance C e of the electrode and the resistance R n , since C e ⁇ Ci n . Values of C e «100 pF and Ri n « 50 M ⁇ result in a cutoff frequency of Hz.
  • the device according to the invention has an operational amplifier OP with an input resistance R O p> 10 12 ⁇ .
  • the system noise is also drastically reduced by the device according to the invention.
  • the noise amplitude is defined by the term
  • An electrode array, biosensor or implant for this purpose comprises at least one device according to the invention.
  • the invention will be described in more detail below with reference to exemplary embodiments and the attached figures.
  • Fig. 1 shows a device according to the prior art.
  • Fig. 2 shows the device according to the invention.
  • FIG. 3 shows by way of example a cell signal derived with the device according to the invention.
  • the electrode is connected via a circuit of capacitor Ci n and a resistor Ri n to the amplifier.
  • This arrangement forms a high pass filter with the cutoff frequency
  • FIG. 3 shows by way of example a signal derived from the device according to the invention of a heart muscle cell of an embryonic rat which has grown on an electrode.
  • the signal is composed of a very fast positive peak 1, which corresponds to the depolarization of the cell membrane. This is followed by a very fast negative peak 2, which is due to the Na + -Influx by only a few milliseconds open, voltage-dependent Na + - channels. This is followed by a slowly decreasing and again increasing negative signal proportion 3, which corresponds to the Ca 2+ influx through the Ca 2+ channels opened several hundred milliseconds. A slowly increasing and decreasing positive signal component 4 is attributable to the K + efflux due to the time-delayed, long-lasting open K + channels.
  • the heart muscle lines show characteristic action potentials. As soon as a pacemaker potential from the sinoatrial node arrives at the cells, the administrat ⁇ th, temporally successive events take place.
  • the circuit K1 corresponds to the device according to the invention without shunt resistance.
  • Embryonic rat heart muscle cells were plated on the electrodes and incubated. After a few days the spontaneous electrical activity of these cardiac muscle cells was measured by means of the electrodes.
  • FIGS. 5 and 6 show, by way of example, tracks from a series of measurements. It is the signal amplitude plotted against time.
  • the cell signals have clearly visible both very fast, high-frequency components, as well as very langsa ⁇ me, low-frequency components.
  • FIGS. 6A-D Measurements with the device according to the invention without the shunt resistor are shown in the respective upper tracks of FIGS. 6A-D (each state K1). Embryonic rat heart cells were cultured on the electrodes. It can be seen that the different tracks in the signal forms differ significantly from one another.
  • Fig. 6A shows only the derived signal of the membrane depolarization.
  • 6B and 6C show, in addition to the depolarization, time-resolved activity of the Na + , Ca 2+ and K + channels, the signal of the Na + inflow being only weakly recorded in FIG. 6C ,
  • the signal in FIG. 6D (state K1) consists only of the depolarization and the K + efflux.
  • the difference in the signal composition is due to the fact that the cells in the different experimental approaches are adhered differently to the electrodes and thus the signal transmission in the gap between cell and electrode is different.
  • test substances which have an influence on the kinesiology of the ion channels and thus influence the low-frequency signals are listed here.
  • norepinephrine increases the open probability of the voltage-dependent Ca 2+ channels. This results in an increased contractility of the heart, an increased heart rate and an increased excitation conduction.
  • Verapamil inhibits the Ca 2+ influx by inhibiting the slow Ca 2+ channels, while at least in the therapeutic concentration range the fast Na + influx is not affected.
  • Carbachol activates via the K + efflux from the cells. Above all, this inhibits the spontaneous spread of excitation in the sinus node. At the same time an inhibition of Ca 2+ -Influxes is observed in the cells.
  • the influence of such test substances can be detected only with the device according to the invention.
  • the signals shown only as an example without a shunt resistor show a significantly reduced noise compared to the measurements with the secondary resistance. This can be seen from the fact that the peak-to-peak width of the signals measured with the shunt resistor is about 50-100% greater than in the comparison measurements without the shunt resistance.
  • the device is thus particularly suitable for broadband and low-noise signal reproduction.
  • the device can be used to record broadband signals from a cutoff frequency of in particular 0.01 Hz upwards.
