CN102648053A - 液滴生成技术 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及生产液滴的体系与方法。该液滴可包括例如用于生成文库的变化物种。在一些情况下，使用诸如流动聚集技术的技术，使用至少一个液滴生成多个液滴。在一组实施方案中，含有变化物种的多个液滴可以细分形成在其内含有各种物种的液滴群。根据某些实施方案，一群液滴可以含有在其内部含相同物种的各种液滴亚群。这种液滴群在一些情况下可以用作文库，或可以用于其它目的。

Description

液滴生成技术
相关申请
本申请要求2009年10月27日Weitz等人提交的标题为“DropletCreation Techniques”的美国临时申请序列号No.61/255,239的权益，在此通过参考将其引入。
政府资金资助
根据国家科学基金授予的DMR-0820484，利用政府资助，做出了本发明。政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明一般地涉及生产液滴的体系与方法。该液滴可含有例如用作文库(library)的变化物种。
背景技术
许多微流体工艺中的一种组分是多个单分散的液滴。为了采用传统技术形成多个液滴，通常使用强力方法。例如，在一些工艺中，必须独立地使用单一的微流体液滴制造器，乳化各试剂各自所需的结合物，然后将所有乳化的产品汇聚在一起，产生一种单一乳液的文库。对于甚至小的文库来说，这可能是费时、繁重且昂贵的工艺。而且，由于按序的人工乳化每一要素(element)，因此可能非常难以维持液滴尺寸高的均匀度。
发明概述
本发明一般地涉及生产液滴的体系与方法。该液滴可包括例如用于生成文库的变化物种。在一些情况下，本发明的主题牵涉互相关联的产品，特定问题替代的解决方案，和/或一个或更多个体系和/或制品的多种不同用途。
在一个方面中，本发明涉及一种方法。在一个实施方案中，形成多个液滴的方法包括提供含基本上被第二流体包围的第一流体的至少一个液滴，和使所述至少一个液滴流经微流体通道，形成多个微细液滴。
在另一方面中，本发明涉及制品。在一个实施方案中，制品包括含多个液滴的流体，其中至少一些液滴具有可区分的组成，和使用在该流体内包含的多个液滴，能产生微细液滴的流动聚焦(flow-focusing)装置，所生产的微细液滴的直径分布使得不大于约5％的液滴的直径大于液滴平均直径的约10％。
当结合附图考虑时，根据本发明的各种非限定性实施方案的下述详细说明，本发明的其他优点和新型特点将变得显而易见。在本说明书和参考引入的文献包括冲突和/或不一致的公开内容情况下，本申请说明书占支配地位。若通过参考引入的两篇或更多篇文献包括彼此冲突和/或不一致的公开内容，则具有最近有效日的文献占支配地位。
附图简述
参考附图，作为实例描述了本发明的非限定性实施方案，所述附图是示意性的且不打算按照比例绘制。在附图中，所示的每一相同或几乎相同的组件一般用单一的数字代表。为了清楚的目的，在每一附图中并非标记每一组件，在不需要说明本领域的技术人员就能理解本发明的情况下，也没有示出本发明每一实施方案中的每一组件。在附图中：
图1示出了根据本发明的非限定性实施方案，形成一群液滴的方法。
图2示出了根据本发明的另一实施方案，含两组基本上不可区分液滴的一群液滴的图像。
图3A示出了根据本发明再一实施方案，含两组基本上不可区分的液滴的一群大的多分散液滴的图像。
图3B示出了根据本发明的非限定性实施方案，微流体过滤器的图像。
图4A－4B分别示出了根据本发明的非限定性实施方案，多个液滴的绿色和红色通道的图像。
图5A－5B分别示出了图4A－4B所示的绿色和红色通道图像的强度柱状图。
图5C示出了由图5A的绿色强度相对由图5B的红色强度所作的图表。
图6A－6C示出了微流体过滤器的非限定性实例。
图6D阐述了可存在于微流体过滤器内的柱桩形状的非限定性实例。
图7A－7H阐述了微流体过滤器的非限定性实例。
图8示出了膜乳化的非限定性实例。
详细说明
本发明一般地涉及生产液滴的体系与方法。该液滴可含有例如用作文库的变化物种。在一些情况下，使用诸如流动聚焦技术之类的技术，使用至少一种液滴，生成多个液滴。在一组实施方案中，含变化物种的多个液滴可细分，形成在其内包含各种物种的一群液滴。根据一些实施方案，一群液滴可含有液滴的各种子群，所述液滴的各种子群在其内全部含有相同的物种。在一些情况下，这样一群液滴可用作文库，或者可用于其他目的。
在一个方面中，本发明提供形成多个液滴的技术。至少一些液滴可在其内包括至少一种物种，例如核酸探针或细胞。在一组实施方案中，提供含被第二流体基本上包围的第一流体的至少一种液滴。在一些情况下，第一流体和第二流体基本上不混溶。例如，液滴可含有水性液体，且被油性液体基本上包围；以下详细地讨论了其他结构。例如通过使液滴流经微流体通道和使用流动聚焦或其他技术，引起液滴形成多个较小的液滴，从而可将液滴细分为多个液滴，正如以下所述。对于多个进入的液滴来说，可反复这一方法，和在一些情况下，一些或所有液滴可含有各种物种。在一些情况下，如此生产的液滴可收集在一起，例如形成乳液。若使用含各种物种的不同液滴，则所得收集物可包括多个液滴组，其中在每一组内的液滴基本上不可区分，但每一组液滴与其他组液滴可区分，例如这是因为在每一组液滴内包含的不同物种所致。在一些情况下，这种收集物可用于生成含各种物种的液滴文库。
图1示出了涉及形成含多个基本上不可区分液滴组的乳液的实施方案的非限定性实例。在该附图中，提供六种可区分的流体(例如，含六种可区分物种的流体)，其中每一流体包含在容器16之一内(此处仅仅作为实例，提供六种这样的流体和容器；在本发明的其他实施方案中，可使用其他数量的容器或流体，正如以下所述)。流体可以是可区分的，例如具有不同组成，和/或相同组成，但在流体内包含不同物种，和/或相同物种，但不同浓度的形式。例如，容器161可包括第一流体和在其内包含的第一物种，而容器162可包括第一流体和包含在其内的第二流体，或者容器162可包括含第一物种或不同物种的第二流体，或者容器162可包括第一流体和第一物种，但浓度不同于容器161，等。可使用任何合适的技术，例如自动化技术，例如自动化移液技术，机器人等，填充容器，或者可人工添加流体到容器16中，或者任何合适的方法的组合。
在容器16内的流体然后可倾倒在用载体流体24填充的共同的容器4内，所述载体流体24基本上不与来自容器16的流体混溶。可按照任何合适的顺序，例如按序，同时等，将来自容器16的流体加入到共同的容器4中。因此，在这一实例中，共同的容器4含有含来自各种容器16的流体的多个液滴。在一些情况下，在共同的容器4内的液滴可形成乳液。应当注意，尽管在这一实例中通过添加流体到共同的容器4中，形成了乳液2，但在一些实施方案中，如下所述，可使用其他方法形成乳液2。
仍然参考图1所示的例举的实例，来自共同的容器4中的液滴12然后流经通道18，和使用液滴制造器10，由液滴12形成多个液滴14。以下详细地描述了这种液滴制造器的实例。正如图1所示，液滴制造器10包括通道20和22，其中各自横穿通道18。通道20和22各自含有外部(outer)流体。外部流体10在通道18内的流体周围流动会引起流体细分，形成多个液滴14。然而，此处仅仅作为实例列出了液滴制造器10；在本发明的其他实施方案中，可使用牵涉不同通道的其他液滴制造器结构。在一些情况下，液滴14可以基本上单分散，或者在其他情况下，具有窄的平均直径或体积范围。然后液滴14流动到收集腔室8中。
然后可使用在收集腔室4内的其他液滴，反复这一工序。例如，第一液滴30可被细分形成第一多个微细液滴，和第二液滴32可被细分形成第二多个微细液滴。在多个微细液滴的每一个内的每一液滴基本上不可区分，尽管来自多个不同液滴中的液滴可彼此区分。在细分之后的液滴都可在收集腔室8内收集，任选地混合，形成一群液滴6(例如，乳液)，正如图1所示。在一些情况下，液滴6的群可确定物种的文库，其中各自包含在多个液滴内，和液滴6的群可用于分析核酸，细胞等。
