CN100372920C - 药理测定装置及系统以及其中使用的井容器 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种通过将批量式的药液滴下交换方式时混入的干扰成分陡然减小，从而可对生物样本的药理活动所引起的微小且短暂的电信号的变化迅速且高敏感度地进行检测的药理测定装置。该药理测定装置(20)，用于测定因生物样本的药理活动或者电生理活动所引起的电信号变化，其特征在于，具有：上面上具有开口部分(8)的导电箱(2)、以及配置在上述开口部分(8)中的井容器(19)，上述井容器(19)，具备：基体(1)，其具有配置上述生物样本(6)的凹部(4)；测定电极(10)，形成在上述凹部(2)的底面；参照电极(13)，与上述测定电极(10)电绝缘，上述参照电极(13)与上述导电箱(2)一起将上述井容器(19)静电屏蔽。

Description

药理测定装置及系统以及其中使用的井容器

技术领域

本发明，涉及一种用于测定生物样本的药理活动或电生理活动所引起的电信号变化的药理测定装置及系统以及其中使用的井(well，ウエル)容器。

背景技术

以往，公知有对细胞的电生理活动进行测定的技术。这种技术，例如用于以细胞的电生理活动为指标筛选药品。所谓细胞的电生理活动，主要指的是细胞的离子通道的活性度。细胞中，细胞膜内外的离子浓度随着离子通道的活性度所对应的离子透过性的变化而变化。从而，通过测定细胞膜电位的变化，能够测定离子通道的开闭时间、时刻、其次数、离子通道的活性度(细胞的电活动)。

作为测定细胞膜电位的变化的方法，以往所公知的方法是，通过使用显微操作装置(micromanipulator)等将玻璃制的细胞外电位测定用电极或金属制(铂等)的电极设置在细胞附近来进行测定。另外，作为其他的方法公知的方法是，通过将同样的电极刺入到细胞内来对细胞内电位的变化进行测定。

通过上述的方法，能够对细胞的离子通道的活性度定量且详细地进行测定。然而，由于电极的调制及其操作等需要熟练的技术，且一个样本的测定需要大量的时间，因此不适于对大量的药品候选化合物高速地进行筛选。另外，还有一个方面在于容易对细胞造成伤害。

对于高速的药品筛选的用途，特别是快速筛选(第一候选的锁定)的用途而言，并非一定需要被视为电极刺入法的离子通道的定量测定，离子通道的开闭的定性检测就足够了，由于更为重视测定的快速性、简便性，因此对这种用途而言，一般认为使用平板电极的细胞外电位记录法较为合适(专利文献1：特许第2949845号公报，专利文献2：美国专利第5810725号说明书，专利文献3：美国专利第5563067号说明书；专利文献4：特开平9-827318号公报；专利文献5：美国专利第5187069号说明书)。

使用平板电极的细胞外电位记录法，利用的是通过在接近生物体内盐浓度组成的溶液中将生物样本配置在平板电极上，对该电极的电位变化进行测定，能够测定通过离子通道的离子流。即，利用的是，细胞的电生理活动给配置在其附近的电极电位带来变化。

由于上述细胞外电位记录法，只需要将细胞配置在平板电极上，无需往细胞内刺入电极等，因此能够简便且迅速地对细胞的电生理活动进行测定。另外，由于平面电极的制造，能够应用半导体加工技术，因此能够在基板上微小且大量地形成电极。从而，适合于多种的药品的高速筛选等。

然而，细胞的电生理活动所引起的电信号的变化非常微弱，在使用平板电极的细胞外电位记录法中，由于该信号的变化要透过溶液进行检测，因此被进一步微弱化。从而，要想进行高精度的测定，必须对细胞的电生理活动所引起的电信号的变化进行感度良好的检测。

要想将微小信号以良好的S/N比进行检测，一般来说，只要将测定部静电屏蔽为测定系统内不会混入干扰噪声即可(非专利文献1：M.Krause，S.Ingebrandt，D.Richter et al，Extended gate electrode arrays forextracellularsignal recordings，Sensors and Actuators B 70(2000)pp.101-107)。然而，要想使用于药品的高速筛选用途中，基于以下的理由，无法对测定部进行完全静电屏蔽。在对多种药品进行高速筛选时，必须以简单的结构用较短时间交换多种药剂溶液。因此，每回都设置对各个溶液保持部单独注入·排出溶液的机构，同时对溶液的移动进行控制，会使传感器基板和装置的结构更为复杂。实际上药液的交换，是将一个或者排成一列的、XY移动式的溶液注入排出装置在溶液保持部的上方驱动，并对各个溶液保持部分的每一某个给定的单位的溶液从上方用批量式进行溶液添加·吸引。然而，批量式的溶液添加·吸引方式中，必须在溶液面上形成用于注入的开口区域，无法对测定部进行静电屏蔽。其结果就是，电极上会发生伴随溶液滴下的干扰，并且其值大到相对微弱的电信号无法忽略的地步。另外，伴随溶液交换发生的干扰，在溶液滴下结束之后还长时间持续。因此产生的问题是，无法测定对药剂产生较小反应的离子通道的响应，以及从药剂的交换时起短时间以内活动、之后变得不活性化的急速不活化离子通道开闭响应。

