KR20140003562A - 현수 액적 플레이트 - Google Patents

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Abstract

현수 액적 플레이트(1)는 각각 액체 액적을 수용할 수 있는 기설정된 개수의 액적 구획들(10)을 포함한다. 각각의 액적 구획(10)은 액적이 마이크로유체 습윤 장벽(102)을 넘어 퍼지는 것을 방지하며 각각의 내강(100)을 둘러싸도록 배열되는 환상 마이크로유체 습윤 장벽(102)을 포함한다. 각각의 구획(10)은 폐쇄된 저부(101) 및 적어도 하나의 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽(104)을 포함하며, 각각의 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽(104)은 상기 환상 마이크로유체 습윤 장벽(102)을 둘러싸도록 배열된다. 습윤 가능한 영역(103)은 두 인접 배열된 마이크로유체 습윤 장벽들(102, 104) 사이에 배열된다.

Description

현수 액적 플레이트{HANGING DROPLET PLATE}
본 발명은 독립 청구항에 따른 현수 액적 플레이트에 관한 것이다.
일반적으로 여러 애플리케이션들 및 분석들, 예를 들어 약물 탐색 또는 독성 분석들에서 전통적인 2차원(단층) 배양에서의 세포들에 비해 3차원 구조로 배양된 세포들이 생리학적 연관성이 더 높다고 받아들여지고 있다. 이러한 3차원 세포성 응집물들을 형성하기 위해 현수 액적 플레이트가 제안되었다. 세포들이 현탁된 세포 배양 배지의 액적들은 이러한 플레이트의 배양 구획 또는 웰 내로 배치된 후 플레이트가 역전된다. 그 위에 세포가 부착할 수 있는 기재가 없으므로, 이들은 현수 액적의 끝에 축적되어 3차원 세포성 응집물을 형성한다. 배아 줄기 세포들을 이용하는 경우, 이들 줄기 세포들은 이들이 만나 배상체로 불리는 3차원 세포성 응집물을 형성하는 액적 끝으로 가라앉는다.
플레이트를 역전시킬 필요성이 있는 현수 액적 플레이트 분배는 WO 2010/031194에 나타나 있다. 이 문헌에 나타낸 플레이트는 플레이트 본체, 제1 및 제2 동일 평면의 표면들 및 제1(상부) 표면에서 제2(하부) 표면으로 수직으로 전체 본체를 관통하는 복수의 통로들을 포함한다. 통로는 제1(상부) 표면 근처의 깔때기-모양 입구 구획, 제2(하부) 표면 근처의 역전된 깔때기-모양 배양 구획, 및 입구 구획과 배양 구획 사이에 배열된 모세관 부분을 포함한다. 본체의 제2(하부) 표면에서 돌출하며 각각의 배양 구획을 둘러싼 개별 테들의 형태인 이완 구조들이 제공된다. 이들 테들은 액체 액적들이 테들을 넘어 퍼지는 것을 방지한다.
세포들을 함유하는 액체의 배양 구획 내로의 도입은 입구 구획 및 모세관 부분을 통해 수행된다. 예로서, 줄기 세포들을 함유하는 액체 배양 배지는 이러한 방식으로 배양 구획들 내로 도입될 수 있고, 이어서 현수 액적들이 있는 플레이트는 세포들이 응집하여 3차원 배상체들을 형성하도록 하는 기설정된 시간 간격 동안 인큐베이션될 수 있다. 일정 시간 후 신선한 액체 배양 배지를 공급해야 하는 경우, 이는 입구 구획 및 모세관 부분을 통해 "기존" 액체 배양 배지를 흡입한 뒤(예로 피펫의 보조를 받아) 상술된 방식으로 "신선한" 액체 배양 배지를 공급하여 수행된다.
WO 2010/031194에 기재된 플레이트는 일반적으로 세포들을 배양하여 3차원 세포성 응집물들을 형성하기 적합하지만, 개선의 여지가 있다. 예를 들어, 입구 구획 및 모세관 부분을 통해 기존 액체 배양 배지를 흡입하기 위해서는 적절한 흡입을 수행하기 위해 입구 구획 벽들에 대해 꽉 맞게 구현되어야 하는 흡입 장치(예로 피펫)가 필요하다. 신선한 액체 배양 배지의 후속 공급을 위해서도 역시 그러하다. 그러나 더 중요하게는, 각 배양 구획 내 현수 액적의 안정성이 제한되어 있다. 또 다른 단점은 액체가 조절되지 않는 속도로 열린 입구 구획을 통해 증발할 수 있다는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 현수 액적들의 안정성 및 액체의 증발에 관련된 상기 언급된 문제점들을 극복하는 현수 액적 플레이트를 제안하는 것이다. 또한, 액체 배양 배지의 추가 공급 또는 교체를 수행하기 용이해야 한다.
상기 언급된 목적(들)을 달성하기 위해, 본 발명은 이러한 현수 액적 플레이트에 대한 독립 청구항의 특징들로 명시되는 바와 같은 현수 액적 플레이트를 제안한다. 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 추가 구현예들은 종속 청구항들에 따른다.
특히, 본 발명은 각각 액체 액적을 수용할 수 있는 기설정된 개수의 액적 구획들을 포함하는 현수 액적 플레이트를 제안한다. 각각의 액적 구획은 액적이 마이크로유체 습윤 장벽을 넘어 퍼지는 것을 방지하고 각각의 내강을 둘러싸도록 배열되는 환상 마이크로유체 습윤 장벽을 포함한다. 또한, 각각의 구획은 폐쇄된 저부 및 적어도 하나의 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽을 포함하며, 각각의 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽은 상기 환상 마이크로유체 습윤 장벽을 둘러싸도록 배열되며, 습윤 가능한 영역은 두 인접 배열된 마이크로유체 습윤 장벽들 사이에 배열된다.