  • the noise of the recorded signals is between 10 ⁇ V and 20 ⁇ V or smaller, depending on the quality of the adhesion.

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Abstract

Vorrichtung zur Erfassung der von auf einer Elektrode immobilisierten Zellen (Isig) ausgehenden elektrischen Signale, wobei die Elektrode eine Parallelschaltung aus einer Kapazität (Ce) und einem Widerstand (Re) darstellt. Die Vorrichtung ist zur Signalübertragung unmittelbar mit einem Verstärker (OP) verbunden. Dadurch wird vorteilhaft die breitbandige und rauscharme Messung der von den Zellen ausgehenden Signale möglich.

Description

B e s c h r e i b u n g
Vorrichtung zur nicht-invasiven Messung von Zellsignalen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur nicht- invasiven Messung von Zellsignalen.
Die Kenntnis der exakten Signalform elektrisch aktiver Zellen ist von Bedeutung für die Evaluierung der Wir¬ kungsweise von Testsubstanzen, wie z. B. Medikamenten auf die Zellen. Die Kenntnis der Signalform ist ebenso Vorraussetzung bei der Entwicklung neuartiger Biosensoren und Implan¬ tate.
Aus dem Stand der Technik bekannt ist die sogenannte patch-clamp-Technik, bei der die Leitfähigkeit biologi- scher Membranen untersucht wird. Dabei wird die Membran einer intakten Zelle mit Hilfe einer Mikropipette ange¬ saugt und durch den verwendeten Unterdruck an deren Rand versiegelt. Das Membranstück kann aus der Zelle abgetrennt und in ein geeignetes Elektrolytbad einge- taucht werden und die Leitfähigkeit zwischen diesem und einer Elektrolytlösung innerhalb der Pipette gemessen werden. Im inaktiven Zustand der Membran werden Wider¬ stände im Gigaohm-Bereich gefunden. In Abhängigkeit von den in die Elektrolytlösung zugesetzten Testsubstanzen oder einer angelegten Spannung können sich Ionenkanäle öffnen, und die Leitfähigkeit steigt sprunghaft an. Die Methode ermöglicht den Nachweis der Wirkungsweise von Testsubstanzen auf spezifische Ionenkanäle. Aus dem Stand der Technik sind ebenfalls nicht-invasive Messmethoden bekannt. Die Zellen werden bei der Messung der Zellsignale mechanisch nicht verletzt, so dass vor¬ teilhaft LangZeitmessungen zur Wirkungsweise der Test- Substanzen auf die Zellen ermöglicht werden.
Elektrisch spontan-aktive, aber auch zu elektrischer Aktivität stimulierbare Zellen, wie z. B. Herzmuskel- zellen, Skelettmuskelzellen oder Nervenzellen, werden in einer Suspension mit den entsprechenden Nährmedien auf eine oder mehrere Elektroden einer Messvorrichtung gegeben und in einem Brutschrank unter geeigneten Be¬ dingungen inkubiert. Nach einiger Zeit adhärieren die Zellen auf den Elektrodenoberflächen.
Zwischen der Zellmembran der Zellen und den jeweiligen Elektrodenoberflächen liegt ein mit Elektrolytlösung gefüllter Spalt geringen Volumens vor. Der Spalt steht mit der freien Elektrolytlösung, welche die Zellen als Reservoir umgibt, in direktem Kontakt.
Es resultiert ein elektrisches Leitungsband im Adhäsi- onsbereich. Dieses Leitungsband weist aufgrund des mit der Elektrolytlösung gefüllten Spaltes, die Eigenschaft eines elektrischen Widerstandes Rj auf. Die Leitfähig¬ keit gσ des Leitungsbandes ergibt sich aus
Die Elektrolytlösung im Reservoir wird über einen Me¬ talldraht, z. B. mittels eines chlorierten Silberdrah¬ tes, mit der Masse der Messvorrichtung verbunden und liegt somit auf Erdpotential. Die elektrische Aktivität der Zellen stellt unabhängig von dem verwendeten Zelltyp und von der spontanen oder durch gezielte Erregung ausgelösten elektrischen Akti¬ vität den Fluss von Ionen wie z. B. Na+-, K+-, Ca2+- und anderen Ionen durch die Ionenkanäle der Zellmembran dar.