发明内容

本发明，解决的正是上述问题点，其目的在于，提供一种通过将批量式的药液滴下交换方式时混入的干扰成分陡然地减小，从而可以迅速且高敏感度地检测出生物样本的药理活动所引起的微小而短暂的电信号的变化的、药理测定装置及系统以及其中使用的井容器。

本发明的发明者，经过细心研究，发现产生上述干扰的原因在于，在将离子性的测定溶液注入到井容器内时，溶液中会瞬间发生电偏，虽然非常微弱，但也会产生本测定中难以忽略的大小的电流，因此可以看出，若将井容器静电屏蔽，则能够抑制干扰。

根据上述结论，本发明中的药理测定装置，用于对生物样本的药理活动或者电生理活动所引起的电信号进行检测，其特征在于：所述药理测定装置，具有：具有开口部分的导电箱、以及配置在所述开口部分中的井容器，所述井容器，具备：基体，具有配置所述生物样本的井凹部；在所述井凹部的底面或者背面上形成的测定电极；以及，与所述测定电极电绝缘的参照电极，所述参照电极与所述导电箱一起，将所述井容器静电屏蔽。

这里，所谓静电屏蔽，指地是抑制干扰的发生，可知通过将参照电极扩大到能够遮蔽电磁波的程度、或将参照电极与导电箱连接释放大量的电流，能够实现，

从而，本发明中的优选药理测定装置的特征是，参照电极，与导电箱电连接。这样，将参照电极与导电箱电连接后，能够让从配置在屏蔽外部的溶液积存处向屏蔽开口部分注入离子性溶液或者进行排出时所产生的电流流向导电性的导电箱，陡然降低干扰成分。

另外，本发明中的另一优选药理判定装置的特征是，参照电极，形成为覆盖井凹部以外的井容器上部。这样，将参照电极扩展形成后，能够使参照电极作为屏蔽的一部分来发挥作用。另外，由于浸渍到测定溶液中的参照电极的面积增大，能够使测定溶液注入时产生的电流瞬时分散释放，不会发生干扰。再有，还能够在不产生干扰地、以批量式实施高速筛选。

再有，通过采用抑制上述干扰的发生的结构，本发明中的药理测定装置，将包含生物样本的溶液注入到凹部以及从凹部排出的注入排出器排列多个，按照该注入排出器滑动的方式对井凹部进行注入。从而，能够以较短时间向多个凹部中注入测定液。

另外，虽然为了对微弱电流进行测定，优选设有信号放大部，但是测定时，由于该信号放大部也会受到来自外部的电磁波等的影响，因此必须将该信号放大部静电屏蔽。本发明中的药理测定装置的特征是，还具备与测定电极电连接的第一信号放大部，该第一信号放大部配置在该导电箱内部。第一信号放大部，由于被参照电极以及导电箱静电屏蔽，因此无需另外设置信号放大部，能够简化结构。

另外，本发明中，测定电极与参照电极之间形成绝缘部，优选该绝缘部中没有生物体毒性。从而不会对要测定的生物体细胞产生不良影响。

本发明中，井凹部具有上方扩大的锥侧壁，参照电极被制作在上述凹部侧壁上，对与位于井凹部的底面上的测定电极相邻接的在锥侧壁面附近的参照电极部分进行除去加工，在测定电极与参照电极之间形成绝缘部。通过这种结构，即使不设置隔离物，也能提高参照电极与测定电极的绝缘性。

本发明中优选，在上述基板的凹部的底面上，设置至少一个以上的贯通孔，在与固定在该贯通孔中的生物样本相接触的位置上，形成有测定电极。这样，能够将生物样本密接保持，能够提高测定敏感度，能够稳定地实施测定。再有，上述基板的贯通孔中，优选具备诱导生物样本的吸引机构。

另外，本发明中，能够替换井凹部中收纳的溶液。

在本发明中的药理测定装置中，特征是井容器在所述导电箱的开口部分中可安装、拆卸，可为一次性用品。井容器可拆可装、且为一次性用品的情况下，能够对大量的样本进行高速测定。再有，通过使用这种一次性的容器，也能更加卫生。另外，由于能够仅更换井容器，与将药理测定装置整体更换的情况相比成本更低。