如上所述，在细分之前的液滴组(和/或第一多个微细液滴和第二多个微细液滴)可按照一些方式区分，例如基于在液滴和/或形成液滴的流体内包含的物种的组成和/或浓度。例如，第一液滴可包括第一流体且含有第一物种，和第二液滴可包括相同的第一流体且含有第二物种，其中第一物种和第二物种彼此可区分，或者第二液滴也可含有第一物种，但浓度基本上不同于第一液滴等，可在本发明液滴内引入的物种的非限定性实例包括，但不限于，核酸(例如，siRNA，RNAi，DNA，等)，蛋白质，肽，酶，纳米颗粒，量子点，香料，蛋白质，指示剂，染料，荧光物种，化学品，细胞，颗粒，药物试剂，药物，以下所述的用于硬化的前体物种，或类似物。一种物种可以或者可以基本上不溶于在液滴内包含的流体和/或基本上包围该液滴的流体中。
在一些情况下，第一液滴和第二液滴(例如由液滴形成的第一微细液滴和第二微细液滴，和/或在细分之前的第一液滴和第二液滴)可具有基本上相同的组成。本发明所使用的“基本上相同的组成”是指在相同的浓度下，至少两个液滴具有基本上相同的组成(例如，流体，聚合物，凝胶等)，其中包括在液滴内包含的任何物种，例如液滴可具有基本上不可区分的组成和/或物种浓度。液滴可具有相同或不同的直径。在一些情况下，相对于液滴的平均组成，具有基本上相同组成的两个液滴在其组成上的差别可不大于约0.5%，不大于约1％，不大于约2％，不大于约3％，不大于约4％，不大于约5％，不大于约10％，不大于约20％和类似物。
在一些情况下，液滴可包括大于一类物种。例如，液滴可包括至少约2类，至少约3类，至少约4类，至少约5类，至少约6类，至少约8类，至少约10类，至少约15类，或至少约20类物种，等。在液滴内包含的每一类物种的总数可以或可以不一定相等。例如，在一些情况下，当在液滴内包含两类物种时，可存在大致相等数量的包含在液滴内的第一类物种和第二类物种。在其他情况下，第一类物种可以以比第二类物种或者大或者少的用量存在，例如，一种物种与另一种物种之比可以是约1:2，约1:3，约1:4，约1:5，约1:6，约1:10，约1:20，和约1:100，等。在每一组液滴内的每一类物种数目可以或者可以不相等。例如，某一组的第一液滴可包括第一类物种之一和第二类物种之一，和这一组的第二液滴可含不止一种第一类物种和一种或更多种第二类物种。在一些情况下，可形成液滴，以便多个液滴含有至少四种可区分的物种，结果不大于约1％，约2％，约3％，约5％，约10％等的液滴在其内含有至少四种可区分物种中的两种或更多种。可区分物种可以是本发明所述的四种可区分的核酸，鉴定元素，或蛋白质。在一些情况下，液滴可包括一类物种中的大于一个成员。例如，液滴可包括至少约2个，至少约3个，至少约5个，至少约10个，至少约20个，至少约50个，至少约100个等单一物种的成员。
在一些实施方案中，一群液滴可包括至少约2，至少约4，至少约10，至少约30，至少约50，至少约64，至少约128，至少约1024，至少约4096，至少约10,000，或更多组可区分的液滴，其中每一组液滴含有一个或更多个可区分的液滴。在每一组内的液滴数量可以或者可以基本上不相等。
液滴(例如，在细分之前或之后)可以是多分散，单分散，或基本上单分散的(例如，具有均匀的直径分布)。在其中液滴的直径分布使得不大于约10%，约5%，约4%，约3%，约2%，约1%或更少的液滴的直径比大于或小于所有液滴的平均直径的约20%，约30%，约50%，约75%，约80%，约90%，约95%，约99%或更多的情况下，多个液滴是基本上单分散。此处所使用的一群液滴的“平均直径”是液滴直径的算术平均。本领域的技术人员能确定一群液滴的平均直径，例如使用激光散射或其他已知的技术。在一些实施方案中，在细分之后，多个液滴基本上单分散或是单分散的，而在细分之前液滴是多分散的。在不希望束缚于任何理论的情况下，本发明一些实施方案的技术的一个优点是，在细分之后，可由多分散的多个液滴形成基本上单分散的一群液滴。在一些情况下，在细分之后，由一个液滴形成的液滴数量越大，则在细分之后所有液滴基本上单分散的可能性越大，甚至在其中液滴是多分散的情况下。
本领域的技术人员能确定一个液滴的合适大小，这取决于例如由液滴形成的微细液滴的所需直径和/或数量之类的因素等，取决于应用。在一些情况下，在细分之前，液滴的平均直径大于约500微米，大于约750微米，大于约1毫米，大于约1.5毫米，大于约2毫米，大于约3毫米，大于约5毫米，或更大，和多个微细液滴的平均直径小于约100微米，小于约750微米，小于约500微米，小于约400微米，小于约300微米，小于约200微米，小于约100微米，小于约50微米，小于约25微米，小于约10微米，或更小。在一些情况下，由一个液滴产生至少约5，至少约10，至少约20，至少约25，至少约50，至少约75，至少约100，或更多个的微细液滴。在一些情况下，通过细分一个单个的液滴，形成约5－约100，约10－约100，约10－约50，或约50－约100等个液滴。
可使用任何合适的技术，形成多个液滴(例如在细分之前)。例如，可通过摇动或搅拌液体，形成单个的液滴，生成含单个液滴的悬浮液或乳液，或通过移液技术形成液滴，针或类似物，形成液滴。生成液滴的其他非限定性实例公开于如下：2004年12月28日Stone等人提交的标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion”的美国专利申请序列号No.11/024,228，于2005年8月11日公布为美国专利申请公开No.2005/0172476；2005年10月7日Link等人提交的标题为“Formation and Control of Fluidic Species”的美国专利申请序列号No.11/246,911，于2006年7月27日公布为美国专利申请公开No.2006/0163385；或者2006年2月23日Link等人提交的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的美国专利申请序列号No.11/360,845，于2007年1月4日公布为美国专利申请公开No.2007/0003442；2008年6月26日提交的标题为“Methods and Apparatus for Manipulation of Fluidic Species”的国际专利申请No.PCT/US2008/007941，于2009年1月28日公布为WO 2009/005680，其中每一篇在此通过参考引入。
如上所述，在一些情况下，可通过使液滴流经与液滴制造器有关的微流体通道，由一个液滴形成多个微细液滴。在一些实施方案中，可在一个容器内提供多个液滴，其中该容器具有微流体通道的入口，或者在其他情况下，与微流体通道流体连通。含第一流体且基本上被载体流体包围的液滴可进入微流体通道。在其中液滴直径足够大于微流体通道的情况下，可压缩液滴，例如在微流体通道内形成液体物流。可通过液滴制造器，在微流体通道内，由进入流体(例如，以流体物流形式)形成多个液滴。这可以是与其中进入液滴制造器的流体基本上连续的体系类似的工艺。因此，可由第一液滴(例如以流体物流形式存在于微流体通道内)形成第一多个液滴。然后，第二液滴可进入微流体通道，并可重复该工艺，从而由第二液滴形成第二多个液滴，和第二多个液滴可以区别于第一多个液滴。可采用任何数量的液滴重复这一工艺，所述液滴与其他液滴可以是可区分或者不可区分的。
在一些情况下，可平行地进行微细液滴的形成。例如，含多个液滴的一个或更多个容器可与含液滴制造器的多于一个微流体通道相联，从而允许一次由大于一个液滴形成微细液滴。在一些情况下，容器各自可与1，2，3，4，5，10，20或更多的微流体通道和/或液滴制造器相联。这种体系的一个实例公开于2009年3月13日M.Romanowsky等人提交的标题为“Scale-up of Microfluidic Devices”的美国临时申请序列号No.61/160,184中，在此通过参考将其引入。
