CN117098607A - 用于浓缩乳液中的液滴的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于形成液滴和浓缩液滴的装置及其使用方法。在所述装置运行期间，使用两种液相生成液滴。一旦液滴形成完成，则通过使用一个或多个压差移除过量的连续相。
Description
背景技术
许多生物医学应用依赖于对与液滴中的一种或多种试剂结合的样品进行高通量测定。例如，在研究和临床这两类应用中，使用目标特异性试剂的高通量基因检测能够在药物发现、生物标志物发现和临床诊断及其他过程中提供关于样品的信息。用于产生液滴的改进的装置和方法将是有益的。
发明内容
在一个方面，本发明的特征在于用于浓缩液滴的方法。所述方法包括(a)提供装置，所述装置具有(i)第一通道，所述第一通道具有第一近侧端部、第一远侧端部、第一深度和第一宽度；(ii)液滴源区域，所述液滴源区域与所述第一通道的所述第一远侧端部流体连通，其中所述液滴源区域的宽度或深度大于所述第一宽度或所述第一深度；以及(iii)收集储器，所述收集储器与所述液滴源区域流体连通并收集在所述液滴源区域中形成的液滴，(b)使第一液体从所述第一近侧端部流向所述液滴源区域，以在收集储器中的第二液体中产生所述第一液体的液滴的乳液，以及(c)通过在第一时间段内施加第一压差和在第二时间段内施加第二压差来减少所述乳液中所述第二液体的体积，以产生浓缩乳液。
在一些实施方案中，该方法还包括通过移液以基本上相等的等分试样的形式移除浓缩乳液。在一些实施方案中，等分试样中第二液体的体积分数大致相同。
在一些实施方案中，第二时间段大于第一时间段。在一些实施方案中，第一压差大于第二压差。在一些实施方案中，第一时间段介于1秒与60秒之间。在一些实施方案中，第二时间段介于30秒与600秒之间。在一些实施方案中，第一压差介于1.0PSI与10PSI之间。在一些实施方案中，第二压差介于0.01PSI与1.0PSI之间。
在一些实施方案中，该装置还包括与第一近侧端部流体连通的第一储器。
在一些实施方案中，第一液体包含颗粒，并且液滴还包含颗粒。
在一些实施方案中，该装置还包括第二通道，该第二通道具有第二近侧端部、第二远侧端部、第二深度、第二宽度；其中第二通道在第一近侧端部与第一远侧端部之间与第一通道相交，并且其中使第一液体从第一近侧端部流向液滴源区域以在收集储器中的第二液体中产生第一液体的液滴的乳液还包括使第三液体从第二近侧端部流向与第一液体结合的相交部处，并且液滴还包含第三液体。
在一些实施方案中，该装置还包括与第二近侧端部流体连通的第二储器，并且其中在减少乳液中第二液体的体积的步骤期间，第二储器和收集储器中的压力基本上相同。
在一些实施方案中，该装置还包括具有第三近侧端部和第三远侧端部的第三通道，其中第三近侧端部与收集储器流体连通，并且第一压差和第二压差将第二液体从收集储器输送至第三远侧端部。
在一些实施方案中，该方法还包括与第三远侧端部流体连通的第三储器。在一些实施方案中，第一液体是水性的或者可与水混溶的。在一些实施方案中，第二液体是油。在一些实施方案中，浓缩乳液是至少80％体积的液滴。
在一些实施方案中，收集储器与第三通道之间的界面的深度介于10μm与30μm之间。在一些实施方案中，该装置包括阻碍液滴离开收集储器的过滤器。在一些实施方案中，过滤器包括多个柱。
定义
对于本发明的公开内容中使用的特定术语提供以下定义。在值被描述为范围的情况下，应当理解，此类公开内容包括此类范围内的所有可能子范围的公开内容，以及落入此类范围内的具体数值，而不论具体数值或具体子范围是否被明确陈述。
如本文所用，术语“约”是指所列举值的±10％。
术语“衔接物”、“衔接子”和“标签”可以同义地使用。可以通过任何方法(包括连接、杂交或其他方法)将衔接物或标签偶联到要“加标签”的多核苷酸序列。
如本文所用，术语“条形码”一般是指传达或能够传达关于分析物的信息的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以是连接至分析物(例如，核酸分子)的标签或该标签加上分析物的内在特性(例如，分析物或末端序列的大小)的组合。条形码可以是独特的。条形码可以具有各种不同的形式。例如，条形码可包括多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码能够以可逆或不可逆方式附接到分析物。条形码可以在样品测序之前、期间和/或之后加入例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许实时鉴定和/或量化各个测序读段。
如本文所用，术语“珠粒”一般是指颗粒。珠粒可以是固体或半固体颗粒。珠粒可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以包括聚合物基质(例如，通过聚合或交联形成的基质)。聚合物基质可以包括一种或多种聚合物(例如，具有不同官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基质中的聚合物可以是随机排列的，例如在随机共聚物中，和/或具有有序结构，例如在嵌段共聚物中。交联可以经由共价、离子或诱导相互作用或者物理缠结实现。珠粒可以是大分子。珠粒可以由结合在一起的核酸分子形成。珠粒可以经由分子(例如，大分子)诸如单体或聚合物的共价或非共价组装形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是或包括例如核酸分子(例如DNA或RNA)。珠可以由聚合材料形成。珠粒可以是磁性的或非磁性的。珠粒可以是刚性的。珠粒可以是柔性的和/或可压缩的。珠粒可以是可破坏的或可溶解的。珠粒可以是覆盖有包含一种或多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，基于金属的颗粒，包括但不限于氧化铁、金或银)。此类涂层可以是可破坏的或可溶解的。
如本文所用，术语“生物颗粒”一般是指来源于生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是来自细胞的细胞器。来自细胞的细胞器的实例包括但不限于细胞核、内质网、核糖体、高尔基氏体、内质网、叶绿体、胞吞囊泡、胞吐囊泡、液泡和溶酶体。生物颗粒可以是来自细胞群的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或无论从单细胞生物体还是多细胞生物体衍生的任何其他细胞类型。生物颗粒可以是细胞的成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以是或可以包括基质(例如，凝胶或聚合物基质)，该基质包含细胞或来自细胞的一种或多种成分(例如，细胞珠粒)，诸如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或它们的任何组合。生物颗粒可以获自受试者的组织。生物颗粒可以是硬化的细胞。此类硬化细胞可以包括或可以不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或多种成分，但是可以不包括细胞的其他成分。此类成分的一个实例是细胞核或细胞的另一种细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以是能够被培养的，例如，当被封闭在凝胶或聚合物基质中时被培养，或者当包含凝胶或聚合物基质时被培养。