本发明中的药理测定系统，其特征是具备上述的药理测定装置、以及对由第1信号放大部放大的信号进行数据处理的计算部。

再有，优选还具备第2信号放大部，对被所述第1放大部放大的来自测定电极的输出信号再放大、实施频带限制。

另外，还具备电刺激发生装置，在期望的时刻对所述电极施加期望的电流。再有，优选还具备测定环境调整装置，将所述装置调整为期望的温度、湿度、气体浓度。

另外，本发明为一种井容器，用于药理测定装置，所述药理测定装置用于对生物样本的药理活动或者电生理活动所引起的电信号进行检测，其特征在于：所述井容器，具备：基体，具有配置所述生物样本的多个井凹部；在所述凹部的底面或者背面上形成的测定电极；以及，与所述测定电极电绝缘的参照电极，其可以被拆装，并使所述参照电极与所述导电箱电连接。

通过令井容器能够对导电箱拆装，能够方便地实施测定溶液的交换、井容器的清洗等。另外，由于将井容器制成为将井容器安装到导电箱上时井容器的参照电极与导电箱导通，因此将该井容器与导电箱电连接时，能够将井容器静电屏蔽，能够将溶液注入·排出时发生的干扰陡然降低。

如上所述，通过本发明的药理测定装置，由于伴随来自上方的药剂滴下·交换的干扰不会对传感器产生影响，因此能够以较短时间实现多种的药理判定。另外，能够对伴随急速的不活化的离子通道的开闭进行测定，可实现大范围的判定试验。

附图说明

图1为示意表示实施方式1的药理判定装置的结构的概念图。

图2为表示实施方式1的井容器的一例的部分剖面图。

图3为表示实施方式1的井容器的一例的部分剖面图。

图4为实施方式1的井容器的俯视图(省略参照电极13)。

图5为图4的井容器的A0-A1剖面图。

图6为表示实施方式2的井容器的一例的部分剖面图。

图7为实施方式2的井容器的俯视图。

图8为图7的井容器的C0-C1剖面图。

图9为示意表示本发明的药理判定装置的结构的概念图。

图10为示意表示比较例1的药理判定装置的结构的概念图。

图11为表示实施例1中的电压的测定结果的图。

图12为表示比较例1中的电压的测定结果的图。

图13为表示比较例2的测定结果的图。

具体实施方式

下面，采用附图对本发明更详细地进行说明。

(实施方式1)

(实施方式1的药理测定装置的结构)

图1是示意表示实施方式1的药理测定装置20的结构的图。实施方式1的药理测定装置，具有上面具有开口部分8的导电箱2以及开口部分8中配置的井容器19。该井容器19，可为可固定在导电箱2的开口部分8中，也可为可从该开口部分8中拆下。另外，根据需要，还具备：溶液注入排出器7、导电箱2的内部的前置放大器(第1信号放大器)3、用于固定井容器19的基板设置台11、将测定电极10与前置放大器(第1信号放大器)3电连接的接点12。优选溶液注入排出器7的排出部的数量，对应于基体内排列的一列凹部的数量，滑动(slide)式地滴下测定液。

实施方式1的井容器19，具有：基体1，其具有用于将包含生物样本6的测定液5注入的凹部4；形成在凹部4的底面的测定电极10；以及，与测定电极电绝缘的参照电极13。当测定时，凹部4中充满测定液5，生物样本6(以下，以细胞6作为具体例)被配置在测定电极10附近。

参照电极13，如图1所示，形成在井容器19的除凹部4的底面及其附近之外的全部的上面上。参照电极13，配置为不与测定电极10直接导通，并且，为了减小噪声，参照电极的面积必须足够大于测定电极的面积。其原因在于，参照电极的面积大的话阻抗就低，干扰所对应的信号的变动要因就小。具体来说，优选按照参照电极13的面积的总和，相对全部测定电极的面积的总和大5倍以上那样形成。参照电极13的最表面，由金、铂、银一氯化银等的材料制成，可为任意的形状。另外，参照电极13，必须将一部分浸渍于培养液5中。

来自测定电极10的电信号，被以参照电极13的电位为基准测定。也就是说，测定电极10连接在前置放大器(第1信号放大器)3的输入端子的一方3A上。前置放大器3的另一方的输入端子3B，被连接为与参照电极13的电位相等。如图1所示，输入端子3B与参照电极13，均采取以导电箱2为接地点连接为彼此电位相同的结构。前置放大器3，配置在导电箱2的内部，并且，能够极近地对测定电极10的电位进行测定。通过该结构，能够对被测定电极10测得的微小的信号在低噪声环境下以良好的SN比进行测定。

井容器19，配置在导电箱2的开口部分8中，参照电极13和导电箱2被电连接。通过该结构，在用于以批量式滴下溶液的开口面积之内，能将未被静电屏蔽的开口面积，减小到仅为凹部4的一部分，能够减少伴随溶液交换的干扰变动。

