CN105334176A - 用于AChE的组合物、筛选AChE抑制剂方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种于乙酰胆碱酯酶的组合物、筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法和用途。该组合物包括罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物。本发明使用双信号输出，其检测灵敏度和特异性高，双两个信号的输出，包括AuNP溶液的颜色改变和RB分子的荧光恢复，能够有效的用于避免假阳性信号。同时可以有效的避免了来自巯基化合物的干扰，保证了检测结果的准确性。

Description

用于AChE的组合物、筛选AChE抑制剂方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种用于乙酰胆碱酯酶(AChE)的组合物、筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法和用途。

背景技术

AChE(乙酰胆碱酯酶)是一种可以在胆碱神经突触催化分解乙酰胆碱的酶，使突触传递终止。很多研究已证实AD小鼠脑脊液中AChE水平显著降低，低水平的AChE与一定程度的认知障碍显著相关。小鼠脑脊液中低水平AChE可能表明大脑处于风险或者个体正处于AD的临床症状前阶段。由于现有的AD确诊不仅需要存在严重的认知功能缺损，而且需要证实存在典型的脑组织病理学改变，这些信息对于早期阻断和治疗疾病就非常有用。现在尚无准确的方法在早期无症状阶段识别AD，越来越多的证据表明，使用脑脊液(CSF)生物标记物本身(β-淀粉样蛋白，全蛋白和磷酸化tau蛋白水平)或者与神经影像学结合，可为AD的临床诊断提供有效的信息。CSF中AChE的水平与AD认知进程的相关性，可以作为一个重要的参数应用于监测AD进程和治疗效果，尤其是同时结合其他CSF生物标记物和神经影像学检查。因此开发可靠的方法来检测CSF中AChE的水平十分重要。

传统方法检测AChE水平包括使用Ellman试剂的比色法，和检测乙酰胆碱酯酶氧化胆碱产生的过氧化氢，这两个方法均灵敏度低且需要大量时间。为了提高灵敏度，增强的化学方法，如基于有机化合物和量子点的电化学探针和化学发光或者荧光检测AChE，起到了重要作用。然而这些方法仍然灵敏度较低且需要繁琐的化学合成步骤。

已报道两种基于AuNP(纳米金)比色法检测AChE，一种是基于AuNP的聚集，会导致红色吸收带的红移，以及从红色到蓝色的颜色变化；另一种依赖于AChE催化的单分散AuNPs尺寸的扩大。然而，研究者仍然面临提高试验灵敏度和准确性的挑战，更重要的是，没有报道评估它们在实际复杂混合物样品，如CSF或血清分析中的应用。因此，开发具有高灵敏度和特异性的检测AChE实际样本方法有很大需求。

发明内容

本发明需要解决的现有技术的问题是：现有的用于乙酰胆碱酯酶分析以及筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，其灵敏度和准确性较低且需要繁琐的化学反应步骤，而且不合适应用于复杂的样品中。

为了解决上述问题，本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶分析用的组合物、用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法以及用途。

具体而言，本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶分析用的组合物，包括罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物。

优选的，所述的罗丹明素、所述纳米金以及所述乙酰胆碱酯酶的作用底物的摩尔比为：800～1800:5：10000～40000，优选摩尔比为1000～1600：5:10000～30000，更优选摩尔比为1000～1400：5:15000～20000。

优选的，所述的纳米金为柠檬酸修饰的纳米金。

优选的，所述的纳米金的粒径大小为10nm～80nm，优选为10～40nm，更优选为13～20nm。

优选的，所述乙酰胆碱酯酶的作用底物为碳数子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类化合物及其类似物；优选为乙酰胆碱及其类似物，丙酰胆碱及其类似物，丁酰胆碱及其类似物；更优选为乙酰胆碱及其类似物。

其中，本发明中的乙酰胆碱酯酶可以作用于乙酰胆碱酯酶的作用底物，特异性的断开乙酰胆碱酯酶作用底物中的酯键，生成碳原子数为2-6个的羧酸和胆碱类化合物或者其类似物。

优选的，所述的碳数子数为2-6的羧酸酰化的胆碱类化合物的类似物为碳数子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类含盐类似物或者碳原子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类受体类似物；优选为乙酰胆碱含盐类似物，乙酰胆碱受体类似物，丙酰胆碱含盐类似物，丙酰胆碱受体类似物，丁酰胆碱含盐类似物，丁酰胆碱受体类似物；更优选为乙酰胆碱含盐类似物或乙酰胆碱受体类似物；进一步优选为乙酰胆碱含磷类似物。