如本文所用，术语“流动路径”是指供液体从至少一个入口流到至少一个出口的通道和其他结构的路径。流动路径可以包括分支，并且可以例如通过公共入口或连接通道连接到相邻的流动路径。
如本文所用，术语“流体地连接”是指至少两个装置元件(例如，通道、储器等)之间的直接连接，其允许流体在此类装置元件之间移动，而无需穿过中间元件。
如本文所用，术语“以流体方式设置在……与……之间”是指一个元件在另外两个元件之间的位置使得流体可以在一个流动方向上流过这三个元件。
如本文所用，术语“基因组”一般是指来自受试者的基因组信息，该基因组信息可以是例如受试者的遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以在DNA中或RNA中编码。基因组可以包含(编码蛋白质的)编码区以及非编码区。基因组可以包含生物体中所有染色体一起的序列。例如，人类基因组具有总共46个染色体。所有这些染色体一起的序列可以构成人类基因组。
如本文所用，术语“与……流体连通”是指至少两个装置元件(例如，通道、储器等)之间的连接，其允许流体在穿过或不穿过一个或多个中间装置元件的情况下在此类装置元件之间移动。当流体连通的两个隔室直接连接时，即以允许流体交换而无需流体通过任何其他中间隔室的方式连接时，这两个隔室被认为是流体连接的。
如本文所用，术语“大分子成分”一般是指包含在生物颗粒内或来自生物颗粒的大分子。大分子成分可以包括核酸。在一些情况下，生物颗粒可以是大分子。大分子成分可以包括DNA或DNA分子。大分子成分可以包括RNA或RNA分子。RNA可以是编码的或非编码的。RNA可以是例如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转运RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA分子可以是(i)成簇的规则间隔短回文(CRISPR)RNA分子(crRNA)或(ii)单向导RNA(sgRNA)分子。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转运RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、与Piwi蛋白相互作用的RNA(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。大分子成分可以包括蛋白质。大分子成分可以包括肽。大分子成分可以包括多肽或蛋白质。该多肽或蛋白质可以是细胞外或细胞内的多肽或蛋白质。大分子成分也可以包括代谢物。本领域技术人员将会知道这些和其他合适的大分子成分(也称为分析物)(参见美国专利号10,011,872和10,323,278，以及PCT公开号WO 2019/157529，其中每一者均全文以引用方式并入本文)。
如本文所用，术语“分子标签”一般是指能够结合于大分子成分的分子。分子标签可以以高亲和力结合于大分子成分。分子标签可以以高特异性结合于大分子成分。分子标签可以包括核苷酸序列。分子标签可以包括寡核苷酸或多肽序列。分子标签可以包括DNA适体。分子标签可以是或包含引物。分子标签可以是或包含蛋白质。分子标签可以包含多肽。分子标签可以是条形码。
如本文所用，术语“油”通常是指与水不可混溶的液体。油可以具有高于或低于水的密度和/或高于或低于水的粘度。
术语“细胞的微粒组分”是指来源于细胞或其片段并且至少一种尺寸为0.1μm(例如，至少0.1μm、至少1μm、至少10μm，或至少100μm)的离散生物系统。细胞的微粒组分可以是例如细胞器，诸如细胞核、内质网、核糖体、高尔基氏体、内质网、叶绿体、胞吞囊泡、胞吐囊泡、液泡、溶酶体或线粒体。
如本文所用，术语“样品”一般是指受试者的生物样品。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品可以来源另一种样品。样品可以是组织样品，诸如活检样品、芯针活检样品、针抽吸物或细针抽吸物。样品可以是液体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是颊拭子。样品可以是血浆或血清样品。样品可以包含生物颗粒，例如细胞或病毒，或者它们的群体，或者样品可以替代性地不含生物颗粒。无细胞样品可以包含多核苷酸。可以从身体样品分离多核苷酸，该身体样品可以选自由血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液组成的组。
如本文所用，术语“测序”一般是指用于确定一个或多个多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法和技术。这些多核苷酸可以是例如核酸分子，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可以由当前可用的各种系统执行，诸如但不限于、Pacific Biosciences/>、Oxford或Life Technologies(ION />)生产的测序系统。另选地或此外，测序可以使用核酸扩增、聚合酶链反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来执行。此类系统可以提供与受试者(例如，人类)的遗传信息相对应的多个原始遗传数据，如这些系统从受试者提供的样品所生成的。在一些实例中，此类系统提供测序读段(本文也称为“读段”)。读段可以包括与已被测序的核酸分子的序列相对应的一连串核酸碱基。在一些情况下，本文所提供的系统和方法可以与蛋白质组信息一起使用。
如本文所用，术语“侧通道”是指与液滴源区域流体连通但没有流体地连接到液滴源区域的通道。
如本文所用，术语“受试者”一般是指动物诸如哺乳动物(例如，人类)或禽(例如，鸟)，或其他生物体诸如植物。受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、小鼠、灵长类动物、猿或人。动物可以包括但不限于农场动物、运动动物和宠物。受试者可以是健康或无症状的个体、患有或疑似患有疾病(例如，癌症)或易患该疾病的个体或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。
如本文中关于储器或通道内的压力所使用的术语“基本上相同”通常是指当第一储器或通道内的压力在第二储器或通道内的压力的±10％以内时的状态。
附图说明
图1A和图1B是装置的示意性设计，该装置包含第一储器、可用于容纳第一液体的第一通道、第二储器、可用于容纳第二液体的第二通道、液滴源区域、收集储器、第三储器和第三通道。在所示的示例性装置中，所有部件都是流体连接的。图1B显示了收集储器与包括过滤器的第三通道之间的界面的特写。
图2是显示具有不同水平的乳液体积的小瓶的照片。在该实验中使用了两个压差(第一压差为4.0PSI持续30秒，并且然后压差为0.3PSI持续300秒)。管1-2和5-6显示了两次单独的液滴生成运行以及随后施加两个压差的结果。两次抽吸后，管3-4和7-8显示无残留乳液。
图3A是在4.0PSI的压差持续30秒之后的八个小瓶的一对照片，该小瓶含有来自两次实验的乳液，每次实验的四种抽吸物。
图3B是4.0PSI的第一压差持续30秒、4.0PSI的第二压差持续38秒、0.6PSI的第三压差持续60秒和0.3PSI的第四压差持续60秒，持续时间188秒之后的八个小瓶的一对照片，该小瓶含有来自四次独立实验的乳液，每次实验的两种抽吸物。
图3C是4.0PSI的第一压差持续30秒、4.0PSI的第二压差持续38秒、1.2PSI的第三压差持续60秒、0.6PSI的第四压差持续5秒以及0.3PSI的第五压差持续5秒，持续时间138秒之后的八个小瓶的一对照片，该小瓶含有来自四次独立实验的乳液，每次实验的两种抽吸物。