接下来，在图2以及图3中表示，井容器19的包含一个测定电极的部分的详细结构的一例。从制作工序的角度出发，井容器19，由以下部分构成：基板101上形成有测定电极10的传感器基板16；以及，在上部基体102上设置凹部4(以下，根据状况也称作框、孔)来保持测定溶液5的溶液保持部17。即，图1的基体1，由基板101和上部基体102形成，凹部4的内侧为细胞培养区域。凹部4，从适用的角度来看，优选为研钵状。通过该结构，能够利用来自上方的反射光，来对被集成的微小区域中培养的细胞进行光学观察。

作为基板101的材料，优选电阻高且有绝缘性的材料。另外，基板1，优选使用能够便于微细加工的材料。若具体列举，则有：以单晶硅、无定形硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等为代表的半导体材料，以及以绝缘体上外延硅(SOI)等为代表的这些半导体材料的复合材料，或者从玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石(sapphire)、碳化硅、氧化硅、氮化硅的群中选出的无机绝缘材料、或者聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸脂(PC)、聚酰胺、酚醛树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈·丁二烯苯乙烯共聚物、硅树脂、聚苯醚、以及聚砜等的群中选出的有机材料。优选使用的材料为，单晶硅、SOI、PET、PC。

测定电极10中，使用能在基板1上层状层叠的金属材料、金属氧化物材料、导电性高分子材料等的导电性材料。作为金属材料，例如为：铂、铂黑、金、钯、铑、银、钨的群中选出的金属材料。作为金属氧化物材料，也能够使用从氧化钛、氧化锡、氧化锰、氧化铅、ITO(氧化铟锡)的群中选出的材料。为了在最表面上堆积上述材料，可在基板之间堆积其他的金属层。优选用于此目的的材料，从由镍、铬、ITO、钨、钛、锡、锰、铅及其合金构成的群中选出。测定电极10，可还被导电性高分子覆盖，另外，也可被单分子膜覆盖。连接在测定电极10上的导线9中，也可应用与上述相同的电极材料。

接着，在图4以及图5中表示具有多个测定电极的井容器19的结构示例。图4为俯视图，图5为图4的A0-A1剖面图。图5中用虚线围起来的部分相当于1个包含测定电极的井容器。关于多个井容器的排列方法，如图4、图5所示，可对1个凹部(框)4，设置1个测定电极10来构成；也可对1个凹部4，设置多个测定电极10。对1个凹部4设置1个测定电极10的结构，适用于例如对被固定在各个电极10上的细胞的药品响应性进行测定的情况；与此相对，对1个凹部4设置多个测定电极10的结构，适用于例如能够在各电极10上在固定化的神经细胞间形成网络、并实施涉及网络的解析的情况。

(实施方式1的药理测定装置中井容器的制作方法)

对实施方式1的药理测定装置20的井容器19的制作方法进行说明。图2、图3的井容器19，通过传感器基板16的制作工序、溶液保持部17的制作工序、以及传感器基板16及溶液保持部17的粘接工序来形成。

对井容器19的传感器基板16的制作方法进行说明。首先，将上述电极材料蒸镀到基板1上之后，通过使用光致抗蚀剂来进行蚀刻，将电极10、以及对应的导线9作为1组，形成具有多个该组的期望的图案。再有，电极10的图案形成，除此以外，也能够应用通过预先形成电极图案的模板掩模进行蒸镀的掩模法、抬升(lift off)法。之后，将除外部连接部以外的导线9部分用绝缘膜18覆盖后，进行划切，切出规定角的小片，并将一个小片作为上述传感器基板16。一个小片上，电极10以及导线9被形成为1组。

上述期望的图案，为在各个小片的近似中心上形成一个电极10的样式，电极10的形状，代表性地为正方形或者圆形，例如，可将一边的长度、或直径，形成在约1～2000μm的范围中。当电极10的大小大于生物样本6时，可以用一个电极测定多个生物样本。

在用于测定一个细胞的电生理活动的井容器19中，在根据测定对象的细胞的大小，例如测定对象是长直径为15μm左右的细胞时，优选直径为5μm左右的圆形的电极10。这是因为，此时容易在电极10上只将一个细胞固定化，能够容易地对一个细胞的电生理变化所引起的电信号进行测定。

作为用于覆盖导线9进行绝缘的绝缘膜18的材料，例如为聚酰亚胺(PI)树脂、丙烯酸树脂、环氧树脂等的树脂。优选使用负性感光性聚酰亚胺(NPI)等的感光性树脂。若使用感光性树脂的材料，例如，利用由光蚀刻实现的图案形成，可在电极10上的绝缘膜18部分上开出孔，仅使该电极10露出。这样，绝缘膜18被设置为，除了各个电极10上以及导线9的外部连接部之外，基本覆盖基板101的全面，这点对生产效率等有利。