优选的，所述组合物为含有罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物的缓冲溶液。

优选的，所述的缓冲溶液的pH值为9.0-11.0，优选pH值为10.0，更优选为碳酸氢钠-氢氧化钠的缓冲溶液。

本发明同时提供了一种用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，包括如下步骤：

(1)将样本置于含有罗丹明素、纳米金、乙酰胆碱酯酶的作用底物的溶液中反应；

(2)利用紫外吸收的方法，测定溶液的吸收值；

以及

(3)采用荧光检测，测定溶液的荧光值。

优选的，所述的紫外吸收检测波长范围为400～800nm。

优选的，所述的荧光检测的激发波长范围为540nm～560nm，吸收波长范围为560～580nm。

本发明还通过了以上所述的组合物或以上所述的方法在硫代胆碱含量测定领域、乙酰胆碱酯酶分析领域或者在乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选领域中的用途。

本发明的检测原理为：RB(罗丹明素)可溶于水、耐光、有强烈的荧光，且容易吸附到金纳米粒子的表面导致荧光淬灭。RB分子上带正电荷的氨基能够通过静电相互作用识别带负电荷的柠檬酸-AuNPs，从而连接到AuNPs的表面。同时RB分子的荧光被AuNPs淬灭。此时若加入乙酰胆碱类似物(acetylthiocholine，ATC)和AChE到RB-AuNPs溶液中，AChE可以水解ATC形成硫代胆碱，硫代胆碱通过形成Au–S键替代RB分子，紧密结合到AuNPs表面，导致RB分子从Au表面脱离，释放出荧光。同时，吸附到不同AuNP表面的硫代胆碱和RB分子可以通过硫代胆碱上的季铵基团和RB分子上的酸性基团之间的静电相互作用发生反应，引起AuNPs聚集。这个过程导致吸收光谱带的快速变化，同时AuNPs溶液的颜色由红色变为蓝色。另外，如果存在AChE抑制剂，AChE就无法水解ATC产生硫代胆碱来引起RB-AuNPs聚集或恢复RB分子的荧光。

应用以上原理，本发明提供了一个使用RB-AuNPs筛选AChE抑制剂的高灵敏度检测方法，同时验证了它在检测转基因AD小鼠CSF中AChE的效用。

基于罗丹明素纳米金(RB-AuNP)的双读数(比色和荧光)检测，其灵敏度高、特异性强，可以应用于监测阿尔茨海默氏病(AD)小鼠脑脊液(CSF)中乙酰胆碱酯酶(AChE)的含量。由于分子的变化可以容易转化为颜色变化，从而被吸光度或表面等离子体共振改变识别，所以使用AuNP比色进行检测成为强有吸引力的检测方式。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过AuNP溶液的颜色改变和RB分子的荧光恢复可以作为检测复杂样本中AChE的含量的有效工具。

(2)本发明的方法可以应用于筛选AChE抑制剂，如果存在AChE抑制剂，AChE就无法水解ATC产生硫代胆碱来引起RB-AuNPs聚集或恢复RB分子的荧光。

(3)本发明采用双信号输出是一个显著的进步，而且虽然巯基化合物与硫代胆碱类似，可从AuNPs表面释放RB分子，引起荧光恢复，但是巯基化合物并不能引起肉眼可见的AuNPs聚集。因此如果满足荧光恢复和溶液颜色变化两个条件，必须满足可以指示硫代胆碱的条件。这个要求有效的避免了来自巯基化合物的干扰，因此保证了检测结果的准确性。两个信号的输出，包括AuNP溶液的颜色改变和RB分子的荧光恢复，能够有效的用于避免假阳性信号。