특히 WO 2010/031194에 나타낸 현수 액적 플레이트와 비교할 때, 배양 구획들의 폐쇄된 저부 구조는 환상 습윤 장벽과 함께 각각의 배양 구획들에서부터 현수하는 액적들의 안정성 개선을 위해 기능하며, 이것은 입구 구획에서 공기에 액세스하게 되는 WO 2010/031194의 현수 액적 플레이트에 비해 공기에 대한 액세스가 없기 때문인 것으로 여겨진다. 또한, 공기에 대한 액세스가 없기 때문에, 액체의 증발이 많이 감소된다.
또한, 현수 액적 플레이트가 재역전되어 추가적인 액체 배양 배지의 액적을 이미 배양 구획에 함유된 액적에 공급해야 하지만, 이것이 용이하고 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 이것은 첫 번째로는 우수한 액적 안정성에 기인하며, 두 번째로는 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽 및 액체 배양 배지의 추가 액적을 용이하게 공급할 수 있도록 하는 추가적인 마이크로유체 습윤 장벽 및 상기 마이크로유체 습윤 장벽 간의 습윤 가능한 영역에 기인한다. 이렇게 형성된 더 큰 액적은 상기 추가적인 마이크로유체 장벽에 의해 퍼지는 것이 방지되어, 플레이트가 현수 액적 구조로 다시 역전된 뒤에도 더 큰 액적의 우수한 안정성이 유지된다. 일반적으로 추가적인 마이크로유체 습윤 장벽들의 개수는 제한되지 않지만, 실제 구현예들에서는 단지 하나 또는 두 개의 추가적인 마이크로유체 습윤 장벽들이 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 하나의 구현예에서 각각의 액적 구획들은 웰들이지만, 다른 구현예에서 액적 구획들은 평면 표면에 의해 형성될 수 있다(각각 마이크로유체 습윤 장벽들에 의해 둘러싸임).
본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 추가 구현예에서, 환상 마이크로유체 습윤 장벽은 환상 가장자리를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽은 적어도 하나의 추가적인 환상 가장자리를 포함한다. 각각의 추가적인 환상 가장자리는 상기 환상 가장자리를 둘러싸도록 배열되며, 습윤 가능한 영역이 두 인접 배열된 환상 가장자리들 사이에 배열된다. 본 구현예의 추가 변형에서, 두 인접한 환상 가장자리들은 단계식으로 배열된다.
추가 구현예에서, 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트는 내부에 기설정된 개수의 구멍들을 갖는 별도도 제작된 플레이트 및 액적 구획들을 형성하는 대응하는 기설정된 개수의 별도로 제작된 웰들로 제조되며, 각각의 별도로 제작된 웰은 별도로 제작된 플레이트의 각 구멍 내로 압입된다. 이는 폴리스티렌 또는 임의의 다른 적합한 재료로 제조될 수 있는 플레이트 및 웰들 모두의 용이한 제작을 가능케 한다. 별도로 제작된 플레이트 및 웰들은 웰들을 구멍들 내로 압입하여 쉽게 조립될 수 있다. 일반적으로 웰들의 플레이트의 내부 평면으로의 초음파 용접도 선택할 수 있지만(이 경우, 플레이트가 구멍들을 포함하지 않을 수 있음), 초음파 용접이 웰들 내에 함유된 내용물의 현미경 분석을 더 어렵게 만들 수 있으므로 웰들의 구멍들 내로의 압입이 바람직하다.
본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 추가 구현예에서, 별도로 제작된 웰들은 플레이트의 외부 표면을 형성하는 플레이트 측면으로부터 구멍들 내로 압입된다. 이는 자동 수행될 수 있는 플레이트 및 웰들의 용이한 조립을 가능케 한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트는 24개 웰들, 96개 웰들 또는 384개 웰들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 또 다른 구현예에서, 환상 마이크로유체 습윤 장벽은 환상 테를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 마이크로유체 습윤 장벽은 추가적인 환상 테를 포함하고, 각각의 추가적인 환상 테는 상기 환상 테를 둘러싸며, 습윤 가능한 영역은 두 인접 배열된 환상 테들 사이에 배열된다. 본 구현예의 한 변형에서 인접 배열된 환상 테들은 단계식으로 배열되는 반면, 본 구현예의 다른 변형에서 환상 테들은 평면 표면 상에 배열된다.
본 발명의 추가 측면은 상기 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트 및 수용 플레이트를 포함하는 현수 액적 플레이트 어셈블리에 관한 것이다. 현수 액적 플레이트는 기설정된 개수의 액적 구획들 또는 웰들을 가지며, 수용 플레이트는 현수 액적 플레이트의 기설정된 개수의 액적 구획들 또는 웰들에 대응하는 개수의 웰들을 갖는다. 현수 액적 플레이트 및 수용 플레이트는 조립된 상태에서 수용 플레이트의 웰들이 현수 액적 플레이트의 액적 구획들 또는 웰들과 정렬 배열되도록 하는 방식으로 조립된다. 상기 어셈블리는 어셈블리의 원심분리를 통해 현수 액적 플레이트로부터 수용 플레이트의 웰들로 3차원 세포성 응집물들을 전달하기 쉽게 만든다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포들에 대한 물질의 독성 평가 방법에 관한 것이다. 그 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a) 기설정된 개수의 액체 액적들을 현수 액적 플레이트의 대응하는 개수의 배양 구획들 내로 도입하는 단계(각각의 액적은 기설정된 부피의 평가될 물질 및 복수의 세포들뿐만 아니라 액체 배양 배지를 함유한다);
b) 현수 액적 플레이트를 역전시키고, 세포들이 각각의 액적들에서 3차원 세포성 응집물들을 형성할 수 있도록 각각의 배양 구획들에서 현수되도록 하는 방식으로 액적들을 운반하는 현수 액적 플레이트를 기설정된 시간 간격 동안 인큐베이션하는 단계,
c) 추가적인 액체 배양 배지를 배양 구획들 내 액적들로 공급하여 3차원 세포성 응집물들의 추가 성장을 촉진하는 단계; 및
d) 평가될 물질이 3차원 세포성 응집물들에 대해 독성인지 여부를 평가하기 위해 3차원 세포성 응집물들을 분석하는 단계.