图4是一系列图表，显示了四个参数的平均值和标准偏差：油Δ(第一抽吸物的油体积与第二抽吸物的油体积之间的差)、估计的油分数(第一抽吸物和第二抽吸物中油的总体积)、水分数(aqueous fraction)(第一抽吸物和第二抽吸物中液滴乳液的总体积除以总液体体积)以及收集孔中的总体积，以响应不同的压差范例。
图5是一系列图表，显示了四个参数的平均值和标准偏差：油Δ(第一次抽吸物的油体积与第二抽吸物的油体积之间的差)、产品孔中的总体积(推回后孔中的总体积，其包括总的水和剩余的油)、水分数(AQ)(输出中水体积与水和油体积的比率)和水体积(200μL乳液集合中水体积的量)。
图6是一系列图表，显示了三个参数的平均值和标准偏差：预期的GEMS数量(预期的乳液包凝胶珠粒的总数)、预期的过量体积(抽吸后剩余的预期总体积)和油Δ(第一抽吸物的油体积与第二抽吸物的油体积之间的差)。
具体实施方式
本发明提供了用于形成液滴、浓缩液滴的装置(例如，微流体装置)和方法，以及它们的使用方法。该装置可用于形成含有生物颗粒(例如，细胞)的液滴。在装置操作期间，使用两种液相(例如，油相和水相)生成液滴。一旦液滴形成完成，通常会存在过量的油，导致液滴的堆积密度和回收效率降低，这可能会影响进一步的操作或分析。此外，由于密度小于连续相的液滴的浮力，位于收集储器顶部附近的液滴比位于底部的液滴更紧密地堆积。因此，当收集多于一种的液滴乳液的抽吸物时，抽吸物具有不同的水体积和不同数量的液滴。本发明提供了通过使用一个或多个压差来减少过量油的方法，从而增加液滴的堆积密度，使乳液在多个抽吸物中均化，并使最终使用者收集的液滴量最大化。
液滴装置
用于产生液滴或颗粒的装置可以与本文描述的方法结合使用。一般来讲，液滴或颗粒由液滴或颗粒源提供。可以首先通过使第一液体流经通道并进入包含第二液体(即，连续相)的液滴或颗粒源区域而形成液滴或颗粒，该第二液体可以是主动流动的，也可以是不主动流动的。液滴或颗粒可以通过本领域已知的任何合适的方法来形成。一般来讲，液滴形成包括两种液相。这两种液相可以是例如样品相和油相。在形成期间，形成多个离散体积的液滴或颗粒。
液滴可以通过以下方式来形成：摇动或搅拌液体以形成各个液滴，从而产生含有各个液滴的悬浮液或乳液，或者通过移液技术(例如用针头等)形成液滴。可以使用毫米流体、微米流体或纳米流体液滴生成器来形成液滴。此类液滴生成器的实例包括例如T型结液滴生成器、Y型结液滴生成器、通道内通道结液滴生成器、交叉(或“X”形)结液滴生成器、流动聚焦结液滴生成器、微毛细管液滴生成器(例如，同向流动或流动聚焦)和三维液滴生成器。液滴可以使用流动聚焦装置或使用乳化体系(诸如均化、膜乳化、剪切细胞乳化和流体乳化)来产生。
离散的液滴可以被润湿微通道的载送流体包封。这些液滴(有时称为栓塞)形成在其中发生反应的分散相。使用栓塞的系统与分段流动注射分析的不同之处在于栓塞中的试剂不与微通道发生接触。在T型结中，分散相和连续相从“T”的两个分支注入。分散相的液滴由于流体-流体界面处的剪切力和界面张力而产生。与通道壁具有较低界面张力的相是连续相。为了在流动聚焦构造中生成液滴，连续相通过两个外部通道注入，分散相通过中央通道注入窄孔口中。本领域技术人员将会知道用于产生液滴的其他几何设计。产生液滴的方法在以下文献中公开：Song等人，Angew.Chem.45:7336-7356,2006；Mazutis等人，Nat.Protoc.8(5):870-891,2013；美国专利号9,839,911；美国专利公开号2005/0172476、2006/0163385和2007/0003442；PCT公开号WO 2009/005680和WO 2018/009766。在一些情况下，电场或声波可以用于产生液滴，例如，如PCT公开号WO 2018/009766中所述。
在一个实施方案中，液滴源区域包括搁板区域，该搁板区域允许液体基本上在一个维度上(例如，垂直于流动方向)膨胀。搁板区域的宽度大于第一通道在其远侧端部处的宽度。在某些实施方案中，第一通道是不同于搁板区域的通道，例如，搁板区域相比第一通道的远侧端部加宽，或者以比第一通道的远侧端部更陡的斜率或曲率加宽。在其他实施方案中，第一通道和搁板区域合并成连续的流动路径，例如，从其近侧端部到其近侧端部线性或非线性地加宽的流动路径；在这些实施方案中，第一通道的远侧端部可以被认为是沿合并的第一通道和搁板区域的任意点。在另一个实施方案中，液滴源区域包括台阶区域，其提供空间位移并允许液体在多于一个维度上膨胀。空间位移可以相对于通道向上或向下，或者向上和向下。对方向的选择可以基于分散相和连续相的相对密度来进行，当分散相的密度小于连续相时采用向上的台阶，当分散相的密度大于连续相时采用向下的台阶。液滴源区域也可以包括搁板区域和台阶区域的组合，例如，搁板区域设置在通道与台阶区域之间。该实施方案的示例性装置在WO 2019/040637和WO 2020/176882中描述，该专利的液滴形成装置据此以引用方式并入本文。
不希望受理论束缚，通过使第一液体从远侧端部流入液滴源区域，可以在第二液体中形成第一液体的液滴。在具有搁板区域和台阶区域的实施方案中，第一液体料流在搁板区域中侧向膨胀成盘状形状。当第一液体料流继续流过搁板区域时，该料流进入台阶区域，在该台阶区域中液滴呈现更接近球形的形状并最终与液体料流分离。与在其他系统中不同，通过这种机制形成液滴可以在没有外部驱动连续相的情况下发生。应当理解，连续相可以在液滴形成期间被外部驱动，例如通过温和搅拌或振动，但这种运动对于液滴形成不是必需的。
在这些实施方案中，所生成的液滴的尺寸对液体特性的变化明显较不敏感。例如，所生成的液滴的尺寸对分散相流速较不敏感。从布局和制造的角度来看，添加多个源区域也明显更容易。添加另外的源区域使得即使在一个液滴源区域变得堵塞的情况下，也能够形成液滴。可以通过调整流体通道体系结构的一个或多个几何特征(诸如一个或多个流体通道的宽度、高度和/或扩展角)来控制液滴形成。例如，可以控制液滴尺寸和液滴形成速度。在一些情况下，可以增加在驱动压力下的形成区域的数量，以增加液滴形成的通量。
连续相的被动流动可以仅在初生液滴周围发生。液滴或颗粒源区域还可以包括一个或多个通道，其允许连续相流到第一通道的远侧端部与初生液滴本体之间的位置。这些通道允许连续相在初生液滴后面流动，从而改变(例如，增大或减小)液滴形成的速率。此类通道可以流体地连接到液滴或颗粒源区域的储器或连续相的不同储器。尽管外部驱动连续相不是必需的，但是可以采用外部驱动，例如，以经由附加通道将连续相泵送到液滴或颗粒源区域中。此类附加通道可以位于初生液滴的一侧或两侧，或者位于初生液滴平面的上方或下方。
一般来讲，由本发明的方法提供的装置的部件(例如通道)可以具有至少部分地确定液滴的尺寸的某些几何特征。例如，本文所述的任何通道具有深度、高度h0和宽度w。液滴或颗粒源区域可以具有扩展角α。液滴尺寸可能会随着扩展角的增加而减小。所得到的液滴半径Rd可以通过前述几何参数h0、w和α的以下关系式来预测：
作为非限制性实例，对于w＝21μm、h＝21μm并且α＝3°的通道，预测的液滴尺寸为121μm。在另一个实例中，对于w＝25μm、h＝25μm并且α＝5°的通道，预测的液滴尺寸为123μm。在又一个实例中，对于w＝28μm、h＝28μm并且α＝7°的通道，预测的液滴尺寸为124μm。在一些情况下，扩展角可以在约0.5°至约4°、约0.1°至约10°或约0°至约90°的范围内。例如，扩展角可以至少为约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°，或更高的度数。在一些情况下，扩展角可以至多为约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°，或更低的度数。