Je nach adhäriertem Zelltyp und Testbedingungen wird zwischen einem Influx von Ionen in bzw. einem Efflux von Ionen aus der Zelle unterschieden. Der Ionenflux erfolgt durch die Ionenkanäle der Zell¬ membran, welche in Wechselwirkung mit der die Zellen umgebenden Elektrolytlösung im Reservoir steht. Die Io¬ nenkanäle werden durch Zugabe der TestSubstanzen akti¬ viert und ihre charakteristischen kinetischen Eigen- Schäften, wie die Geschwindigkeit des Öffnens und Schließens oder die Geschwindigkeit des Fluxes verändert .
Die Aktivität der Zellen führt spontan zur Änderung der Ionenkonzentrationen in der Elektrolytlösung in der Umgebung der Zellen.
Diese Änderung fällt aufgrund des geringen Volumens des Spaltes gegenüber dem großen Volumen des Reservoirs im Spalt relativ stärker aus. Die unterschiedlichen Ionen¬ konzentrationen im Spalt und in der freien Elektrolyt- lösung führen zum Abfallen einer elektrischen Spannung über Rj. Diese Spannungssignale werden mit der Elektro¬ de, die im Spalt der adhärierten Zellmembran gegenüber¬ liegt, abgegriffen. Durch Einsatz vieler Elektroden in Elektrodenarrays oder in parallelen Reaktionsgefäßen wird der Messdurch¬ satz erhöht.
Messtechnisch betrachtet stellen die immobilisierten Zellen eine Stromquelle Isig und der mit Elektrolytlö- sung gefüllte Spalt zwischen Zellmembran und Elektro¬ denoberfläche den Widerstand dar.
Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, die Messvor¬ richtungen so auszugestalten, dass die von der Elektro- de abgegriffenen Signale über eine Anordnung aus Kon¬ densator mit einer Kapazität Cin und einem Widerstand Rin an einen Verstärker gesendet werden. Hiermit wird vorteilhaft erreicht, dass der Biasstrom des Operationsverstärkers nicht zur Elektrode fließt. Zum anderen wird eine Filterung der Signale in Abhän¬ gigkeit von deren Frequenz erhalten. In Abhängigkeit von den elektrischen Eigenschaften des verwendeten Kon¬ densators Cin und des Widerstands Rin ist es möglich, bestimmte Frequenzanteile aus den Signalen gemäß der Formel fOff=l/ (Cin*Rin) als so genannte cut-off-Frequenz herauszufiltern. Bei gegebenen Werten von Cin«1000 pF und Rin«50 MΩ resultiert eine nominelle Grenzfrequenz von 20 Hz.
Nachteilig ist es bisher mit derartigen Messvorrichtun- gen noch nicht gelungen, derartig niederfrequente An¬ teile der Signale zu erfassen und mit bestimmten Test- substanzen in Beziehung zu setzen, obwohl dies an Hand der Grenzfrequenz möglich sein sollte. Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Er¬ fassung der von auf Elektroden immobilisierten Zellen ausgehenden elektrischen Signale bereit zu stellen, mit der breitbandig die Frequenzgänge der von den Zellen ausgehenden Signale und auch deren niederfrequente Signalanteile erfasst werden können.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Hauptan¬ spruch gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf jeweils rückbezogenen Patentansprü- chen.
Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekenn¬ zeichnet, dass die mit Zellen behaftete Elektrode zur Übertragung induzierter Signale unmittelbar, das heißt direkt mit einem Verstärker verbunden ist. Die Signale werden also nicht zunächst über eine Anordnung aus Kon¬ densator Cin und Widerstand R±n an den Verstärker gelei¬ tet .
Hierdurch wird vorteilhaft bewirkt, dass die Signale in einem vorhersehbaren und breitbandigen Frequenzbereich verstärkt werden, der auch die niederfrequenten Signal- anteile umfasst . Breitbandig bedeutet, dass Frequenzan¬ teile größer 0,01 Hz ermittelt werden können. Die Mes¬ sung des Frequenzgangs zu hohen Frequenzen ist nicht limitiert .