본 발명에 따른 방법에서, 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트는 상술된 바와 같이 이용되며, 단계 c)는 현수 액적 플레이트를 재역전시키고, 추가적인 액체 배양 배지의 액적을 3차원 세포성 응집물들을 함유하는 각각의 액적들에 첨가하여 각각의 배양 구획들에서 각각의 더 큰 액적들을 형성함으로써 수행된다. 이어서 현수 액적 플레이트를 다시 역전시켜 3차원 세포성 응집물들이 배양 구획들로부터 현수되는 각각의 더 큰 액적들에서 자라도록 한다. 그 장점들은 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 장점들을 논의할 때 이미 언급되었다. 또한, 이는 적어도 일부 처리 단계들, 예로 추가적인 액체 배양 배지 공급의 자동화를 가능케 한다.
본 발명에 따른 방법의 한 구현예는 하기 단계들을 추가로 포함한다:
e) 성장한 3차원 세포성 응집물들을 현수 액적 플레이트의 배양 구획들로부터 수용 플레이트의 대응하는 개수의 웰들 내로 옮기는 단계;
f) 수용 플레이트를 추가 기설정된 시간 간격 동안 3차원 세포성 응집물들을 함유하는 웰들과 인큐베이션하는 단계; 및
g) 인큐베이션 후, 평가될 물질이 3차원 세포성 응집물들에 대해 독성인지 여부를 평가하기 위해 3차원 세포성 응집물들을 분석하는 단계. 본 발명에 따른 방법의 상기 구현예의 바람직한 변형에서, 단계 e)는 수용 플레이트의 각 웰들이 현수 액적 플레이트의 각 배양 구획들과 반대로 배열되도록 하는 방식으로 현수 액적 플레이트 및 수용 플레이트를 조립한 뒤, 조립된 플레이트들을 원심분리하여 수행된다. 이는 3차원 세포성 응집물들이 현수 액적 플레이트로부터 수용 플레이트의 각 웰들로 편리하게 자동으로 이동할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 구현예에서, 세포들은 배아 줄기 세포들이며 3차원 세포성 응집물들은 배상체들이다. 평가될 물질이 3차원 세포성 응집물들에 대해 독성인지 여부를 평가하기 위한 3차원 세포성 응집물들의 분석 단계는 배상체들이 심근 세포들을 함유하는지 여부를 분석하여 수행된다. 심근 세포들은 박동하기 때문에 3차원 세포성 응집물들 중 심근 세포들의 존재를 쉽게 검출할 수 있다는 점에서 상기 구현예가 편리하다.
본 발명의 추가로 유리한 측면들은 하기 도면과 함께 구현예들의 하기 상세한 설명에서 자명해질 것이다:
도 1은 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의의 제1 구현예의 투시도를 나타내며, 하나의 웰은 액적을 함유하고 또 다른 웰은 추가 액적이 첨가될 액적을 함유하며;
도 2는 도 1의 현수 액적 플레이트의 구현예의 상면도를 나타내고;
도 3은 현수 액적 플레이트가 재역전된 도 2의 선 III-III을 따른 단면도를 나타내고;
도 4는 현수 액적 플레이트가 역전된 도 2의 선 III-III을 따른 단면도를 나타내고;
도 5는 도 4의 상세 V의 확대도를 나타내고;
도 6은 도 1의 현수 액적 플레이트의 구현예의 한 웰의 확대도를 나타내고;
도 7은 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 제2 구현예의 웰의 단면도를 나타내고, 웰은 액적을 함유하며;
도 8은 추가 액적이 첨가된 현수 액적 플레이트의 제2 구현예의 웰을 나타내고;
도 9는 또 다른 추가 액적이 첨가된 현수 액적 플레이트의 제2 구현예의 웰을 나타내고;
도 10은 액적 구획이 액적을 함유하는, 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 제3 구현예의 단면도를 나타내고;
도 11은 추가 액적이 첨가된 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 제3 구현예를 나타내고;
도 12는 또 다른 추가 액적이 첨가된 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 제3 구현예를 나타내고;
도 13은 또 다른 추가 액적이 첨가된 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 제3 구현예를 나타내고;
도 14는 또 다른 추가 액적이 첨가된 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 제4 구현예를 나타내고;
도 15는 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트가 이용되는 배아 줄기 세포 분석의 구현예를 나타내고;
도 16은 본 발명에 따른 24-웰 현수 액적 플레이트의 구현예의 별도로 제작된 웰을 투시도로 나타내고;
도 17은 도 16의 웰의 단면도를 나타내고;
도 18은 본 발명에 따른 24-웰 현수 액적 플레이트의 구현예의 별도로 제작된 플레이트의 상면도를 나타내고, 그 구멍들 내로 도 16의 별도로 제작된 웰들이 삽입될 수 있으며;
도 19는 도 18의 플레이트의 하면도를 나타내고;
도 20은 그 안으로 웰들이 삽입될 수 있는 구멍들 중 하나를 포함하는 도 18 및 도 19의 플레이트의 상세 확대도를 나타내고;