第一通道的深度和宽度可以相同，或者一者可以大于另一者，例如宽度大于深度，或者第一深度大于宽度。在一些实施方案中，深度和/或宽度介于约0.1μm与1000μm之间。在一些实施方案中，第一通道的深度和/或宽度为1μm至750μm、1μm至500μm、1μm至250μm、1μm至100μm、1μm至50μm，或3μm至40μm。在一些情况下，当宽度和长度不同时，宽度与深度之比为例如0.1至10，例如0.5至2或大于3，诸如3至10、3至7，或3至5。第一通道的宽度和深度在其长度上可以是恒定不变的，也可以不是恒定不变的。特别地，该宽度可以在远侧端部附近增大或减小。一般来讲，通道可以具有任何合适的横截面，诸如矩形、三角形或圆形，或者它们的组合。在具体实施方案中，通道可以包括沿底表面的沟槽。通道的宽度或深度也可以增大或减小，例如在离散部分中，以改变液体或颗粒的流速或颗粒的排列。
装置还可以包括在其近侧端部与远侧端部之间与第一通道相交的附加通道，例如一个或多个具有第二深度、第二宽度、第二近侧端部和第二远侧端部的第二通道。第一近侧端部和第二近侧端部中的每一个都与液体源流体连通或者被构造成与液体源流体连通，例如流体连接到液体源，该液体源例如与装置成一整体或联接到装置(例如通过管道)的储器。包括一个或多个通道相交部允许从第一通道分离液体或将液体引入第一通道中，例如，与第一通道中的液体结合或不与第一通道中的液体结合的液体，例如，以形成鞘流。通道能够以任何合适的角度与第一通道相交，例如相对于第一通道的中心线介于5°与135°之间，诸如介于75°与115°之间，或者介于85°与95°之间。可以类似地存在附加的通道，以允许引入另外的液体或相同液体的附加流动。多个通道可以在第一通道的同一侧或不同侧与第一通道相交。当多个通道在不同侧相交时，这些通道可以沿第一通道的长度相交，以允许在同一点处引入液体。替代性地，这些通道可以在沿第一通道的长度的不同点处相交。在一些情况下，被配置为引导含有多个颗粒的液体的通道可以含有在该通道的一个或多个表面中的一个或多个沟槽，用于将多个颗粒朝向液滴形成流体连接引导。例如，这种引导可以增加所生成的液滴或颗粒的单独占据率。这些附加通道可以具有上文针对第一通道所论述的任何结构特征。
在一个实施方案中，该装置包括具有第三近侧端部和第三远侧端部的第三通道，其近侧端部与收集储器流体连通(例如，如图1所示)。过量的第二液体可以经由第三通道移除。在一些实施方案中，第三通道具有比第一通道更低的流体阻力，例如，相对于第一通道具有更大的宽度和/或深度。第三通道与收集储器之间的界面可以具有相对浅的尺寸，例如深度，以抑制液滴与第二液体的转移(参见例如图1)。浅尺寸可以与如本文所述的搁板区域的深度近似。
该装置还可以包括过滤器，例如一系列的柱、杆或栅格，以抑制液滴移动到通道中，过量的第二液体通过该通道被移除，例如第一通道和/或第三通道。过滤器可以包括两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个)柱。
一个或多个压差(例如，第一压差和第二压差)从乳液中输送第二液体。过量的第二流体可以沿装置中与乳液的位置流体连通的任何通道(例如，收集储器)输送。例如，第二流体可以沿第一通道或第二通道(如果存在)输送，特别是输送到第一容器或第二容器(如果存在)。替代性地或除此之外，第二流体可以沿第三通道输送，例如输送到第三储器。因此，该装置可以包括压力源或压力歧管或者联接到压力源或压力歧管，以控制相对压力。可以使各种通道或储器中的压力基本上相同，以沿保持在较低的压力下的期望路径引导流动。压差可以由正压或负压或其组合产生。
装置可以包括多个第一通道，例如以增加液滴或颗粒形成的速率。一般来讲，通过增大装置中的液滴或颗粒源区域的数量，通量可以显著增加。例如，假设液体流速基本上相同，具有五个液滴或颗粒源区域的装置生成的液滴或颗粒可以是只具有一个液滴或颗粒源区域的装置生成的液滴的五倍。装置具有的液滴或颗粒源区域可以与液体源(例如储器)的尺寸实际所允许的液滴源区域一样多。例如，该装置可以具有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、2000个或更多个液滴或颗粒源区域。包括多个液滴或颗粒源区域可能需要包括横穿但不相交的通道，例如，流动路径在不同的平面中。多个第一通道可以与单独的源储器和/或单独的液滴源区域流体连通，例如流体地连接到单独的源储器和/或单独的液滴或颗粒源区域。在其他实施方案中，两个或更多个第一通道与同一个流体源流体连通，例如流体地连接到同一个流体源，例如，其中多个第一通道从单个上游通道分支。液滴或颗粒源区域可以包括与第一近侧端部流体连通的多个入口，以及多个出口(例如，与收集区域流体连通的多个出口)(例如，流体地连接到第一近侧端部并且与多个出口流体连通)。液滴或颗粒源区域中的入口数量和出口数量可以相同(例如，可以有3个至10个入口和/或3个至10个出口)。替代性地或除此之外，液滴或颗粒形成的通量可以通过增加第一液体的流速来增加。在一些情况下，通过在单个装置中设置多个单一液滴或颗粒形成装置，例如具有第一通道和液滴或颗粒源区域的装置，例如平行液滴或颗粒形成装置，可以增加液滴或颗粒形成的通量。
搁板区域的宽度可以为0.1μm至1000μm。在具体实施方案中，搁板的宽度为1μm至750μm、10μm至500μm、10μm至250μm，或10μm至150μm。搁板区域的宽度沿其长度可以是恒定的，例如形成矩形形状。替代性地，搁板区域的宽度可以沿其长度背离第一通道的远侧端部增加。这种增加可以是线性的、非线性的，或它们的组合。在某些实施方案中，搁板相对于第一通道的远侧端部的宽度加宽5％至10,000％，例如至少300％(例如，10％至500％、100％至750％、300％至1000％，或500％至1000％)。搁板的深度可以与第一通道相同或不同。例如，第一通道在其远侧端部处的底部和搁板区域的底部可以是共面的。替代性地，在该远侧端部与搁板区域汇合的位置可以存在台阶或斜面。该远侧端部的深度也可以大于搁板区域，使得第一通道在搁板区域中形成凹口。搁板的深度可以为0.1μm至1000μm，例如1μm至750μm、1μm至500μm、1μm至250μm、1μm至100μm、1μm至50μm，或3μm至40μm。在一些实施方案中，该深度沿搁板的长度基本上是恒定的。替代性地，搁板的深度从液体通道的远侧端部到台阶区域倾斜，例如向下或向上倾斜。倾斜搁板的最终深度可以例如比最短深度大5％至1000％，例如10％至750％、10％至500％、50％至500％、60％至250％、70％至200％，或100％至150％。搁板区域的总长度可以为至少约0.1μm至约1000μm，例如0.1μm至750μm、0.1μm至500μm、0.1μm至250μm、0.1μm至150μm、1μm至150μm、10μm至150μm、50μm至150μm、100μm至150μm、10μm至80μm，或10μm至50μm。在某些实施方案中，搁板区域的侧壁(即限定宽度的那些侧壁)可以彼此不平行。在其他实施方案中，搁板区域的壁可以从第一通道的远侧端部朝台阶区域变窄。例如，搁板区域在第一通道远侧端部附近的宽度可以大到足以支持液滴形成。在其他实施方案中，搁板区域基本上不是矩形的，例如，不是矩形或者不是具有圆角或倒角的矩形。
