CN107406886A - 用于在液滴内扩增或克隆的系统、方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明一般而言涉及基于液滴的微流体装置，包括用于在液滴内扩增或克隆的系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，本发明一般而言涉及用于扩增多个核酸的系统、方法或试剂盒，例如，基本上不会相对于其它核酸选择性地扩增一些核酸。核酸可以包含在液滴内。此外，在一些实施方案中，可以将包含感兴趣的物质(例如核酸)的多个微流体液滴与不含该物质的微流体液滴混合，然后吸移或以其它方式转移，以使得平均预定数量的含有感兴趣物质的液滴被转移。

Description

用于在液滴内扩增或克隆的系统、方法和试剂盒
相关申请
本申请要求由Weitz等人于2015年1月23日提交的题为“Systems，Methods，andKits for Amplifying or Cloning Within Droplets”的美国临时专利申请系列号62/106,981的优先权，其以引用方式全部并入本文。
领域
本发明一般而言涉及基于液滴的微流体装置，包括用于在液滴内扩增或克隆的系统、方法和试剂盒。
背景
存在用于在微流体系统内产生流体液滴的各种技术，例如国际专利公开号WO2004/091763，WO 2004/002627，WO 2006/096571，WO 2005/02151，WO 2010/033200和WO2011/056546，其各自通过引用整体并入本文。在一些情况下，可能产生相对大量的液滴，并且通常以相对高的速度产生，例如，可以以每秒至少约10个液滴的速率产生液滴。液滴中也可含有各种物质。
概述
本发明一般而言涉及基于液滴的微流体装置，包括用于在液滴内扩增或克隆的系统、方法和试剂盒。在一些情况下，本发明的主题涉及相关的产品，特定问题的替代解决方案，和/或一个或多个系统和/或物品的多种不同用途。
一方面，本发明一般而言涉及一种方法。在一组实施方案中，所述方法包括以下步骤：将核酸破碎以产生核酸片段，将至少一些核酸片段包含在多个微流体液滴中，和扩增包含在微流体液滴内的至少一些核酸片段。
根据另一组实施方案，该方法包括以下步骤：将核酸包含在多个微流体液滴中，和均匀扩增微流体液滴内包含的至少一些核酸。
在一组实施方案中，该方法包括将多个核酸包含在第一多个微流体液滴中，扩增第一多个微流体液滴内的至少一些核酸，将扩增的核酸组合在共同的溶液中，将扩增的核酸包含在第二多个微流体液滴中，以及扩增第二多个微流体液滴内的至少一些扩增的核酸。
在一个实施方案中，该方法通常涉及均匀扩增微流体液滴中所含的多个核酸。
在又一组实施方案中，该方法包括将含有感兴趣的物质的第一微流体液滴与不含感兴趣的物质的第二微流体液滴混合以产生微流体液滴的混合物，并转移(例如，吸移)至少10nl的微流体液滴的混合物到容器中。
在一些实施方案中，该方法包括将含有感兴趣的物质的第一微流体液滴与不含感兴趣的物质的第二微流体液滴混合以产生含有微流体液滴的混合流体，以产生微流体液滴的混合物，以及平均地转移多个第二微流体液滴和不超过约1.5个第一微流体液滴到容器中。
在另一方面，本发明一般而言涉及试剂盒。在一组实施方案中，试剂盒包括被配置成产生微流体液滴的液滴制造装置，被配置为操纵微流体液滴的微流体装置，以及包含具有基本上相同组成的多个微流体液滴的容器。
在另一方面，本发明包括制备本文所述的一个或多个实施方案的方法。在另一方面，本发明包括使用本文所述的一个或多个实施方案的方法。
当结合附图考虑时，本发明的其它优点和新颖特征将根据本发明的各种非限制性实施方案的以下详细描述而变得明显。在本说明书和通过引用并入的文献包括冲突和/或不一致的公开内容的情况下，以本说明书为准。如果通过引用并入的两个或多个文献包括冲突和/或不一致的公开内容，则以具有较晚生效日期的文献为准。
附图说明
将参考附图通过示例的方式描述本发明的非限制性实施方案，附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示的每个相同或几乎相同的部件通常由单个数字表示。为了清楚起见，当示出对于本领域普通技术人员理解本发明不是必需的时，并非每个部件都在每个图中标出，并且并非本发明的每个实施方案的每个部件被示出。在附图中：
图1A-1B示出了在本发明的某些实施方案中包含在液滴内的核酸的扩增；
图2示出了本发明的另一个实施方案中感兴趣的液滴的转移；
图3示出了用于本发明的某些实施方案的装置；
图4示出了根据本发明的一些实施方案的液滴内的PCR扩增的示意图；
图5示出了本发明的另一个实施方案中均匀扩增的核酸；
图6示出了根据本发明的一些实施方案的液滴内的PCR扩增的示意图；
图7A-7B示出了本发明的另一个实施方案中的扩增的核酸；和
图8示出了根据本发明的另一个实施方案的液滴中的扩增。
详细描述
本发明一般而言涉及基于液滴的微流体装置，包括用于在液滴内扩增或克隆的系统、方法和试剂盒。在一些实施方案中，本发明一般而言涉及用于扩增多个核酸(例如，基本上不相对于其它核酸选择性地扩增一些核酸)的系统、方法或试剂盒。核酸可以包含在液滴内。此外，在一些实施方案中，可以将包含感兴趣的物质(例如核酸)的多个微流体液滴与不含该物质的微流体液滴混合，然后吸移或以其它方式转移，以使得平均预定数量的含有感兴趣物质的液滴被转移。
现在参考图1，显示了用于扩增液滴内的核酸的本发明的一个方面。在该图中，示出了包含待扩增的核酸55的多个细胞50。细胞可以相同或不同，并且细胞可以具有相同或不同的核酸。例如，一个(或多个)细胞可以是具有突变基因组的癌细胞，例如在正常细胞群体内。然而，应该理解，这只是举例说明；在一些实施方案中，可以使用游离DNA或其它核酸，例如不一定来自预定的细胞。例如，核酸可以由法医DNA样品分析或其它未知来源或未知细胞产生。
如果将细胞50裂解并将其核酸收集在一起进行扩增，则来自不同细胞的核酸也将混合在一起。在某些情况下，这种不同核酸混合物的扩增可能在扩增过程中产生问题。例如，如图1A所示，由于竞争效应，某些核酸可以相对于其它核酸而被选择性地扩增，导致各种误差，例如倾斜分布(例如，链A)，物质的丢失(例如，链B)或在扩增过程中产生的“嵌合体”(例如，链C/D)。例如，嵌合体可以通过两个模板的交叉杂交或通过在生长过程中酶从核酸模板解离到不同的核酸模板上来产生。此外，一些链可以相对于其它链被选择性地扩增，例如由于酶亲和力的差异，随机过程和扩增期间的变异性等。因此，与原始核酸群体相比，扩增的核酸可能具有低保真度。
然而，在本发明的一些实施方案中，通过扩增液滴中所含的核酸可以避免或减少这些问题。例如，如图1B所示，含有核酸的液滴群可以暴露于适于引起液滴内的核酸扩增的条件。例如，液滴可以与包含用于扩增目的的合适化合物(例如聚合酶和/或脱氧核糖核苷酸)的液滴59合并，和/或通过将液滴暴露于合适的温度变化。用于合并液滴的技术是本领域普通技术人员已知的。作为非限制性实例，携带不同试剂和/或模板的两种或更多种流体可以使用共流微流体装置同时引入到液滴中；例如，一种流体携带PCR试剂，第二种流体携带模板混合物。由于每个核酸的每个扩增反应分别在每个液滴内发生，而不会将不同的核酸混合在一起，所以可以基本保持保真度。因此，由于每个核酸的扩增通常保持在每个液滴内，而不与其它核酸混合，因此可以基本上减少或消除诸如倾斜分布，样品损失或嵌合体之类的错误。
因此，本发明的某些方面通常涉及用于扩增液滴内的核酸(例如用于测序或其它应用)的系统和方法。核酸可以是例如RNA和/或DNA，例如基因组DNA或线粒体DNA。在一些情况下，核酸是自由浮动的或包含在液滴内所包含的流体中。核酸可以取自一个或多个细胞(例如，在一个或多个细胞裂解时释放)、合成产生的等等。如果核酸来自细胞，细胞可以来自相同或不同的物种(例如小鼠，人，细菌等)和/或相同或不同的个体。例如，核酸可以来自单个生物体的细胞，例如健康或患病细胞(例如癌细胞)，生物体的不同器官等。在一些情况下，可以使用不同的生物体(例如，相同或不同的物种)。在一些情况下，核酸可以具有这样的分布，使得一些核酸不通常存在于核酸群体内。例如，正常或其它细胞的数十、数百、数千或更多中可能存在一个癌症或疾病细胞。
核酸可以包含在液滴内，并且可以在液滴内扩增。在一些实施方案中，核酸可以在包封在液滴内之前首先被破碎。例如，核酸可以例如在细胞裂解时从细胞释放，然后使用诸如超声或机械破坏的技术进行破碎。如果使用的话，细胞可以在裂解之前包含在液滴内，或者细胞可以先被裂解，然后将细胞裂解物包含在一个或多个液滴内。在液滴内包封核酸(或细胞)的技术是本领域普通技术人员已知的。
多种技术可用于扩增液滴内的核酸，例如PCR(聚合酶链式反应)技术。然而，通过在液滴内扩增核酸，例如在从液滴中释放核酸之前，可以在本发明的一些实施方案中实现各种核酸的“均匀”扩增。通常，在“均匀”扩增中，可以在每个液滴内产生大致相同量的核酸。相比之下，如果将多种核酸批量混合在一起然后进行扩增(例如，如通常在PCR中进行的那样)，PCR期间各种核酸之间的反应速率的差异可导致一些核酸相对于其它核酸被扩增，并且在一些情况下，一些核酸可能由于其它核酸的相对过度扩增而丢失。参见例如图1A。因此，例如，与批量扩增相反，可以在“均匀”扩增条件下扩增可能更缓慢地反应(例如，暴露于聚合酶或其它酶时)的核酸。
因此，根据本发明的某些实施方案，多个液滴中的核酸可以“均匀地”扩增，使得在扩增后相对于扩增之前核酸的分布基本上不发生改变。液滴可以是流体液滴，例如，如本文所讨论的。例如，根据某些实施方案，可以扩增多个液滴内的核酸，使得每种类型的核酸的核酸分子的数目可以具有这样的分布，使得在扩增后不超过约5％、不超过约2％、或不超过约1％的核酸具有小于每个液滴的扩增的核酸分子的总平均数的约90％(或小于约95％，或小于约99％)和/或大于每个液滴的扩增的核酸分子的总平均数的约110％(或大于约105％，或大于约101％)的数量。在一些实施方案中，可以扩增液滴内的核酸，使得扩增的每个核酸可以在扩增的核酸中被检测到，并且在一些情况下使得核酸与总核酸群体的质量比相对于扩增前的质量比，在扩增后的变化小于约50％，小于约25％，小于约20％，小于约15％，小于约10％或小于约5％。在一些情况下，扩增保真度可以通过破坏液滴，释放核酸和对核酸进行杂交来确定，或者可以对核酸进行FISH测试。
如上所述，可以使用PCR(聚合酶链式反应)或其它扩增技术来扩增核酸(例如包含在液滴内的)。通常，在PCR反应中，加热核酸(例如，加热至至少约50℃，至少约70℃，或在某些情况下至少约90℃的温度)，以使核酸解离成单链，并使用热稳定的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)来扩增核酸。该过程通常重复多次以扩增核酸。本领域普通技术人员将了解科学文献中描述的各种不同的PCR技术。
因此，在一组实施方案中，可以在液滴内进行PCR扩增。例如，液滴可以含有聚合酶(例如Taq聚合酶)和DNA核苷酸(脱氧核糖核苷酸)，并且液滴可以被处理(例如通过反复加热和冷却)以扩增液滴内的核酸。用于PCR或其它扩增技术的合适试剂，例如聚合酶和/或脱氧核糖核苷酸，可以在液滴形成期间和/或之后(例如，通过与包含这些试剂的液滴合并，和/或通过直接注射例如包含在流体内的这些试剂)添加至液滴。用于液滴注射或液滴合并的各种技术将是本领域普通技术人员已知的。参见例如美国专利申请公开号No.2002/0132288，其通过引用并入本文。此外，在一些情况下，合适的引物可用于引发聚合，例如P5和P7，或本领域普通技术人员已知的其它引物。在一些实施方案中，引物可以添加到液滴中，或者引物可以存在于液滴内的一个或多个核酸上。本领域普通技术人员将知道合适的引物，其中许多可以容易地商业获得。