下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：

附图说明

图1a为本发明实施例一中RB-AuNPs溶液以及同时与AChE和ATC孵育的RB-AuNPs溶液的UV吸收谱。

图1b为发明实施例一中与RB-AuNPs溶液以及同时与AChE和ATC孵育的RB-AuNPs溶液的荧光谱。

图2a为实施例一中RB-AuNPs和ATC以及不同浓度的AChE溶液的UV吸收谱。

图2b为实施例一中RB-AuNPs和ATC以及不同浓度的AChE溶液的荧光图像。

图2c为实施例一溶液的ΔA/D值与不同浓度AChE的关系图。

图2d为实施例一溶液的F/F0值与不同浓度AChE的关系图。

图3a为实施例一中经过不同处理的样品溶液的ΔA/D值。

图3b为实施例一中经过不同处理的样品溶液的F/F0值。

其中，1为：SAM-R1样本，使用磷酸钠缓冲液(pH7.4)处理；

2为：SAM-P8样本，使用磷酸钠缓冲液(pH7.4)处理；

3为：SAM-P8样本，使用高剂量新斯的明(5.0mgkg^-1day^-1)处理；

4为：SAM-P8样本，使用低剂量(0.05mgkg^-1day^-1)处理。

具体实施方式

如上所述，本发明的目的在于：提供一种乙酰胆碱酯酶分析用的组合物、用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法以及用途，实现乙酰胆碱酯酶的高灵敏度和高准确性检测，而且可以应用于复杂的样品以及用来筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂。

具体而言，本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶分析用的组合物，包括罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶作用底物。

本发明同时提供了一种用于乙酰胆碱酯酶的分析体系，所述组合物为含有罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物的缓冲溶液。

同时，本发明提供了一种筛选乙酰胆碱抑制剂的方法，包括如下步骤：

(1)将样本置于含有罗丹明素、纳米金、乙酰胆碱酯酶的作用底物的溶液中反应；

(2)利用紫外吸收的方法，测定溶液的吸收值；

以及

(3)采用荧光检测，测定溶液的荧光值。

同时，本发明提供了一种测定硫代胆碱含量的方法，包括如下步骤：

(1)将样本置于含有罗丹明素、纳米金、乙酰胆碱酯酶的作用底物的溶液中反应；

(2)利用紫外吸收的方法，测定溶液的吸收值；

以及

(3)采用荧光检测，测定溶液的荧光值。

需要说明的是，本发明的以上方法用来筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的原理是用该方法直接测定出待测样品中硫代胆碱的含量，而硫代胆碱含量的变化会引起本发明所述含有罗丹明素、纳米金、乙酰胆碱酯酶的作用底物的溶液体系的荧光吸收波谱变化和紫外吸收波谱变化，从而借助该荧光吸收波谱变化可以找到与乙酰胆碱酯酶含量的对应关系，测定出乙酰胆碱酯酶含量，从而可以筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂。

以上方法还可以用于恢复RB-AuNPs溶液的荧光特性。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明实施例中所用的试剂和仪器信息如下：

柠檬酸，Sigma-Aldrich公司；

透射电子显微镜(TEM)，JEM-2100，日本；

动态光散射粒度仪DLS，山东耐克特分析仪器有限公司；

SAM-R1小鼠模型，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司；

SAM-P8小鼠模型，购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司；

半胱氨酸，高半胱氨酸，谷胱甘肽，购自上海酶联试剂公司；

碱性磷酸酶，酰基酶，β牛乳糖，葡糖氧化物，购自上海如吉生物科技发展有限公司；

新斯的明，购自武汉远程共创科技有限公司；

加兰他敏，购自上海好康化工有限公司；

小鼠模型(SAM-R1模型和SAM-P8模型)，购自天津医科大学，饲养环境为温度18～22℃，湿度50～60％。

实施例一

一、RB-AuNPs检测系统的建立

(一)RB-AuNPs检测系统建立

采用常规方法合成13nm的AuNPs。取包含0.4ml1％HAuCl₄·3H₂O的40ml的水溶液，将其不断加热到沸点，达到沸点后，快速加入1.2ml1％柠檬酸三钠溶液。5分钟后，溶液从淡黄色变为深红色，然后将溶液冷却15分钟，确保完全分解，胶质溶液慢慢降到室温。制备得到以柠檬酸作为取代基和稳定基团的柠檬酸-AuNPs。通过TEM电镜检测，检测结果显示柠檬酸-AuNPs直径大小为13nm，而且通过荧光检测显示溶液呈红色荧光且由于表面等离子体共振在520nm有典型吸收峰。

然后向2.5mMNaHCO₃-NaOH缓冲液(pH10.0)中加入AuNPs溶液中和不同浓度的RB，使混合后的溶液中AuNPs的最后浓度固定为5nM，RB的浓度为0–2.0μM之间，形成梯度，轻轻搅拌混合制备得到RB-AuNPs。反应平衡2h后记录制备得到的RB-AuNPs溶液的吸收光谱以及荧光谱。