接着，对井容器19的溶液保持部17的制作方法进行说明。溶液保持部17的制作方法，可使用本领域技术人员所公知的技术来切割，也可通过光造型法来制作。特别表示参照电极13的制作示例之一。该结构的参照电极13的制作工序，可使用蒸镀、溅射等金属堆积法、电解·无电解镀敷等。用金属堆积法制作参照电极13时，通过对溶液保持部件17实施相对堆积装置的旋转台倾斜安装的处置，能够容易地在框4的侧壁上堆积目标金属。另外，以下对使用镀敷法制作参照电极13的工序进行说明。作为溶液保持部17的上部基体102的材料，优选使用绝缘材料。适于使用的有，例如丙烯酸、ABS树脂等。对用可化学镀敷的ABS树脂形成的上部基体102的下面和侧面，用本领域技术人员所公知的方法进行掩模形成。从作业性的角度出发，优选使用胶糊状掩模形成剂或者掩模形成带。之后，将溶液保持部17浸入镀敷槽，来将化学铜无电解镀敷。能够借助上述化学铜将金电解镀敷。经过上述工序，在上述基体102的上面以及框4的侧壁上制成参照电极13。由于与金属堆积法相比，镀敷法可实现一次性·大量处理，并且能实现框4的侧壁等、与形状无关的均匀的电极的形成，因此从生产性来看更为有利。

再将传感器基板16与溶液保持部17粘接。此时，必须构成为，基板101上形成的测定电极10与溶液保持部17上形成的参照电极13不直接导通。如图2所示，可在溶液保持部17与传感器基板16之间，介插绝缘体的隔离物25。在与孔4对应的位置上开出孔的隔离物25，从封闭溶液的角度出发优选具有黏着性(以下，隔离物25也称作黏着性介质)。用于该用途的黏着性介质25，例如为硅胶薄板、或优选不具有生物体毒性的成分的粘接剂、粘接薄板。例如，具体来说，可使用热融接薄板NS-1000(日东シンコ—公司生产)或硅胶粘接剂一液型KE42T(信越硅化物公司生产)来制作。

图3中表示的是，将溶液保持部17与传感器基板16用另一接合形态接合的示例。在图3中，将溶液保持部17与传感器基板16用粘接剂(未图示)粘接这点，与图2的情况相同。但是，本图的情况中，通过插入粘接剂，从而无需确保绝缘性。本图中，为了确保电极10、13的绝缘，在图3中，在将溶液保持部17与传感器基板16粘接之前，在用金对上部基体102的凹部4进行镀敷之后，用锥度不同的钳具，仅切削研钵状的孔4的底面附近，通过实施削去底面附近的参照电极13的工序来形成。

(样本的插入与测定准备)

接着，对往电极10上固定细胞的工序的一例进行说明。首先，优选在井容器19的凹部4内的区域中将固定化材料(未图示)固定化。所谓固定化材料，指的是能够使细胞的固定化容易以及/或者强固的材料。固定化材料的固定化，可在设置凹部(框)4之前进行。

作为固定化细胞6的固定化剂，一般使用电介质体。作为电介质体，优选使用具有强碱性或者强酸性官能基的高分子。具体来说，优选使用聚乙烯亚胺(PEI)、聚鸟氨酸(PO)、聚赖氨酸(PL)等的带正电性聚合物。带正电的这些聚合物，具有吸引带负电的细胞的效果。同样，具有细胞粘接能力的材料，例如有，具有双胍基、或者氨甲酰胍基的高分子。具体来说，优选使用烯丙双胍基—co—烯丙胺(PAB)、烯丙基—N—氨甲酰胍基—co—烯丙胺(PAC)。另外，可以使用基质材料。作为基质材料，优选使用细胞粘接性的蛋白质，作为该蛋白质，例如有胶原蛋白、纤维粘连蛋白、玻连蛋白、昆布宁等。

固定化剂的向电极10的覆盖，可通过如下来实施：将以给定浓度溶解上述固定化材料后的固定化溶液，在电极10上暴露，经过给定时间后，从电极10的表面上除去固定化溶液，将表面用洗净液洗净至少1次以上，并进行干燥。另外，也可使用仅在电极10的上面滴点上述固定化溶液来进行覆盖的方法。

由固定化剂实现的电极的覆盖，不会对细胞的大小对应的电极10表面的平坦性产生影响。从而，不会妨碍细胞的固定化。

接着，在溶液保持部17的凹部4内充满培养液5。作为培养液5，优选使用以20mM～400mM的氯化钠为主成分的生理食盐水溶液、以及含有各种营养素、成长因子、抗生物质等的培养基、溶解有给定的化学物质、化合物、药剂的缓冲溶液等。