例如，作为非限制性实例，液滴可以含有聚合酶和DNA核苷酸，其与含有核酸的液滴融合，以允许发生核酸扩增。本领域普通技术人员将知道合适的PCR技术和变型，例如组装PCR或聚合酶循环组装，其可在一些实施方案中用于产生扩增的核酸
核酸可以扩增至任何合适的程度。可以例如通过控制诸如温度，循环时间或包含在液滴内的酶和/或脱氧核糖核苷酸的量等因素来控制扩增程度。例如，在一些实施方案中，液滴群体可以具有每个液滴至少约50,000，至少约100,000，至少约150,000，至少约200,000，至少约250,000，至少约300,000，至少约400,000，至少约500,000，至少约750,000，至少约1,000,000或更多个分子的扩增的核酸。参见例如图5，其显示已经在液滴内被均匀扩增的核酸分子群体的实例。
在一些情况下，液滴可以被爆裂或破裂，例如，以对包含在液滴内的核酸测序。例如，使用诸如机械破裂、化学破坏和/或超声波的技术可以破裂运载液体中所含的液滴。用于测序核酸的方法的实例包括但不限于链终止测序，杂交测序，Maxam-Gilbert测序，染料终止子测序，链终止法，大规模并行标签测序(Lynx Therapeutics)，聚合酶克隆测序，焦磷酸测序，连接测序，离子半导体测序，DNA纳米球测序，单分子实时测序，纳米孔测序，微流体Sanger测序，数字RNA测序(“数字RNA-seq”)等。
如上所述，本发明的某些方面涉及使用含有细胞和/或由细胞产生的核酸(例如基因组DNA)的多个液滴。细胞可以基本上相同或不同。例如，液滴可以含有多于一种细胞或其它物质，其中细胞(或其它物质)是相同或不同的；不同液滴中的细胞(或其它物物质)也可以相同或不同。如果使用细胞，在一些实施方案中，细胞也可以来自特定的细胞群，例如来自特定器官或组织(例如，心脏细胞，免疫细胞，肌肉细胞，癌细胞等)，细胞来自特定个体或物种(例如人细胞，小鼠细胞，细菌等)，细胞来自不同生物体，细胞来自天然存在的样品(例如池塘水，土壤等)等。液滴可以是流体液滴，例如，如本文所讨论的。
在一些实施方案中，一个或多个“标签”可以存在于液滴内，其可以被分析或用于例如确定液滴的身份和/或历史，以确定液滴中的细胞或其它物质，以确定液滴内的核酸等。在一些情况下，可以选择标签为相对于液滴的其它组分相对惰性。标签可以最初存在于液滴中，和/或可以被后续添加。例如，当液滴暴露于一个或多个条件(或接近于这种暴露的时间)时，可以添加标签。在一些情况下，液滴中可能存在多于一个标签。合适条件的非限制性实例包括在Bernstein等人2014年4月17日提交的题为“Systems and Methods forDroplet Tagging”的美国专利申请系列号61/981,123、Weitz等人于2014年4月17日提交的题为“Methods and Systems for Droplet Tagging and Amplification”的美国专利申请系列号61/981,108(其全部内容通过引用并入本文)中讨论的那些。
在本发明的某些实施方案中，可将微滴内的标签连接在一起(例如化学地)，以产生连接的标签。标签可以在包含在液滴内的流体中自由浮动。可使用任何合适的技术例如在从微滴移除之前将标签连接在一起。标签可使用任何合适的技术连接。诸如，标签可以使用酶、催化剂或反应物(其可以使用任何合适的技术来添加至微滴中)连接在一起。例如，可将包含标签的微滴与包含化学剂的另一个微滴融合，或者可以例如使用移液或其它技术以及在一些情况下使用自动化技术将化学反应物添加或插入至微滴中。
通过将微滴中的标签连接在一起以产生连接的标签，可通过保持连接的标签来维持微滴的身份和/或来历，即使标签与微滴分离或来自不同微滴的标签混合在一起。例如，可将来自各种微滴的连接的标签收集在一起并进行分析。在一些实施方案中，取决于各种性质，可将一系列微滴分离成各种组，并且可将每组内的标签一起操纵和/或用于鉴定具有这样的性质的这样的微滴。
标签可以包括例如可以连接在一起的核酸。在一组实施方案中，可使用酶将核酸连接在一起。例如，在某些实施方案中，使用连接酶将核酸连接在一起。连接酶的非限制性实例包括DNA连接酶，诸如DNA连接酶I、DNA连接酶II、DNA连接酶III、DNA连接酶IV、T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶等。许多这样的连接酶可以商购获得。作为另外的实例，在一些实施方案中，可使用退火或引物延伸法将两个或更多个核酸连接在一起。在另一组实施方案中，可使用PCR(聚合酶链式反应)或其它扩增技术将核酸连接在一起和/或扩增。
在一些实施方案中，用作标签的各种核酸序列可用于编码液滴可以暴露于的特定特征和/或条件(例如，由细胞产生的核酸或本文所讨论的其它核酸)，并且根据某些实施方案，可以向其中添加这样的核酸以指示对条件的这样的暴露。在一些情况下，可将微滴内的核酸在移除(诸如，在微滴破裂后、在洗涤载玻片后等)之前连接在一起。可将来自不同微滴的不同核酸混合在一起；然而，即使在这样的混合之后，可单独对每个核酸测序以确定相应的微滴已暴露于的特定条件。
任何合适的系统可以用于编码。例如，在一组实施方案中，核酸标签可以包括核苷酸的编码区，和任选地连接区。编码区中的核苷酸可以对应于特定条件(或条件组)。任何合适数量的条件可以以这样的方式被任意编码，其中可由这样的编码区编码的条件的数量可由编码区中的核苷酸的数量确定。因此，例如，具有长度n的编码区可以编码多达4n个区域(基于四种类型的核苷酸)。例如，第一条件可以用A编码，第二条件可以用T编码(或如果核酸是RNA，用U编码)，第三条件可以用G编码，第四条件可以用C编码，等。作为更复杂的实例，含有3个核苷酸的编码区足以编码超过50种不同条件(因为43＝64)。可以使用一个或不止一个编码区。另外，在某些实施方案中，编码区还可包括用于错误检测和/或校正、冗余等的其它核苷酸。
在一些情况下，核酸标签还可包括一个或多个连接在一起的连接区域。例如，连接区可包括核酸的“粘性末端”或悬突，以使得只有特定的核酸可以适当地连接在一起。例如，第一核酸标签(编码第一条件)可包括与第二核酸标签上的粘性末端基本上互补但不与第三核酸标签上的粘性末端基本互补的第一粘性末端；类似地，第二核酸(编码第二条件)可包括与第三核酸标签(编码第三条件)上的粘性末端基本上互补但不与第一核酸上的粘性末端基本上互补的粘性末端。因此，在暴露于合适的连接酶时，第一、第二和第三核酸可以以适于后续研究的顺序连接在一起，而不存在以不正确的顺序(例如，第一核酸连接至另一第一核酸)错误地连接在一起的核酸。因此，通过对最终连接的核酸进行测序，可以确定该核酸处于暴露于第一、第二和第三条件的微滴中。然而，应当理解，在其它实施方案中，可能不需要确保核酸标签以某一构型或顺序连接在一起。
取决于应用，核酸标签还可具有任何合适的长度或核苷酸数目。例如，核酸标签可具有短于或长于10nt、30nt、50nt、100nt、300nt、500nt、1000nt、3000nt、5000nt或10000nt等的长度。在一些情况下，还可将核酸标签的其它部分用于其它目的，例如除了编码条件以外。例如，核酸标签的部分可用于增加核酸标签的体积(例如，使用特定序列或无义序列)，以便于处理(例如，标签可包括多聚A尾巴)，以增加结合的选择性(例如，如下所讨论的)，以促进被酶(例如，合适的连接酶)识别，以促进鉴定等。
在一些情况下，液滴可以被爆裂或破裂，例如，以对包含在液滴内的核酸测序。例如，使用诸如机械破裂、化学破坏和/或超声波的技术可以破裂运载液体中所含的液滴。如果存在标签，则可以确定标签以确定液滴的身份和/或历史，例如确定液滴暴露于的条件。根据使用的标签类型，可以使用任何合适的方法来确定标签。例如，可以使用荧光测量来确定荧光颗粒，或者可以使用各种技术和仪器对核酸进行测序，其中许多技术和仪器在市场上容易获得。用于测序核酸的技术的非限制性实例包括本文所述的那些。
在一些实施方案中，可以发生多个回合的包封成液滴和液滴破裂。例如，在一些情况下，核酸(例如本文讨论的那些)可以被包封在第一多个液滴中，然后液滴被破裂，并且将它们的内容物合并在一起，例如在共同的溶液中。然后内容物可以被包封在第二多个液滴内。
在一些实施方案中，来自任何合适来源的核酸可以包含在第一多个微流体液滴内，并且在液滴内以某种方式进行扩增或操纵，例如如本文所讨论的。在一些情况下，扩增的核酸(或“扩增子”)可以组合在一起，例如通过将液滴破裂或破碎到共同的溶液中，然后溶液可以被包含在第二多个微流体液滴中。
参考图8举例说明一个非限制性实例。在图8中，多个核酸(例如，由破碎的核酸，生物模板或其它合适的来源产生)被包封在第一多个液滴内。核酸可以包括例如DNA或RNA。用于将核酸包封在液滴中的技术包括本文讨论的任何一种。
在一些情况下，核酸可以在液滴内以某种方式进行操纵。实例包括本文讨论的任何一种。例如，在一组实施方案中，可以向液滴中添加各种化学物质或其它物质，例如引物，核苷酸，其它核酸，染料等。作为非限制性实例，液滴内的核酸可以暴露于允许在液滴内扩增核酸(例如，以产生“扩增子”)的条件(例如，使得发生均匀扩增，如本文所讨论的)。在一些情况下，可以进行微流体液滴的分选或合并。
如图8所示，扩增后，液滴可以被破坏或以其它方式破裂，例如，如本文所述的，并且将液滴内的核酸组合，例如在共同的溶液中。在一些实施方案中，核酸可以在溶液中以某种方式操纵，或者可以添加或除去各种化学物质或其它物质。在一些情况下，还可以移除溶液的以部分或等分试样，例如用于随后的测定。例如，在一个实施方案中，核酸可以在溶液中纯化，并且可以除去其它物质(例如，未反应的物质，催化剂或酶等)。
然后可以将核酸包封在第二多个液滴中，例如如图8所示。类似于上文所述，核酸可以在液滴内以某种方式操纵，例如如本文所讨论的。例如，在一组实施方案中，可以向液滴中添加各种化学物质或其它物质，例如引物，核苷酸，其它核酸，染料等。作为非限制性实例，液滴内的核酸可以暴露于允许发生液滴内的核酸扩增的条件(例如，用于索引或测序)。例如，在一些实施方案中，诸如本文所述的“条形码”可以被添加到液滴中，例如以标记液滴内的核酸。在一些情况下，可以在液滴内进行测序，尽管在一些情况下，在对核酸进行测序之前，液滴可能被破坏或以其它方式被破裂。在一些情况下，也可以发生微流体液滴的分选或合并。
另外，应当理解，上文所述的并不意味着限制。例如，在一些实施方案中，扩增和条形码的并入均可以在多个微流体液滴内执行，即不一定需要在这之间破裂液滴。
本发明的一些方面通常涉及用于将微流体液滴转移到容器的系统和方法，例如用于进一步的分析或研究。转移可以包括例如吸移，并且可以例如手动或自动地进行转移。微流体液滴可以包含感兴趣的物质，例如核酸(例如本文所述的那些)或细胞或其它样品，并且容器可以是例如小瓶，试管，烧杯，微孔板(例如，96孔板，384孔板，1536孔板等)的孔等。
在一些实施方案中，液滴要转移至的容器具有宏观尺寸。例如，容器可用于使用普通(宏观)实验室设备(例如平板读数器，分光荧光计，天平，离心机等)来分析样品。然而，微流体液滴通常可以具有非常小的尺寸(例如，具有小于约1mm的平均直径或小于约1微升的体积)。因此，将这种微流体液滴吸移或以其它方式转移到这样的容器中存在显著的挑战，例如，难以准确地吸移或以其它方式转移小体积，或难以将微流体液滴与其它微流体液滴(例如在流体内)分离或分开。