Es wurde erkannt, dass die im Stand der Technik angege¬ benen Werte zum verstärkten Frequenzbereich nicht der Realität entsprechen. Die tatsächliche Grenzfrequenz beträgt stattdessen mehr als 200 Hz. Die elektrischen Zellsignale in Form zeitabhängiger Spannungen darunter werden nicht erfasst.
Gerade dieser Frequenzbereich ist aber zum Nachweis der Wirksamkeit bestimmter Testsubstanzen von besonderem Interesse, da sich die Zellsignale aus dem zeitlichen Zusammenspiel aller beteiligten Ionenkanälen mit ihren jeweiligen charakteristischen Eigenschaften zusammen¬ setzen, die zum Teil langsame und lang anhaltende, nie¬ derfrequente Signalanteile verursachen. Die mit dem Stand der Technik ermittelten Signalformen sind daher nicht aussagekräftig.
Im Rahmen der Erfindung wurde erkannt, dass die Elekt¬ rode als Wachstumsoberfläche für die Zellen eine Paral¬ lelschaltung, bestehend aus einer Kapazität Ce und ei¬ nem Widerstand Re darstellt. Deren Größe ist vom Material der Elektrode aus z. B. Gold oder Platin, der Fläche, der Form, der Oberflächenstruktur und dem Kon¬ takt zwischen den adhärierten Zellen und der Elektrode abhängig. Es wurde auch erkannt, dass in Schaltungen gemäß Stand der Technik der Widerstand der Elektrode Re größer als der Widerstand Rin ist (Re>Rin) . Ebenfalls wurde erkannt, dass die Kapazität Ce der Elektrode we¬ sentlich kleiner als die Kapazität Cin ist (Ce<<Cin) .
Somit stellt die Schaltung gemäß Stand der Technik einen effektiven Hochpassfilter dar, dessen Grenzfre- quenz von der Kapazität Ce der Elektrode und dem Wider¬ stand Rin abhängig ist, da Ce<<Cin gilt. Bei Werten von Ce«100 pF und Rin«50 MΩ resultiert eine Grenzfrequenz von Hz. Vorteilhaft weist die erfindungsgemäße Vorrichtung ei¬ nen Operationsverstärker OP mit einem Eingangswider¬ stand ROp>1012 Ω auf.
Bei einer Kapazität Ce der Elektrode von Ce=100 pF wird vorteilhaft ein effektiver Hochpassfilter mit einer
Grenzfrequenz von 0,01 Hz bereit gestellt. Dies ermög¬ licht eine um den Faktor 20000 verbesserte niederfre¬ quente Signalerfassung im Vergleich zum Stand der Tech¬ nik mit foff=200 Hz, mit den bekannten Auswirkungen auf die erweiterte Auswahl der TestSubstanzen und Aussage¬ kräftigkeit der Messergebnisse.
Besonders vorteilhaft wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung auch das Systemrauschen drastisch verklei¬ nert. Die Rauschamplitude ist definiert durch den Term
^Rauschen =V4 x k x T x i?in '
mit k= Boltzmann-Konstante (l,38xlθ~23 J/K) , bei T = 293 K.
Es können sämtliche nicht-invasiv erfassten Signale der elektrischen Zellaktivität auf Elektroden mit dieser extrem breitbandigen und zudem rauscharmen Schaltung ausgelesen und verstärkt werden.
Ein Elektrodenarray, Biosensor oder Implantat umfasst hierzu mindestens eine erfindungsgemäße Vorrichtung. Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungs- beispielen und den beigefügten Figuren näher beschrie¬ ben.
Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung gemäß Stand der Technik.
Fig. 2 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung.
Fig. 3 zeigt beispielhaft ein mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgeleitetes Zellsignal.
Fig. 4 bis 6 zeigen den nachteiligen Einfluss eines zu¬ sätzlichen Widerstandes Rs/ der dem Widerstand Rin gemäß Stand der Technik entspricht auf die induzierten Signa¬ le im Vergleich zu den durch die erfindungsgemäße Vor¬ richtung gemessenen Signale.