本领域的技术人员会知道在微流体通道内，由(例如来自液滴的)流体物流形成液滴的其他合适的体系和方法。例如，在一组实施方案中，可通过改变通道的尺寸，其方式使得能诱导流体形成单个的液滴，由被通道内的载体流体包围的流体生成流体液滴。通道可以是例如相对于流动方向膨胀的通道，例如以便流体没有粘附到通道壁上，反而形成单个的液滴，或者是相对于流动方向变窄的通道，例如使得流体受迫聚结成单独的液滴。在其他实施方案中，也可利用内部障碍(obstruction)，引起液滴生成。例如，挡板，隆起物，柱桩，或类似物，可用于干扰载体流体的流动，其方式为引起流体聚结成流体液滴。可与微流体体系结合使用的其他液滴制造器是本领域技术人员已知的，且包括，但不限于，T接头液滴制造器，微毛细管液滴制造器(例如，共-流动(co-flow)或者流动聚焦)，三维液滴制造器等。
在一些情况下，可使用乳化体系，例如均化，膜乳化，剪切细胞(shear cell)乳化，流体乳化等，其中包括，但不限于，毫米-，微米-和纳米-流体体系，从而形成多个液滴。也就是说，可使用除了微流体以外的装置和/或技术，细分多个液滴。本领域的技术人员熟悉这些体系。
在一些情况下，可使用膜乳化，细分多个液滴。膜乳化是本领域技术人员已知的且通常包括使将要形成为乳液的第一流体流经膜(例如，含多个孔隙的膜)。基本上互不混溶的第二流体在膜板的外表面流过(例如，第一流体离开膜时的表面)，从而形成含第一流体的多个液滴(例如，通过流经膜表面的连续相，使液滴分离)，如图8所示。一般地，通过压力控制第一流体的流动。在其中结合本发明使用膜乳化的实施方案中，含多个液滴的流体可流经膜。然后通过连续相在膜的外表面流过，将每一液滴细分成多个较小的液滴。
在另一组实施方案中，可在被载体流体包围的流体上生成电荷，所述电荷可在载体流体内引起流体分离成单个的液滴。因此，流体可以以在载体流体内的一系列的单独荷电和/或电诱导的液滴形式存在。可使用任何合适的技术，例如通过将流体置于电场(它可以是AC，DC等)内，和/或引起反应发生，所述反应会引起流体具有电荷，例如化学反应，离子反应，光催化反应等，在载体流体内部的流体内生成电荷。
在一些实施方案中，由电场发生器，即能产生可施加到流体上的电场的装置或体系，生成电场。电场发生器可产生AC场，DC场(即，相对于时间，恒定的场)，脉冲场等。可构造并排列电场发生器，以便在通道或者微流体通道内包含的流体中产生电场。根据一些实施方案，电场发生器可以与含通道或微流体通道的流体体系一体或者独立于该流体体系。此处所使用的“一体”是指彼此一体的一部分组件连接，其方式使得在没有切割或破坏至少一个组件的情况下，各组件不可能人工彼此分离。
产生合适的电场(它可以是AC，DC等)的技术是本领域技术人员已知的。例如，在一个实施方案中，通过在一对电极上施加电压，产生电场，所述电极可以位于流体体系上或者包埋在流体体系内(例如，在确定通道的基底内)，和/或定位在流体附近，以便至少一部分电场与流体相互作用。电极可由本领域技术人员已知的一种或多种任何合适的电极材料制造，其中包括，但不限于，银，金，铜，碳，铂，铜，钨，锡，镉，镍，氧化锡铟(“ITO”)等，以及其结合物。在一些情况下，可使用透明或基本上透明的电极。
在一些实施方案中，微流体装置可包括一个或更多个过滤器，所述过滤器辅助从装置内包含的流体中，例如在细分形成多个液滴之前，从微流体通道内包含的液滴中除去任何不想要的粒状物中的至少一部分，正如本发明所述的。除去粒状物质(例如，灰尘，颗粒，尘土，废墟，细胞残余物，蛋白质聚集体，脂质体，胶态颗粒，不溶材料，其他未鉴定的粒状物，等)可能是重要的，因为微流体装置可包括相对窄的通道，和粒状物质可能堵塞或者阻止通道。粒状物可能大于通道，和/或其形状使得粒状物运输经过通道至少受到某种妨碍。例如，粒状物可具有不均匀或者非球形的形状，包括可在通道侧面上“钩住(snag)”或摩擦(rub)的部分，具有在粒状物周围至少部分妨碍流体流动的形状，等。在一些情况下，多个粒状物可一起引起在通道内流动的至少某种妨碍；例如，颗粒可在通道内聚集在一起，妨碍流体流动。
一般地，根据本发明的一个方面，微流体过滤器包括多个柱桩(post)。在一些实施方案中，柱桩可在通道内排列；这些柱桩可过滤掉任何不想要的粒状物，同时允许流体在柱桩周围流动。例如，如图6A所示，微流体通道50包括位于微流体通道的壁52之间的多个柱桩56。通过柱桩56捕获粒状物58，同时流体能在其余的间隙之间流动，如箭头60所示。(任选地，流体可含有液滴，例如本发明所述的那些)。流体然后可进入液滴制造器，和/或在其他情况下，可在微流体装置内使用。
在一些方面中，过滤器，例如图6A所述的那种可用于从含液滴的流体(图6A中未示出)中过滤粒状物质。例如，液滴可在柱桩之间流过，而粒状物，例如58可能在过滤器内堵塞并受到阻止流过其中。应当注意，即使存在某些粒状物，例如图6A中的粒状物58，在流体流过其中并过滤额外的粒状物时，过滤器仍然可能是有效的，只要存在穿过过滤器的一些通路以供流体流动即可，例如如图6A中的箭头60所示。
然而，在一些实施方案中，当液滴流经过滤器时，用于过滤含液滴的流体的图6A所述的过滤器可引起较大的液滴劈裂成多个较小的液滴。在一些情况下，较小的液滴可以是多分散的。例如，当液滴在柱桩54之间流过时，液滴可能变形或者以各种方式引起破裂。
参考图6B，示出了本发明的另一实施方案。在这一实施方案中，通道62包括含多个柱桩64的过滤器61。在这一实施方案中，过滤器和柱桩可能没有在通道62周围对称地排列；相反，在这一实施方案中，可排列过滤器，以便柱桩基本上位于通道的一侧上。因此，相对于通道的另一侧，例如至少50％，至少70％，或至少90％的柱桩可位于通道的一侧上。在一些实施方案中，例如在图6A所示的那些中，通道可在过滤器周围变宽，以容纳柱桩；然而，在其中柱桩基本上位于通道一侧上的某些布局中，通道可按照非对称的方式变宽，即相对于通道的另一侧，通道在该通道的一侧上变宽更多。还应当注意，过滤器的出口与过滤器的入口基本上共线地布置；然而，在其他实施方案中，出口可位于中心或者过滤器的另一侧上，和/或出口可以在不与入口相同方向的方向上。过滤器的形状可以是任何合适的形状，其中包括，但不限于，正方形，三角形，矩形，圆形等。在图7A－7H中示出了过滤器的形状和结构的非限定性实例。
在一些实施方案中，过滤器包括多个柱桩和在柱桩之间的多个间隙，其中每一间隙具有从过滤器的入口到出口不同的路径长度。因此，在不希望束缚于任何理论的情况下，认为相对于从过滤器的入口到出口的间隙之间穿过的其他路径，在每一间隙之间流动的流体具有不同的水动阻力。这一布局的结果可引起流体主要流经具有最低水力比的间隙。若粒状物进入过滤器，则它可在这一间隙内被卡住(catch)，且流体流动在周围变换方向到下一间隙，所述下一间隙成为流体流动阻力最小的下一个可获得的路径。令人惊奇的是，这一布局可允许除去粒状物，同时还保持在通道内的流体液滴完整，和通过在通道内简单地提供一系列的柱桩，预料或预期不到这一布局。
因此，一组实施方案一般地涉及在入口和出口之间含多个不同路径长度的过滤器。在一些情况下，可使用多个柱桩和在这些柱桩之间的多个间隙，产生这些不同的路径长度。如上所述，流体的入口和出口可位于过滤器的一侧上。例如，如图6B的实例所示，流体62流经含柱桩64的过滤器61。大多数流体流经水动阻力最低的间隙66。如图6C所示，若间隙66被粒状物72基本上阻滞时，大多数流体可流经间隙74，即下一个水动阻力最低的间隙。图3B中示出了过滤器实例的图像。