要转移的微流体液滴可以具有任何合适的直径或体积。例如，在一些情况下，微流体液滴可以小于约1mm，小于约700微米，小于约500微米，小于约300微米，小于约100微米，小于约70微米，小于约50微米，小于约30微米，小于约10微米，小于约5微米，小于约3微米，小于约1微米等。在一些情况下，平均尺寸也可大于约1微米，大于约3微米，大于约5微米，大于约7微米，大于约10微米，大于约30微米，大于约50微米，大于约70微米，大于约100微米，大于约300微米，大于约500微米，大于约700微米，或大于约1mm。任何这些的组合也是可能的；例如，微流体液滴的平均或特征尺寸可以为约1mm至约100微米。
在一组实施方案中，感兴趣的微流体液滴可以与不感兴趣的其它第二微流体液滴混合。例如，如图2所示，包含在流体15(例如液体)中的感兴趣的液滴10将被转移到容器20(例如，小瓶或微孔板的孔)。感兴趣的液滴可以是相对小尺寸的微流体液滴，并且在一些情况下，液滴可以被其它液滴11包围。然而，仅需要转移感兴趣的液滴10，例如不同时转移其它液滴进入同一目的容器。
吸移器和其它宏观实验室设备(例如，注射器，吸管等)不能以这样的方式普通使用。例如，如图2所示，由吸移管19吸取的流体的量通常显著大于微流体液滴，并且不可能从流体15仅取出感兴趣的液滴10，而不会意外地同时取出一个或多个液滴11。(但注意的是，图2未按比例绘制。)
然而，在某些实施方案中，可以将多个第二微流体液滴12添加到流体15中。在一些实施方案中，流体15的体积可以增加(即，添加或没有添加液滴12)。这可能具有如图2所示的用液滴12将感兴趣的液滴10与其它液滴11“稀释”的效果。在一些情况下，第二微流体液滴可以基本上不含感兴趣的物质，和/或不含与感兴趣的物质相似的物质。例如，如果感兴趣的微流体液滴包含特定核酸(或核酸片段，例如来自基因组)，则第二微流体液滴可以不含该特定核酸和/或不含其它核酸。因此，在转移时，平均只有一个(或少量或预定数量)的感兴趣的液滴10被转移到容器20中，而不转移(或转移较少数量的)其它液滴11。
第二微流体液滴的组成可以与感兴趣的微流体液滴相同或不同。类似地，第二微流体液滴可以彼此独立地具有相同或不同的组成。第二微流体液滴可以是基本上单分散的，和/或具有一定范围的尺寸或平均直径，其可以与感兴趣的微流体液滴的直径相同或不同。
例如，在一组实施方案中，第二微流体液滴可以具有平均直径的分布，使得不超过约20％、不超过约10％或不超过约5％的液滴可以具有大于第二微流体液滴的平均直径的约120％或小于第二微流体液滴的平均直径的约80％，大于第二微流体液滴的平均直径的约115％或小于第二微流体液滴的平均直径的约85％，大于第二微流体液滴的平均直径的约110％或小于第二微流体液滴的平均直径的约90％，大于第二微流体液滴的平均直径的约105％或小于第二微流体液滴的平均直径的约95％，大于第二微流体液滴的平均直径的约103％或小于第二微流体液滴的平均直径的约97％，或大于约101％或小于约99％平均的平均直径。如本文所使用的，液滴的“特征尺寸”是具有与液滴相同体积的完美球体的直径。此外，在一些情况下，液滴的平均直径的变异系数可以小于或等于约20％，小于或等于约15％，小于或等于约10％，小于或等于约10％等于约5％，小于或等于约3％，或小于或等于约1％。然而，如前所述，在其它实施方案中，第二微流体液滴可以不需要是基本上分散的，并且可以代替地呈现不同直径的范围。
在一些实施方案中，第二微流体液滴的平均直径可以小于约1mm，小于约700微米，小于约500微米，小于约300微米，小于约100微米，小于约70微米，小于约50微米，小于约30微米，小于约10微米，小于约5微米，小于约3微米，小于约1微米等。在某些情况下，平均直径也可大于约1微米，大于约3微米，大于约5微米，大于约7微米，大于约10微米，大于约30微米，大于约50微米，大于约70微米，大于约100微米，大于约300微米，大于约500微米，大于约700微米，或大于约1mm。任何这些的组合也是可能的。因此，例如，第二微流体液滴的平均或特征尺寸可以为约1mm至约10微米。
在一些情况下，感兴趣的微流体液滴可以与感兴趣的第二微流体液滴以至少约1:10，至少约1:30，至少约1:50，至少约1:100，至少约1:300，至少约1:500，至少约1:1,000，至少约1:3,000，至少约1:500，至少约1:10,000，至少约1:30,000，至少约1:50,000，至少约1:100,000，至少约1:300,000，至少约1:500,000，至少约1:000,000的比例或任何其它合适的比例混合。在一些情况下，使用相对高的比例，例如，使得感兴趣的微流体液滴基本上与可能感兴趣的其它微流体液滴分离。
因此，如图2所示，感兴趣的液滴10相对于其它液滴11通过另外的流体和/或第二微流体液滴12而被广泛地间隔或稀释。应当注意，尽管另外的流体可能已经被添加到流体15(即，不添加第二微流体液滴)，但这样做在一些情况下还可能改变流体15的物理性质或特性，在某些情况下是相对不利的。然而，在其它情况下，流体(不含液滴12)也可用于将液滴10与其它液滴11“稀释”。
在一些情况下，当将一定量的流体15转移到容器20(例如，使用吸移管19)时，平均而言，只有一个感兴趣的液滴10与第二微流体液滴12一起转移，但没有任何液滴11。然而，应当注意的是，在此实例中仅转移了一个感兴趣的液滴10，在其它实施方案中也可以转移其它合适数目的感兴趣的液滴。例如，在一些情况下，感兴趣的液滴可以与第二微流体液滴混合，使得平均将不超过约10个感兴趣的液滴转移到例如容器中。如所述的，这通常是“平均”确定的；单次转移可以包含更多或更少的感兴趣的微流体液滴，例如由于随机概率或取样，在流体内的混合等。在一些情况下，例如，小于约1,000,000个感兴趣的液滴，小于约500,000个感兴趣的液滴，小于约300,000个感兴趣的液滴，小于约100,000个感兴趣的液滴，小于约50,000个感兴趣的液滴，小于约30,000个感兴趣的液滴，小于约10,000个感兴趣的液滴，小于约5000个感兴趣的液滴，小于约3,000个感兴趣的液滴，小于约1,000个感兴趣的液滴，小于约500个感兴趣的液滴，小于约300个感兴趣的液滴，小于约100个感兴趣的液滴，小于约50个感兴趣的液滴，小于约感兴趣的30个液滴，小于约10个感兴趣的液滴，小于约5个感兴趣的液滴，小于约3个感兴趣的液滴，小于约2个感兴趣的液滴，小于约1.5个感兴趣的液滴，小于约1个感兴趣的液滴，小于约0.5个感兴趣的液滴，小于约0.3个感兴趣的液滴，小于约0.1个感兴趣的液滴等可以被转移，例如，进入合适的容器。(液滴的分数也是可能的，因为这是“平均”确定的。)
此外，转移的液体体积可以取决于应用；例如，在一些情况下，转移的体积可以为至少约10nl，至少约30nl，至少约50nl，至少约100nl，至少约300nl，至少约300nl，至少约500nl，至少约1微升，至少约3微升，至少约5微升，至少约10微升，至少约30微升，至少约50微升，至少约100微升，至少约300微升，至少约500微升，至少约1ml等。在一些情况下，可以被转移的体积可以不超过约1ml，不超过约500微升，不超过约300微升，不超过约100微升，不超过约50微升，不超过约30微升，不超过约10微升，不超过约5微升，不超过约3微升，不超过约1微升，不超过约500nl，不超过约300nl，不大于约100nl，不超过约50nl，不超过约30nl，不超过约10nl等。任何这些的组合也是可能的，例如，转移的体积可以为300微升至500微升的流体。在一些情况下，转移的微流体液滴的体积可以是上面给出的任何值或范围。
关于用于在微流体系统中操纵液滴的系统和方法的其它细节遵循例如用于测定液滴(或液滴内的物质)、分选液滴、合并或聚集液滴等。液滴可以是微流体液滴，例如含有流体，并且可以被第二流体包围，例如与液滴中包含的流体基本上不混溶。流体可以是液体，例如水性液体。在一些实施方案中，液滴不是凝胶或半固体状态。例如，用于筛选和/或分选液滴的各种系统和方法描述于由Link等人在2006年2月23日提交的题为“ElectronicControl of Fluidic Species”的美国专利申请系列号11/360,845，其在2007年1月4日公开为美国专利申请公开号2007/000342，其通过引用将全部内容并入本文。在一些方面，作为非限制性实例，通过施加(或移除)第一电场(或其一部分)，液滴可被引导到第一区域或通道；通过将第二电场施加(或移除)到装置(或其一部分)，可将液滴引导到第二区域或通道；通过将第三电场施加到装置(或其一部分)，液滴可以被引导到第三区域或通道；等等，其中电场可以以某种方式不同，例如在强度、方向、频率、持续时间等方面不同。
在本发明的某些实施方案中，提供传感器，其可以以允许确定流体液滴的一个或多个特性的方式感测和/或确定流体液滴的一个或多个特性，和/或包含流体液滴的流体系统的一部分(例如，围绕流体液滴的液体)的特性。本领域普通技术人员可以鉴定可相对于液滴确定并且可用于本发明的特性。这种特征的非限制性实例包括荧光、光谱学(例如光学，红外，紫外等)、放射性、质量、体积、密度、温度、粘度、pH、物质诸如生物物质(例如，蛋白质，核酸等)的浓度等等。
在一些情况下，传感器可以连接至处理器，处理器进而导致对流体液滴执行操纵，例如通过对液滴进行分选、从液滴添加或去除电荷、使液滴与另一液滴融合、分割液滴、引起液滴内发生混合等，例如，如前所述的。例如，响应于流体液滴的传感器测量，处理器可以使流体液滴分割、与第二流体液滴合并等。
一个或多个传感器和/或处理器可以被定位成与流体液滴感测连通。如本文所使用的“感测连通”意味着传感器可以定位在任何地方，以使得可以以某种方式感测和/或确定流体系统内(例如，通道内)的流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分。例如，传感器可以与流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分流体地、光学地或视觉地、热地、气动地、电子地等感测连通。传感器可以定位在流体系统附近，例如嵌入在通道的壁内或一体地连接至通道的壁，或者与流体系统分开定位，但是与流体系统进行物理、电和/或光通信，以便能够感测和/或确定流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分(例如，通道或微通道，包含流体液滴的液体等)。例如，传感器可以没有与包含液滴的通道的任何物理连接，但是可以定位成检测从液滴或流体系统产生的电磁辐射，例如红外线、紫外线或可见光。电磁辐射可以由液滴产生，和/或可以从流体系统的其它部分(或者流体系统的外部)产生，并且以例如通过吸收、反射、衍射、折射、荧光、磷光、极性变化、相变、相对于时间的变化等指示流体液滴的一个或多个特性的方式与流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分相互作用。作为示例，激光可以指向流体液滴和/或围绕流体液滴的液体，并且可以确定流体液滴和/或周围的液体的荧光。如本文所使用的“感测连通”还可以是直接或间接的。作为示例，来自流体液滴的光可以被引导到传感器，或者在被引导到传感器之前首先被引导通过光纤系统、波导等。
可用于本发明的传感器的非限制性实例包括基于光学或电磁学的系统。例如，传感器可以是荧光传感器(例如，由激光激发)、显微镜系统(其可以包括相机或其它记录装置)等。作为另一示例，传感器可以是电子传感器，例如能够测定电场或其它电特性的传感器。例如，传感器可以检测流体液滴和/或包含流体液滴的流体系统的一部分的电容、电感等。