Gemäß Fig. 1 ist die Elektrode über eine Schaltung aus Kondensator mit Cin und einem Widerstand Rin mit dem Verstärker verbunden. Diese Anordnung bildet einen Hochpassfilter mit der Grenzfrequenz
(Cin*Rin)=20 Hz, bei C1n-IOOOpF und Rin~50MΩ.
Frequenzen mit einem geringeren Wert sollen durch die Vorrichtung herausgefiltert werden.
Die Anordnung aus Kondensator Cin und Widerstand Rin bildet, wie erläutert, zusammen mit den auf der Elekt¬ rode immobilisierten Zellen einen effektiven Hochpassfilter, dessen Grenzfrequenz von der Elektro¬ denkapazität Ce und dem Eingangswiderstand Rin abhängig ist, da die Kapazität der Elektrode Ce viel kleiner ist, als die Kapazität Cin des dem Verstärker OP vorge¬ schalteten Kondensators. Bei Werten von Ce=100 pF und Rin=50 MΩ resultiert ein tatsächlicher Wert der Grenzfrequenz von foff=200 Hz. Niederfrequente Signale der elektrischen Zellaktivität werden herausgefiltert. Es werden falsch negative Er¬ gebnisse in Bezug auf die getesteten Substanzen er¬ zeugt .
Fig. 2 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung, in der auf die Verwendung des Eingangswiderstandes Rin und des Kondensators Cin verzichtet wurde, mit Ce=IOO pF und ROP=1012Ω.
Fig. 3 zeigt exemplarisch ein mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung abgeleitetes Signal einer HerzmuskelzelIe einer embryonalen Ratte, die auf einer Elektrode ge¬ wachsen ist.
Das Signal setzt sich zusammen aus einem sehr schnellen positiven Peak 1, der der Depolarisation der Zellmemb¬ ran entspricht. Hierauf folgt ein sehr schneller nega- tiver Peak 2, der auf den Na+-Influx durch die nur we¬ nige Millisekunden geöffneten, spannungsabhängigen Na+- Kanäle zurückzuführen ist. Hierauf folgt ein langsam abfallender und wieder ansteigender negativer Signalan¬ teil 3, der dem Ca2+-Influx durch die mehrere Hundert Millisekunden geöffneten Ca2+-Kanäle entspricht. Ein langsam ansteigender und wieder abfallender positiver Signalanteil 4 ist auf den K+-Efflux durch die zeitlich verzögert, langanhaltend geöffneten K+-Kanäle zurückzu¬ führen. Die HerzmuskelZeilen zeigen charakteristische Aktions¬ potentiale. Sobald ein Schrittmacherpotential aus dem Sinusknoten an den Zellen ankommt, laufen die erläuter¬ ten, zeitlich aufeinander folgenden Ereignisse ab. Erst bei Erreichen des Schwellenpotentials öffnen sich sehr schnell die spannungsgesteuerten Na+-Kanäle. Der Na+- Einstrom in die Zelle verursacht die schnelle Depolari- sation der Zellmembran. Dieser Vorgang ist in den ext¬ razellulären Abteilungen als schneller Peak 1 zu Beginn des Aktionspotentials zu sehen. Durch Inaktivieren der Na+-Kanäle und Depolarisation werden die Ca2+-Kanäle ge¬ öffnet. Durch Ca2+-Einstrom wird die Kontraktion des Herzmuskels ausgelöst und das Membranpotential auf po¬ sitive Werte gehalten. Während dieser lang anhaltenden Depolarisation bleiben die Na+-Kanäle inaktiviert. Mit Verzögerung öffnen lang anhaltend die K+-Kanäle. Der resultierende K+-Ausstrom aus der Zelle repolarisiert die Zellmembran.
Zum Nachweis der Funktionsweise der erfindungsgemäßen Schaltung gemäß der Fig. 2 bis 6 und der Vorteile ge¬ genüber dem Stand der Technik gemäß Fig. 1 wurde in die erfindungsgemäße Schaltung gemäß Fig. 2 ein Nebenwider¬ stand Rs mit unterschiedlicher Größe (Rs=100MΩ, 10MΩ oder 1MΩ) eingefügt, der in Fig. 4 mit dem Zustand K2 angegeben ist und Rin in Fig. 1 entspricht. Die Schal¬ tung Kl entspricht hingegen der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung ohne Nebenwiderstand.