之后，在培养液5内，播种期望的细胞。在进行细胞培养的同时，在固定化材料被固定化的情况下，附着性细胞通过它被固定在电极10最表面上。

将细胞固定化后，经过给定时间，用以下的药理测定系统，实施药理判定。

(高速药理测定系统)

本发明的药理测定系统30，如图9所示，具有：药理测定装置20；第2信号放大部26，对药理测定装置20的前置放大器输出22实施放大或者频带限制；以及，计算部28，对由第2信号放大部26放大的信号实施数据处理。根据需要，药理测定系统30，还具备：电刺激发生装置27、摄像装置29或者测定环境调节装置24。药理测定系统，可用简单的系统，被提供作为对作为固定在测定电极10上的细胞的药理响应的输出进行处理的系统。即，该药理测定系统30中，可对由溶液注入·排出器7提供的各种药剂对应的细胞的细胞膜电位或者细胞膜电位的变化，作为细胞外电位变化所引起的电压的变化来进行测定。

药理测定系统30，为了对药理测定装置的前置放大器输出22进行处理，由具备适当的测定用软件的计算部28一体化构成。由井容器19测定并初级放大的来自细胞的输出信号，通过输出端子22，被第2信号放大部26放大，并在限制频带之后，通过A/D转换器输出给计算机(计算部)28。测定用软件，给计算机的画面上提供可设定信号处理·测定条件等的参数设定画面、记录从细胞检测出的电位变化并可实时显示的记录画面、以及可对记录的数据进行解析的数据解析画面等。

药理测定系统30，还可具备用于给期望的测定电极10赋予刺激信号的电刺激发生装置27。施加的刺激信号，由电刺激发生装置27设定刺激条件。或者，由具备适当的测定用软件的计算部28来设定刺激条件。优选来自计算机28的刺激信号，可通过D/A转换器输出给电极10，然后来自细胞的输出信号，被信号放大装置26放大。当然，药理测定系统30，可不从电信号发生装置提供刺激信号，能够仅对细胞中发生的自发电位进行测定。

再有，药理测定系统30，也可具备对井容器19中设置的电极10进行拍摄或者观察的摄像装置29、用于将井容器19保持为给定的温度、气体浓度、湿度的测定环境调节装置24等。

(实施方式2)

本实施方式，涉及的是具备结构与实施方式1不同的电极的药理测定装置。图6是示意表示本实施方式的药理测定装置的井容器19的结构的图。图7是在6行6列的格子状的各个交点上配置电极10的结构。图8是图7的C0-C1剖面图。图8中用虚线围起来的部分相当于1个包含测定电极的井容器。图6中，虽然表示的是在凹部(框)4内仅形成有一个测定电极10的井容器19，但与实施方式1相同，框4内也可形成多个电极10及与其对应的导线9。再有，由于本实施方式的传感器基板16中，在传感器基板16的背面上没有形成布线，因此无需用基板101和上部基体102来分别单独形成传感器基板16以及溶液保持部17后进行粘接，可在一体化的基体1上形成凹部4和电极10、13。

由于本实施方式的井容器19，与图1所示的相比，区别仅在于传感器基板16的结构，因此省略传感器基板16以外的结构的说明。

传感器基板16具有贯通孔14。通过贯通孔14，生物样本被密接保持。贯通孔14的形状没有特别地被限制，只要能保持目的的生物样本即可。图6中，贯通孔14为上面开口部分大于下面开口部分的圆筒状。贯通孔14的尺寸，可采用依存于目的的生物样本的任意的大小，只要是能保持目的的生物样本的大小即可，没有特别的限定。具体的贯通孔14的尺寸，传感器基板16上面的开口部分的直径在10～500μm的范围中，优选直径在10～100μm的范围中，作为更优选的示例，在作为生物样本使用的细胞的长直径为30μm左右的情况下，直径为20μm左右。

贯通孔14如图7所示，具有对一个电极10形成多个的结构。贯通孔14的数量以及位置关系是任意的。位置关系，可例如图示那样为放射状。本改变例中，多个贯通孔14中保持的细胞6所引起的电信号被作为一个电信号从一个电极10检测出来。本改变例，适用于对多个细胞的响应同时进行检测的药品筛选等。

贯通孔14的形成方法，因基板1材料而异，而例如在基板1为PET的情况下，可使用准分子激光器来形成。另外，例如在基板1为Si晶片的情况下，可通过蚀刻来形成。

再有，通过将贯通孔14从下方连结至细胞吸引机构，能够使得贯通孔14中的细胞保持更为强固，并提高测定敏感度以及测定的稳定性。通过此结构，即使是浮游性的细胞也能在贯通孔14中进行保持。

