JP2007218716A - 細胞電気生理センサ - Google Patents

Abstract

【課題】細胞測定を行う際に、培養液中へ接着剤などの不純物の混入が極力少ないことと、効率よくチップを確実に固定することができる細胞電気生理センサを実現することを目的とする。
【解決手段】キャビティ２と貫通孔３を設けたダイアフラム４からなるチップ１と、Ｏリング５と、段差部１０を設けた第一の開口部７を有した第一のプレート６と、第二の開口部９を有した第二のプレート８とからなり、段差部１０の面上にチップ１、Ｏリング５および第二の開口部９を同一軸上に配置し、且つ段差部１０と第二のプレート７の一面とでＯリング５とチップ１を加圧した状態で第一のプレート６と第二のプレート８を接合することによってチップ１を固定する。
【選択図】図２

Description

本発明は、細胞の電気生理的活動の測定に用いられる細胞電気生理センサに関するものである。

従来の技術である電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要とせず、減圧を行うだけで自動に細胞を固定・測定を行うことができ、自動化システムとして適している。

例えば、絶縁接着部を用いて微細構造ユニットを容器に固定したシステムであり、細胞の測定を実施するための技術を開示している（例えば、特許文献１参照）。

ここで、絶縁接着部を用いた場合には、チップ固定が煩雑になるとともに、これが細胞測定の際の測定精度を下げる要因になると考えられた。
特表２００４−５１０９８０号公報

しかしながら、前記従来の技術においては細胞を保持するための貫通孔が設けられたチップを、電極が施されたプレートの開口部などに実装するための最適な構造については開示されていなかった。

本発明は、細胞測定を行う際に、培養液中へ接着剤などの不純物の混入が極力少ないことと、効率よくチップを確実に固定することができる細胞電気生理センサを実現することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、段差部の面上にチップおよびＯリングを同一軸上に載置するとともに、第二の開口部を同一軸上に配置し、且つ段差部の一面と第二のプレートの一面とでＯリングとチップを加圧した状態で第一のプレートと第二のプレートを接合することによってチップを固定し、前記チップの貫通孔のみによって液体が通過することができる構成としたものである。

本発明の細胞電気生理センサは、Ｏリングを用いたプレートへのチップ固定を行うことで、接着剤を用いずチップをプレートの第一の開口部に固定することができ、接着剤などの不純物の混入が少なく、且つ効率よくチップを固定するセンサ構造を実現することができる。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの構成を説明するための上面図であり、図２は図１のＡ−Ａ部における断面図であり、図３は細胞電気生理センサの動作を説明するための断面図である。また、図４は別の例の細胞電気生理センサの断面図であり、図５〜図８はさらに別の例の細胞電気生理センサの断面図である。

図１および図２において、チップ１はキャビティ２を有し、このキャビティ２の底部に貫通孔３を有したダイアフラム４を形成している。この貫通孔３の上には細胞１１を吸引あるいは加圧などによって液体の中に分散された細胞１１が貫通孔３を塞ぐように固定できるように形成している。

ここで、貫通孔３の直径は測定する細胞１１の大きさ、形状、性質によって決定されるが、細胞１１の大きさが１０〜５０μｍ程度の場合、細胞１１が貫通孔３を通り抜けずに確実に吸引または加圧保持される直径としては５μｍ以下が望ましい。

そして、このチップ１の材質はシリコンまたはガラスを用いることによって半導体プロセスの微細加工技術を用いることができ、小型化と高精度化および高い生産性を実現することができる。

また、Ｏリング５はドーナツ型の形状で弾性を有しており、このＯリング５の材料としてはシリコンゴム、ニトリルゴム、フッ素ゴム、アクリルゴム、ブチルゴム、またはウレタンゴムのいずれかを用いることができる。

次に、第一のプレート６はチップ１を載置するための第一の開口部７を有しており、この第一の開口部の一部にチップ１を保持するための段差部１０を設けている。そして、この段差部１０のチップ１を載置する一面は平坦な平面とすることが好ましい。

また、第二のプレート８は第二の開口部９を有しており、この第二のプレート８の一面は平坦な平面としている。そして、前記段差部１０の平坦な一面と、第二のプレートの平坦な一面でＯリング５とチップ１を固定保持する。