从吸收光谱的结果来看，RB-AuNPs的吸收光谱带类似于柠檬酸修饰的AuNPs，而且肉眼可以观察到AuNPs溶液经RB修饰后溶液仍呈现红色。

从荧光谱的对比结果可以发现，RB的最佳反应浓度为1.2μM，此时制备得到的RB-AuNPs溶液只有非常弱的荧光信号，证明反应体系中没有多余的游离RB。推测RB分子带正电荷，通过静电作用可以容易的吸附在带负电荷的柠檬酸-AuNPs上，从而形成RB-AuNPs，而且AuNPs使RB荧光淬灭。

(二)RB-AuNPs检测系统反应机制的验证

为了证实以上推测的机制，通过Zeta电位测定、动态光散射(DLS)、UV吸收以及荧光光谱检测等手段进行验证。

通过Zeta电位测量来研究RB-AuNPs与AChE和ATC孵育前后，RB-AuNPs表面的Zeta电位变化。由于存在酸性基团，RB-AuNPs呈负电荷，分散RB-AuNPs的Zeta电位为–38mV，AChE导致的RB-AuNPs聚集，使RB-AuNPs的Zeta电位增加到–0.27mV，其原因很可能是由于AChE催化水解ATC形成硫代胆碱，硫代胆碱上带有正电荷的季铵基团，使聚集后的RB-AuNPs的Zeta电位增加。

聚合过程也被动态光散射(DLS)实验和TEM电镜分析证实。DLS实验结果表明，RB-AuNPs的平均流体力学直径为21nm，AChE导致RB-AuNPs聚集使其粒径增加到400nm，与透射电子显微镜(TEM)分析结果一致。

聚集过程进一步被UV吸收证实。UV光谱显示随着聚集的形成，RB-AuNPs在520nm处的吸收降低，同时在500nm至600nm之间出现新的吸收峰，如图1a所示。同时，从Au表面分开的RB分子被荧光光谱检测到，如图1b所示。AuNPs上吸附的RB分子的非常微弱的荧光在加入AChE和ATC后显著上升。

所有上述实验的结果特征支持我们关于该检测系统作用机制的设想。

二、AChE的检测限

接下来我们研究了该方法用于检测AChE在水溶液中的检测限。在ATC(20μM)和RB-AuNPs(5nM)的混合溶液中加入不同剂量的AChE，使AChE的终浓度分别为0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0mUmL^-1，溶液在室温下放置21min。每3min记录下AChE催化水解ATC的反应过程中溶液的吸收光谱。

从吸收光谱的结果可以看出，RB-AuNPs的聚集是一个线性动态过程，AuNPs聚集程度依赖于AChE的浓度，高浓度的AChE导致更完全的聚集。如图2a所示，其中图2a所示为反应3min后，520nm波长波峰处从高往低依次为0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0mUmL^-1。从图2a可以看出，随着AChE浓度的增加，溶液在520nm波长处的吸收逐渐降低，同时伴随着500nm至600nm之间波长处的吸收峰的增加。而且注意到加入低浓度的AChE(2.0mUmL^-1以下)，生成的500nm至600nm之间波长处的吸收峰已无法观测到。根据吸收光谱的检测结果，推测AuNPs的聚集是不完全的，因此溶液的颜色从红色逐渐变为紫色。结果，500nm和600nm的新吸收峰并没有图1a中AChE浓度1UmL^-1时显示的清楚。

UV吸收光谱的变化通过计算A/D(聚集/分散区)吸收峰下的面积来定量，它们在荧光光谱的相应变化通过计算荧光强度的变化(F/F0)进行监测。计算所有样本曲线下区域D(分散，吸收面积从450到570nm)和区域A(聚集，吸收面积从580到750nm)的面积。测量ΔA/D与AChE浓度的关系，显示检测限可达到1.0mUmL^-1，如图2c所示。同时，聚集是一个时间依赖的过程。其中，ΔA/D的值越大，表示更高程度的聚集。从结果可以看出，除了空白样本(0mUmL^-1)只显示出可忽略的变化外，加入不同浓度的AChE，溶液的ΔA/D值均随着时间的增加而增大。