如本文所使用的，“处理器”或“微处理器”是能够从一个或多个传感器接收信号、存储信号和/或引导一个或多个响应(例如，如上所述)(例如，通过使用数学公式或电子或计算电路)的任何组件或设备。该信号可以是指示由传感器确定的环境因素的任何合适的信号，例如气动信号，电子信号，光信号，机械信号等。
在一组实施方案中，可以通过在液滴上产生电荷和/或电偶极子，并且使用施加的电场操纵液滴来引导流体液滴，施加的电场可以是AC场、DC场等。作为示例，可以根据需要选择性地施加和移除电场(或者可以施加不同的电场，例如，反向电场)以将流体液滴引导到特定区域。在一些实施方案中，可以根据需要选择性地施加和移除电场，而不实质上改变包含流体液滴的液体的流动。例如，液体可以在基本上稳态的基础上(即，包含流体液滴的液体的平均流速偏离稳态流动或者液体流动相对于时间的预期值的小于20％或小于15％，并且在一些情况下，平均流速可以偏离小于10％或小于5％)或在其它预定的基础上流动通过本发明的流体系统(例如，通过通道或微通道)，并且包含在液体内的流体液滴可以例如使用电场被引导到各个区域，而基本上不改变通过流体系统的液体的流动。
在一些实施方案中，可以通过改变包含液滴的液体的流动在本发明的流体系统内对流体液滴进行筛选或分选。例如，在一组实施方案中，可以通过将围绕流体液滴的液体引导到第一通道、第二通道等中来引导或分选流体液滴
在另一组实施方案中，可以控制流体系统内例如不同通道内或通道的不同部分内的压力，以引导流体液滴的流动。例如，液滴可以被引导朝向包括用于进一步的流动方向(例如，被引导朝向限定任选的下游流动通道的通道中的分支或分叉)的多个选件的通道接合部。可控制一个或多个任选的下游流动通道内的压力以将液滴选择性地引导到通道中的一个中，并且可以在连续的液滴到达接合部所需的时间量级上实现压力变化，以使得可以独立控制每个连续液滴的下游流动路径。在一种布置中，液体储存器的膨胀和/或收缩可以用于将流体液滴引导或分选到通道中，例如通过引起包含流体液滴的液体的定向运动。液体储存器可以定位成使得当被激活时，由激活的储存器引起的液体的运动导致液体沿优选方向流动，从而在该优选方向上携带流体液滴。例如，液体储存器的膨胀可以引起朝向储存器的液体流动，而液体储存器的收缩可以引起液体远离储存器流动。在一些情况下，液体储存器的膨胀和/或收缩可以与其它流动控制装置和方法(例如，如本文所述的)组合。能够引起液体储存器的膨胀和/或收缩的装置的非限制性实例包括活塞和压电部件。在一些情况下，压电部件可能是特别有用的，因为它们具有相对快速的响应时间，例如响应于电信号。在一些实施方案中，流体液滴可以被分选到多于两个通道中。
如上所述，某些实施方案总体上涉及用于分选液体中的流体液滴的系统和方法。例如，可以以某种方式(例如，如本文进一步描述的)感测和/或确定液滴的性质，然后可以将液滴引导朝向装置的特定区域，例如微流体通道，例如，用于分选目的。在一些情况下，使用本发明的某些系统和方法可以实现高分选速度。例如，在一些情况下，可以确定和/或分选至少约10个液滴/秒，并且在其它情况下，可以确定和/或分选至少约20个液滴/秒，至少约30个液滴/秒，至少约100个液滴/秒，至少约200个液滴/秒，至少约300个液滴/秒，至少约500个液滴/秒，至少约750个液滴/秒，至少约1,000个液滴/秒，至少约1,500个液滴/秒，至少约2,000个液滴/秒，至少约3,000个液滴/秒，至少约5,000个液滴/秒，至少约7,500个液滴/秒，至少约10,000个液滴/秒，至少约15,000个液滴/秒，至少约20,000个液滴/秒，至少约30,000个液滴/秒，至少约50,000个液滴/秒，至少约75,000个液滴/秒，至少约100,000个液滴/秒，至少约150,000个液滴/秒，至少约200,000个液滴/秒，至少约300,000个液滴/秒，至少约500,000个液滴/秒，至少约750,000个液滴/秒，至少约1,000,000个液滴/秒，至少约1,500,000个液滴/秒，至少约2,000,000或更多个液滴/秒，或至少约3,000,000或更多个液滴/秒。
在一些方面，可以使用相对小的液滴的群体。在某些实施方案中，作为非限制性实例，液滴的平均直径可以小于约1mm，小于约500微米，小于约300微米，小于约200微米，小于约100微米，小于约75微米，小于约50微米，小于约30微米，小于约25微米，小于约20微米，小于约15微米，小于约10微米，小于约5微米，小于约3微米微米，小于约2微米，小于约1微米，小于约500nm，小于约300nm，小于约100nm或小于约50nm。在某些情况下，液滴的平均直径也可以为至少约30nm，至少约50nm，至少约100nm，至少约300nm，至少约500nm，至少约1微米，至少约2微米，至少约3微米，至少约5微米，至少约10微米，至少约15微米或至少约20微米。液滴群体的“平均直径”是液滴直径的算术平均值。
在一些实施方案中，取决于具体应用，液滴可以具有基本上相同的形状和/或尺寸(即，“单分散”)或具有不同的形状和/或尺寸。在一些情况下，液滴可以具有横截面直径的均匀分布，即液滴可以具有这样的直径分布，以使得不超过约5％，不超过约2％或不超过约1％的液滴具有小于约90％(或小于约95％，或小于约99％)和/或大于约110％(或大于约105％，或大于约101％)的多个液滴的总平均直径的直径。用于产生液滴的横截面直径的均匀分布的一些技术公开于由Link等人于2004年4月9日提交的题为“Formation andControl of Fluidic Species”的国际专利申请号PCT/US2004/010903，其于2004年10月28日公开为WO 2004/091763，其通过引用并入本文。
本领域普通技术人员将能够例如使用激光散射或其它已知技术确定液滴群体的平均直径。如此形成的液滴可以是球形的，或在某些情况下是非球形的。在非球形液滴中的液滴的直径可以被认为是具有与非球形液滴相同的体积的完美数学球体的直径。
在一些实施方案中，可以通过在被液体包围的流体上产生电荷来在通道内产生一个或多个液滴，这可以使流体分离在液体内的个体液滴中。在一些实施方案中，可以向流体施加电场以使液滴形成发生。流体可以作为在液体内的一系列单独的带电和/或电诱导的液滴存在。可以使用任何合适的技术在液体内的流体中产生电荷，例如通过将流体置于电场(可以是AC、DC等)内，和/或通过引起使流体具有电荷的反应发生。
在一些实施方案中，电场从电场发生器(即，能够产生可施加到流体的电场的装置或系统)产生。电场发生器可以产生AC场(即，相对于时间周期性变化的场，例如正弦波、锯齿波、方波等)、DC场(即，相对于时间恒定的场)、脉冲场等。用于产生合适的电场(其可以是AC、DC等)的技术是本领域普通技术人员已知的。例如，在一个实施方案中，通过在一对电极上施加电压来产生电场，所述电极可以位于通道附近，以使得电场的至少一部分与通道相互作用。电极可以由本领域普通技术人员已知的任何合适的电极材料形成，所述材料包括但不限于银、金、铜、碳、铂、铜、钨、锡、镉、镍、铟锡氧化物(“ITO”)等，及其组合。
在另一组实施方案中，可以通过以能够引起流体形成个体液滴的方式改变通道尺寸来从由通道内的液体包围的流体产生流体液滴。通道可以例如是相对于流动方向变宽的通道，例如，以使得流体不粘附到通道壁而是形成个体液滴，或者相对于流动方向变窄的通道，例如，以使得流体被迫聚结成个体液滴。在一些情况下，通道尺寸可以以导致个体液滴的形成发生的方式相对于时间改变(例如，机械地或机电地，气动地等)。例如，通道可以机械地收缩(“挤压”)以引起液滴形成，或者流体流可以被机械地破坏(例如通过使用移动挡板、旋转叶片等)以引起液滴形成。
某些实施方案总体上涉及用于将液滴分割成两个或更多个液滴的系统和方法。例如，可以使用施加的电场来分割液滴。液滴可以具有比周围液体更大的电导率，并且在一些情况下，液滴可以是中性电荷的。在某些实施方案中，在施加的电场中，可以促使电荷从液滴的内部迁移至待分布在其上的表面，从而可以消除液滴内部中经历的电场。在一些实施方案中，液滴表面上的电荷也可能由于所施加的电场而经受力，这导致具有相反极性的电荷在相反的方向上迁移。在一些情况下，电荷迁移可导致液滴被拉开成两个单独的液滴。
本发明的一些实施方案总体上涉及用于将两个或更多个液滴融合或聚结成一个液滴的系统和方法，例如，当两个或更多个液滴例如由于组成、表面张力、液滴尺寸、表面活性剂的存在或不存在等而通常不能融合或聚结时。在某些情况下，相对于液滴尺寸，液滴的表面张力还可以防止发生液滴的融合或聚结。
作为非限制性实例，两个液滴可以被给予相反的电荷(即，正电荷和负电荷，不一定具有相同的量级)，这可以增加两个液滴的电相互作用，以使得液滴的融合或聚结由于它们相反的电荷而发生。例如，电场可以被施加到液滴，液滴可以通过电容器，化学反应可以使液滴变得带电等。在一些情况下，液滴可能不能够融合，即使施加表面活性剂以降低液滴的表面张力。然而，如果液滴以相反的电荷(其可以是但不一定是相同的量级)带电，则液滴可以能够融合或聚结。作为另一个实例，液滴可以不必须被给予相反的电荷(并且在一些情况下，可以不被给予任何电荷)，并且通过使用在液滴中诱导的导致液滴聚结的偶极子而融合。此外，允许聚结的两个或更多个液滴不一定需要满足“迎头相对的”。只要初始发生液滴的至少一些融合，则任何接触角度都是足够的。还参见例如由Ahn等人于2007年1月24日提交的题为“Fluidic Droplet Coalescence”的美国专利申请系列号11/698,298，其于2007年8月23日公开为美国专利申请公开号2007/0195127，通过引用将其全部内容并入本文。
在一组实施方案中，流体可以被注入到液滴中。在一些情况下，可以例如使用微针或其它这样的装置将流体微注射到液滴中。在其它情况下，当液滴与流体通道接触时，可以使用流体通道将流体直接注入到液滴中。流体注射的其它技术公开于例如由Weitz等人于2010年6月25日提交的题为“Fluid Injection”的国际专利申请号PCT/US2010/040006，其于2010年12月29日公开为WO 2010/151776；由Weitz等人于2009年12月18日提交的题为“Particle-Assisted Nucleic Acid Sequencing”的国际专利申请号PCT/US2009/006649，其于2010年7月15日公开为WO 2010/080134，这些专利申请通过引用整体并入本文。
本发明的另一方面通常涉及试剂盒，例如用于在液滴内扩增或克隆。在一些实施方案中，试剂盒可以包含一个或多个被选择的组分，以促进本文所述的一种或多种方法的执行。例如，试剂盒可以包含含有一个或多个组分(如本文讨论的那些)的包装或组件。其它组分也可以包括在试剂盒内，例如包装或保护性材料，配合的设备如烧杯，烧瓶，小瓶，吸移管，微孔板，收集管，说明书等。
在某些实施方案中，试剂盒可以包含多个液滴，例如包含在合适的容器(例如管)中，例如用作不含感兴趣的物质的第二微流体液滴。本文已经描述了诸如第二微流体液滴的液滴，包括其浓度或量。在一些情况下，液滴可以由油和/或表面活性剂(包括本文详细描述的那些)形成。此外，第二微流体液滴可以具有基本上(或精确地)相同的组成或不同的组成，例如如前文所述。液滴也可以包含在合适的水性或亲水性液体中，例如水和包含水的其它水溶液，例如细胞培养基或生物介质，乙醇，盐溶液等。试剂盒可以具有任何合适体积的第二微流体液滴，例如，包含在合适的液体中，例如水性或亲水性液体。例如，试剂盒可以具有至少约1ml，至少约2ml，至少约3ml，至少约5ml，至少约7ml，至少约10ml，至少约20ml，至少约30ml，至少约50ml，至少约100ml等的含有液滴的液体。