在传感器基板16中，在贯通孔14的孔壁面14a、或者还在孔的开口部分周边14b上，形成有电极10。传感器基板16的背面，以与电极10相连接的方式形成有导线9。有时，接着电极10的导线9可被绝缘覆盖。电极10，通过使用真空蒸镀法或者溅射法将电极材料附着于贯通孔14的孔壁面14a以及开口部分周边14b来形成。

贯通孔14的形状，可为图8所示的圆筒状，作为其他示例，也可为图6所示的研钵状。例如，根据基板1的厚度的情况，难以制作连续的圆筒状的贯通孔14的情况下，可设置比上面以及下面凹陷的孔后将它们贯通来作为一体，从而形成图6所示的贯通孔14。

<实施例>

以下，对本发明更具体地进行例示。这些实施例，并非对本发明进行限定。

(实施例1)

作为实施例1，试制图1所示的实施方式1的药理测定装置。另外，作为比较例1，还试制图10所示的现有结构的药理测定装置。对实施例1与比较例1，实施考察电极特性的实验。

(药理测定装置的制作)

首先，对构成井容器19的传感器基板16以及溶液保持部17的制作方法进行说明。

传感器基板16的制作中，实施例1、比较例1均使用4英寸SOI晶片作为基板材料。基板表面，通过使用RIE的干蚀刻来蚀刻出贯通孔群。背面，通过使用TMAH(四甲铵)的各向异性湿蚀刻，来使表面和背面贯通。将基板整体热氧化，并在表面以及设备的最表面上堆积SiO₂层。然后，划切为30mm角的小片，并在该小片化的基板的背面SiO₂层上，用真空蒸镀法或者溅射法，将电极图案成形。使用金作为电极材料。从而，得到在30mm角的基板上图案成形16个电极，并对这各个电极各配置100个贯通孔的传感器基板。

实施例1的溶液保持部17的上部基体102中，使用切割成5mm厚·30mm角的ABS树脂片。树脂片102上，在上述传感器基板的电极(16处)所对应的位置上切削加工出上面直径3mm、下面直径1mm的锥孔，形成凹部4。之后，对下面和侧面实施掩模形成，并在ABS树脂片102上将化学铜无电解镀敷作为基层之后，使用比上述的锥体更为钝角的锥钳具，在ABS树脂片102的孔侧壁上削去下面附近上镀敷的金属。从而，参照电极13，形成在溶液保持部17的上面全体和溶液凹部壁面的上面上。将溶液保持部17，用热融接薄板NS-1000(日东シンコ—公司生产)与传感器基板16粘接。

另一方面，比较例1的传感器基板的参照电极131中，使用Φ0.5mm铂绞线。参照电极13，同样浸渍于安装有ABS树脂制的溶液保持部的传感器基板的凹部内实施测定。

导电箱，由铝构成。在上面形成25mm角的开口。实施例1中，将井容器19安装为收纳在开口部分8中，导电箱2与井容器19的参照电极13电接触。导电箱2内部，在井容器19的正下方使用AD620(Analog Devices公司)，制成前置放大器(第1信号放大器)3。供给前置放大器的电源使用18V干电池。

比较例1的情况下，如图10所示，在导电箱2中，配置有井容器19。而且，导电箱2的上部开有开口，以便药液的注入、排出。另外，比较例1中，前置放大器3，独立于导电箱2配置在另外的前置放大器箱体31内。即设备部32以及前置放大器部33单独构成。

细胞，使用的是通过遗传因子改变技术发现了碳酰胆碱(以下称CCh)感受性离子通道的人肾脏胚细胞HEK-293(以下，称HEK)。在溶液保持部17内充满培养液，并在保持部内播种8000个HEK细胞。培养液，使用HEPES缓冲DMEM+10重量％FBS。将细胞从背面吸引，嵌入孔中之后，将培养液置换为测定液。测定液的组成，设定为以林格氏液为基础，且Ca浓度为2mM、浸透压为300Osm。

图11，是使用实施例1，将上述的林格氏液，置换为含有CCh100μM的林格氏液的电压噪声。图11中插入的图，将Y轴放大显示。可知，因CCh滴下电压噪声增加(图11中，F1至G1)。另一方面，在图12中表示用现有的方式(比较例1)实施同样的实验的结果。测定，在由前置放大器的初级放大变为100倍之后，再放大100倍。LPF用5kHz设定。仅在图中空心四角表示的时间滴下药剂(CCh)。

表1

	比较例1(图11)	实施例1(图12)
			平常时噪声振幅平均值(μVrms)	7.3	1.0
药剂滴下时噪声增加率(倍/平常时噪声振幅)[图11，12中B]	109	1.41
			药剂滴下时恢复时间(sec)[图11，12中A]	30	0.4