台阶区域包括空间位移(例如，深度)。通常，该位移以约90°(例如，介于85°与95°之间)的角度发生。其他角度也是可能的，例如10°至90°，例如20°至90°、45°至90°，或70°至90°。台阶区域的空间位移可以是待容纳在由本发明的方法提供的装置上的任何合适的尺寸，因为位移的最终程度并不影响装置的性能。优选地，该位移是正在形成的液滴直径的几倍。在某些实施方案中，该位移为约1μm至约10cm，例如至少10μm、至少40μm、至少100μm，或至少500μm，例如40μm至600μm。在一些实例方案中，该位移为至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm、至少65μm、至少70μm、至少75μm、至少80μm、至少85μm、至少90μm、至少95μm、至少100μm、至少110μm、至少120μm、至少130μm、至少140μm、至少150μm、至少160μm、至少170μm、至少180μm、至少190μm、至少200μm、至少220μm、至少240μm、至少260μm、至少280μm、至少300μm、至少320μm、至少340μm、至少360μm、至少380μm、至少400μm、至少420μm、至少440μm、至少460μm、至少480μm、至少500μm、至少520μm、至少540μm、至少560μm、至少580μm或至少600μm。在一些情况下，台阶区域的深度基本上是恒定的。替代性地，台阶区域的深度可以背离搁板区域而增加，例如，以允许下沉或上浮的液滴在它们形成时滚离该空间位移。台阶区域还可以相对于搁板区域在两个维度上增加深度，例如，在搁板区域平面的上方和下方都增加深度。储器可以具有入口和/或出口，用于添加连续相、使连续相流过，或者去除连续相和/或液滴。
虽然由本发明的方法提供的装置的维度可以描述为宽度或深度，但是通道、搁板区域和台阶区域可以设置在任何平面中。例如，搁板的宽度可以在x-y平面、x-z平面、y-z平面或这些平面之间的任何平面中。此外，液滴源区域(例如包括搁板区域)可以在x-y平面中相对于第一通道侧向间隔开，或者位于第一通道的上方或下方。类似地，液滴源区域(例如包括台阶区域)可以在x-y平面中例如相对于搁板区域侧向间隔开，或者位于搁板区域的上方或下方。台阶区域中的空间位移可以在适于允许初生液滴形成球形形状的任何平面中定向。流体部件也可以在不同的平面中，只要满足连通性和其他尺寸要求即可。
该装置还可以包括用于液体试剂的储器。例如，该装置可以包括用于流入第一通道的液体的储器和/或用于液滴或颗粒在其中形成的液体的储器。在一些情况下，装置包括收集区域，例如用于收集所形成的液滴或颗粒的容积。收集区域可以是容纳连续相的储器，或者可以是装置上或装置中的任何其他合适的结构，例如通道、搁板或空腔。对于在收集中使用的储器或其他元件，壁可以是光滑的，并且不包括会阻碍液滴或颗粒运动的正交元件。例如，这些壁可以不包括至少部分地从该表面突出或凹陷的任何特征。然而，应当理解，此类元件可以具有上限或下限。所形成的液滴或颗粒可以在重力作用下移出正在形成的下一个液滴或颗粒的路径(根据液滴或颗粒和连续相的相对密度向上或向下)。替代性地或除此之外，所形成的液滴或颗粒可以在施加到收集区域中的液体上的外力(例如，温和搅拌、流动的连续相，或振动)的作用下移出正在形成的下一个液滴或颗粒的路径。类似地，可以存在用于在附加通道(诸如与第一通道相交的通道)中流动的液体的储器。单个储器还可以连接到装置中的多个通道，例如，当要在该装置中的两个或更多个不同位置处引入相同的液体时。还可以包括废料储器或溢流储器，以在形成液滴或颗粒时收集废料或溢流。替代性地，该装置可以被配置为与液体源配合，该液体源可以是外部储器，诸如小瓶、管或袋。类似地，该装置可以被配置为与容纳储器的独立部件配合。储器可以具有任何合适的尺寸，例如，以容纳10μL至500mL，例如10μL至300mL、25μL至10mL、100μL至1mL、40μL至300μL、1mL至10mL，或者10mL至50mL。当存在多个储器时，每个储器可以具有相同或不同的尺寸。
除上文论述的部件之外，装置还可以包括附加部件。例如，通道可以包括过滤器，以防止碎屑进入装置。在一些情况下，由本文所述的方法提供的微流体装置可以包括一个或多个液体流动单元，以引导一种或多种液体(诸如水性液体和/或与该水性液体不可混溶的第二液体)的流动。在一些情况下，液体流动单元可以包括压缩机，以在上游位置处提供正压，从而引导液体从上游位置流向下游位置。在一些情况下，液体流动单元可以包括泵，以在下游位置处提供负压，从而引导液体从上游位置流向下游位置。在一些情况下，液体流动单元可以包括压缩机和泵两者，其各自处于不同的位置。在一些情况下，液体流动单元可以包括位于不同位置处的不同装置。液体流动单元可以包括致动器。在一些情况下，其中第二液体基本上是静止的，储器可以在每个液滴或颗粒源区域处或附近保持恒定的压力场。装置还可以包括各种阀，以控制液体沿通道的流动，或者以允许液体或液滴或颗粒从装置引入或移除。合适的阀在本领域中是已知的。可用于本发明装置的阀包括隔膜阀、电磁阀、夹管阀，或它们的组合。阀能够以手动方式、电动方式、磁力方式、液压方式、气动方式或通过这些方式的组合来控制。该装置还可以包括一体式液体泵，或者能够连接到泵，以允许泵入第一通道以及任何其他需要流动的通道。压力泵的实例包括注射器、蠕动泵、隔膜泵和真空源。其他泵可以采用离心力或电动力。替代性地，液体运动可以通过重力、毛细作用或表面处理来控制。在单个装置中可以采用多个泵和多种促使液体运动的机制。该装置还可以包括一个或多个通气孔以允许压力均衡，以及一个或多个过滤器以从液体中去除微粒或其他不想要的组分。该装置还可以包括一个或多个入口和/或出口，例如，用于引入液体和/或移除液滴或颗粒。此类附加部件可以由可操作地耦接到该装置(例如，通过与该装置集成、物理连接(以机械方式或电气方式)，或者通过有线或无线连接)的一个或多个控制器或计算机来启动或监控。
表面特性
装置的表面可以包括决定装置的物理特性的材料、涂层或表面纹理。特别地，通过本发明装置的液体流动可以由装置的表面特性(例如，液体接触表面的润湿性)来控制。在一些情况下，装置的一部分(例如，区域、通道或分类器)可以具有润湿性适于促进液体流动(例如，在通道中)或协助液滴形成(例如，在通道中)(例如，如果形成液滴的话)的表面。
润湿性是液体保持与固体表面接触的能力，其可以作为水接触角的函数来测量。材料的水接触角可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量，诸如静态静滴法、悬滴法、动态静滴法、动态Wilhelmy法、单纤维Wilhelmy法、单纤维弯月面法和Washburn方程毛细上升法。每个表面的润湿性可能适合于产生液滴。一种装置可以包括表面具有第一润湿性的通道，该通道与表面具有第二润湿性的储器流体连通(例如，流体地连接到该储器)。每个表面的润湿性可能适合于在第二液体中产生第一液体的液滴。在该非限制性实例中，运送第一液体的通道的表面可以具有适合于第一液体润湿该通道表面的第一润湿性。例如，当第一液体基本上与水可混溶(例如，第一液体是水性液体)时，表面材料或涂层可以具有约95°或更小(例如，90°或更小)的水接触角。此外，在该非限制性实例中，液滴形成区域(例如，包括搁板)的表面可以具有第二润湿性，使得第一液体从其去润湿。例如，当第二液体基本上与水不可混溶(例如，第二液体是油)时，所使用的材料或涂层可以具有约70°或更大(例如，90°或更大、95°或更大，或者100°或更大)的水接触角。通常，在该非限制性实例中，第二润湿性将比通道更疏水。例如，通道和液滴形成区域中所采用的材料或涂层的水接触角将相差5°至150°。