可选择柱桩之间的间隙尺寸，以便每一间隙的尺寸是过滤器出口尺寸的约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，或约90％，或者是紧跟着离开过滤器之后，流体可流经其内的通道的截面距离的尺寸。该尺寸可确定为在过滤器内隔开相邻柱桩的最短距离。在一些情况下，柱桩之间的间隙尺寸为通道宽度的约50％。柱桩可以是任何合适的尺寸，形状，和/或数量，且可以以任何合适的布局位于过滤器内。图6D描述了形状的非限定性实例，且包括，但不限于，矩形，正方形，圆形，椭圆形，梯形，泪滴状(例如，具有正方形和圆形底部边缘二者)，和三角形。在一些实施方案中，柱桩的长度可以显著大于柱桩的宽度，或者柱桩的宽度可以显著大于柱桩的长度。例如，柱桩的长度或宽度可以分别是宽度或长度的约2倍，约3倍，约4倍，约5倍，约10倍，约15倍，约20倍，或更大。在一些情况下，当柱桩的长度显著大于柱桩的宽度时，两个柱桩之间的间隙可形成通道。在过滤器内的柱桩可以或者可以不具有相同的尺寸，形状和/或布局。例如，在一些情况下，基本上所有的柱桩可具有相同的尺寸，形状和布局，而在其他情况下，柱桩可具有各种尺寸，形状，和/或布局。
过滤器可包括约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约15，约20或更多的柱桩。柱桩的宽度可以具有与柱桩之间的间隙尺寸大致相同的尺寸，或者比柱桩之间的间隙尺寸大大约1.5倍，大大约2倍，大约3倍,大约4倍，大约5倍，大约7倍，或大约10倍。可以以线性布局，例如如图6B所示，和/或以其他布局，其中包括多列柱桩(矩形排列，错列等)，或柱桩的无规布局排列柱桩。在一些情况下，柱桩可与通道的任何合适的表面(例如，通道的底部，顶部和/或侧壁)相联。在一些情况下，可以以三维布局排列柱桩。在一些情况下，微流体通道的高度可以变化和/或柱桩的高度可以变化。若存在多列柱桩，则它们可相对于过滤器的入口和出口，以约900或者以非900角排列。在一些情况下，可通过过滤器，从流体中除去至少约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％，约98％或更多存在于流体内的粒状物质。
应当理解，尽管相对于液滴制造器，例如本发明所述的那些，描述了以上所述的过滤器，但过滤器不限于仅仅这些应用。在其他微流体应用中使用过滤器认为在本发明范围内，其中包括期望除去粒状物的任何应用(不管液滴是否存在于通道内的流体中)。这种应用的非限定性实例包括微流体应用(例如，“lab-on-a-chip”应用)，色谱应用(例如，液相色谱，例如HPLC，亲和色谱，离子交换色谱，尺寸排阻色谱等)，半导体制造技术，可饮用水应用，喷墨打印应用，酶分析，DNA分析，或类似物。
在一些实施方案中，在过滤器之前，微流体通道的高度可快速下降(例如，通道高度剧烈缩短)。随着高度下降，在进入通道内之前，这可引起至少一部分灰尘或者其他粒状物沉降。
在一些情况下，一个或更多个通道可与过滤器交叉。通道可与过滤器在柱桩之前的位置，与之相邻的位置或者紧跟着在其后的位置交叉。在一些情况下，通道可位于一组或更多组柱桩之间。通道与过滤器结合可便于从进入过滤器内的流体中添加或提取(extract)连续相。在一些情况下，通道可以用于引入与进入过滤器内的流体中存在的连续相不同的连续相。在一些情况下，通道可以是电容器通道，其中电容器通道是一头不通的通道。电容器通道可辅助均衡液滴制造器内的压力，和/或辅助形成高度单分散的多个液滴。
在一些情况下，可结合组件与过滤器(或微流体体系中的其他部分)，以辅助减少泡沫。术语“泡沫”以其在本领域中常见的含义给出。在过滤器中或者微流体体系(例如液滴制造器)的其他部分中泡沫的存在可干扰流体流动和/或导致其他难度(例如，增加在液滴制造器处形成的液滴的多分散性)。在一些情况下，可使用润湿片(patch)，电场，和/或表面活性剂(例如，存在于一种或更多种流体内)，减少或消除泡沫。
可在各种应用，例如涉及诸如食品和饮料，健康和美容助剂，油漆和涂料，以及药物和药物递送之类的领域的技术中，使用本发明所述的组合物和方法。在一些情况下，液滴或乳液也可起到反应容器的作用，例如用以控制化学反应，或者用于体外转移(transcription)和转录，例如用于定向进化技术。另外，本发明的液滴可包括额外的反应组分，例如催化剂，酶，抑制剂和类似物。在一些实施方案中，含物种的多个微细液滴可用于确定分析物。
本发明所使用的“测定”一般地是指例如定性或定量分析或测量目标分析物分子，或检测目标分析物分子存在与否。“测定”也可指例如定性或定量分析或测量至少一种物种和目标分析物分子之间的相互作用，或者通过检测相互作用的存在与否。实例技术包括，但不限于，光谱，例如红外，吸收，荧光，UV/可见光，FTIR(“傅里叶变换红外光谱”)，或拉曼；重量分析技术；椭圆光度法；压电测量；免疫测定；电化学测量；光学测量，例如光密度测量；圆形二色性；光散射测量，例如准电光散射；偏振测定；折光测定；或浊度测量。
在一些情况下，组合物和方法可用于确定目标核酸的序列。例如，目标分析物分子可以是核酸，包括在多个微细液滴内的物种可以选自核酸探针文库，以便可例如使用诸如2008年12月19日Weitz等人提交的标题为“Systems and Methods for Nucleic Acid Sequencing”的国际专利申请No.PCT/US2008/013912；或者2008年9月19日中Weitz等人提交的标题为“Creation of Libraries of Droplets andRelated Species”的美国临时申请序列号No.61/098,674中公开的技术，测定核酸序列，其中每一篇在此通过参考引入。
在一些实施方案中，本发明公开的技术可用于生成含多个液滴组的乳液，其中每一不同组的液滴包括可区分的核酸探针。例如，每一组微细液滴可包括一种或更多种额外的物种，例如，在可使用该物种鉴定核酸探针的情况下。在一些情况下，液滴文库可用于对例如核酸测序。例如液滴群中的至少一些可与含目标核酸的液滴融合在一起，从而形成多个融合的液滴。可使用本领域技术人员已知的技术(例如，杂交测序技术)，分析多个融合的液滴，测定核酸序列。
在一个实施方案中，多个可区分的鉴定元素用于鉴定多个微细液滴或核酸探针或其他合适的样品。本发明所使用的“鉴定元素”是含可按照某一方式测定的组分的物种，例如当包含在液滴内时，可鉴定该鉴定元素。例如，若使用荧光颗粒，则首先测定一组可区分的颗粒，例如具有至少5个可区分的颗粒，至少约10个可区分的颗粒，至少约20个可区分的颗粒，至少约30个可区分的颗粒，至少约40个可区分的颗粒，至少约50个可区分的颗粒，至少约75个可区分的颗粒，或至少约100个或更多个可区分的颗粒。这一组的非限定性实例获自Luminex。可区分的鉴定元素可细分为多个组(例如，2，3，4，5，6，7或更多)，其中每一组含有该组可区分鉴定元素的至少两个成员。
在一些实施方案中，本发明的液滴包括前体材料，其中该前体材料能经历相变，例如形成硬质化的液滴或流化的液滴。例如，液滴可含有凝胶前体和/或聚合物前体，这些前体可硬质化形成含凝胶和/或聚合物的硬质化液滴。因此，可在一些情况下，使用上述方法和工艺，形成含多组颗粒的一群颗粒，其中每一组颗粒可与其他组颗粒可区分。在一些情况下，硬质化液滴也可在凝胶或聚合物内含有流体。可使用任何合适的技术，引起液滴经历相变。例如，通过将硬质化液滴暴露于变化的环境下，硬质化液滴可形成流化液滴。可通过改变液滴周围的环境，例如改变温度，改变pH水平，改变离子强度，暴露于电磁辐射下(例如紫外光)，添加化学品(例如，解离聚合物内交联剂的化学品)，和类似方法，流化或硬质化该液滴。
现提供各种定义，这些定义将辅助理解本发明的各方面。以下且用这些定义点缀的是更加充分地描述本发明的进一步的公开内容。