Auf den Elektroden wurden Herzmuskelzellen embryonaler Ratten ausplattiert und inkubiert. Nach einigen Tagen wurde die spontane elektrische Aktivität dieser Herz¬ muskelzellen mit Hilfe der Elektroden gemessen.
In Fig. 5 und 6 sind beispielhaft Spuren aus einer Messserie aufgeführt. Es ist die Signalamplitude gegen die Zeit aufgetragen.
In der ersten Spur gemäß der Fig. 5A sind Messungen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ohne den Nebenwider¬ stand abgebildet.
Die Zellsignale weisen deutlich sichtbar sowohl sehr schnelle, hochfrequente Anteile, als auch sehr langsa¬ me, niederfrequente Anteile auf.
Die Einführung des Nebenwiderstandes Rs=100MΩ (K2 in Fig. 4 und Fig. 5B) wie aus dem Stand der Technik be¬ kannt, führt zu deutlichen Veränderungen der aufge- zeichneten Zellsignale. Niederfrequente Signalanteile sind nicht nachweisbar. Es werden nachteilig nur hochfrequente Komponenten in Form schmaler Peaks gemes¬ sen. Das Rauschen der Messanordnung, erkennbar an der breiten Basislinie, ist im Vergleich zu der erfindungs- gemäßen Anordnung nachteilig deutlich erhöht.
Nebenwiderstände unterschiedlicher Größe (vgl. Fig. 5C: Rs=10MΩ, Fig. 5D: R3=I MΩ) haben neben dem völligen Verschwinden langsamer Signalkomponenten auch eine Ver¬ kleinerung der Amplituden der hochfrequenten Signalan- teile zur Folge. Durch den Nebenwiderstand wird der
Frequenzgang der Schaltung verändert. Der Nebenwider¬ stand mit Rs=100 MΩ hat eine Veränderung von foff=0,01 Hz (Fig. 5A, Zustand Kl) auf foff=100 Hz zur Folge (vgl. Fig. 5C: foff=1000 Hz, Fig. 5D: foff=10000 Hz) . In Fig. 5B und 5C werden etwa die Signale wiedergegeben, die mit dem Stand der Technik gemessen werden.
In den jeweils oberen Spuren der Fig. 6A-D (jeweils Zu- stand Kl) sind Messungen mit der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung ohne den Nebenwiderstand dargestellt. Embryonale Rattenherzzellen wurden auf den Elektroden kultiviert. Es ist erkennbar, dass sich die verschiede¬ nen Spuren in den Signalformen deutlich voneinander un- terscheiden. Fig. 6A (Zustand Kl) zeigt ausschließlich das abgeleitete Signal der Membrandepolarisation. Fig. 6B und Fig 6C (Zustand Kl) zeigen neben der Depolarisa- tion zeitaufgelöst die Aktivität der Na+-, Ca2+- und K+- Kanäle, wobei das Signal des Na+-Influxes in Fig. 6C nur schwach aufgezeichnet wurde. Das Signal in Fig. 6D (Zustand Kl) besteht hingegen nur aus der Depolarisati- on und dem K+-Efflux. Die Unterschiede hinsichtlich der Signalzusammensetzung ist darauf zurückzuführen, dass die Zellen in den verschiedenen Versuchsansätzen unter- schiedlich auf den Elektroden adhäriert sind und somit die Signalübertragung im Spalt zwischen Zelle und Elektrode verschieden ausgeprägt ist. Die jeweiligen unteren Spuren der Fig. 6A-D (Zustand K2) zeigen die aufgezeichneten Signale nach Einführen eines Nebenwi- derstandes Rs=100MΩ. Unabhängig von der ursprünglichen Signalform sind nach Einführen des Nebenwiderstandes ausschließlich die schnellen, hochfrequenten Signalan¬ teile erfasst . Sämtliche langsamen, niederfrequenten Anteile des Ca2+-Influx und K+-Efflux sind aus den Sig- nalen vollständig herausgefiltert. Ebenso hat das Sig¬ nalrauschen durch den Nebenwiderstand zugenommen, er- kennbar an der breiteren Basislinie, im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Anordnung.