도 21은 도 16의 웰들이 도 18의 플레이트의 구멍들 내로 삽입된 24-웰 현수 액적 플레이트의 상면도를 나타내고;
도 22는 도 21의 24-웰 현수 액적 플레이트를 통한 단면을 나타내고;
도 23은 도 21의 24-웰 현수 액적 플레이트의 하면도를 나타내고;
도 24는 하나의 구멍 내로 삽입된 하나의 웰을 포함하는 도 22의 상세 단면도를 나타내고;
도 25는 도 21의 24-웰 현수 액적 플레이트가 실장될 수 있는 추가 24-웰 플레이트의 구현예의 투시도를 나타내고(도 15에 나타낸 어셈블리와 유사);
도 26은 도 25의 추가 24-웰 플레이트의 구현예의 단면도를 나타내고;
도 27은 도 25에 나타낸 추가 24-웰 플레이트에 실장된 도 21의 24-웰 현수 액적 플레이트의 투시도를 나타내고;
도 28은 도 27에 나타낸 플레이트 어셈블리의 단면도를 나타내고;
도 29는 본 발명에 따른 96-웰 현수 액적 플레이트의 구현예의 별도로 제작된 웰의 확대 투시도를 나타내고;
도 30은 도 29의 웰의 단면도를 나타내고;
도 31은 마이크로유체 습윤 장벽들을 형성하는 단계식 환상 테들을 포함하는 도 29의 웰을 상세히 나타내고;
도 32는 그 구멍들 내로 도 29의 별도로 제작된 웰들이 삽입될 수 있는 본 발명에 따른 96-웰 현수 액적 플레이트의 구현예의 별도로 제작된 플레이트의 상면도를 나타내고;
도 33은 그 안으로 도 29의 웰들이 삽입될 수 있는 구멍들을 포함하는 도 32의 플레이트의 단면도를 나타내고;
도 34는 도 32의 플레이트의 하면도를 나타내고;
도 35는 도 29의 웰들이 도 32의 플레이트의 구멍들 내로 삽입된 96-웰 현수 액적 플레이트의 상면도를 나타내고;
도 36은 도 35의 96-웰 현수 액적 플레이트를 통한 단면을 나타내고;
도 37은 도 35의 96-웰 현수 액적 플레이트의 하면도를 나타내고;
도 38은 하나의 구멍 내로 삽입된 하나의 웰을 포함하는 도 36의 상세 단면도를 나타내고;
도 39는 도 35의 96-웰 현수 액적 플레이트가 실장될 수 있는 추가 96-웰 플레이트의 구현예의 상면도를 나타내고(도 15에 나타낸 어셈블리와 유사);
도 40은 도 39의 추가 96-웰 플레이트의 구현예의 단면도를 나타내고;
도 41은 도 39에 나타낸 추가 96-웰 플레이트에 실장된 도 35의 96-웰 현수 액적 플레이트의 투시도를 나타낸다.
도 1 내지 도 6은 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트 1의 제1 구현예 또는 이들의 상세사항들을 다양한 도면들로 나타낸다(상기 참고). 플레이트 1은 웰들 10의 형태로 기설정된 개수의 액적 구획들을 포함한다. 나타낸 구현예는 24-웰 플레이트이지만, 임의의 다른 개수의 웰들도 고려될 수 있다. 표준 마이크로웰-플레이트들, 예컨대 96-웰 플레이트들 또는 384-웰 플레이트들에 따라 배열되는 표준화된 개수의 웰들을 갖는 플레이트들이 바람직하다.
일반적으로 웰들의 상이한 구현예들이 고려될 수 있지만, 현수 액적 플레이트 1의 구현예의 웰들 10은 도 6의 확대도에 나타낸 바와 같이 구현된다. 웰 10은 폐쇄된 저부 101을 갖는 제1 내강 100을 둘러싼 뾰족한 환상 가장자리 102의 형태로 제1 환상 습윤 장벽을 포함한다. 제1 환상 가장자리 102는 제2의 뾰족한 환상 가장자리 104에 의해 둘러싸이며, 습윤 가능한 영역 103은 제1 환상 가장자리 102 및 제2 환상 가장자리 사이에 배열된다. 도 6에서 볼 수 있듯이, 환상 가장자리들은 단계식 방식으로 배열되지만 이것이 의무적인 것은 아니다. 고리형 컷아웃 105는 제2 환상 가장자리 104를 둘러싸는 방식으로 제공된다.
웰들 10의 기하 구조에 대한 이유는 액적들을 웰들 10으로 공급하고 이들을 웰들 10에서 현수하는 절차를 나타내는 도 3, 도 4 및 도 5를 살피면 더 확실해진다. 도 3에서, 현수 액적 플레이트 1은 재역전된 위치로, 즉 웰들 10이 상부를 향하게 하여 나타낸다. 최좌측 위치에 배열된 웰 10에서, 작은 액체 액적 20이 인식될 수 있다. 왼쪽에서 두 번째 웰 10에서 더 큰 액적 21을 형성하기 위해 또 다른 액체 액적을 액적 20으로 공급함으로써 수득되는 더 큰 액적 21이 인식될 수 있다. 웰들 10으로의 액적들의 공급은, 예를 들어 피펫의 보조를 받아 수행될 수 있음을 알 수 있다. 특히, 웰들 10 내로의 액적들의 배치는 피펫팅 로봇의 보조를 받아 수행될 수도 있지만 수동으로 수행될 수도 있다. 또한, 일부 액체가 웰로부터 흡입되는 경우(예로 "기존" 액체 배양 배지를 "신선한" 액체 배양 배지로 교체하려는 경우), 액적들에 쉽게 액세스할 수 있기 때문에 이것이 쉽게 수행될 수 있다.
도 4는 더 작은 액적 20 및 더 큰 액적 21이 각각의 웰들 10으로부터 현수되는 위치의 현수 액적 플레이트 1을 나타내며, 이는 도 4의 V를 상세히 나타낸 도 5에서 가장 잘 알 수 있다. 더 작은 액적 20은 최좌측 웰 10에서 현수되고 있는 반면 더 큰 액적 21은 왼쪽에서 두 번째 웰 10에서 현수되고 있다.