在一个实施方案中，可提供含有一种或更多种上述组合物的试剂盒。本发明所使用的“试剂盒”典型地定义为含一种或更多种本发明组合物，和/或与本发明有关的其他组合物，例如前面所述的一群液滴的包装或组件。可以以液体形式(例如，在溶液中)，固体形式(例如，干燥的粉末或一群硬化液滴)等，提供试剂盒中的每一组合物。在一些情况下，本发明的试剂盒可包括结合本发明的组合物提供的任何形式的说明，其方式使得本领域技术人员之一会意识到该说明与本发明的组合物有关。例如，该说明可包括使用，改良，混合，稀释，防腐，给药，组装，储存，包装，和/或制备组合物和/或与试剂盒有关的其他组合物的说明。可提供本领域技术人员可意识到的任何形式的说明作为以任何方式提供的包含该说明的合适的媒介载体，例如手写或出版，口头，听得见的(例如电话)，数码，光学，视觉(例如，录像带，DVD等)或电子通信(其中包括互联网或网页基通信)的说明。
本发明所使用的“液滴”是完全被第二流体包围的第一流体的孤立部分。要注意液滴不一定是球形，而也可以是其他形状，例如这取决于外部环境。在非球形液滴中，液滴直径是具有与非球形液滴相同体积的完美的数学球形的直径。可使用前面讨论的任何合适的技术，生成液滴。
本发明所使用的“流体”以其常见含义给出，即液体或气体。流体不可能维持确定的形状且在可观察到的时间框架期间流动，以填充它置于其内的容器。因此，流体可具有提供流动的任何合适的粘度。若存在两种或更多种流体，则每一流体可独立地选自本领域技术人员已知的基本上任何流体(液体，气体，和类似物)。
本发明的一些实施方案提供多个液滴。在一些实施方案中，由第一流体形成多个液滴，且可以基本上被第二流体包围。如果可在液滴周围通过仅仅流体画出一个闭环，则本发明所使用的液滴被流体“包围”。若可在液滴周围画出仅仅流过流体的闭环，而与方向无关，则液滴被“完全包围”。若取决于方向，可在液滴周围画出仅仅流过流体的闭环，则液滴被“基本上包围”(例如，在一些情况下，在液滴周围的环包括大多数流体，所述流体也可包括第二流体，或者第二液滴等)。
在大多数，但并非所有的实施方案中，液滴和含该液滴的流体基本上互不混溶。然而，在一些情况下，可以混溶。在一些情况下，亲水液体可悬浮在疏水液体中，疏水液体可悬浮在亲水液体中，气泡可悬浮在液体中，等。典型地，疏水液体和亲水液体基本上彼此互不混溶，其中亲水液体对水的亲和性大于疏水液体。亲水液体的实例包括，但不限于，水和含水的其他水溶液，例如细胞或生物介质，乙醇，盐溶液，等。疏水液体的实例包括，但不限于，油，例如烃，硅油，氟烃油，有机溶剂等。在一些情况下，可选择两种流体，在形成流体物流的时间框架内基本上互不混溶。本领域的技术人员可使用接触角测量或类似方法，选择合适的基本上混溶或者基本上互不混溶的流体，进行本发明的技术。
在一些，但并非所有的实施方案中，可使用本发明更加详细地讨论的微流体技术，生成多个液滴。本发明所使用的“微流体”是指含截面尺寸小于1mm，和长度与最大截面尺寸之比为至少约3:1的至少一个流体通道的器件，装置或体系。本发明所使用的“微流体通道”是满足这些标准的通道。垂直于流体流动方向，测量通道的“截面尺寸”。在一些实施方案中，可通过单一组件(例如，蚀刻的基底或模塑的单元)，部分形成流体通道。当然，较大的通道，管道，腔室，容器等可用于储存本体流体，并递送流体到本发明的组件中。在一组实施方案中，含本发明实施方案的最大截面尺寸小于1mm，小于500微米，小于200微米，小于100微米，小于50微米，或小于25微米。在一些情况下，可选择通道的尺寸，以便流体能自由地流经制品或基底。也可选择通道的尺寸，例如在通道内提供一定的体积流速或线性流速的流体。当然，可通过本领域技术人员已知的任何方法，改变通道的数量和通道的形状。在一些情况下，可使用大于一个通道或毛细管。例如，可使用两个或更多个通道，其中它们位于彼此内，彼此相邻地布置，彼此交叉地布置，等。
本发明所使用的“通道”是指至少部分导引流体流动的在制品(基底)上或其内的特征。通道可具有任何截面形状(圆形，椭圆形，三角形，不规则形状，正方形，或矩形，或类似形状)，且可被覆盖或者未覆盖。在其中它被完全覆盖的实施方案中，至少一部分通道可具有完全封闭的截面，或者整个通道可以沿着其整个长度方向完全封闭，例外的是其入口和出口。通道的长径比(长度与平均截面尺寸)也可以是至少约3:1，至少约5:1，或至少约10:1，或更大。开放的通道通常包括有助于控制流体输送的特征，例如结构特征(细长的凹陷)和/或物理或化学特征(疏水性vs亲水性)，或可在流体上产生力的其他特征。在通道内的流体可部分或完全填充通道。在其中使用开放通道的一些情况下，可例如使用表面张力(即凹或凸的半月板)，使流体保持在通道内。
可与本发明一起使用的微流体体系的非限定性实例公开于2005年10月7日提交的标题为“Formation and Control of FluidicSpecies”的美国专利申请序列号No.11/246,911，于2006年7月27日公布为美国专利申请公开No.2006/0163385；2004年12月28日提交的标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion,”的美国专利申请序列号No.11/024,228，于2005年8月11日公布为美国专利申请公开No.2005/0172476；2006年2月23日提交的标题为“Electronic Control of Fluidic Species”的美国专利申请序列号No.11/360,845，于2007年1月4日公布为美国专利申请公开No.2007/000342；2006年3月3日提交的标题为“Method andApparatus for Forming Multiple Emulsions”的国际专利申请号No.PCT/US2006/007772，于2006年9月14日公布为WO 2006/096571；2006年3月3日提交的标题为“Systems and Methods of FormingParticles”的美国专利申请序列号No.11/368,263，于2007年3月8日公布为美国专利申请公开No.2007/0054119；2008年3月28日提交的标题为“Multiple Emulsions and Techniques for Formation”的美国专利申请序列号No.12/058,628，于2009年1月8日公布为美国专利申请公开No.2009/0012187；和2006年1月20日提交的标题为“Systems and Methods for Forming Fluidic DropletsEncapsulated in Particles Such as Colloidal Particles”的国际专利申请No.PCT/US2006/001938，于2006年1月20日公布为WO2006/078841中，其中每一篇在此通过参考引入。
在一些实施方案中，可使用所提供的微流体体系来巧妙地处理液滴。例如，在一些情况下，可筛分或分类多个液滴。例如，针对含有物种的那些液滴，可以筛分或分类多个液滴，并在一些情况下，针对含有特定数量或范围的感兴趣物种的实体的那些液滴，可筛分或分类多个液滴。筛分和/或分类液滴的体系与方法是本领域技术人员已知的，例如公开于2006年2月23日Link等人提交的标题为“ElectronicControl of Fluidic Species”的美国专利申请序列号No.11/360,845，于2007年1月4日公布为美国申请公开No.2007/000342中，在此通过参考引入。作为非限定性实例，通过施加(或除去)第一电场到装置(或它的一部分)上，可将液滴导引到第一区域或通道中；通过施加(或除去)第二电场到装置(或它的一部分)上，可将液滴导引到第二区域或通道；通过施加第三电场到装置(或它的一部分)上，可将液滴导引到第三区域或通道；等，其中电场在某一方式上可以不同，例如强度、方向、频率、持续时间等。
在另一方面中，一个液滴可进一步劈裂或细分成两个或更多个液滴。劈裂液滴的方法，体系和技术是本领域技术人员已知的，例如公开于2004年4月9日Link等人提交的美国专利申请序列号No.PCT/US2004/010903；2003年8月27日Link等人提交的美国专利申请序列号No.60/498,091；和2003年6月30日Stone等人提交的国际专利申请序列号No.PCT/US03/20542，2004年1月8日公布为WO 2004/002627，其中每一篇在此通过参考引入。例如，可使用所施加的电场，劈裂微细液滴。电场可以是AC场，DC场等。