Die Verminderung der Amplitude, vor allem jedoch das Fehlen der niederfrequenten Signalanteile hat nachtei- lig zur Folge, dass sich mit dem Stand der Technik der Einfluss unterschiedlicher Testsubstanzen, die von größter pharmakologischer Bedeutung sind, auf die Kinetik eines Teiles der an den Signalen beteiligten Ionenkanäle nicht nachvollziehen lässt, da die langsamen, niederfrequenten Signalanteile der K+- und Ca2+-Kanäle messtechnisch nicht auflösbar sind.
Exemplarisch seien an dieser Stelle verschiedene Test- substanzen aufgeführt, die einen Einfluss auf die Kine¬ tik der Ionenkanäle besitzen und insofern die nie- derfrequenten Signale beeinflussen.
Noradrenalin erhöht beispielsweise die Offen-Wahr- scheinlichkeit der spannungsabhängigen Ca2+-Kanäle. Dies hat eine erhöhte Kontraktilität des Herzens, eine erhöhte Herzfrequenz und eine erhöhte Erregungsleitung zur Folge.
Verapamil unterbindet den Ca2+-Influx durch Hemmung der langsamen Ca2+-Kanäle, während zumindest im therapeuti¬ schen Konzentrationsbereich der schnelle Na+-Einstrom nicht beeinflusst wird. Carbachol aktiviert über den K+-Efflux aus den Zellen. Dies hemmt vor allem die spontane Erregungsausbreitung im Sinusknoten. Zugleich ist eine Inhibierung des Ca2+-Influxes in die Zellen zu beobachten.
Der Einfluss derartiger Testsubstanzen lässt sich erst mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfassen. Die nur beispielhaft dargestellten Signale ohne einen Nebenwiderstand zeigen ein deutlich vermindertes Rau¬ schen auf im Vergleich zu den Messungen mit dem Neben¬ widerstand. Dies ist daran zu erkennen, dass die peak- to-peak-Breite der mit dem Nebenwiderstand gemessenen Signale etwa 50-100% größer ist, als bei den Ver¬ gleichsmessungen ohne den Nebenwiderstand.
Die Vorrichtung ist somit zur breitbandigen und rausch¬ armen Signalwidergabe besonders geeignet. Mit der Vor¬ richtung können Signale ab einer Grenzfrequenz von ins¬ besondere 0,01 Hz aufwärts breitbandig aufgezeichnet werden. Das Rauschen der aufgezeichneten Signale liegt je nach Güte der Adhäsion zwischen 10 μV und 20 μV oder kleiner.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Vorrichtung zur Messung der von auf einer Elektrode immobilisierten Zellen (Isig) ausgehenden elektri¬ schen Signale, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrode unmittelbar mit einem Verstärker (OP) verbunden ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Elektrode eine Parallelschaltung aus einer Kapazität (Ce) und einem Widerstand (Re) dar- stellt.
3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, mit Ce<100 pF.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü- che, gekennzeichnet durch einen Verstärker (OP) mit einem Eingangswiderstand
ROp>1012 Ω .
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü- che, gekennzeichnet durch mindestens einen weiteren Widerstand (Ri, R2) .
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass diese Signale ab einer Grenzfrequenz von 0,01 Hz breitbandig misst.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Rauschen kleiner als 10 μV aufweist.
8. Elektrodenarray, Biosensor, Implantat, umfassend mindestens eine Vorrichtung nach einem der vorher- gehenden Ansprüche.
EP05804560A 2004-11-09 2005-10-15 Vorrichtung zur nicht -invasiven messung von zellsignalen Withdrawn EP1810022A1 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200410054292 DE102004054292A1 (de) 2004-11-09 2004-11-09 Vorrichtung zur nicht-invasiven Messung von Zellsignalen
PCT/DE2005/001842 WO2006050683A1 (de) 2004-11-09 2005-10-15 Vorrichtung zur nicht -invasiven messung von zellsignalen

Publications (1)

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EP1810022A1 true EP1810022A1 (de) 2007-07-25

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ID=35517606

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