例如，该装置载运水相的部分(例如，通道)可以具有亲水或比该装置的另一个区域更亲水的表面材料或涂层，例如包括水接触角小于或等于约90°的材料或涂层，并且/或者该装置的其他区域可以具有疏水或比通道更疏水的表面材料或涂层，例如包括水接触角大于70°(例如大于90°、大于95°、大于100°(例如95°至120°或100°至150°))的材料或涂层。在某些实施方案中，该装置的某个区域可以包括减少或防止被水相润湿的材料或表面涂层。该装置可以被设计成在整个装置上具有单一类型的材料或涂层。替代性地，该装置可以具有材料或涂层不同的分离区域。
除此之外或替代性地，该装置载运或接触油相的部分(例如，收集储器或液滴形成区域)可以具有疏水、亲氟或者比该装置接触水相的部分更疏水或更亲氟的表面材料或涂层，例如包括水接触角大于或等于约90°的材料或涂层。
该装置可以被设计成在整个装置上具有单一类型的材料或涂层。替代性地，该装置可以具有材料或涂层不同的分离区域。表面纹理也可以用于控制流体流动。
装置表面特性可以是天然表面的特性(即，用于制造装置的基体材料的表面特性)或表面处理的特性。表面处理的非限制性实例包括例如表面涂层和表面纹理。在一种方法中，装置表面特性可归因于装置部分中存在的一个或多个表面涂层。疏水涂层可以包括含氟聚合物(例如玻璃处理)、硅烷、硅氧烷、硅酮或本领域已知的其他涂层。其他涂层包括由前体气相沉积的那些，其中前体诸如：二十一烷基-1,1,2,2-四氢十二烷基二甲基三(二甲基氨基硅烷)、二十烷基-1,1,2,2-四氢十二烷基三氯硅烷(C12)、十七氟-1,1,2,2-四氢癸基三氯硅烷(C10)、九氟-1,1,2,2-四氢己基三(二甲氨基)硅烷、3,3,3,4,4,5,5,6,6-九氟己基三氯硅烷、十三氟-1,1,2,2-四氢辛基三氯硅烷(C8)、双(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)二甲基甲硅烷氧基甲基氯硅烷、九氟己基三乙氧基硅烷(C6)、十二烷基三氯硅烷(DTS)、二甲基二氯硅烷(DDMS)或10-十一碳烯基三氯硅烷(V11)、五氟苯基丙基三氯硅烷(C5)。亲水涂层包括聚合物，诸如多糖、聚乙二醇、聚胺和聚羧酸。亲水表面也可以通过对某些材料进行氧等离子体处理来产生。
可以通过将金属氧化物沉积到装置的表面上来形成带涂层的表面。可用于对表面加涂层的示例金属氧化物包括但不限于Al2O3、TiO2、SiO2，或它们的组合。可用于表面改性的其他金属氧化物在本领域中是已知的。金属氧化物可以通过标准沉积技术沉积到表面上，这些标准沉积技术包括但不限于原子层沉积(ALD)、物理气相沉积(PVD)(例如溅射)、化学气相沉积(CVD)或激光沉积。用于对表面加涂层的其他沉积技术(例如基于液体的沉积)在本领域中是已知的。例如，Al2O3原子层可以通过使其与三甲基铝(TMA)和水接触而沉积在表面上。
在另一种方法中，装置表面特性可能可归因于表面纹理。例如，表面可以具有纳米纹理，例如表面具有纳米表面特征，诸如改变表面润湿性的锥体或柱体。纳米纹理化表面可以是亲水的、疏水的或超疏水的，例如，具有大于150°的水接触角。示例性的超疏水材料包括氧化锰聚苯乙烯(MnO2/PS)纳米复合材料、氧化锌聚苯乙烯(ZnO/PS)纳米复合材料、沉淀碳酸钙、碳纳米管结构和二氧化硅纳米涂层。超疏水涂层还可以包括低表面能材料(例如，固有疏水材料)和表面粗糙度(例如，使用激光烧蚀技术、等离子体蚀刻技术，或者通过图案化掩模中的开孔来蚀刻材料的光刻技术)。低表面能材料的实例包括氟碳材料，例如聚四氟乙烯(PTFE)、氟化乙烯丙烯(FEP)、乙烯四氟乙烯(ETFE)、乙烯氯三氟乙烯(ECTFE)、全氟烷氧基烷烃(PFA)、聚(氯三氟乙烯)(CTFE)、全氟烷氧基烷烃(PFA)和聚(偏二氟乙烯)(PVDF)。其他超疏水表面在本领域中是已知的。
在一些情况下，亲水或更亲水的材料或涂层的水接触角小于或等于约90°，例如小于80°、70°、60°、50°、40°、30°、20°或10°，例如90°、85°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°或0°。在一些情况下，疏水或更疏水的材料或涂层的水接触角为至少70°，例如至少80°、至少85°、至少90°、至少95°或至少100°(例如约100°、101°、102°、103°、104°、105°、106°、107°、108°、109°、110°、115°、120°、125°、130°、135°、140°、145°或约150°)。
亲水或更亲水的材料或涂层与疏水或更疏水的材料或涂层之间的水接触角的差值可以为5°至150°，例如5°至80°、5°至60°、5°至50°、5°至40°、5°至30°、5°至20°、10°至75°、15°至70°、20°至65°、25°至60°、30至50°、35°至45°，例如5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°、110°、120°、130°、140°或150°。
上面的论述以水接触角为中心。应当理解，在本发明的装置和方法中采用的液体可以不是水，甚至可以不是水性的。因此，液体在装置表面上的实际接触角可以不同于水接触角。此外，当材料或涂层未结合到本发明的装置中时，可以在该材料或涂层上进行对该材料或涂层的水接触角的测定。
颗粒
本发明包括具有颗粒的方法。例如，被构造为具有分析物部分(例如，条形码、核酸、结合分子(例如，蛋白质、肽、适体、抗体或抗体片段)、酶、底物等)的颗粒可以被包括在含有分析物的液滴中，以修饰分析物和/或分析分析物的存在或浓度。在一些实施方案中，颗粒是合成颗粒(例如珠粒，例如凝胶珠粒)。
例如，液滴可以包含一个或多个分析物部分，例如唯一标识符，诸如条形码。分析物部分(例如条形码)可以在液滴形成之前、之后或在液滴形成的同时引入液滴中。将分析物部分(例如，条形码)递送到特定液滴允许随后将各个样品(例如，生物颗粒)的特征归因于该特定液滴。分析物部分(例如条形码)可以例如在核酸(例如寡核苷酸)上经由任何合适的机制递送到液滴。分析物部分(例如加条形码的核酸(例如寡核苷酸))可以经由颗粒(诸如微胶囊)引入液滴中。在一些情况下，分析物部分(例如加条形码的核酸(例如寡核苷酸))可以最初与颗粒(例如微胶囊)缔合，然后在施加刺激时释放，该刺激允许分析物部分(例如核酸(例如寡核苷酸))从颗粒解离或释放。
颗粒(例如珠粒)可以是多孔的、无孔的、中空的(例如微胶囊)、固体的、半固体的、半流体的、流体的，以及/或者前述性质的组合。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以是可溶解的、可破裂的和/或可降解的。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可能是不可降解的。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以是凝胶珠粒。凝胶珠粒可以是水凝胶珠粒。凝胶珠粒可以由分子前体(诸如聚合物或单体物类)形成。半固体颗粒(例如珠粒)可以是脂质体珠粒。固体颗粒(例如珠粒)可以包含金属，其中金属包括氧化铁、金和银。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以是二氧化硅珠粒。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以是刚性的。在其他情况下，颗粒(例如珠粒)可以是柔性的和/或可压缩的。