在一些情况下，第一液滴(例如，微细液滴)可与第二液滴融合或聚结在一起。例如，在一组实施方案中，在其中例如，由于组成，表面张力，液滴尺寸，存在或者不存在表面活性剂等导致两个或更多个液滴不能融合或聚结的情况下，提供能引起两个或更多个液滴(例如，它们来自于流体的不连续物流)融合或聚结成一个液滴的体系与方法。在其他实施方案中，液滴可与流体物流融合在一起。例如，在通道内的流体物流可与同一通道内的一个或更多个液滴融合在一起。在一些情况下，在某些微流体体系中，相对于液滴的尺寸，液滴的表面张力也可防止液滴发生融合或聚结。可使用本领域技术人员已知的方法，体系和/或技术，融合或聚结两个或更多个液滴，例如在2004年12月28日Stone等人提交的标题为“Method and Apparatus for FluidDispersion”的美国专利申请序列号No.11/024,228，于2005年8月11日公布为美国专利申请公开No.2005/0172476；2005年10月7日Link等人提交的标题为“Formation and Control of FluidicSpecies”的美国专利申请序列号No.11/246,911，于2006年7月27日公布为美国专利申请公开No.2006/0163385；2007年8月29日Weitz等人提交的标题为“Method and Apparatus for FormingMultiple Emulsions”的美国专利申请序列号No.11/885,306，于2009年3月21日公布为美国专利申请公开No.2009/0131543；或者2006年2月23日Link等人提交的标题为“Electronic Control ofFluidic Species”的美国专利申请序列号No.11/360,845，于2007年1月4日公布为美国专利申请公开No.2007/0003442中，其中每一篇在此通过参考引入。在一些情况下，可将第二流体注入到微细液滴内，例如如2009年6月26日Weitz等人提交的标题为“FluidInjection”的美国专利申请序列号No.61/220,847中所述的那些，在此通过参考将其引入。
根据本发明一些方面的各种材料与方法可用于形成本发明体系与装置中的任何以上所述的组件。在一些情况下，所选的各种材料适合于各种方法。例如，可由固体材料形成本发明的各种组件，其中可通过微切削加工，薄膜沉积工艺，例如旋涂和化学气相沉积，激光制造，照相平版技术，蚀刻方法，其中包括湿法化学或等离子体工艺，和类似方法，形成通道。参见，例如Scientific American,248:44-55,1983(Angell等人)。在一个实施方案中，通过在硅片内的蚀刻特征，由硅形成至少一部分流体体系。由硅精确并有效地制造本发明的各种流体体系和装置的技术是已知的。在另一实施方案中，可由聚合物，例如弹性体聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)，聚四氟乙烯(“PTFE”或
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)或类似物，形成本发明体系和装置中的各种组件。
可由不同材料制造不同组件。例如，可由不透明材料，例如硅或PDMS，制造含底壁和侧壁的基座(base)部分，和可由透明或至少部分透明的材料，例如玻璃或透明聚合物制造顶部部分，以供观察和/或控制流体工艺。可涂布组件，以便将所需的化学官能度暴露于接触通道内壁的流体下，在此情况下，基座支持材料不具有精确的所需官能度。例如，正如所述的，可采用用另一材料涂布的通道内壁，制造组件。制造本发明体系和装置中的各种组件所使用的材料，例如涂布流体通道内壁所使用的材料可所需地选自没有负面影响流经流体体系的流体或者受到其影响的那些材料，例如在装置内所使用的流体存在下化学惰性的材料。
在一个实施方案中，由聚合物和/或挠性和/或弹性材料，制造本发明的各种组件，且可方便地由可硬化的流体形成，从而有助于借助模塑(例如，复制模塑，注塑，浇注成形等)制造。可硬化流体可以基本上是可诱导固化或者自发固化成固体的任何流体，所述固体能包含和/或运输在流体网络中且与之一起使用而加以考虑的流体。在一个实施方案中，可硬化流体包括聚合物流体或液体聚合物前体(即“预聚物”)。合适的聚合物液体可包括例如，在其熔点以上加热的热塑性聚合物，热固性聚合物，或这种聚合物的混合物。作为另一实例，合适的聚合物液体可包括一种或更多种聚合物在合适的溶剂内的溶液，当例如通过蒸发除去溶剂时，所述溶液形成固体聚合物材料。可以由例如熔体状态或者通过溶剂蒸发硬化的这种聚合物材料是本领域技术人员公知的。对于其中母模之一或二者由弹性体材料组成的实施方案来说，各种聚合物材料(它们中的许多是弹性的)是合适的，且还合适地用于形成模具或母模。这些聚合物实例的非限定性列举包括下述通用组的聚合物：硅酮聚合物，环氧聚合物，和丙烯酸酯聚合物。环氧聚合物的特征在于存在常常称为环氧基，1,2-环氧化物或环氧乙烷的三元环醚基。例如，除了基于芳族胺，三嗪和脂环族主链的化合物以外，还可使用双酚A的二缩水甘油醚。另一实例包括已知的酚醛清漆聚合物适合于本发明使用的硅酮弹性体的非限定性实例包括由含氯代硅烷，例如甲基氯代硅烷，乙基氯代硅烷，苯基氯代硅烷等的前体形成的那些。
在一组实施方案中，优选硅酮聚合物，例如硅酮弹性体聚二甲基硅氧烷。PDMS聚合物的非限定性实例包括由Dow Chemical Co.,Midland,MI以商品名Sylgard销售的那些，和尤其是Sylgard 182，Sylgard 184，和Sylgard 186。含PDMS的硅酮聚合物具有简化制造本发明微流体结构的数个有益的性能。例如，这些材料便宜，可容易获得，且可由预聚物液体借助加热固化而硬化。例如，通过将预聚物液体暴露于例如约65℃－约75℃的温度下例如约1小时的暴露时间，PDMS典型地可固化。此外，硅酮聚合物，例如PDMS可以是弹性体，因此可以用于形成在本发明的一些实施方案中必须的具有相对高长径比的非常小的特征。关于这一点，挠性(例如弹性)模具或母模可以是有利的。
由硅酮聚合物，例如PDMS形成结构诸如本发明微流体结构的一个优点是，这些聚合物例如通过暴露于含氧等离子体，例如空气等离子体下，能被氧化，结果氧化的结构在其表面含有能与其他氧化的硅酮聚合物表面或者与各种其他聚合物和非聚合物材料的氧化表面交联的化学基团。因此，可制造组件，然后氧化，且基本上不可逆地密封到其他硅酮聚合物表面上，或者密封到对氧化硅酮聚合物表面具有反应性的其他基底表面上，且不需要单独的粘合剂或其他密封手段。在大多数情况下，可简单地通过氧化硅酮表面与另一表面接触，完成密封，不需要施加辅助压力形成密封件。也就是说，预氧化的硅酮表面对合适的配合表面起到接触粘合剂的作用。具体地，除了不可逆地可密封到自身上以外，氧化硅酮，例如氧化的PDMS也可以不可逆地密封到除了自身以外的一系列氧化材料上，其中包括例如玻璃，硅，氧化硅，石英，氮化硅，聚乙烯，聚苯乙烯，玻璃碳，和环氧聚合物，它们以与PDMS表面类似的方式氧化(例如，借助暴露于含氧等离子体下)。可用于本发明上下文的氧化和密封方法，以及总的模塑技术在本领域中被公开，例如公开于标题为“Rapid Prototyping of MicrofluidicSystems and Polydimethylsiloxane”，Anal.Chem.,70:474-480,1998(Duffy et al.)的文章中，在此通过参考引入。