도 5 및 도 6에서 액적 20 및 더 큰 액적 21이 가장자리를 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽들로서의 제1 및 제2 환상 가장자리들 102 및 104의 기능이 더 확실해진다. 따라서 제1 및 제2 환상 가장자리들 102 및 104는 각각의 웰 10에서 현수되는 액적의 안정화에 기여한다. 제2 환상 가장자리 104에 대해, 상기 효과는 고리형 컷아웃 105를 통해 증강된다. 제1 및 제2 환상 가장자리들 102 및 104 사이에 배열된 습윤 가능한 영역 103(도 6 참고)은 추가 액체 액적을 액적 20으로 쉽게 첨가하여 더 큰 액적 21을 형성할 수 있도록 한다(도 4 및 도 5 참고). 웰들 10의 폐쇄된 저부 100은 액체가 저부를 통과하여 구멍 또는 채널을 통해 증발하는 것을 방지하며, 또한 공기가 액적을 "뒤에서부터" 미는 것을 방지함으로써 웰들로부터 현수되는 액적들을 안정화하는 역할을 한다.
본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 제2 구현예를 현수 액적 플레이트 3의 단일 웰 30만을 나타낸 도 7 내지 도 9에 각각 나타낸다. 상기 구현예는 액적이 각각의 마이크로유체 장벽을 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽들의 단계식 구조를 또한 포함한다는 점에서 어느 정도 상기에 상세히 기재된 제 1 구현예에 관한 것이다. 그러나 제2 구현예는 뾰족한 가장자리들 대신에 웰들 30이 웰 30의 개방 말단을 향해 내강을 넘어 돌출하고 내강 301을 둘러싼 제1 환상 테 302에 의해 둘러싸인 폐쇄된 저부 300을 갖는 내강 301을 포함한다는 점에서 제1 구현예와 다르다. 도 7은 웰 30에서 현수되는 작은 액체 액적 40을 나타낸다. 액적 40은 마이크로유체 장벽을 형성하는 제1 환상 테 302에 의해 내강 301 중에 보유된다.
도 8은 또 다른 액체 액적이 액체 액적 40에 첨가되어 더 큰 액적 41을 형성한다는 점에서 도 7과 다르다. 더 큰 액적 41은 제1 환상 테 302를 둘러싼 제2 환상 테 304에 의해 보유되며, 습윤 영역 303은 제1 환상 테 302 및 제2 환상 테 304 사이에 배열된다. 다시, 제2 환상 테 304는 더 큰 액적 41이 테 304를 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽으로 작용한다.
도 9는 또 다른 액체 액적이 더 큰 액적 41에 첨가되어 더욱더 큰 액적 42를 형성한다는 점에서 도 8과 다르다. 액적 42는 제2 환상 테 304를 둘러싼 제3 환상 테 306에 의해 보유되며, 또 다른 습윤 영역 305는 제2 환상 테 304 및 제3 환상 테 306 사이에 배열된다. 다시, 제3 환상 테 306은 더욱더 큰 액적 42가 테 306을 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽으로 작용한다.
도 10 - 도 14는 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트 5의 제3 구현예의 단일 액적 구획 50을 나타낸다. 현수 액적 플레이트 5의 상기 구현예는 구획 50이 단계식 구조로 마이크로유체 장벽들을 포함하지 않고 환상 테들 형태의 마이크로유체 장벽들이 플레이트 5의 하부 평면 표면 상에 배열된다는 점에서 상기 상세히 기재된 제1 및 제2 구현예와 다르다. 구획 50도 폐쇄된 저부 500을 포함하지만, 내강 501은 내강 501을 둘러싸고 플레이트 5의 하부 표면에서 돌출하는 제1 환상 테 502에 의해 결합된다. 도 10은 구획 50에서 현수되는 작은 액체 액적 64를 나타낸다. 액적 64는 마이크로유체 장벽을 형성하는 제1 환상 테 502에 의해 내강 501 중에 보유된다.
도 11은 또 다른 액체 액적이 액체 액적 64에 첨가되어 더 큰 액적 65를 형성한다는 점에서 도 10과 다르다(또한 더 큰 액적 41은 제1 단계로서 액적 구획 50 내로 도입될 수 있다). 더 큰 액적 65는 제1 환상 테 302를 둘러싸는 제2 환상 테 504에 의해 보유되며, 습윤 영역 503은 제1 환상 테 502 및 제2 환상 테 504 사이에 배열된다. 다시, 제2 환상 테 504는 더 큰 액적 65가 테 504를 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽으로 작용한다.
도 12는 제2 환상 테 504를 둘러싸는 제3 환상 테 506에 의해 보유되는 더욱더 큰 액적 66을 나타내며, 추가로 습윤 가능한 영역 505는 제2 환상 테 604 및 제3 환상 테 506 사이에 배열된다. 제3 환상 테 506은 마찬가지로 액적 66이 테 506을 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽으로 작용한다.
도 13은 제3 환상 테 506을 둘러싸는 제4 환상 테 508에 의해 보유되는 더욱더 큰 액적 67을 나타내며, 추가로 습윤 가능한 영역 507은 제3 환상 테 506 및 제4 환상 테 508 사이에 배열된다. 제4 환상 테 508은 마찬가지로 액적 67이 테 508을 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽으로 작용한다.
마지막으로, 도 14는 제4 환상 테 508을 둘러싸는 제5 환상 테 510에 의해 보유되는 더욱더 큰 액적 68을 나타내며, 추가로 습윤 가능한 영역 509는 제4 환상 테 508 및 제5 환상 테 510 사이에 배열된다. 상술된 바와 동일한 방식으로, 제5 환상 테 510은 더욱더 큰 액적 68이 테 510을 넘어 퍼지는 것을 방지하는 마이크로유체 장벽으로 작용한다.