在某些实施方案中，试剂盒可以包括合适的疏水性液体和/或表面活性剂。在某些实施方案中，疏水性液体是在水中基本上不混溶(例如在环境温度和压力下)的疏水性液体。在一些情况下，液体被包含在合适的容器(例如管)中。疏水性液体的非限制性实例包括油，例如烃，硅油，氟碳油，有机溶剂等。潜在合适的烃的实例包括但不限于轻质矿物油(Sigma)，煤油(Fluka)，十六烷(Sigma)，癸烷(Sigma)，十一碳烷(Sigma)，十二烷(Sigma)，辛烷(Sigma)，环己烷(Sigma)，己烷(Sigma)等。潜在合适的硅油的非限制性实例包括2cst聚二甲基硅氧烷油(Sigma)。氟碳油的非限制性实例包括FC3283(3M)，FC40(3M)，KrytoxGPL(Dupont)等。表面活性剂的非限制性实例包括在美国专利申请公开号No.2010/0105112(通过引用并入本文)中讨论的那些。表面活性剂的其它非限制性实例包括Span80(Sigma)，Span80/Tween-20(Sigma)，Span80/Triton X-100(Sigma)，Abil EM90(Degussa)，Abilwe09(Degussa)，聚甘油蓖麻醇酯“PGPR90”(Danisco)，吐温-85，749液(Dow Corning)，Krytox 157FSL(Dupont)的羧酸铵盐，Krytox 157FSM(Dupont)的羧酸铵盐或Krytox157FSH(Dupont)的羧酸铵盐。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包括信号传导实体，例如其可以被添加到细胞、液滴等中。信号传导实体在某些情况下可以是荧光的。作为其它非限制性实例，信号传导实体可以是染料诸如荧光染料，放射性原子或化合物等。在某些情况下，信号传导实体也可以是紫外线染料或红外染料。信号传导实体的实例包括但不限于钙黄绿素(或钙黄绿素衍生物，如钙黄绿素AM)，碘化丙啶，7-氨基放线菌素D，核染料，钙黄绿素蓝AM，钙黄绿素紫AM，Fura-2AM，Indo-1AM，刃天青等。许多这样的染料是可商购的。信号传导实体的确定可以使用放射性，荧光，磷光，光散射，光吸收，荧光偏振等技术进行。
在某些实施方案中，试剂盒还可以包括用于计数液滴的细胞计数装置。例如，试剂盒可以包括血细胞计数器或玻璃毛细管。许多这样的计数板是可商购的。
在一些实施方案中，试剂盒可以包括与试剂盒相关提供的任何形式的说明书。例如，说明书可以包括用于使用，修改，混合，稀释，保存，施用，组装，储存，包装和/或制备与试剂盒相关的组分的说明。说明书可以以本领域普通技术人员可识别的任何形式提供作为用于包含这样的说明书的合适的媒介物，例如以任何方式提供的书面或公开的、口头上、可听的(例如电话)、数字、光学、视觉(例如，录像带，DVD等)或电子的通信(包括因特网或基于网络的通信)。
在某些实施方案中，试剂盒可以包括用于制备液滴(例如微流体液滴)的装置。下文参照图3讨论这种液滴制造装置的一个非限制性例子；然而，其它液滴制造装置也是可能的，包括本领域普通技术人员已知的那些。在图3中，该装置包括第一通道，第二通道和多个侧通道，每个侧通道将第一通道与第二通道相连接。这些通道中的一些或全部可以是微流体的。第一流体可以通过第一通道进入，而第二流体通过第二通道进入。第一流体可以流过侧通道进入第二通道。如果第一流体和第二流体至少基本上不混溶，则离开侧通道的第一流体可以在第二通道内形成单独的液滴，如通过液滴所显示的。此外，在某些实施方案中，第一流体本身可以含有乳液。更多细节可见Weitz等人于2014年5月14日提交的题为“RapidProduction of Droplets”的国际专利申请公开号PCT/US2014/037962，其全部内容通过引用并入本文。
在一些情况下，侧通道可以各自具有基本上相同的尺寸，例如，它们可以具有基本相同的体积，横截面面积，长度，形状等。例如，第一通道和第二通道各自可以基本上是直的和平行的，和/或第一和第二通道可以不一定是直的，但是通道可以具有相对恒定的间隔距离，使得一些或全部的侧通道具有基本上相同的形状或其它尺寸，同时将第一通道与第二通道连接。
如上所述，从第一通道流动通过侧通道并进入第二通道的流体可以形成包含在第二流体内的多个第一流体液滴。在一些情况下，液滴可以具有基本上相同的大小或特征尺寸，例如，如果侧通道具有基本相同的横截面面积和/或长度和/或其它尺寸。以这种方式，根据本发明的某些实施方案，可以形成多个基本上单分散的液滴。
然而，虽然图3中所示的侧通道被示出为直的，具有恒定的横截面面积，但这仅作为示例，并且在其它实施方案中，侧通道不必是直的，和/或侧通道可能不一定具有恒定的横截面面积。例如，侧通道可以在通道内的不同位置处具有不同的横截面面积。此外，在某些实施方案中，可能存在与这些通道相关联的其它通道。此外，尽管侧通道被示出为在图3中规则地周期性间隔开，但这不是必需的，并且在其它情况下，侧通道的其它间隔也是可能的。例如，在一组实施方案中，相邻通道之间的间隔可以基本上相同，和/或侧通道的横截面尺寸或面积可以基本上是相同的大小以产生具有基本相同尺寸或平均直径的液滴。
在一组实施方案中，侧通道的最小横截面面积基本上小于第一或第二通道的横截面面积。例如，第一通道可以具有为侧通道的最小横截面面积的至少10倍的横截面面积。在一些情况下，第一通道的高度和侧通道的高度可以是不同的，例如，以产生横截面面积的这种差异。不希望受任何理论束缚，据信，由于侧通道的横截面面积基本上小于第一或第二通道的横截面面积，因此流体流动阻力主要由侧通道的尺寸，而不是第一或第二通道的尺寸来决定。因此，如果侧通道具有基本上相同的尺寸，则侧通道应当各自产生基本上相同的流体流动阻力，并因此产生基本上相同的液滴。因此，至少根据本发明的一些实施方案，通过将因素诸如跨侧通道的总体压降控制为几乎恒定，可以产生多个基本上单分散的液滴。
还应当理解，第一通道和第二通道可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，可以使用相对较长的通道，例如，使得可以在第一和第二通道之间存在相对大量的侧通道，其可以用于产生相对大量的液滴和/或以相对大的速率产生液滴。例如，在第一通道和第二通道之间可能存在至少100个、500个、1000个等的侧通道。此外，在某些实施方案中，第一和/或第二通道可以具有至少1mm，至少5mm，至少1cm，至少2cm，至少3cm等的长度。
根据本发明的某些方面，多种材料和方法可用于形成某些制品或组件(诸如本文所述的那些)，例如通道诸如微流体通道、腔室、微流体装置(例如，用于产生液滴，操纵液滴，引起液滴内的扩增等)等。例如，各种制品或组件可以由固体材料形成，其中通道可以通过微加工、膜沉积工艺如旋涂和化学气相沉积、激光制造、光刻技术、蚀刻法包括湿化学或等离子体工艺等形成。参见，例如，Scientific American,248:44-55,1983(Angell等人)。
在一组实施方案中，本文所述制品的各种结构或组件可由聚合物形成，所述聚合物为例如弹性体聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)，聚四氟乙烯(“PTFE”或)等。例如，根据一个实施方案，可以通过使用PDMS或其它软光刻技术单独制造流体系统来实现微流体通道(适合于此实施方案的软光刻技术的细节在Younan Xia和GeorgeM.Whitesides的题为“Soft Lithography”，公开于Annual Review of Material Science，1998，第28卷，第153-184页以及George M.Whitesides，Emanuele Ostuni，ShuichiTakayama，Xingyu Jiang和Donald E.Ingber的题为“Soft Lithography in Biology andBiochemistry”，公开于Annual Review of Biomedical Engineering，2001，第3卷，第335-373页的参考文献中讨论；这些参考文献中的每一个通过引用并入本文)。
潜在合适的聚合物的其它实例包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯，环烯烃共聚物(COC)，聚四氟乙烯，氟化聚合物，硅酮诸如聚二甲基硅氧烷，聚偏二氯乙烯，双苯并环丁烯(“BCB”)，聚酰亚胺，聚酰亚胺的氟化衍生物等。也设想了包括聚合物(包括上述的那些)的组合、共聚物或掺合物。装置还可以由复合材料(例如，聚合物和半导体材料的复合材料)形成。
在一些实施方案中，制品的各种结构或部件由聚合和/或柔性和/或弹性体材料制成，并且可以方便地由可硬化流体形成，从而便于经由模制(例如复制成型、注射成型、铸塑成型等等)制造。可硬化流体可以基本上是可以被诱导固化或自发固化成能够容纳和/或输送预期用于流体网络和与流体网络一起使用的流体的固体的任何流体。在一个实施方案中，可硬化流体包括聚合物液体或液体聚合物前体(即“预聚物”)。合适的聚合物液体可包括例如热塑性聚合物、热固性聚合物、蜡、金属或其在高于其熔点的温度下加热的混合物或复合物。作为另一个实例，合适的聚合物液体可以包括一种或多种聚合物在合适溶剂中的溶液，该溶液在除去溶剂(例如通过蒸发)后形成固体聚合物材料。可以例如从熔融状态固化或通过溶剂蒸发固化的这种聚合物材料是本领域普通技术人员公知的。对于其中一个或两个母模模具由弹性体材料组成的实施方案，各种聚合物材料(其中许多是弹性体的)是合适的，并且也适用于形成模具或母模模具。这种聚合物的实例的非限制性列表包括一般类别的硅酮聚合物、环氧聚合物和丙烯酸酯聚合物的聚合物。环氧聚合物的特征在于存在通常被称为环氧基团、1、2-环氧化物或环氧乙烷的三元环醚基团。例如，除了基于芳族胺、三嗪和脂环族主链的化合物之外，还可以使用双酚A的二缩水甘油醚。另一个实例包括公知的酚醛清漆聚合物。适用于根据本发明使用的硅酮弹性体的非限制性实例包括由包括氯硅烷如甲基氯硅烷、乙基氯硅烷、苯基氯硅烷、十二烷基三氯硅烷等的前体形成的那些。
在某些实施方案中使用硅酮聚合物，例如，硅酮弹性体聚二甲基硅氧烷。PDMS聚合物的非限制性实例包括由Dow Chemical Co.,Midland,MI以商品名Sylgard销售的那些，特别是Sylgard 182，Sylgard 184和Sylgard 186。包括PDMS的硅酮聚合物具有几种使本发明的各种结构的制造简化的有益性质。例如，这种材料便宜、容易获得，并且可以通过用热硬化而从预聚物液体固化。例如，PDMS通常通过将预聚物液体暴露于约例如约65℃至约75℃的温度进行例如约1小时的暴露时间而硬化。此外，硅酮聚合物例如PDMS可以是弹性体的，因此可用于形成具有相对高的纵横比的非常小的特征，这在本发明的某些实施方案中是必需的。在这方面，柔性(例如，弹性体)模具或母模可以是有利的。
由硅酮聚合物(例如PDMS)形成结构诸如微流体结构或通道的一个优点是这些聚合物被氧化的能力，例如通过暴露于含氧等离子体如空气等离子体，以使得氧化结构在其表面含有能够与其它氧化的硅酮聚合物表面或与各种其它聚合和非聚合材料的氧化表面交联的化学基团。因此，可以制造结构，然后氧化并且基本上不可逆地密封至其它硅酮聚合物表面，或者密封至与氧化的硅酮聚合物表面反应的其它基底的表面，而不需要单独的粘合剂或其它密包封置。在大多数情况下，可以简单地通过使氧化的硅酮表面与另一表面接触来完成密封，而不需要施加辅助压力以形成密封。也就是说，预氧化的硅酮表面用作针对合适的配合表面的接触粘合剂。具体地，除了不可逆地密封自身之外，氧化的硅酮例如氧化的PDMS还可以不可逆地密封至除了自身之外的一系列氧化材料，包括例如玻璃、硅、氧化硅、石英、氮化硅、聚乙烯、聚苯乙烯、玻璃碳和环氧聚合物，它们以与PDMS表面类似的方式氧化(例如，通过暴露于含氧等离子体)。在本发明的上下文中有用的氧化和密封方法以及整体模制技术描述于本领域中，例如描述于题为“Rapid Prototyping of MicrofluidicSystems and Polydimethylsiloxane”Anal.Chem.,70:474-480,1998(Duffy等人)的文章中，其通过引用并入本文。