由氧化的硅酮聚合物形成本发明微流体结构(或内部流体接触表面)的另一优点是，这些表面的亲水性会比典型的弹性体聚合物表面大得多(在期望亲水内表面的情况下)。因此与由典型的未氧化的弹性体聚合物或其他疏水性材料组成的结构相比，可更加容易地用水溶液填充并润湿这种亲水性通道表面。
在一个实施方案中，由不同于一个或更多个侧壁或顶壁的材料，或者其他组分形成底壁。例如，底壁的内表面可包括硅片或微晶片或其他基底的表面。其他组分可如上所述密封到这种替代的基底上。在期望密封含硅酮聚合物(例如，PDMS)的组分到不同材料的基底(底壁)上的情况下，基底可选自氧化的硅酮聚合物能不可逆地密封到其上的材料(例如，已经被氧化的玻璃，硅，氧化硅，石英，氮化硅，聚乙烯，聚苯乙烯，环氧聚合物，和玻璃碳表面)。或者，可使用其他密封技术，这对本领域技术人员来说是显而易见的，其中包括，但不限于，使用单独的粘合剂，热粘结，溶剂粘结，超生焊接等。
2009年10月27日Weitz等人提交的标题为“Droplet CreationTechniques”的美国临时申请序列号No.61/255,239在此通过参考全文引入。
下述实施例拟阐述本发明的一些实施方案，但没有例举本发明的全部范围。
实施例1
下述实施例描述了根据一个非限定性实施方案，多个液滴的形成。具体地，这一实施例示出了形成大的乳液文库的受控和可按比例放大的方法。该方法是自动的，从而要求受到使用者很少的干扰。它还被平行安放，从而允许快速产生文库。
在这一实例中，该方法包括三步，如图1所示。另外，对于这一特定实例来说，文库包括含六种可区分流体(或者含6种可区分物种的流体)的液滴。构成文库的不同流体被置于单独的容器16内，如图1所示；这可通过使用自动移液技术，机器人，或任何其他合适技术来进行。
用于每一容器的溶液然后送入到用载体流体24填充的共同的容器4中，所述载体流体24与容器16中的六种可区分流体基本上不混溶。这一方法在共同的容器4内形成六组不可区分的液滴，其中各组本身是可区分的，但在每一组内，液滴的组成不可区分。在这一实例中，在这一实施方案内，多个液滴2可形成为大的且多分散的液滴(且不一定是微流体液滴)，并在大约几分钟内形成。在液滴之间不存在流体转移，从而使得液滴能在共同的容器4中汇聚在一起，且基本上没有吸收(merger)不同液滴。另外，由于液滴可形成为大的液滴，在一些情况下可使用标准平行移液器，或者其他常见的已知技术，平行地且在大约几秒内形成大的用量。
多个液滴2中的至少一部分可流动到与液滴制造器10有关的微流体通道18(例如，包括通道20和22)内，每次一滴。例如，液滴12进入到微流体通道18内，且当来自液滴12的流体物流穿过液滴制造器10时，形成多个微细液滴14。可采用任何数量的液滴(例如，液滴30和32)，反复这一方法，从而形成基本上不可区分的基本上单分散的多个液滴6。在细分之前，液滴可以是大的和/或多分散的，因此可以以柱塞流(plug)(例如，流体物流)形式流动经过微流体通道朝向液滴制造器。
液滴制造器10可引起液滴细分形成为基本上不可区分的多个基本上单分散的液滴。各种液滴因此可穿过液滴制造器，各自形成基本上单分散和/或不可区分的多个液滴，从而形成含多个微细液滴组的一群液滴6(例如，每一组通过细分具有基本上不可区分组成，例如携带相同物种的液滴形成)。在一些实施方案中，由液滴制造器形成的微细液滴可形成为基本上单分散的(例如在1％以内)。在一些情况下，为了形成基本上单分散的液滴，起始的多个液滴可以比微细液滴的所需尺寸大得多(例如，至少约5倍)。
在一些情况下，这一方法也可按比例放大。可使用标准平行移液器或其他已知技术，以高度平行化的方式形成在细分之前的多个液滴。采用机器人，这可甚至更加快速地实现。例如通过使多个液滴流入到一排微流体制造器或分叉通道内等，也可平行进行由多个液滴形成微细液滴。
实施例2
这一实施例阐述了一群两组液滴，其中每一组可通过组成区分，但每一组的液滴本身在组成上不可区分。
在这一非限定性实例中，制备两种水溶液，一种含有含5mM溴代苯酚蓝的溶液，和另一种含有蒸馏水。在HFE-7500中用表面活性剂预乳化该溶液。用固定到PE/5管材上的宽针将预乳化的液滴装载在注射器内。更具体地，为了装载预乳化液滴，用装订夹夹持管材，并从注射器中取出活塞。将预乳液倾倒在注射器背面，并再插入活塞，和轻弹注射器，以便针面朝上。取出装订夹，并推出注射器内的任何空气。
在这一点处，注射器含有或者无色(例如，包括水)或者蓝色(例如，包括含溴代苯酚蓝的溶液)的一群液滴。液滴的平均直径为约2mm。然后将注射器置于注射器泵上，所述注射器泵泵送预乳液到微流体流动聚焦液滴制造器内，在此添加额外的油。预乳液和油的流速分别为700uL/hr和1100uL/hr。这一工艺引起由每一较大液滴形成多个微细液滴。然后将微细液滴收集在含有1mL FC40氟烃油的3mL注射器内。微细液滴滴落在注射器内，并形成上升到顶部的乳霜(cream)。在所有较大的液滴细分成微细液滴之后，旋转该收集注射器约30秒，在容器内均匀地分布微细液滴。然后，将微细液滴的小样品置于玻璃载片上，用明视野显微镜进行成像(图2)。在这一图像中，两群液滴清晰可见，也就是说，含无色水的液滴和含染料的液滴。液滴全部具有大致相同的平均直径。
实施例3
这一实施例阐述了含多个液滴组的一群液滴，其中每一组在组成上可区分，但每一组的液滴本身在组成上不可区分。
在这一实例中，为了预乳化溶液，将每一溶液移液到用载体油(HFE-7500氟烃油)和表面活性剂(E0665，它包括与全氟化二嵌段尾相连的亲水PEG头基)填充的小瓶内。将溶液移液到油内的过程会引起形成大液滴，所述大液滴对因表面活性剂导致的聚结表现稳定。这一工艺形成含由每一溶液形成的可区分液滴组的一群大的多分散液滴。为了由较大液滴群形成单分散的较小液滴群(例如微细液滴)，使用微流体液滴制造器，进一步乳化较大液滴。为了这样，使用液滴制造器的喷嘴截面尺寸为25×25微米的流动聚焦液滴制造器。使用软光刻方法，在聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)中制造液滴制造器。为了引起氟烃油润湿装置表面并包封水溶液，化学处理通道，使得它们疏水。用Aquapel填充通道，并允许静置30秒，之后使空气流过通道，除去过量的Aquapel。然后，在使用之前，在设定为65℃的烘箱中加热该装置5分钟。
较大液滴的体积比微流体液滴制造器的体积大得多。结果，较大的液滴当流经液滴制造器时，形成长的未破裂的物流或流体柱塞。使用与实施例2中所述的方法类似的方法，将长的流体柱塞形成为单分散的多个微细液滴。在一些情况下，在不希望束缚于理论的情况下，可能产生一群适中的多分散的微细液滴，这是因为柱塞的尺寸有限导致的。例如，在柱塞的末端，不可能存在充足的流体形成所需尺寸的微细液滴。然而，在其中较大液滴的体积为微细液滴尺寸的至少约5倍或更大(例如100倍)的情况下，所形成的微细液滴可以是单分散或者基本上单分散的。例如，对于直径为约2mm的较大液滴来说，若所形成的微细液滴的直径为约20微米，则较大液滴比微细液滴大大约1百万倍，因此这一效果没有显著归因于多分散性。
在含FC40氟烃油的收集腔室内收集多个微细液滴，因此将所有的微细液滴汇聚在一起。在这一实例中，存在FC40油会增加液滴的表面张力，从而使得液滴更加硬质且抗剪切，且还减少溶质在连续相内的分配，有助于包封。在所有微细液滴被收集之后，温和地旋转收集腔室约30秒，使液滴在腔室内均匀地分布。
在一些情况下，重要的是可确保选择形成较大液滴所使用的油与表面活性剂的结合物，以便液滴对聚结表现稳定。在这一实例中，已发现，使用HFE-7500与PEG-全氟化二嵌段表面活性剂得到极端稳定的一群较大液滴，正如图3A所示，图3A示出了由蒸馏水(无色)和溴代苯酚蓝染色(蓝-黑)的液滴组成的包装的预乳液的图像。然而，应当理解，可采用各种其他氟烃，烃，和硅油以及表面活性剂，制造稳定的液滴群。另外，预乳化所使用的油和表面活性剂不需要与微乳化步骤所使用的那些相同，这是因为不同的油常常具有不同的比重，从而允许不想要的相在离心作用下分离。这使得该方法相对于选择油和表面活性剂来说，非常灵活。