도 15에는 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트의 상술된 임의 구현예들이 이용될 수 있는 본 발명에 따른 방법의 구현예를 나타내는 배아 줄기 세포 분석의 구현예가 나타난다. 분석의 하기 설명에 있어서, 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트 1의 제1 구현예가 이용된다고 가정한다. 분석의 상기 구현예에서는 배상체들에 대한 물질의 독성이 평가된다. 그 목적을 위해, 기설정된 개수의 액체 액적들이 대응하는 개수의 액적 구획들 또는 웰들 내로 도입된다. 각각의 액적은 기설정된 부피의 평가될 물질들과 더불어 액체 배양 배지뿐만 아니라 복수의 줄기 세포들 82를 함유한다. 현수 액적 플레이트 1의 제1 구현예의 경우, 플레이트 1은 재역전된 위치인 동안 24개 액적들 20이 대응 웰들 10 내로 도입될 수 있다(도 4 참고). 액적들 20이 웰들 10 내로 도입된 뒤, 플레이트 1이 역전되고 폐쇄된 어셈블리를 형성하도록 현수 액적 플레이트 1의 웰들 10에 반대로 배열된 대응하는 개수의 웰들 70을 갖는 추가 플레이트 7과 조립된다. 웰들 70은 배양 배지도 함유할 수 있다. 이렇게 형성된 어셈블리는 상기에서 상세히 설명된 바와 같이 액적들 20이 웰들 10에서 현수되도록 할 수 있다. 이렇게 형성된 어셈블리(도 15, 상부 좌측 참고)는 기설정된 시간 간격 동안, 예로 3일 동안 인큐베이션된다. 상기 인큐베이션 기간 동안, 각각의 액적들 중에 함유된 줄기 세포들 82가 침강하고 각 액적 20에서 액적의 끝에, 즉 액적 20의 최저점에서 3차원 배상체 83(보다 일반적으로 3차원 세포성 응집물)을 형성한다(도 15, 상부 우측 참고).
제1 인큐베이션 기간 후, 배상체들 83의 추가 성장을 촉진하기 위해 액적 20에 추가 액체 배양 배지를 공급해야 할 수 있다. 그 목적을 위해, 어셈블리가 재개봉되고 플레이트 1이 재역전된다. 상기 재역전된 위치에서, 추가 액체 배양 배지가 각각의 웰들 10 중 각각의 액적들 20에 공급되어 더 큰 액적들 21을 형성한다. 일단 추가적인 액체 배양 배지가 공급되어 더 큰 액적들 21을 형성하면, 플레이트 1이 다시 역전되고 추가 플레이트 7과 재조립된다(그 웰들 70도 신선한 액체 배양 배지를 함유할 수 있다). 이렇게 형성된 어셈블리는 추가적인 기설정된 시간 간격 동안, 예로 2일 동안 인큐베이션되어 배상체들의 추가 성장이 허용된다.
추가 인큐베이션 기간 후, 배상체들 83은 원심분리에 의해 플레이트 7(수용 플레이트)의 웰들 70 내로 전달될 수 있으며, 이는 당분야에 널리 공지된 원심분리 장치로 수행될 수 있다. 배상체들 83이 액체 배양 배지를 함유하는 플레이트 7의 웰들 70 내로 원심분리된 후, 어셈블리는 또 다른 기설정된 시간 간격 동안, 예로 5일 내지 7일 동안 인큐베이션될 수 있다. 배상체들 83은 플레이트 7의 각 웰들 70의 평면 저부로 침강한다.
상기 인큐베이션 기간 후, 어셈블리가 재개봉될 수 있고, 세포성 응집물들은 평가될 물질이 세포들에 독성인지 여부에 대해 검사될 수 있다. 다양한 유형의 분석들이 고려되지만, 하나의 분석 유형은 현미경의 보조를 받아 세포성 응집물들을 분석하는 것이다. 세포성 응집물들은 플레이트 7의 웰들의 평면 저부들 상에 놓이므로, 현미경 분석이 가능하다. 예를 들어, 세포성 응집물들은 이들이 심근 세포들을 함유하는지에 대해 검사될 수 있는데, 이들 세포들은 수축 및 팽창하기 때문에(이들이 박동하기 때문에) 이들 유형의 세포들이 현미경 하에서 쉽게 식별될 수 있기 때문이다.
원심분리를 통한 추가 플레이트 7의 웰들 70에 대한 상술된 배상체들 또는 3차원 세포성 응집물들의 전달은 선택 사항이다. 대안적으로, 어셈블리가 재개봉될 수 있고, 플레이트 1이 원심분리 시 배상체들 또는 세포성 3차원 세포성 응집물들이 액적의 끝으로부터 웰 10의 저부 101을 향해 이동하도록 하는 방식으로 원심분리기에 실장될 수 있다(도 6 참고). 이후, 배상체들은 현미경 분석을 위해 안정한 배경을 형성하는 웰 10의 저부 101 상에 배열되기 때문에 현미경의 보조를 받아 플레이트의 웰들 10에서 분석될 수 있다.
도 16 - 도 24는 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트 6의 추가 구현예를 나타낸다(도 21 - 도 23). 상기 구현예는 별도로 제작된 플레이트 61의 구멍들 610 내로 압입될 수 있는(도 18 - 도 20 참고) 별도로 제작된 웰들 60(도 16 및 도 17 참고)을 포함한다. 도 17에 나타낸 별도로 제작된 웰 60의 단면도에서 알 수 있듯이, 웰 60은 제1 환상 테 602, 제2 환상 테 604 및 제3 환상 테 606을 포함한다. 웰 및 제1, 제2 및 제3 환상 테들의 구조들 및 기능들은 이미 도 7, 도 8 및 도 9와 함께 상세히 기재되었으므로, 이를 상기 설명에서 이들 부품들로 나타낸다. 나타낸 구현예에서, 웰들 60은 플레이트 61의 측면에서 플레이트 61의 구멍들 610 내로 압입되어 플레이트 61의 외부 표면 611을 형성한다. 모든 웰들 60이 구멍들 610 내로 압입되면, 이들이 플레이트 61에 고정 부착되고 현수 액적 플레이트 6의 형성이 완료된다(도 21 - 도 24).