颗粒(例如珠粒)可以包含天然材料和/或合成材料。例如，颗粒(例如珠粒)可以包含天然聚合物、合成聚合物，或天然聚合物和合成聚合物两者。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖，诸如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、蚕丝、聚羟基链烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原、角叉菜胶、卵叶车前子、阿拉伯树胶、琼脂、明胶、虫胶、梧桐胶、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐胶、琼脂糖、藻酸、藻酸盐或它们的天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸、尼龙、硅酮、氨纶(spandex)、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)，和/或它们的组合(例如，共聚物)。珠粒也可以由除聚合物之外的材料形成，所述材料包括脂质、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料等。
在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以包含分子前体(例如，单体或聚合物)，这些分子前体可以经由分子前体的聚合来形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是能够经历进一步聚合(例如，经由化学交联键)的已经聚合的物类。在一些情况下，前体可以包括丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、寡聚物或聚合物中的一种或多种。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以包含预聚物，这些预聚物是能够进一步聚合的低聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠粒。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以包含可以进一步聚合在一起的单独的聚合物。在一些情况下，可以经由不同前体的聚合来生成颗粒(例如珠粒)，使得它们包含混合的聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。在一些情况下，颗粒(例如，珠粒)可以包含聚合物前体(例如单体、低聚物、线型聚合物)、寡核苷酸、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键可以是碳-碳键或硫醚键。
交联可以是永久的或可逆的，这取决于所使用的特定交联剂。可逆交联可以允许聚合物在适当的条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联也可以允许结合于珠粒表面的材料的可逆连接。在一些情况下，交联剂可以形成二硫键。在一些情况下，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或经修饰的胱胺。
颗粒(例如珠粒)可以具有均匀的尺寸或不均匀的尺寸。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)的直径可以至少为约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm，或更大的值。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)的直径可以小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm，或更小的值。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)的直径可以在约40μm至75μm、30μm至75μm、20μm至75μm、40μm至85μm、40μm至95μm、20μm至100μm、10μm至100μm、1μm至100μm、20μm至250μm或者20μm至500μm的范围内。用于产生液滴的颗粒(例如珠粒，例如凝胶珠粒)的尺寸通常与第一通道的横截面(宽度或深度)近似。在一些情况下，凝胶珠粒大于第一通道和/或搁板的宽度和/或深度，例如至少是第一通道和/或搁板的宽度和/或深度的1.5倍、2倍、3倍或4倍。
在某些实施方案中，颗粒(例如珠粒)可以作为具有相对单分散的尺寸分布的一群或多个颗粒(例如珠粒)来提供。在可能期望在液滴内提供相对一致量的试剂的情况下，维持相对一致的颗粒(例如珠粒)特征(诸如尺寸)可以有助于整体的一致性。特别地，本文所述的颗粒(例如珠粒)可以具有其横截面尺寸的变异系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小百分比的尺寸分布。
颗粒可以具有任何合适的形状。颗粒(例如珠粒)形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长方形、无定形、圆形、圆柱形，以及它们的变型。
注入或以其他方式引入液滴中的颗粒(例如珠粒)可以包含可释放地、可裂解或可逆地附接的分析物部分(例如条形码)。注入或以其他方式引入液滴中的颗粒(例如珠粒)可以包含可活化的分析物部分(例如条形码)。注入或以其他方式引入液滴中的颗粒(例如珠粒)可以是可降解的、可破裂的或可溶解的颗粒，例如可溶解的珠粒。
通道内的颗粒(例如珠粒)能够以基本上规则的流动剖面(例如，以规则的流速)流动。此类规则的流动剖面可以允许液滴在形成时包括单个颗粒(例如珠粒)和单个细胞或其他生物颗粒。此类规则的流动剖面可以允许液滴具有大于群体的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的双重占据率(例如，液滴具有至少一个珠粒和至少一个细胞或其他生物颗粒)。在一些实施方案中，液滴具有大于群体的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的1:1双重占据率(即，液滴具有恰好一个颗粒(例如珠粒)和恰好一个细胞或其他生物颗粒)。例如在美国专利公开号2015/0292988中提供了此类规则流型和可以用于提供此类规则流型的装置，该美国专利公开全文以引用方式并入本文。
如上文所论述的，分析物部分(例如条形码)可以可释放地、可裂解地或可逆地附接到颗粒(例如珠粒)，使得分析物部分(例如条形码)可以通过裂解条形码分子与颗粒(例如珠粒)之间的键联而释放或可释放，或可以通过颗粒(例如珠粒)本身的降解而释放，从而允许条形码被其他试剂接近或可被其他试剂接近，或两者兼而有之。可释放的分析物部分(例如条形码)有时可以被称为可活化的分析物部分(例如可活化的条形码)，因为它们一旦释放就可用于反应。因此，例如，可活化的分析物部分(例如，可活化的条形码)可以通过从颗粒(例如珠粒(或本文所述的其他合适类型的液滴))释放分析物部分(例如，条形码)而被活化。在所描述的方法的上下文中也设想了其他可活化的构型。