因此，在某些实施方案中，制品的设计和/或制造可以相对简单，例如通过使用相对公知的软光刻和其它技术诸如本文所述的那些。另外，在一些实施方案中，制品的快速和/或定制设计(例如，在几何形状方面)是可能的。在一组实施方案中，制品可以被制成是一次性的，例如在制品与放射性、毒性、有毒、反应性、生物危害性等的物质一起使用的实施方案中，和/或当物质的性质(例如，毒理学性质、放射性性质等)是未知的时。从氧化的硅酮聚合物形成通道或其它结构(或内部、流体接触表面)的另一个优点是这些表面比典型的弹性体聚合物的表面亲水得多(当需要亲水的内表面时)。因此，与由典型的未氧化的弹性体聚合物或其它疏水性材料构成的结构相比，这种亲水性通道表面可以更容易地用水溶液填充和润湿。
为了所有目的，以下文献通过引用整体并入本文：Link等人的题为“Formationand Control of Fluidic Species”的国际专利申请公开号WO 2004/091763；Stone等人的题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion”的国际专利申请公开号WO 2004/002627；Weitz等人的题为“Method and Apparatus for Forming Multiple Emulsions”的国际专利申请公开号WO 2006/096571；Link等人的题为“Electronic Control of FluidicSpecies”的国际专利申请公开号WO 2005/021151；Weitz等人的题为“Droplet CreationTechniques”的国际专利申请公开号WO 2011/056546；Weitz等人的题为“Creation ofLibraries of Droplets and Related Species”的国际专利申请公开号WO 2010/033200；Weitz等人的题为“Fluid Injection”的美国专利申请公开号2012-0132288；Agresti等人的题为“Assay And Other Reactions Involving Droplets”国际专利申请公开号WO2008/109176；Weitz等人的题为“Fluid Injection”的国际专利申请公开号WO 2010/151776；Bernstein等人的题为“Systems and Methods for Droplet Tagging”的美国专利申请系列号61/981,123；Weitz等人的题为“Methods and Systems for Droplet Taggingand Amplification”的美国专利申请系列号61/981,108；Weitz等人于2014年5月14日提交的题为“Rapid Production of Droplets”的国际专利申请公开号PCT/US2014/037962。还通过引用整体并入本文的是Weitz等人于2015年1月23日提交的题为“Systems，Methods，and Kits for Amplifying or Cloning Within Droplets”的美国临时专利申请系列号62/106,981。
以下实施例旨在举例说明本发明的某些实施方案，但不代表本发明的全部范围。
实施例1
分子克隆为科学家提供了从原始资源衍生的基本上无限量的个体DNA片段。然而，由于其繁琐的程序，低通量，以及从稀有模板中扩增待克隆的DNA的挑战，克隆是许多相关生物学研究的速率确定步骤(RDS)。本实施例使用基于液滴的微流体数字PCR来扩增个体微微反应器(pico-reactor)中的单个靶分子，其模拟来自一个成功转染的感受态细胞的集落形成和扩增过程。在分离每个阳性液滴之后，内部的许多扩增子允许有效的再扩增以获得用于表征的足够材料，例如通过Sanger测序。与常规的4天连续实验台工作相比，扩增可以在大大减少的时间(例如约7小时)内发生，并且显著提高的通量允许在单个实验中筛选例如300,000个反应。本实施例显示了一种灵敏，简单和经济高效的高通量分子克隆方法。
分子克隆是分子生物学中一组用于组装DNA分子并引导其在宿主生物体内的扩增的实验方法，其可用于广泛的目的，例如变体检测，基因组组织和基因表达。在标准分子克隆实验中，DNA片段的克隆通常涉及以下步骤：(1)宿主生物和克隆载体的选择；(2)载体DNA的制备；(3)待克隆的DNA的制备；(4)克隆载体和靶DNA的连接；(5)引入宿主生物；(6)通过PCR、限制性片段分析和DNA测序筛选具有所需DNA插入片段和生物学特性的克隆。整个过程是耗时，劳动密集和低通量的。此外，当目标生物学事件非常罕见时，要克隆的扩增子的获取是非常具有挑战性的。更重要的是，DNA的制备(通常为PCR)几乎总是引入偏倚和误差，不能忠实地代表原始生物样品中的基因组信息。因此，快速克隆和可靠地表征单个分子的能力将显著简化和加速分子克隆。
不是通过采取额外的步骤降低噪声来增加信噪比，克服初始扩增中该低样品数限制的替代方法是通过使用数字PCR(dPCR)，其中单个模板被分隔成微微升体积，从而减少包含靶模板的隔室中的非特异性模板的数量，并降低非特异性扩增的可能性。含有50个HIV颗粒和107个白细胞的1mL血液样品将具有1:106的批量信噪比。分隔成1nL液滴后，一些液滴以相当于每毫升2x105个细胞的浓度含有1个病毒，和以每毫升107个细胞的浓度含有10个白细胞。这些液滴的信噪比将为1:10，因此可以容易地与不含病毒且因此信噪比远更低的大多数液滴区分开来。此外，增加信号的有效浓度还将提高信号与PCR抑制剂的比例。因此，液滴对阻塞批量PCT的抑制剂浓度较不敏感。这对于例如通常具有高浓度PCR抑制剂的血液、尿和粪便尤为重要。
本实施例提出了一种基于液滴的微流体数字RT-PCR方案，其用于扩增和表征驱动病毒进化的单个重组RNA病毒。RNA病毒是地球上最快速进化的生物体之一，这使它们能够逃避免疫系统，抵御治疗或在宿主间切换。两个其它密切相关的但不同的病毒之间的重组是病毒进化过程之一。虽然罕见，但通常是出现新的和更毒的菌株的原因，同时病毒基因中的突变由于随着时间逐渐积累而慢慢地改变病毒。在重组时，每种罕见病毒都含有关于新出现疾病的独特而有价值的信息。为了尽早鉴定和分离这些重组体，通常有必要在许多其它RNA基因组的背景下选择性扩增稀有的RNA基因组。此外，由于每个突变体携带独特的信息，所以它必须单独排序。本实施例中使用的方案使用基于液滴的微流体数字RT-PCR来增强dPCR以使其适用于单个重组RNA分子，和恢复在鉴定病毒性疾病中的罕见变体方面将具有巨大的价值的产物。该系统还可以与市售的Taqman探针以及与DNA结合染料如EvaGreen结合的实验设计的引物一起使用。
本实施例使用基于液滴的微流体数字PCR用于单病毒基因组扩增，允许在单个实验中研究例如300,000个反应。虽然下面描述的实施例是关于特定病毒储备物的，但该方案也可以应用于任何种类的DNA或RNA片段，例如在研究与耐药性和癌症异质性有关的基因突变的背景下。使用本文所述的方案进行分子克隆允许敏感，简单，成本效益和高通量的分子克隆。这对其它应用也是非常有价值的，例如研究稀有细胞、特别是癌症中生物功能的调节。
本实施例涉及将单个DNA和/或RNA分子划分到单独的液滴中，它们的扩增，定量和/或测序。本实施例显示了回收液滴中扩增的DNA/RNA分子并分别对其进行测序的程序。这可以通过一组组件(试剂盒)描述以执行“液滴中的克隆”。本实施例包括以下主要步骤：
i)模板包封到液滴中；
ii)液滴中无载体基因扩增(用于模板的克隆复制)；
iii)用血细胞计数器，载玻片或其它技术进行液滴定量；
iv)通过用空液滴稀释将单个PCR阳性液滴分配到个体孔或容器中；空液滴可以携带第二轮扩增所需的PCR试剂，引物，酶和其它生物化学品；和
v)第二轮扩增以获得用于测序的材料，例如Sanger测序。
这些步骤可以在例如几个小时内完成，而基于常规细菌细胞的克隆和测序通常需要超过两天才能完成。因此，这个实施例是非常快的，这允许例如在单分子水平分析大量目标模板。通过在将液滴分配到个体孔中后在液滴中进行模板预扩增，本实施例提供了使用例如96-、384-或1536-微孔板来改进样品中单个DNA/RNA分子的检测的新方法。在没有包封和预扩增步骤(i-ii)的情况下，样品中DNA/RNA模板的定量可能受到PCR偏倚、较大体积的差扩增效率或可能的污染(单个孔中存在多个模板)的阻碍。
在某些情况下，本实施例允许从混合群体中分离单个模板，其允许来自样品的单核酸模板以及单细胞分离。这允许例如原始样品中单个模板分子的无偏倚扩增和准确定量；将合并的遗传物质与含有难以解离的细胞的样品如肿瘤、嵌入样品和脑组织分离；增加模板的相对浓度和稀有分子的检测；提高灵敏度和降低模板检测阈值；以及避免嵌合体和断续扩增子的干扰。其它优点包括单基因组扩增和与耐药性或癌症异质性有关的基因突变的研究。
特别地，在生物学事件非常罕见的情况下，需要在过量背景下克隆的靶DNA片段的获得是非常具有挑战性的，因为分子克隆之前通常用于扩增特异性DNA或RNA(RT-PCR)序列的聚合酶链反应(PCR)方法并不总是起作用。对于标准体积和制备方法，目标模板从每毫升106个分子的初始浓度扩增。这种相当高的模板浓度是必需的，因为PCR可以扩增与靶序列不匹配的非特异性DNA，特别是在次优条件下。特定模板或信号的浓度必须足够高以克服这种噪音。然而，经历低水平复制的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的诸如血液的临床样品可以携带每毫升浓度<50拷贝的人体免疫缺陷病毒(HIV)颗粒，相对于每毫升107个白细胞的背景。即使白细胞被去除，反应也容易被气溶胶，灰尘和其它偶发噪音源污染。因此，需要仔细和专门的样品制备以消除外来DNA并使噪音最小化。
实施例2
高通量筛选(HTS)是药物发现的一种方法。通过使用机器人，数据处理和控制软件，液体处理装置和敏感检测器，研究人员可以进行大规模的药理学检测，或者识别调节特定生物分子途径的活性化合物，抗体或基因。HTS的关键实验室器皿是微量滴定板，其可以具有例如384、1536或3456个孔，并且当前的机器人通常每天可以测试多达100,000种化合物。然而，这种技术正在接近其物理极限；低于1微升体积的1536孔板，蒸发和毛细管力变得显著。基于微孔的微流体技术的发展显著改善了筛选能力，将速度提高了10倍，反应体积减少了1000倍。油包水液滴的使用除去微量滴定板中使用的固体孔；这可以在可接受的时间和成本范围内简化工程改造和/或扩大药物筛选的能力。在本实施例中证明了这一点，其中液滴被多功能化以显示具有高水平组合的药物筛选，例如以测试其对细胞的协同作用。
为了构建大量的药物组合，首先在96平行微流体液滴制造器中单独产生三组相对单分散的微微升液滴。每个组包括96种具有不同药物和不同浓度的液滴，以及溶液中独特的预混合寡核苷酸索引(在此使用96作为举例说明性实例，尽管在其它实施方案中可以使用其它数量的液滴)。然后使用微流体液滴合并器以不同药物和不同浓度的随机组合将这三组液滴合并。通过以已知获得速率λ(lambda)＝0.1的泊松分布的浓度，将细胞悬浮液微微注射到合并的液体中而将单个K562慢性骨髓性白血病细胞引入药物组合中，并在37℃下孵育24小时。参见例如美国专利申请公开号No.220/0132288，标题为“Fluid Injection”，其全部内容通过引用并入本文。