대안적으로, 별도로 제작된 웰들 60이 플레이트 61의 내부 표면 612로 부착되는 것을 고려할 수 있다(예를 들어 초음파 용접 또는 접착에 의해). 이러한 경우, 플레이트 61은 구멍들을 포함하지 않을 수 있다. 그러나 웰들 60의 플레이트 61의 내부 표면 612로의 초음파 용접 또는 접착이 일어나는 위치들이 가시적일 수 있고, 웰들의 내용물들의 현미경 분석을 더 어렵게 만들 수 있다. 따라서 웰들 60의 플레이트 61의 구멍들 610 내로의 압입이 바람직하다.
도 25 및 도 26은 현수 액적 플레이트 6의 웰들 60의 개수에 대응하는 개수의 웰들 80을 포함하는 추가 플레이트 8의 구현예를 나타낸다. 또한, 추가 플레이트 8의 웰들 80은 현수 액적 플레이트 6의 웰들 60의 배열에 대응하는 방식으로 배열된다.
도 27 및 도 28에서 볼 수 있듯이, 현수 액적 플레이트 6은 현수 액적 플레이트 6의 각 웰 60이 추가 플레이트 8의 대응 웰 80 위에 배열되도록 하는 방식으로 추가 플레이트 8 상에 적층 방식으로 실장될 수 있다. 이러한 어셈블리의 하나의 목적은 이미 도 15와 함께 상세히 기재되었으므로, 이를 상기 설명에서 이들 부품들로 나타낸다.
도 16 - 도 28에 있어서 24-웰 플레이트들 또는 24-웰 플레이트들의 어셈블리들만 기재되지만, 하기에서 자명해질 바와 같이 96-웰 플레이트들에도 유사한 고려들이 적용될 수 있다.
도 29 - 도 38은 96-웰 현수 액적 플레이트로 구현된 본 발명에 따른 현수 액적 플레이트 9의 추가 구현예를 나타낸다(도 35 - 도 37). 24-웰 구현예와 유사하게, 96-웰 구현예는 별도로 제작된 플레이트 91의 구멍들 910 내로 압입될 수 있는(도 32 - 도 34 참고) 별도로 제작된 웰들 90(도 29 - 도 31 참고)을 포함한다. 도 30 및 도 31에 나타낸 별도로 제작된 웰 90의 단면도들에서 볼 수 있듯이, 웰 90은 제1 환상 테 902, 제2 환상 테 904 및 제3 환상 테 906을 포함한다. 웰 및 제1, 제2 및 제3 환상 테들의 구조들 및 기능들은 이미 도 7, 도 8 및 도 9와 함께 상세히 기재되었으므로, 이를 상기 설명에서 이들 부품으로 나타낸다. 나타낸 구현예에서, 웰들 90은 플레이트 91의 측면에서 플레이트 91의 구멍들 910 내로 압입되어 플레이트 91의 외부 표면 911을 형성한다. 모든 웰들 90이 구멍들 910 내로 압입되면, 이들이 플레이트 91에 고정 부착되고 현수 액적 플레이트 9의 형성이 완료된다(도 35 - 도 38).
도 39 - 도 41은 현수 액적 플레이트 9의 웰들 90의 개수에 대응하는 개수의 웰들 920을 포함하는 추가 플레이트 92의 구현예를 나타낸다. 또한, 추가 플레이트 92의 웰들 920은 현수 액적 플레이트 9의 웰들 90의 배열에 대응하는 방식으로 배열된다.
도 41에서 볼 수 있듯이, 현수 액적 플레이트 9는 현수 액적 플레이트 9의 각 웰 90이 추가 플레이트 92의 대응 웰 920 위에 배열되도록 하는 방식으로 추가 플레이트 92 상에 적층 방식으로 장착될 수 있다.
상술된 구현예들은 본 발명에 따른 방법, 현수 액적 플레이트 및 현수 액적 플레이트의 다양한 적용들의 일례들일 뿐이어서 본 발명을 이들로 제한하려는 것이 아님은 말할 필요가 없다. 오히려 보호 범위는 첨부한 특허청구범위에 의해 정의되는 것이다.

Claims (15)

  1. 각각 액체 액적(20, 21; 40, 41, 42; 60, 61, 52, 63, 64)을 수용할 수 있는 기설정된 개수의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90)을 포함하는 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)에 있어서,
    각각의 액적 구획(10; 30; 50; 60; 90)은 액적이 마이크로유체 습윤 장벽을 넘어 퍼지는 것을 방지하며 각각의 내강(100; 500)을 둘러싸도록 배열되는 환상 마이크로유체 습윤 장벽(102; 302; 502; 702; 902)을 포함하고, 각각의 액적 구획(10; 30; 50; 60; 90)은 폐쇄된 저부(101; 501) 및 적어도 하나의 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽(104; 304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606; 904, 906)을 포함하며, 각각 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽(104; 304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606; 904, 906)은 상기 환상 마이크로유체 습윤 장벽(102; 302, 304; 502, 504, 506, 508; 604, 606; 904, 906)을 둘러싸도록 배열되고, 습윤 가능한 영역(103; 303, 305; 503, 505, 507, 509)이 두 인접 배열된 마이크로유체 습윤 장벽들 사이에 배열되는,
    현수 액적 플레이트.
  2. 제 1항에 있어서,
    각각의 액적 구획들은 웰들(10; 30; 60; 90)인,
    현수 액적 플레이트.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    환상 마이크로유체 습윤 장벽이 환상 가장자리(102)를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 환상 마이크로유체 습윤 장벽이 적어도 하나의 추가적인 환상 가장자리(104)를 포함하고, 추가적인 환상 가장자리(104)는 상기 환상 가장자리(102)를 둘러싸도록 배열되며, 습윤 가능한 영역(103)은 두 인접 배열된 환상 가장자리들(102, 104) 사이에 배열되는,
    현수 액적 플레이트.