伴随药剂滴下的干扰变化总结在表1中。如表1所示，比较例1中，因溶液的置换所引起的干扰噪声振幅值(图12中B)约为800μV_p-p，是平常时噪声振幅平均值的约109倍左右。另外，溶液的交换中的电压值的复原(图12中A)需要30秒左右。另一方面，实施例1中，平常时噪声振幅也减少到6μV_p-p(1μVrms)，溶液的置换所引起的干扰噪声振幅值减少至8.4μV_p-p，另外，溶液的交换中的电压值在0.4秒左右复原。因此，通过本发明的结构，能够将平常时噪声振幅减少至1/7倍左右，并使药剂滴下时的干扰稳定100倍。另外，还能够将药剂滴下后的电位信号的复原时间减少75倍，通过这些改良，能够捕捉从药剂滴下起几秒就变得不活化的离子通道的变化。

作为比较例2，图13中表示的是使用批量钳(patch clamp)法，即将玻璃制的批量滴管(pipette)与细胞接触、并对细胞内的电位进行测定的现有方法，对同样药剂对应的HEK细胞的细胞内电位的响应同样地进行测定的结果。设CCh的浓度同样为100μM。如图13所示，细胞内的电位，在CCh滴下后，在6秒钟内去极化约10mV左右。另外，可看出CCh感受性离子通道响应中的变化(图13中F至G)。

上述的CCh反应，在比较例1中无法取得。表示出，要想用细胞外电极取得代表CCh反应的细胞的药剂响应，就必须为实施例1的结构。

本发明，能够用于对生物样本的药理活动或者电生理活动所引起的电信号变化进行测定。

Claims (16)

1.一种药理测定装置，用于对生物样本的药理活动或者电生理活动所引起的电信号进行检测，

所述药理测定装置，具有：具有开口部分的导电箱；以及配置在所述开口部分中的井容器，

所述井容器，具备：

基体，其具有配置所述生物样本的井凹部；

测定电极，其形成在所述井凹部的底面、或者设置在所述井凹部的贯通孔的孔壁面或者所述贯通孔的周边上；以及，

参照电极，其与所述测定电极电绝缘，

所述参照电极与所述导电箱一起，将所述井容器静电屏蔽。

2.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

所述参照电极，与所述导电箱电连接。

3.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

所述参照电极，形成为覆盖井凹部以外的井容器上部分。

4.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

排列有多个可将包含所述生物样本的溶液注入到所述凹部以及从所述凹部排出的注入排出器，按照该注入排出器滑动的方式对凹部进行注入。

5.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

还具备与所述测定电极电连接的第一信号放大部，所述第一信号放大部配置在所述导电箱内部。

6.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

在所述测定电极与所述参照电极之间形成绝缘部，该绝缘部中没有生物体毒性。

7.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

所述井凹部具有上方扩大的锥侧壁，所述参照电极被制作在该凹部侧壁上，对与位于所述井凹部的底面上的测定电极相邻接的在锥侧壁面附近的参照电极部分进行除去加工，在所述测定电极与所述参照电极之间形成绝缘部。

8.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

在所述基板的所述凹部的底面上，具有至少一个以上的贯通孔，在与固定在该贯通孔中的生物样本相连接的位置上，形成有所述测定电极。

9.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

所述基板的所述贯通孔中，还具备诱导所述生物样本的吸引机构。

10.根据权利要求1所述的药理测定装置，其特征在于：

所述井凹部中收纳的溶液可替换。

11.根据权利要求1中所述的药理测定装置，其特征在于：

所述井容器，在所述导电箱的开口部分中可安装、拆卸，可为一次性用品。

12.一种药理测定系统，其特征在于，具备：

权利要求1～11的任一项所述的药理测定装置；以及，

对由所述第一信号放大部放大的信号进行数据处理的计算部。

13.根据权利要求12所述的药理测定系统，其特征在于：

还具备第二信号放大部，对被所述第一放大部放大的来自所述测定电极的输出信号再放大、实施频带限制。

14.根据权利要求12或13所述的药理测定系统，其特征在于：

还具备电刺激发生装置，在期望的时刻对所述电极施加期望的电流。

15.根据权利要求12或13所述的药理测定系统，其特征在于：

还具备测定环境调整装置，将所述装置调整为期望的温度、湿度、气体浓度。

16.一种井容器，用于药理测定装置，所述药理测定装置用于对生物样本的药理活动或者电生理活动所引起的电信号进行检测，

所述药理测定装置，具有：具有开口部分的导电箱；以及配置在所述开口部分中的井容器，

所述井容器，具备：

基体，具有配置所述生物样本的凹部；

测定电极，其形成在所述凹部的底面、或者设置在所述凹部的底面上的贯通孔的孔壁面或者所述贯通孔的周边上；以及，

参照电极，其与所述测定电极电绝缘，

其可以被拆装，并使所述参照电极与所述导电箱电连接。

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