通过添加荧光底物，caspalux6-J1D2，其在细胞凋亡期间被增加的半胱天冬酶3和半胱天蛋白酶3样活性特异性切割，可以测定液滴中细胞的凋亡。在该凋亡测定溶液中，其包括PCR混合物，以通过PCR扩增将寡核苷酸索引与全长双链DNA条形码连接。在37℃下孵育半小时后，根据荧光强度对含有暗示有效药物组合的凋亡细胞的液滴进行分选，随后进行PCR扩增和下一代测序(NGS)，以解码每个分选液滴中的双链DNA条形码，其用于揭示最佳药物组合。这种大规模药物联合筛选系统的方案如图4所示，显示了基于滴液的微流体中的大规模药物联合筛选。
创建代表三种寡核苷酸/三种药物及其不同浓度的双链DNA“条形码”的策略如图4插图所示。为了形成该DNA条形码，使用三个寡核苷酸索引族，左侧寡核苷酸(A)，中心寡核苷酸(B)和右侧寡核苷酸(C)。左侧(A)和中心(B)部分重叠，中心(B)和右侧(C)部分重叠。这些重叠允许三种寡核苷酸当它们存在于一个液滴中时彼此退火，如下所述。定义药物的独特条形码在左侧、中心和右侧寡核苷酸的非重叠部分中编码。经过两轮PCR，这三种寡核苷酸导致双链“ABC”DNA“条形码”。为了使DNA条形码通过NGS进行测序，共同的测序引物P5和P7被整合到左侧(A)寡核苷酸的5'端和右侧(C)寡核苷酸的3'末端。退火和PCR在个体液滴中进行，例如，以确保该3种条形码连接在一起，以允许随后的序列分析基于“条形码”内的寡核苷酸显示哪3种药物被组合。已经开发了用于从NGS读数解码DNA条形码的生物信息学渠道。
图5中显示了四个A，四个B和四个C寡核苷酸的组合的批量均匀退火和扩增，总共64个条形码组合；该属性允许通过计数独特的条形码读数来定量分析已经诱导了多少细胞经历凋亡。此外，这种基于液滴的平台执行定量凋亡检测的另一个优点是与批量测定(其中几个染色和洗涤步骤降低了凋亡检测的准确性)相比，凋亡细胞的损失最小化。
图5显示通过深度测序解码的64个条形码组合的批量均匀扩增，代表三种寡核苷酸/三种药物及其不同浓度组合。应当注意，每个“条形码”以基本相同的量被扩增，即扩增为“均匀的”，例如，而不是以牺牲其它条形码为代价的偏好一种或两种条形码。
鉴于每组液滴最多含有96种具有不同药物及其不同浓度的液滴，并且总共有3组液滴，可获得近1百万种药物组合(96×96×96)。为了在多个细胞系方面进一步扩大筛选而不增加深度测序运行，在另一组实验中，将两个寡核苷酸索引D和E添加到含有PCR混合液的溶液中。双链DNA条形码的形成具有与上述类似的机制。简单地说，新添加的寡核苷酸索引D和E整合P5和P7序列，并且分别与寡核苷酸A和C部分重叠。如图6所示，在PCR的三个循环中(而不是PCR的两个循环中)构建最终条形码DNA，显示了产生双链DNA条形码的策略，其组合标记药物的三种寡核苷酸和标记细胞系的另外两种条形码。在批量和基于液滴的扩增中均显示了具有用于标记细胞系的另外两种条形码的64个条形码组合的均匀扩增(图7)。该策略允许在本实施例中以高通量、成本和时间有效的方式筛选药物组合和细胞系。
图7显示具有标记样品的另外2种条形码的64个条形码组合的均匀扩增通过深度测序显示。图7A示出了批量扩增，而图7B示出了基于液滴的扩增。
虽然本文已经描述和示出了本发明的若干实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优势的各种其它工具和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和构造意在是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明的教导的具体应用。本领域技术人员将通过使用不超过常规实验而认识到或者能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅以举例的方式给出，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和请求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本发明的范围。
本文定义和使用的所有定义应理解为优先于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义。
除非清楚地相反指示，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应当被理解为是指“至少一个/一种”。
如在本文中在说明书和权利要求中所用，短语“和/或”应当被理解为意指所连接的元素的“任一个或两者”，即元素在一些情况下结合地存在以及在其它情况下分离地存在。利用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式来解释，即所连接的元素的“一个或多个”。除通过“和/或”从句明确确定的元素外，还可任选地存在其它元素，无论与明确确定的那些元素相关还是无关。因此，作为非限定性实例，对“A和/或B”的提及，当与开放性措辞诸如“包含/包括”结合使用时，在一个实施方案中可仅指A(任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中可仅指B(任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中，可指A和B(任选地包括其它元素)；依此类推。
如本文中在说明书和权利要求中所用，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分开各项时，“或”或“和/或”应当被理解为是包含性的，即包含至少一个，但也包括许多个元素或一列元素中的多于一个，以及任选地，包括另外未列出的项。只有明确地指明相反的术语，例如“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”或当用于权利要求中时的“由……组成”将指包含多个元素或一列元素中的正好一个元素。一般地，如本文中所用的术语“或”应当仅在冠有排他性的术语诸如“任一”、“……之一”、“……中的仅一个”或“……中的恰好一个”时被解释为表示排他性选择(即“一个或另一个但非两个”)。“基本上由……组成”，当用于权利要求中时，应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文中在说明书和权利要求中所用，关于一列一个或多个元素的短语“至少一个”应当被理解为意指选自一列元素中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表内明确列出的每一个元素的至少一个并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许可任选地存在除短语“至少一个”所指的元素列表内明确确定的元素外的元素，无论与那些明确确定的元素相关还是不相关。因此，作为非限定性实例，“A和B的至少一个”(或，等同地，“A或B的至少一个”或，等同地“A和/或B的至少一个”)可在一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)A而无B存在(且任选地包括除B外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)B而无A存在(且任选地包括除A外的元素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括不止一个)A和至少一个(任选地包括不止一个)B(且任选地包括其它元素)；依此类推。
还应当理解，除非明确地指明与之相反，否则在包括不止一个步骤或行为的本文请求保护的任何方法中，所述方法的步骤或行为的顺序不必须地限定于其中叙述所述方法的步骤或行为的顺序。
在权利要求中，以及在上述说明书中，所有过渡短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“拥有”、“牵涉”、“持有”、“由……组成”等被理解为开放性的，即意指包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别是封闭性的或半封闭性的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所示的。

Claims (108)

1.一种方法，其包括：
破碎核酸以产生核酸片段；
将至少一些核酸片段包含在多个微流体液滴中；和
扩增包含在微流体液滴内的至少一些核酸片段。
2.权利要求1的方法，其包括使用PCR扩增至少一些包含在微流体液滴内的核酸片段。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中扩增至少一些核酸片段包括将聚合酶添加到至少一些微流体液滴中。
4.权利要求3的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
5.权利要求3的方法，其中所述聚合酶是RNA聚合酶。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中扩增至少一些核酸片段包括将Taq聚合酶添加到至少一些微流体液滴中。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中至少一些微流体液滴中包含Taq聚合酶。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其包括将至少一些微流体液滴暴露于至少约50℃的温度。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其包括将至少一些微流体液滴暴露于至少约90℃的温度。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中扩增至少一些核酸片段包括将脱氧核糖核苷酸添加到至少一些微流体液滴中。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中至少一些微流体液滴包含脱氧核糖核苷酸。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述核酸是DNA。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述核酸包括基因组DNA。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述核酸包括细菌DNA。
15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述核酸包括病毒DNA。
16.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述核酸包括RNA。
17.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述核酸包括病毒RNA。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述核酸包括从细胞产生的核酸。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞是人细胞。