そして、第一のプレート６、第二のプレート８はすべて熱可塑性樹脂で形成している。これらの熱可塑性樹脂は、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、オレフィンポリマ、ポリメタクリル酸メチルアセテート樹脂のいずれか、またはこれらの組み合わせを用いることが好ましい。さらに、環状オレフィンポリマ、線状オレフィンポリマ、またはこれらが共重合した環状オレフィンコポリマ、およびポリエチレンからなる材料から選択される少なくとも一つの樹脂を含むことがより好ましい。

これらの材質の樹脂を用いることによって第一のプレート６と第二のプレート８を超音波接合、レーザ接合などの熱溶融による接合を行うことによって生産性と封止性の高い接合を実現することができる。

そして、第一の開口部７の内部に設けた段差部１０の上にチップ１を載置し、このチップ１の上面にＯリング５を載置し、このＯリング５が段差部１０とチップ１の上下面と第二のプレート８の一面とによって同一軸上に配置して加圧した状態で、第一のプレート６と第二のプレート８を例えば超音波接合技術を用いて接合し、Ｏリング５を弾性変形させ、その反発力で流体などに対する密封性を実現しており、Ｏリング５の圧縮に対する反力（接触圧力）で流体をシールしていることから、密封すべき液体の圧力が増すとＯリング５は圧力に応じて反力を増して液体をシールするという特性を有している。

このように、Ｏリング５を用いることによって高い密封性を実現するとともに、接着剤などを用いていないことから液体（培養液、あるいは薬液）中に不純物などの混入を防ぎ、さらには生産性の高いセンサ構造を実現することができる。

そして、図２に示すようにＯリング５はチップ１の上面と第二のプレート８の下面とによって加圧され収縮し、その結果チップ１が固定された状態になっている。この加圧によってチップ１を固定し、かつ第二のプレート８の上部空間と第一のプレート６の下部空間がチップ１の貫通孔３のみで繋がった状態となっている。

次に、本発明の細胞電気生理センサの動作について図３を用いて説明する。

図３は貫通孔３を塞ぐように細胞１１の保持を行った状態の細胞電気生理センサの断面図である。

まず、図３に示すようにキャビティ２の内部に細胞１１を分散させた培養液１４ａを投入した後、貫通孔３の下部より吸引する、あるいはキャビティ２の上部より加圧することによって、細胞１１と培養液１４ａは貫通孔３から吸引されて細胞１１は貫通孔３を塞ぐように保持される。

一方、第一のプレート６側の領域は培養液１４ａとは異なる、あるいは同じ培養液１４ｂによって満たしておく。そのため、図示していないが第一のプレートの裏面には流路を形成するためのプレートを設けることによって培養液１４ａ、１４ｂを流入させたり、薬液を投入して細胞１１と反応させることができるように構成している。

その後、細胞１１への刺激となりうる行為をキャビティ２側もしくは貫通孔３側から施す。この刺激の種類としては、例えば化学薬品、毒物、などの化学的な刺激に加え、機械的変位、光、熱、電気、電磁波などの物理的な刺激などがある。そして、細胞１１がこれらの刺激に対して活発に反応する場合、例えば細胞１１は細胞膜が保有するチャンネルを通じて各種イオンを放出あるいは吸収する。この結果として、細胞１１の電位が変化し、その変化を第一の電極１２と第二の電極１３で検出することができる。

このとき、図３に示したようにＯリング５を用いてチップ１の固定を行うことによって、接着剤を用いてないことから培養液１４ａ、１４ｂ中への不純物成分の溶出がなくなることから、高精度な測定を行うことができる。

また、第一のプレート６の第一の開口部７に段差部１０を設けた構造とすることで、後で説明する製造方法においてチップ１またはＯリング５を安定して載置できると共に、第一のプレート６と第二のプレート８を接合した時にＯリング５によって確実にチップ１を固定することができる。そして、この段差部１０の厚みは１００μｍ以上とすることが強度の点から好ましい。例えば、チップ１の外形を５００〜７００μｍとした場合、キャビティ７を形成するチップ１の外壁部の厚みは１００〜１５０μｍ程度とし、その高さは５００〜７００μｍに設計している。

このような形状を有するチップ１を保持するためには段差部１０の厚みは１００μｍ以上とし、その突き出し部の突き出し寸法も１００μｍ以上が好ましい。

次に、別の例の細胞電気生理センサの構成について説明する。この別の例の細胞電気生理センサは、図４に示すようにチップ１が上下反対方向に保持することによって前記センサと同様の効果を発揮することができるものである。