从以上结果可以看出，RB-AuNPs的聚集程度与AChE的浓度和孵育时间成比例。

检测限可以通过监测解离RB的荧光得到，如图2b所示，其中575nm波长处波峰从高到低依次为3.0，1.0，0.6，0.3，0.1，0mU/ml。加入不同浓度的AChE(0，0.1，0.3，0.6，1.0，3.0mU/ml)，检测溶液的荧光值。其中，ATC的浓度为20μM，孵育时间为20min，激发波长为550nm，575nm作为发射波长，收集荧光，从图2b可以看出来，随着AChE的浓度升高，从Au表面分开的RB分子逐渐被检测到荧光，浓度越高，荧光值越大，在AChE的浓度为0.1mU/ml时，相较于AChE的浓度为0时，也能检测到明显的荧光，因此，该检测方法将AChE的检测限提高到0.1mUmL^-1。该检测限比大多数检测AChE的AuNP探针要低很多。F/F₀与不同浓度的AChE的关系如图2d所示。

三、抗巯基化合物和蛋白质的干扰

巯基化合物，如半胱氨酸(Cys)，高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)等都含有巯基。将不同的巯基化合物，包括半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽，分别溶于双蒸水中，其浓度均为0.1mM，分别与ATC(20μM)和RB-AuNPs(5nM)孵育，以仅含有ATC的RB-AuNPs溶液作为空白样本，将加入AChE(0.1UmL^-1)和ATC(20μM)的RB-AuNPs溶液作为阳性对照。实验结果表明，巯基化合物不会引起RB-AuNPs聚集。

巯基化合物与硫代胆碱类似，可以较容易的通过Au–S键吸附到AuNPs的表面，从而可以替代Au表面的RB分子。然而，巯基化合物，不同于ATC，不能够引起AuNPs聚集，因为它们缺少可以与RB酸性基团相互作用的正电荷的季铵基团。

同时，我们研究了通常用于生物分析的其他蛋白对于反应溶液的干扰，取碱性磷酸酶(P.Alka)，磷酸(P.Acid)，酰基酶Ⅰ(Acyl.I)，β牛乳糖(Galac)和葡糖氧化酶(Glu.O)，分别溶于双蒸水中，使每种蛋白的浓度均为1UmL^-1。分别与ATC(20μM)和RB-AuNPs(5nM)孵育，将仅含有ATC的RB-AuNPs溶液作为空白样本，将加入AChE(0.1UmL^-1)和ATC(20μM)的RB-AuNPs溶液作为阳性对照。实验结果发现，即便是有些蛋白，如P.Alka，P.Acid和Glu.O可以引起荧光，但所有这些蛋白质基本无法改变RB-AuNPs溶液颜色，表明没有蛋白质可以引起RB-AuNPs聚集

本实验采用双信号输出检测，相对比其他已报道的只采用一个信号输出的试验是一个显著的进步。如上所述，巯基化合物与硫代胆碱在荧光试验中有相似的功能，即从AuNPs表面释放RB分子，引起荧光恢复，但是他们不能引起肉眼可见的AuNPs聚集。即便有些蛋白会引起应该恢复，但是这些蛋白质基本无法改变RB-AuNPs溶液的颜色改变；荧光恢复和溶液颜色变化必须满足可以指示AChE降解ATC产生的硫代胆碱这个条件。这个要求有效的避免了来自巯基化合物的干扰，因此保证了检测结果的准确性。

四、CSF样本中AChE的检测

被以上发现所鼓舞，我们评估了所述的检测方法是否可以用于检测复杂样本，例如CSF中的AChE的浓度。CSF是一个理想的资源，可以比其他体液更直接的反映中央神经系统的代谢和病理状态，更易于获得，而且比用于AD临床诊断的神经影像学检测花费更少。

为了证明本实验方法在检测CSF中AChE的能力，我们使用了转基因衰老加速小鼠(SAM)，是研究年龄相关的学习和认知缺陷的加速老龄化模型。SAM-P8是一个常见的老年痴呆模型，它的CSF中AChE水平显著低于另外一种表现出正常年龄特征的SAM模型SAM-R1。

新斯的明是一种乙酰胆碱酯酶抑制药，其可以抑制乙酰胆碱酯酶的活性。利用不同的药物，分别对SAM-P8和SAM-R1小鼠模型进行不同的处理，并且分别命名为样本1、样本2、样本3和样本4，其中样本3为SAM-P8样本，使用高剂量新斯的明(5.0mgkg^-1day^-1)给药10天；样本4为SAM-P8样本，使用低剂量新斯的明(0.05mgkg^-1day^-1)给药10天；样本1为：SAM-R1样本，给予等剂量(等体积)磷酸钠缓冲液(pH7.4)，给药10天，作为对照；样本2为SAM-P8样本，给予等剂量(等体积)磷酸钠缓冲液(pH7.4)，给药10天，作为对照。