20.权利要求18或19中任一项的方法，其中所述细胞是癌细胞。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述核酸包括由多于一个细胞产生的核酸。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述核酸包括由多于一种生物体产生的核酸。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述核酸包括由多于一个物种产生的核酸。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述多个微流体液滴具有小于约1mm的平均直径。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述多个微流体液滴具有的直径分布使得不超过约5％的微流体液滴具有小于微流体液滴总平均直径的约90％或大于微流体液滴总平均直径的约110％的直径。
26.权利要求1-25中任一项的方法，还包括将所述多个微流体液滴与第二多个微流体液滴混合。
27.权利要求1-26中任一项的方法，还包括将所述微流体液滴与不含所述核酸片段的第二微流体液滴混合以产生微流体液滴的混合物。
28.权利要求27的方法，其包括以至少1:1,000的比例将所述微流体液滴与所述第二微流体液滴混合。
29.权利要求1-28中任一项的方法，还包括将至少一些微流体液滴转移到容器中。
30.权利要求29的方法，还包括扩增转移到容器中的微流体液滴内的核酸。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其包括将至少一些微流体液滴吸移至容器中。
32.权利要求1-31中任一项的方法，还包括破裂至少一些微流体液滴。
33.权利要求1-32中任一项的方法，还包括对所述核酸片段进行测序。
34.权利要求1-33中任一项的方法，还包括将核酸条形码附接至所述多个微流体液滴中包含的至少一些核酸片段。
35.权利要求1-31中任一项的方法，还包括破坏所述多个微流体液滴并将扩增的核酸收集在共同的溶液中。
36.权利要求35的方法，还包括将共同溶液中的所述扩增的核酸包含在第三多个微流体液滴中。
37.权利要求36的方法，还包括扩增第二多个微流体液滴内的至少一些扩增的核酸。
38.权利要求36或37中任一项的方法，还包括将核酸条形码附接至所述第二多个微流体液滴中包含的至少一些扩增的核酸。
39.一种方法，其包括：
将核酸包含在多个微流体液滴中；和
均匀地扩增微流体液滴中包含的至少一些核酸。
40.一种方法，其包括：
均匀地扩增微流体液滴中包含的多个核酸。
41.一种方法，其包括：
将包含感兴趣的物质的第一微流体液滴与不含感兴趣的物质的第二微流体液滴混合以产生微流体液滴的混合物；和
将至少10nl的微流体液滴的混合物转移到容器中。
42.权利要求41的方法，其包括将平均仅一个第一微流体液滴转移到容器中。
43.权利要求41或42中任一项的方法，其中第一微流体液滴与第二微流体液滴的比例为至少约1:1,000。
44.权利要求41-43中任一项的方法，其中第一微流体液滴与第二微流体液滴的比例为至少约1:10,000。
45.权利要求41-44中任一项的方法，其中第一微流体液滴与第二微流体液滴的比例为至少约1:100,000。
46.权利要求41-45中任一项的方法，其中所述第一微流体液滴的平均直径不超过约1微米。
47.权利要求41-46中任一项的方法，其中所述第二微流体液滴的平均直径不超过约1微米。
48.权利要求41-47中任一项的方法，其中所述第一微流体液滴各自具有第一微流体液滴的平均直径的约90％和约110％之间的平均直径。
49.权利要求41-48中任一项的方法，其中所述第二微流体液滴各自具有第二微流体液滴的平均直径的约90％和约110％之间的平均直径。
50.权利要求41-49中任一项的方法，其中所述第二微流体液滴具有基本上相同的组成。
51.权利要求41-50中任一项的方法，其中所述感兴趣的物质是核酸。
52.权利要求41-51中任一项的方法，其中所述感兴趣的物质是DNA。
53.权利要求41-52中任一项的方法，其中所述感兴趣的物质是基因组DNA。
54.权利要求41-53中任一项的方法，其中所述容器是微孔板的孔。
55.权利要求54的方法，其中所述微孔板是96孔微孔板。
56.权利要求41-55中任一项的方法，其包括将至少约100nl的微流体液滴的混合物转移到容器中。
57.权利要求41-56中任一项的方法，其包括将至少约1微升的微流体液滴的混合物转移到容器中。
58.权利要求41-57中任一项的方法，其中转移包括吸移。
59.权利要求58的方法，其包括将微流体液滴的混合物自动吸移到容器中。
60.权利要求58的方法，其包括将微流体液滴的混合物手动吸移到容器中。
61.权利要求41-60中任一项的方法，其中所述微流体液滴的混合物具有至少约1微升的微流体液滴的总体积。
62.权利要求41-61中任一项的方法，其中所述微流体液滴的混合物具有至少约10微升的微流体液滴的总体积。
63.权利要求41-62中任一项的方法，其中所述微流体液滴的混合物具有至少约100微升的微流体液滴的总体积。
64.权利要求41-63中任一项的方法，其中所述微流体液滴的混合物具有至少约1ml的微流体液滴的总体积。
65.权利要求41-64中任一项的方法，其中所述第二微流体液滴具有小于约1mm的平均直径。
66.一种方法，其包括：
将含有感兴趣的物质的第一微流体液滴与不含感兴趣的物质的第二微流体液滴混合以产生包含微流体液滴的混合流体，以产生微流体液滴的混合物；和
平均地，将多个第二微流体液滴和不超过约1.5个第一微流体液滴转移到容器中。
67.一种试剂盒，其包含：
被配置成产生微流体液滴的液滴制造装置；
被配置成操纵所述微流体液滴的微流体装置；和
包含具有基本上相同组成的多个微流体液滴的容器。
68.权利要求67的试剂盒，还包含含有基本上不混溶于水的流体的第二容器。
69.权利要求67或68中任一项的试剂盒，还包含荧光染料。
70.权利要求67-69中任一项的试剂盒，还包含细胞计数装置。
71.权利要求67-70中任一项的试剂盒，其中所述液滴制造装置包含第一微流体通道，第二微流体通道，以及各自将所述第一微流体通道与所述第二微流体通道连接的至少五个侧面微流体通道，其中所述第一微流体通道的横截面面积至少是所述至少五个侧通道的最小横截面面积的20倍。
72.权利要求67-71中任一项的试剂盒，其中所述液滴制造装置包含长度为至少约5mm的第一微流体通道，基本上平行于所述第一微流体通道的第二微流体通道，以及各自将所述第一微流体通道与所述第二微流体通道连接的至少五个侧面微流体通道。
73.权利要求67-72中任一项的试剂盒，其中所述液滴制造装置包含长度为至少约5mm的第一微流体通道，第二微流体通道，各自将所述第一微流体通道与所述第二微流体通道连接的至少五个侧面微流体通道，第三微流体通道，以及各自将所述第二微流体通道与所述第三微流体通道连接的至少五个侧面微流体通道。
74.权利要求67-73中任一项的试剂盒，其中所述液滴制造装置包含第一微流体通道，第二微流体通道，各自将所述第一微流体通道与所述第二微流体通道连接的至少五个侧面微流体通道，以及连接至所述至少五个侧面微流体通道中的每一个的多个辅助微流体通道。
75.权利要求67-74中任一项的试剂盒，其中所述微流体装置被配置为将微流体液滴与含有核酸的流体融合。
76.一种方法，其包括：
将多个核酸包含在第一多个微流体液滴中；
扩增所述第一多个微流体液滴内的至少一些核酸；
将扩增的核酸组合在共同的溶液中；
将扩增的核酸包含在第二多个微流体液滴中；和
扩增所述第二多个微流体液滴内的至少一些扩增的核酸。
77.权利要求76的方法，其包括使用PCR扩增所述第一多个微流体液滴内的至少一些核酸。
78.权利要求77的方法，其中扩增所述第一多个微流体液滴内的至少一些核酸包括将聚合酶添加到至少一些第一多个微流体液滴中。
79.权利要求78的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
80.权利要求78的方法，其中所述聚合酶是RNA聚合酶。
81.权利要求76-80中任一项的方法，其中扩增所述第一多个微流体液滴内的至少一些核酸包括将Taq聚合酶添加到至少一些第一多个微流体液滴中。
82.权利要求76-81中任一项的方法，其中至少一些第一多个微流体液滴包含Taq聚合酶。
83.权利要求76-82中任一项的方法，其包括将至少一些第一多个微流体液滴暴露于至少约50℃的温度。
84.权利要求76-83中任一项的方法，其包括将至少一些第一多个微流体液滴暴露于至少约90℃的温度。
85.权利要求76-84中任一项的方法，其中扩增所述第一多个微流体液滴内的至少一些核酸包括将脱氧核糖核苷酸添加到至少一些第一多个微流体液滴中。
86.权利要求76-85中任一项的方法，其中至少一些第一多个微流体液滴包含脱氧核糖核苷酸。
87.权利要求76-86中任一项的方法，还包括破碎核酸以产生多个核酸。
88.权利要求76-87中任一项的方法，其中所述多个核酸包括DNA。
89.权利要求76-88中任一项的方法，其中所述多个核酸包括RNA。
90.权利要求76-89中任一项的方法，其中所述多个核酸包括基因组DNA。
91.权利要求76-90中任一项的方法，其中所述多个核酸包括细菌DNA。
92.权利要求76-91中任一项的方法，其中所述多个核酸包括病毒DNA。
93.权利要求76-92中任一项的方法，其中所述多个核酸包括病毒DNA。
94.权利要求76-93中任一项的方法，其中所述多个核酸包括从细胞产生的核酸。
95.权利要求94的方法，其中所述细胞是人细胞。
96.权利要求94或95中任一项的方法，其中所述细胞是癌细胞。
97.权利要求76-96中任一项的方法，其中所述多个核酸包括由多于一个细胞产生的核酸。
98.权利要求76-97中任一项的方法，其中所述多个核酸包括由多于一个生物体产生的核酸。
99.权利要求76-98中任一项的方法，其中所述多个核酸包括由多于一个物种产生的核酸。
100.权利要求76-99中任一项的方法，其中所述多个第一微流体液滴具有小于约1mm的平均直径。
101.权利要求76-100中任一项的方法，其中所述多个第一微流体液滴具有的直径分布使得不超过约5％的微流体液滴具有小于微流体液滴总平均直径的约90％或大于微流体液滴总平均直径的约110％的直径。
102.权利要求76-101中任一项的方法，其中所述多个第二微流体液滴具有小于约1mm的平均直径。
103.权利要求76-102中任一项的方法，其中所述多个第二微流体液滴具有的直径分布使得不超过约5％的微流体液滴具有小于微流体液滴总平均直径的约90％或大于微流体液滴总平均直径的约110％的直径。
104.权利要求76-103中任一项的方法，其中将扩增的核酸组合在共同的溶液中包括破坏液滴并将扩增的核酸收集在共同的溶液内。
105.权利要求104的方法，其中破坏液滴包括将液滴暴露于超声波。
106.权利要求104或105中任一项的方法，其中破坏液滴包括使液滴暴露于机械破裂。
107.权利要求76-106中任一项的方法，其中扩增所述第二多个微流体液滴中的至少一些扩增的核酸包括将核酸条形码附接至所述第二多个微流体液滴中包含的至少一些扩增的核酸。
108.权利要求76-107中任一项的方法，其包括使用PCR扩增所述第二多个微流体液滴内的至少一些核酸。
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