在一些情况下，同样重要的是，就在液滴进入到微流体液滴制造器内之前，从较大液滴群中除去不想要的粒状物。这是因为微流体液滴制造器包括窄的通道且不存在过滤器可导致装置堵塞。典型的微流体过滤器包括在其间具有窄间隙的一排柱桩；柱桩过滤掉不想要的粒状物，同时允许流体在周围流动，进入到液滴制造器内。当液滴流过过滤器时，这一过滤器可引起较大液滴劈裂成小的多分散液滴。小的多分散液滴然后进入到微流体液滴制造器内，并可导致形成微细液滴的多分散文库。为了避免较大液滴被过滤器劈裂，形成专门的过滤器，以除去任何粒状物，同时还防止较大液滴劈裂。过滤器包括具有到达液滴制造器的不同路径长度的柱桩之间的间隙，和因此不同的水动阻力。图3B示出了过滤器的图像。更具体地，该图最左端的间隙具有最短的路径长度和最低的水动阻力，而该图最右端的间隙具有最长的路径长度和最大的水动阻力。结果，当较大液滴进入到过滤器内时，它仅仅流经第一间隙并保持连续柱塞流。若粒状物进入过滤器内，则它在间隙内被钩住，在周围转移流动到下一间隙，所述下一间隙成为最小阻力的下一路径。这一过滤器允许除去粒状物，同时还保持较大液滴完整。
为了证明这一方法的有效性和该方法提供由较大液滴群形成多个微细液滴的容易程度，形成含8种不同组成的液滴群。为了形成不同的组成，使用由不同浓度的两种荧光染料(绿色染料(fluorocien))和红色染料(Alexafluor680))组成的水溶液。8个不同的液滴类型具有两种不同浓度的绿色染料和四种浓度的红色染料。如上所述，将该溶液形成为大的液滴，然后，如上所述，将较大液滴细分成多个微细液滴(平均直径35微米)。将所形成的微细液滴收集到含有FC40的注射器内，旋转所述注射器30秒，均匀地分布液滴，然后允许经2分钟搅成乳霜，在这一时间段内，较轻的含水液滴飘浮到注射器的顶部，而较重的氟烃油下沉。然后将密闭包装的微细液滴再注入到1000微米宽、25微米高的微流体通道内。由于平均液滴直径超过通道高度，因此微细液滴以单层形式流动，从而允许每一液滴单独地成像。
为了激发液滴内的荧光染料，使用配备双带激发过滤器和二色性镜子的落射荧光显微镜；光学组件在样品内反射480+/-10nm和660+/-10nm的波长(分别为绿色和红色染料的激发带)，同时允许从样品发出的光经过。所发出的光被反向的物镜(objective)捕获并通过两个CCD照相机成像。在到达照相机之前，光遇到高流通(high-pass)的二色性镜子(560nm)，它反射绿光并使红光穿过。绿光在到达一个照相机之前，先穿过540+/-10nm发射过滤器，而红光在到达第二照相机之前，先穿过690+/-10nm发射过滤器。在采用照相机和这一光学装备(setup)的情况下，在每一微细液滴内的绿色和红色荧光同时成像。图4A－4B分别示出了微细液滴的绿色和红色通道图像。
为了测量液滴的强度，使用图像分析技术，首先鉴定液滴，然后测量在绿色和红色图像二者内每一液滴的强度。对于每一液滴，将绿色和红色强度值储存在数据文件中。图5A－5B分别示出了绿色和红色通道的强度柱状图。正如所设计的，绿色通道显示出两个峰值，和红色通道显示出四个峰值，这相应于每一染料的不同浓度。为了证明八种结合物可用作液滴的光学标签，对于图5C中的每一液滴，用绿色强度对红色强度作图。各点簇聚成八个不同区域，其中每一区域对应于独特的色码。
尽管此处描述并阐述了本发明的数个实施方案，但本领域的技术人员会容易想到行使本发明所述的功能和/或获得本发明所述的结果和/或一个或更多个优点的各种其他方式和/或结构，和这些变化或改性中的每一种被认为在本发明的范围内。更一般地，本领域的技术人员会容易地理解本发明所述的所有参数，尺寸，材料和结构是例举，且实际的参数，尺寸，材料和结构取决于具体的应用或利用本发明教导的应用上。本领域的技术人员要意识到或者能确认使用仅仅常规试验，可作出此处所述的本发明具体实施方案的许多等价方案。因此，要理解，仅仅作为实例列出了前述实施方案，且在所附权利要求的范围及其等价范围内，可实践不同于此处具体地描述和/或要求保护的发明。本发明涉及此处所述的每一单独的特征，体系，材料和/或方法。另外，两个或更多个这些特征，体系，制品，材料和/或方法的任何组合包括在本发明的范围内，如果这些特征，体系，制品，材料和/或方法没有相互不一致的话。
此处所述的所有定义仅仅是为了本发明公开内容的目的。这些定义不应当必然归因于其他共同拥有的专利和/或专利申请，而与是否涉及这一公开内容无关。此处所使用的定义应当理解为对字典定义，通过参考引入的文献中的定义和/或所定义的术语的常见含义的控制。
还应当理解，除非另有相反的说明，在此处要求保护的包括大于一个行为(act)的任何方法中，方法中的行为顺序不一定限于方法行为在其内引证的顺序。
根据美国专利局专利审查程序手册，2111.03部分，在权利要求中，以及在上述说明书中，所有过渡措辞，例如“含”，“包括”，“携带”，“具有”，“牵涉”，“保持”和类似措辞要理解为开放式，即是指包括，但不限于。仅仅过渡措辞“由…组成”和“基本上由…组成”分别是封闭式和半封闭式过渡措辞。

Claims (20)

1.形成多个液滴的方法，该方法包括：
提供含基本上被第二流体包围的第一流体的至少一个液滴；和
使至少一个液滴流过微流体通道，形成多个微细液滴。
2.权利要求1的方法，其中第一流体和第二流体基本上不混溶。
3.权利要求1的方法，其中多个微细液滴基本上被第二流体包围。
4.权利要求1的方法，包括提供多个液滴，其中每一液滴基本上被第二流体包围，并使至少一些液滴流经微流体通道，以便流经微流体通道的每一液滴被细分，形成两个或更多个微细液滴。
5.权利要求1的方法，包括提供多个液滴，其中每一液滴基本上被第二流体包围，并使至少一些液滴流经微流体通道，以便流经微流体通道的每一液滴被细分，形成基本上相同数量的微细液滴。
6.权利要求4的方法，其中对于流经微流体通道的每一液滴来说，由每一液滴形成的两个或更多个微细液滴具有的直径分布使得不大于约5％的微细液滴的直径大于所形成的全部微细液滴的平均直径的约10％。
7.权利要求5的方法，其中多个微细液滴具有的直径分布使得不大于约5％的液滴的直径大于液滴平均直径的约10％。
8.权利要求5的方法，其中多个液滴在其内含有至少四种可区分的物种，以便不大于约5％的液滴在其内含有所述至少四种可区分物种中的两种或更多种。
9.权利要求8的方法，其中所述至少四种可区分的物种包括至少四种可区分的核酸。
10.权利要求8的方法，其中所述至少四种可区分的物种包括至少四种可区分的鉴定元素。
11.权利要求8的方法，其中所述至少四种可区分的物种包括至少四种可区分的蛋白质。
12.权利要求1的方法，其中所述至少一个液滴的平均直径大于约500微米，和多个微细液滴的平均直径小于约500微米。
13.权利要求1的方法，其中由至少一个第一液滴形成至少约10个微细液滴。
14.权利要求1的方法，其中由至少一个第一液滴形成至少约50个微细液滴。
15.权利要求1的方法，其中多个第二微细液滴的平均直径小于约1000微米，和其中液滴基本上是单分散的。
16.权利要求1的方法，包括提供含至少一个第一物种的第一液滴，和含与第一物种可区分的至少一个第二物种的第二液滴、
17.权利要求16的方法，包括形成含多个微细液滴的乳液，其中每一微细液滴包括一部分第一液滴或一部分第二液滴，其中乳液内微细液滴的平均直径小于约1000微米。
18.一种制品，它包括：
含多个液滴的流体，其中至少一些液滴具有可区分的组成；和
使用在该流体内包含的多个液滴能产生微细液滴的流动聚焦装置，所产生的微细液滴具有的直径分布使得不大于约5％的液滴的直径大于液滴平均直径的约10％。
19.权利要求18的制品，其中流体含有至少五个可区分的液滴。
20.权利要求18的制品，其中由每一液滴产生至少10个微细液滴。
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