10天之后，分别取样本1、样本2、样本3和样本4小鼠的脑脊液，通过穿刺取样，然后分别取0.5μL的CSF样本加入到1.0mL的ATC(20μM)和RB-AuNPs(5nM)的混合物中，孵育20min。同时取0.5μLCSF样本到1.0mL仅含有ATC的(20μM)溶液中，孵育20min，作为阴性对照。

从实验结果来看，加入0.5μL的CSF到ATC和RB-AuNPs混合物中以后，肉眼可以观察到CSF样本的颜色变化程度是不同的。对于SAM-R1样本(样本1)，溶液颜色在20分钟之内从红色变成紫色，而经过同样处理的SAM-P8样本(样本2)依然为红色。对于新斯的明处理过的SAM-P8样本，高剂量组的AuNPs溶液颜色(样本3)比低剂量(样本4)溶液颜色更深，表明样本3的聚集程度比样本4更高，然而，两者都比磷酸钠缓冲液(pH7.4)处理的SAM-P8紫色更深，比SAM-R1紫色更浅。在不同样本中我们把颜色变化归于AChE浓度变化。

由于发表的结果显示AD脑部的CSF中AChE水平显著降低，我们推断未经新斯的明处理的SAM-P8样本AChE水平比SAM-R1样本更低，因此前者依然是红色而后者引起了AuNPs的凝集。

经过新斯的明持续10天的给药，给予高剂量新斯的明的SAM-P8小鼠行为开始活跃，它们的CSF相比低剂量组，其AChE的含量也更高。该结果显示，溶液颜色变化水平与药物剂量表现出良好的相关性。

由于本实验的高灵敏度和特异性，使用非常低剂量的样本(0.5μL)即可满足实验的要求，进行检测。加入如此少量的CSF样本不仅可以避免来自CSF中巯基化合物的可能干扰，也可以使四个样本中的AuNP溶液颜色变化和相应的荧光恢复比加入大量CSF样本的更加明显。当加入大量CSF时，四个样本的颜色和荧光恢复变化基本相同，即四个样本的颜色变化成了紫色，且相应的荧光恢复到相似的水平。

加兰他敏是一种生物碱，具有双重作用机制，能竞争性、可逆性抑制AChE，并且能够调节脑内烟碱乙酰胆碱受体。四个CSF样本经过100nm的加兰他敏预处理，然后分别取经加兰他敏处理过的0.5μLCSF样本到1.0mL含ATC(20μM)和RB-AuNPs(5nM)混合物中，孵育20min。其中ΔA/D与不同浓度的AChE，F/F₀与不同浓度的AChE的关系如图3a和图3b所示。

这些结果表明AChE抑制剂(加兰他敏)处理可以导致CSF中AChE水平的剂量依赖性变化。

五、标准曲线定量检测CSF中AChE水平

为了能够使用现有方法定量检测CSF中AChE的水平，需要建立标准曲线，同时需要找到作为背景的SAM-P8CSF样本不能检测到AChE的最小剂量。

SAM-P8CSF背景样本加上不同浓度的AChE，最小的CSF样本体积是0.125μL(与1.0mLATC(20μM)和RB-AuNPs(5nM)混合物孵育)，然后作为背景建立校准曲线。

使用标准添加方法，建立了两条校准曲线，一个基于ΔA/D，另一个基于F/F0值，基于F/F0值的灵敏度要高于基于ΔA/D，且检测范围更宽。因此，我们选择基于F/F0值的校准曲线来检测CSF中AChE水平。由于F/F0值校准曲线和CSF样本中F/F0值的变化，四个CSF样本的AChE水平得以估算为3.1UmL^-1，0.56UmL^-1，1.1UmL^-1，0.85UmL^-1。

实施例二

实施例二与实施例一的不同之处在于，实施例二所用的乙酰胆碱酯酶的作用底物为乙酰胆碱含磷类似物，实施例二所用罗丹明素和所用纳米金以及所用的乙酰胆碱含磷类似物的摩尔比例分别为0.8μM：5nM：10μM，实施例二中所用到的纳米金的粒径为15nm。应用实施例二所用到的组合物溶液同样可以达到本发明的目的。