ただし、この時、細胞１１はキャビティ２とは反対側の貫通孔３において保持することになる。

さらに別の例の細胞電気生理センサとして、図５に示すように段差部１０の上にＯリング５を載置し、そのＯリング５の上にチップ１を配置したり、図６に示すように図５に示した配置とチップ１の配置を上下反対とした構成においても、Ｏリング５によりチップ１を確実に保持固定することができる。これらのいずれの保持構造を用いるかについてはデバイスの形状、細胞１１および培養液１４ａ、１４ｂの特性に応じて適宜選択することによって、幅広い測定条件に対応できるセンサ構造を実現することができる。

さらに、図７に示すようにＯリング５の上下にチップ１の上面および第二のプレート８の一面と圧接するとともに、第一の開口部７の壁面に対してもＯリングの側面と圧接するような構成とすることによって、より密封性に優れた細胞電気生理センサを実現することができる。

また、このＯリング５をシリコンゴム、ニトリルゴム、フッ素ゴム、アクリルゴム、ブチルゴム、またはウレタンゴムのいずれかを用いることによって、高いシール性と長期信頼性を実現できる細胞電気生理センサを実現することができる。

以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を説明する。

図１〜図７に示したチップ１はシリコンウエハを用いて、穴径；３μｍの貫通孔３を形成し、その後、外径；７００μｍ、内径；５００μｍ、高さ５００μｍのキャビティ２をドライエッチング技術によって形成したものである。

そして、Ｏリング５は外径；７００μｍ、内径；５００μｍ、円環部の断面形状；１００μｍからなるリング形状のものを用いている。

一方、第一のプレート６と第二のプレート８は熱可塑性樹脂で形成しており、これらの樹脂材料を用いて、ドリル、レーザ等によって切削、穴開け加工を行って、段差部１０を有した第一の開口部７、および第二の開口部９をそれぞれ形成する。

次に、図２に示したように第一のプレート６の第一の開口部７の段差部１０の一面上にチップ１を載置する。このとき、段差部１０の厚みは１００μｍとし、その突き出し量は１００μｍとしている。この段差部１０の厚みは１００μｍ以上とすることが強度の観点から好ましい。その後、チップ１の上面にＯリング５を載置する。この時、Ｏリング５の上面が第一のプレート６のチップ１を載置する側の面から突出した構成とすることで、第一のプレート６と第二のプレート８を接合した時、弾性変形した状態となり、この弾性変形した反力によって確実にシール性を確保することができる。

次に、Ｏリング５の上部と第一のプレート６の上部を跨ぐように第二のプレート８を載置する。そして、第二のプレート８を上部から加圧保持してＯリング５を圧縮した状態とし、第一のプレート６と第二のプレート８を超音波あるいはレーザ、超音波などの局部加熱装置を用いて熱融着することによって接合することができる。

このとき、より効果的にはポリカーボネート樹脂（ＰＣ）、ポリエチレン樹脂（ＰＥ）、オレフィンポリマ、ポリメタクリル酸メチルアセテート樹脂（ＰＭＭＡ）のいずれか、またはこれらの熱可塑性樹脂の組み合わせを用いることである。

これらの樹脂材料は材料どうしの固溶性が高く、相互に貼り合わせが容易である。

そして、本発明で示したような樹脂材料を選択することで、第一のプレート６と第二のプレート８は接着剤を使うことなしに、互いに強固に接合できる熱溶着や溶剤溶着を用いることができるという製造上の利点を有する。

このとき、貼り付ける方法としては、第一のプレート６と第二のプレート８の貼り合わせ面にレーザ光線を照射することによって、貼り合わせ面を溶着させて固着させることが容易にできる。そして、レーザ溶着法を用いるときには、少なくとも片側の樹脂材料がレーザ光線に対して透明性を有しており、さらに２つの樹脂材料が同じであるか、相互に固溶するものであることが望ましく、環状オレフィンポリマ、線状オレフィンポリマ、またはこれらが重合した環状オレフィンコポリマ、またはポリエチレンからなる樹脂材料から選択されることが好ましい。