  4. 제 3항에 있어서,
    인접한 두 환상 가장자리들(102, 104)이 단계식 방식으로 배열되는,
    현수 액적 플레이트.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    환상 마이크로유체 습윤 장벽이 환상 테(302; 502; 602; 902)를 포함하며, 적어도 하나의 추가적인 마이크로유체 습윤 장벽이 추가적인 환상 테를 포함하고, 각각의 추가적인 환상 테(304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606; 904, 906)는 상기 환상 테(302, 304; 502, 504, 506, 508; 602, 604; 902, 904)를 둘러싸고, 습윤 가능한 영역(303, 305; 503, 505, 507, 509)은 두 인접 배열된 환상 테들 사이에 배열되는,
    현수 액적 플레이트.
  6. 제 5항에 있어서,
    인접 배열된 환상 테들(302, 304, 306; 602, 604, 606; 902, 904, 906)이 단계식 방식으로 배열되는,
    현수 액적 플레이트.
  7. 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    현수 액적 플레이트가 내부에 기설정된 개수의 구멍들(610; 910)을 갖는 별도로 제작된 플레이트(61; 91) 및 액적 구획들을 형성하며 대응하는 기설정된 개수의 별도로 제작된 웰들(60; 90)로 제조되며, 각각의 별도로 제작된 웰(60; 90)은 별도로 제작된 플레이트(61; 91)의 각 구멍(610; 910) 내로 압입되는,
    현수 액적 플레이트(6; 9).
  8. 제 7항에 있어서,
    별도로 제작된 웰들(60; 90)이 플레이트(6; 9)의 측면으로부터 구멍들(610; 910) 내로 압입되어 플레이트(6; 9)의 외부 표면(611, 911)을 형성하는,
    현수 액적 플레이트(6; 9).
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    24개 웰들, 96개 웰들 또는 384개 웰들을 포함하는,
    현수 액적 플레이트.
  10. 제 5항에 있어서,
    환상 테들(503, 504, 506, 508, 510)이 평면 표면 상에 배열되는,
    현수 액적 플레이트.
  11. 기설정된 개수의 액적 구획들(10; 30; 50; 60, 90) 또는 웰들을 갖는 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 따른 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9) 및 현수 액적 플레이트의 기설정된 개수의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90) 또는 웰들에 대응하는 개수의 웰들(70)을 갖는 수용 플레이트(7)를 포함하는 현수 액적 플레이트 어셈블리에 있어서,
    현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9) 및 수용 플레이트(7)는 조립된 상태에서 수용 플레이트의 웰들(70)이 현수 액적 플레이트의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90) 또는 웰들과 정렬 배열되도록 하는 방식으로 조립되는,
    현수 액적 플레이트 어셈블리.
  12. 세포들에 대한 물질 독성의 평가 방법에 있어서,
    상기 방법은,
    a) 기설정된 개수의 액체 액적들(20; 40; 64)을 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)의 대응하는 개수의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90) 내로 도입하는 단계(각각의 액적은 기설정된 부피의 평가될 물질 및 복수의 세포들(82)뿐만 아니라 액체 배양 배지를 함유한다);
    b) 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)를 역전시키고, 세포들(82)이 각각의 액적들(20; 40; 64)에서 3차원 세포성 응집물들(83)을 형성할 수 있도록 각각의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90)에서 현수되도록 하는 방식으로 액적들(20; 40; 64)을 운반하는 현수 액적 플레이트를 기설정된 시간 간격 동안 인큐베이션하는 단계;
    c) 추가적인 액체 배양 배지를 각각의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90) 내 액적들(20; 40; 64)로 공급하여 3차원 세포성 응집물들(83)의 추가 성장을 촉진하는 단계; 및
    d) 평가될 물질이 3차원 세포성 응집물들(83)에 대해 독성인지 여부를 평가하기 위해 3차원 세포성 응집물들(83)을 분석하는 단계;를 포함하고,
    제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)가 이용되며,
    단계 c)는 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)를 재역전시키고, 추가적인 액체 배양 배지의 액적을 3차원 세포성 응집물들을 함유하는 각각의 액적들에 첨가하여 각각의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90)에서 각각의 더 큰 액적들(21; 41, 42; 65, 66, 67, 68)을 형성한 후, 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)를 다시 역전시켜 3차원 세포성 응집물들(83)이 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90)로부터 현수되는 각각의 더 큰 액적들(21; 41, 42; 65, 66, 67, 68)에서 자라도록 하여 수행되는,
    방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 방법은,
    e) 성장한 3차원 세포성 응집물들(83)을 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)의 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90)로부터 수용 플레이트(7)의 대응하는 개수의 웰들(70)로 옮기는 단계;
    f) 수용 플레이트(7)를 추가 기설정된 시간 간격 동안 3차원 세포성 응집물들(83)을 함유하는 웰들(70)과 인큐베이션하는 단계; 및
    g) 인큐베이션 후, 평가될 물질이 3차원 세포성 응집물들에 대해 독성인지 여부를 평가하기 위해 3차원 세포성 응집물들을 분석하는 단계;를 추가로 포함하는,
    방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    단계 e)는 수용 플레이트(7)의 각 웰들(70)이 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9)의 각 액적 구획들(10; 30; 50; 60; 90)과 반대로 배열되도록 하는 방식으로 현수 액적 플레이트(1; 3; 5; 6; 9) 및 수용 플레이트(7)를 조립한 뒤 조립된 플레이트들을 원심분리하여 수행되는,
    방법.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서,
    세포들(82)이 배아 줄기 세포들이고 3차원 세포성 응집물들(82)이 배상체들이며, 평가될 물질이 3차원 세포성 응집물들에 대해 독성인지 여부를 평가하기 위한 3차원 세포성 응집물들(83)의 분석 단계는 배상체들이 심근 세포들을 함유하는지 여부를 분석하여 수행되는,
    방법.
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