实施例三

实施例三与实施例一的不同之处在于，实施例三所用罗丹明素和所用纳米金以及所用的丙酰胆碱含磷类似物的摩尔比例为1.8μM：5nM：40μM，实施例三中所用到的纳米金的粒径为80nm。应用实施例三所用到的组合物溶液同样可以达到本发明的目的。

实施例四

实施例四与实施例一的不同之处在于，实施例四所用的乙酰胆碱酯酶的作用底物为丙酰胆碱，所用罗丹明素和所用纳米金以及所用丙酰胆碱的摩尔比例为1.0μM：5nM：30μM，实施例四中所用到的纳米金的粒径为40nm。应用实施例四所用到的组合物溶液同样可以达到本发明的目的。

实施例五

实施例五与实施例一的不同之处在于，实施例五所用的乙酰胆碱酯酶的作用底物为丁酰胆碱，所用罗丹明素和所用纳米金以及所用的丁酰胆碱的摩尔比例为1.4μM：5nM：15μM，实施例五中所用到的纳米金的粒径为20nm。应用实施例五所用到的组合物溶液同样可以达到本发明的目的。

总之，本发明提供了一个高灵敏度和特异性的双读数(比色和荧光)的组合物和试验方法，基于RB-AuNPs来检测AChE，分析硫代胆碱含量，或者来筛选复杂样本中AChE抑制剂，同时我们证明了其在检测转基因小鼠CSF样本中AChE的实际应用，也可以将组合物用于监测AD病情的发展和药物疗效。利用基于RB-AuNPs的方法，我们有足够的理由相信，该方法可用于复杂样品中AChE的水平和筛选AChE抑制剂，从而将AChE抑制剂应用于其他任何相关的用途，也可以用于监测AD的发展，获取AD研究领域的第一手资料，尤其是结合其他现有神经影像学技术和CSF标志物以及其他方法如芯片实验系统，将在AD监测和研究领域发挥巨大的作用。

以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种乙酰胆碱酯酶分析用的组合物，其特征在于，包括罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的罗丹明素、所述纳米金以及所述乙酰胆碱酯酶的作用底物的摩尔比为：800～1800:5：10000～40000，优选摩尔比为1000～1600：5:10000～30000，更优选摩尔比为1000～1400：5:15000～20000。

3.根据权利要求1-2任一项所述的组合物，其特征在于，所述的纳米金为柠檬酸修饰的纳米金。

4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其特征在于，所述的纳米金的粒径大小为10nm～80nm，优选为10～40nm，更优选为13～20nm。

5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶的作用底物为碳数子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类化合物及其类似物；优选为乙酰胆碱及其类似物，丙酰胆碱及其类似物，丁酰胆碱及其类似物；更优选为乙酰胆碱及其类似物。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的碳数子数为2-6的羧酸酰化的胆碱类化合物的类似物为碳数子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类含盐类似物或者碳原子数为2-6个的羧酸酰化的胆碱类受体类似物；优选为乙酰胆碱含盐类似物，乙酰胆碱受体类似物，丙酰胆碱含盐类似物，丙酰胆碱受体类似物，丁酰胆碱含盐类似物，丁酰胆碱受体类似物；更优选为乙酰胆碱含盐类似物或乙酰胆碱受体类似物；进一步优选为乙酰胆碱含磷类似物。

7.根据权利要求1-6任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为含有罗丹明素、纳米金和乙酰胆碱酯酶的作用底物的缓冲溶液。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的缓冲溶液的pH值为9.0-11.0，优选pH值为10.0，更优选为碳酸氢钠-氢氧化钠的缓冲溶液。

9.一种用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将样本置于含有罗丹明素、纳米金、乙酰胆碱酯酶的作用底物的溶液中反应；

(2)利用紫外吸收的方法，测定溶液的吸收值；

以及

(3)采用荧光检测，测定溶液的荧光值。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的紫外吸收检测波长范围为400～800nm。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述的荧光检测的激发波长范围为540nm～560nm，吸收波长范围为560～580nm。

12.权利要求1-8所述的组合物或权利要求9-11所述的方法在硫代胆碱含量测定领域、乙酰胆碱酯酶分析领域或者在乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选领域中的用途。