この場合には、これら樹脂材料において、相互に貼り合わせたときの密着力が高いばかりでなく、特に環状オレフィンコポリマの場合は耐熱性が向上し、酸・アルカリなどへの耐薬剤性も増すという利点を有している。

なお、第一のプレート６と第二のプレート８を貼り合わせる方法は前記の他に、貼り合わせ面に非極性有機溶剤を塗布することによって貼り合わせ面を貼り合わせることもできる。

例えば、これら樹脂材料が環状オレフィンコポリマの場合には、非極性有機溶剤として代表的にはトルエンを含有した溶剤を塗布することで、前記樹脂材料が固溶し、固着させることができる。

このように、超音波、レーザ溶着技術あるいは溶剤を用いることによって接合できることから、接着剤を全く使用せずにチップ１を固定し、培養液１４ａ、１４ｂの漏れないシール性を実現できることから、どのような条件においても不純物成分の溶出がなくなり、細胞１１の電気生理現象をより高精度な測定を行うことができる細胞電気生理センサを容易に作成することができる。

（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。

図８は本実施の形態２における細胞電気生理センサを説明するための断面図である。ここで、本実施の形態２における基本的な構成と動作は実施の形態１とほぼ同じであり、大きく異なっている点は構成部品のＯリング５を複数使用するところである。

図８に示すように、第一のプレート６の段差部１０の上に一つのＯリング５ａを載置し、このＯリング５ａの上部にチップ１を貫通孔３が下面になるように載置し、さらにこのチップ１の上面にＯリング５ｂを載置し、２つのＯリング５ａ、５ｂが加圧圧縮された状態で第一のプレート６と第二のプレート８を実施の形態１と同様の方法によって接合することによってチップ１を保持固定し、かつ第二のプレート８の上部空間と第一のプレート６の下部空間がチップ１の貫通孔３のみで繋がった構造となっている。

このような構成とすることによって、実施の形態１で説明した作用に加えて、弾性体を介してチップ１が保持固定することとなり、肉厚の薄いチップ１を保持固定するとき、チップ１のカケ、クラックなどの不良の発生の少ない細胞電気生理センサを実現することができる。

（実施の形態３）
以下、本発明の実施の形態３における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。

図９は本実施の形態３における細胞電気生理センサを説明するための上面図であり、図１０は図９のＢ−Ｂ部における断面図である。本実施の形態３における構成と動作は実施の形態１とほぼ同じであり、大きく異なっている点はＯリング５の内形がチップ１の外形よりも大きくし、Ｏリング５の内形の内部にチップ１を載置し、Ｏリング５が第一のプレート６の一面と第二のプレート８の段差部１０の一面とで直接弾性変形させたＯリング５を圧接することによってシール性を確保した構造としたものである。このような構成とすることによって、実施の形態１と同様の作用に加えて、薄型の細胞電気生理センサを実現することができる。

また、位置決めを容易にすることも可能であり、微小な形状のチップ１を取り扱うときには効率よく組み立てることができる。

さらに、キャビティ２の内形と、第二の開口部９の内形とを同一寸法とすることによって気泡を発生しにくい構造を実現することができる。これはセンサの培養液１４ａ、１４ｂを流入させたとき、少しでも隙間があるとその隙間部分に気泡が発生し、その気泡の除去に手間と時間がかかるということが起こりにくいセンサを実現することができる。

この構造は、第一のプレート６の段差部１０の一面にＯリング５を載置し、このＯリング５の中心部にチップ１を配置し、Ｏリング５が加圧され横に広がるような状態となるように第一のプレート６と第二のプレート８を圧接接合し、この中心部へ弾性変形されたＯリング５の反力によってチップ１を固定するように構成している。そして、第二のプレート８の上部空間と第一のプレート６の下部空間がチップ１の貫通孔３のみで繋がった構造となっている。

さらに、Ｏリング５は第一のプレート６の段差部１０の一面と第二のプレート８の一面とによって加圧収縮され、これにより横方向へ伸張して第一の開口部７の内壁面にも圧接して固定された状態としている。

また、第一のプレート６の第一の開口部７、第二のプレート８の第二の開口部９、キャビティ２の内形形状、Ｏリング５の形状が円形状であることによって、チップ１の側壁をＯリング５によって均等に加圧することができ、確実に固定することができる。

以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を説明する。

まず、第一のプレート６の第一の開口部７の段差部１０の一面にＯリング５を載置し、その後、Ｏリング５の中心部にチップ１を配置する。

次に、Ｏリング５の上部と第一のプレート６の上部を跨ぐように第二のプレート８を載置し、その後、第二のプレート８を上部から加圧しＯリング５を圧縮して弾性変形させた後、第一のプレート６と第二のプレート８を接合することによって図１０に示したような細胞電気生理センサを作製することができる。

本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、細胞測定の際に培養液中への不純物成分の溶出がないため、安定した細胞測定を行うのに有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの上面図 同断面図 同動作を説明するための断面図 同別の構成を有する細胞電気生理センサの断面図 同さらに別の構成を有する細胞電気生理センサの断面図 同断面図 同断面図 同断面図 本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの上面図 同断面図

符号の説明

１ チップ
２ キャビティ
３ 貫通孔
４ ダイアフラム
５ Ｏリング
６ 第一のプレート
７ 第一の開口部
８ 第二のプレート
９ 第二の開口部
１０ 段差部
１１ 被検体細胞
１４ａ 培養液
１４ｂ 培養液

Claims (14)

1. キャビティと貫通孔を設けたダイアフラムとからなるチップと、弾性を有するＯリングと、チップおよびＯリングを載置するための段差部を設けた第一の開口部を有した第一のプレートと、第二の開口部を有した第二のプレートと、第一の電極および第二の電極とからなる細胞電気生理センサであって、
   第一の開口部の段差部の面上に前記チップおよびＯリングを同一軸上に載置するとともに、第二のプレートの第二の開口部を同一軸上に配置し、且つ第一のプレートの段差部の一面と第二のプレートの一面とでＯリングとチップを加圧した状態で第一のプレートと第二のプレートを接合することによってチップを固定した細胞電気生理センサ。
2. Ｏリングの外周部を第一の開口部の内壁面に圧接した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. チップを載置する段差部の一面と、チップの上下面と、第二のプレートの一面が平行な面を有している請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
4. 段差部の面上と第二のプレートの一面にＯリングを配置し、この二つのＯリングを介してチップを載置した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
5. Ｏリングをシリコンゴム、ニトリルゴム、フッ素ゴム、アクリルゴム、ブチルゴム、ウレタンゴムのいずれかを用いた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
6. 第一の開口部の内形、第二の開口部の内形、チップの内形、Ｏリングの内形・外形を円形状とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
7. 第一のプレートと第二のプレートを熱可塑性樹脂とした請求項１に記載の細胞電気生理センサアレイ。
8. 熱可塑性樹脂をポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、オレフィンポリマ樹脂、ポリメタクリル酸メチルアセテート樹脂のいずれか一つを含む熱可塑性樹脂とした請求項７に記載の細胞電気生理センサアレイ。
9. キャビティと貫通孔を設けたダイアフラムとからなるチップと、弾性を有するＯリングと、チップおよびＯリングを載置するための段差部を設けた第一の開口部を有した第一のプレートと、第二の開口部を有した第二のプレートと、第一の電極および第二の電極とからなる細胞電気生理センサであって、
   第一の開口部の段差部の面上に前記チップを載置し、このチップの外形より大きな内形を有するＯリングを前記チップと同心円状に段差部の面上に配置し、且つ第一のプレートの段差部と第二のプレートの一面とでＯリング加圧した状態で第一のプレートと第二のプレートを接合することによってチップを固定した細胞電気生理センサ。
10. Ｏリングが、第一の開口部の内壁面、段差部の一面、第二のプレートの一面およびチップの外周部に圧接した請求項９に記載の細胞電気生理センサ。
11. Ｏリングをシリコンゴム、ニトリルゴム、フッ素ゴム、アクリルゴム、ブチルゴム、またはウレタンゴムのいずれかを用いた請求項１０に記載の細胞電気生理センサ。
12. 第一の開口部の内形、第二の開口部の内形、キャビティの内形、およびＯリングの内形・外形を円形状とした請求項９に記載の細胞電気生理センサ。
13. 第一のプレートと第二のプレートを熱可塑性樹脂とした請求項９に記載の細胞電気生理センサアレイ。
14. 熱可塑性樹脂をポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、オレフィンポリマ樹脂、ポリメタクリル酸メチルアセテート樹脂のいずれか一つを含む熱可塑性樹脂とした請求項９に記載の細胞電気生理センサアレイ。

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