作为对颗粒(例如珠粒)与缔合抗原部分(诸如含有条形码的核酸(例如寡核苷酸))之间的可裂解键的补充或替代，颗粒(例如珠粒)可以是自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物类或化学相，暴露于光、还原剂等)时可降解的、可破裂的或可溶解的。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以是可溶解的，使得当暴露于特定化学物类或环境变化(诸如温度变化或pH变化)时，颗粒(例如珠粒)的材料组分降解或溶解。在一些情况下，凝胶珠粒可以在升高的温度和/或碱性条件下降解或溶解。在一些情况下，颗粒(例如珠粒)可以是可热降解的，使得当颗粒(例如珠粒)暴露于适当的温度变化(例如热)时，颗粒(例如珠粒)降解。与物类(例如核酸，例如寡核苷酸，例如加条形码的寡核苷酸)结合的颗粒(例如珠粒)的降解或溶解可以导致该物类从颗粒(例如珠粒)释放。根据上文的公开内容将会知道，颗粒(例如珠粒)降解可以指代结合或夹带的物类从颗粒(例如珠粒)上离解，伴随和不伴随物理颗粒(例如珠粒)自身的结构降解。例如，夹带的物类可以通过例如由于化学环境改变导致的渗透压差而从颗粒(例如珠粒)释放。举例来说，由于渗透压差引起的颗粒(例如珠粒)孔径改变通常可以在没有颗粒(例如珠粒)本身结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于颗粒(例如，珠粒或微胶囊(脂质体))的渗透溶胀而引起的孔径增加可以允许颗粒内夹带的物类释放。在其他情况下，颗粒的渗透收缩可以由于孔径缩小而致使颗粒(例如珠粒)更好地保留夹带的物类。
可以将可降解的颗粒(例如珠粒)引入液滴(诸如乳液的液滴或孔)中，使得当施加适当的刺激时，颗粒(例如珠粒)在液滴内降解并且任何相关联的物类(例如核酸、寡核苷酸，或它们的片段)在液滴内释放。游离物类(例如核酸、寡核苷酸，或它们的片段)可以与液滴中包含的其他试剂相互作用。例如，可以将包含胱胺且经由二硫键连接至条形码序列的聚丙烯酰胺珠粒与还原剂在油包水乳液的液滴内组合。在液滴内，还原剂可以破坏各种二硫键，导致颗粒(例如珠粒)降解并且条形码序列释放到液滴的水性内环境中。在另一个实例中，在碱性溶液中加热包含颗粒(例如，珠粒)结合的分析物部分(例如，条形码)的液滴也可以引起颗粒(例如珠粒)降解，以及附接的条形码序列释放到液滴的水性内环境中。
任何合适数量的分析物部分(例如，分子标签分子(例如，引物、加条形码的寡核苷酸等))可以与颗粒(例如珠粒)缔合，使得分析物部分(例如，分子标签分子(例如引物，例如加条形码的寡核苷酸等))在从颗粒释放后以预定义浓度存在于液滴中。可以选择这种预定义浓度以促进用于在液滴内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预定义浓度可能受到产生携带寡核苷酸的颗粒(例如珠粒)的方法的限制。
可以包括附加试剂作为颗粒的一部分(例如分析物部分)，并且/或者可以将附加试剂包括在溶液中或分散在液滴中，例如，以活化、介导或以其他方式参与反应(例如，分析物与分析物部分之间的反应)。
生物样品
本发明的液滴可以包含生物颗粒(例如，细胞)和/或其大分子成分(例如，细胞的组分(例如，细胞内或细胞外蛋白质、核酸、聚糖或脂质)或细胞产物(例如，分泌产物))。来自生物颗粒的分析物(例如其组分或产物)可以被认为是生物分析物。在一些实施方案中，生物颗粒(例如，细胞或其产物)包含在液滴中，例如与一个或多个具有分析物部分的颗粒(例如珠粒)一起。在一些实施方案中，生物颗粒(例如，细胞以及/或者其组分或产物)可以被包裹在凝胶内，诸如经由包含生物颗粒和能够聚合或胶凝的前体的液滴的聚合。
就封装的生物颗粒(例如，细胞)而言，生物颗粒可以被包含在含有裂解试剂的液滴中，以便在该液滴内释放生物颗粒的内容物(例如，含有一种或多种分析物(例如，生物分析物)的内容物)。在此类情况下，裂解剂可以在将生物颗粒引入液滴源区域中的同时或在即将把生物颗粒引入液滴源区域中之前与生物颗粒悬浮液接触，例如，通过在第二通道上游或近侧的一个或多个附加通道，或者在第二液滴源区域上游或近侧的第三通道。裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如用于裂解不同细胞类型(例如革兰氏阳性或阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡萄球菌素、labiase、立枯丝核菌裂解酶(kitalase)、溶壁酶和可从例如Sigma-Aldrich,Inc.(St Louis,MO)获得的多种其他裂解酶，以及其他可商购获得的裂解酶。除此之外或替代性地，其他裂解剂可以包含在具有生物颗粒(例如，细胞)的液滴中，以引起生物颗粒的内容物释放到这些液滴中。例如，在一些情况下，可以使用基于表面活性剂的裂解溶液裂解细胞，但是对于其中表面活性剂可能干扰稳定乳液的基于乳液的体系而言，这些溶液可能不太理想。在某些情况下，裂解溶液可以包含非离子表面活性剂，诸如TritonX-100和Tween 20。在一些情况下，裂解溶液可以包含离子型表面活性剂，诸如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施方案中，裂解溶液是低渗的，从而通过渗透压休克使细胞裂解。电穿孔、热、声或机械细胞破坏也可以用于某些情况，例如形成基于非乳液的液滴，诸如封装生物颗粒，其可以作为液滴形成的补充或替代，其中在细胞破坏后包封物的任何孔径足够小，以保留所需大小的核酸片段。
除了裂解剂之外，其他试剂也可以包含在具有生物颗粒的液滴中，包括例如DNA酶和RNA酶失活剂或抑制剂，诸如蛋白酶K、螯合剂(诸如EDTA)，以及用于去除或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对后续核酸处理的负活性或影响的其他试剂。另外，在包封的生物颗粒(例如细胞)的情况下，可以将生物颗粒暴露于适当的刺激以从微滴内的微胶囊中释放生物颗粒或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激物可以连同封装的生物颗粒一起包含在液滴中，以允许封装基质降解以及细胞或其内容物释放到更大的液滴中。在一些情况下，该刺激物可以与本文别处描述的用于从其相应的颗粒(例如珠粒)释放分析物部分(例如寡核苷酸)的刺激物相同。在另选的情况下，这可以是不同且非重叠的刺激物，以便允许封装的生物颗粒在与分析物部分(例如，寡核苷酸)释放到同一液滴中的时间不同的时间释放到液滴中。
附加试剂(诸如核酸内切酶)也可以与生物颗粒一起包括在液滴中，以使生物颗粒的DNA、DNA聚合酶和用于扩增生物颗粒的核酸片段的dNTP片段化，并且将条形码分子标签附接到扩增的片段。其他试剂还可以包括逆转录酶(包括具有末端转移酶活性的酶)、引物和寡核苷酸以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(本文也称为“转换寡核苷酸”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板转换可以用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板转换可以用于将预定义的核酸序列补加至cDNA。在模板转换的实例中，cDNA可以由模板(例如细胞mRNA)的逆转录生成，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以以不依赖模板的方式向cDNA添加附加核苷酸，例如多聚C。转换寡核苷酸可以包括与附加核苷酸互补的序列，例如多聚G。cDNA上的附加核苷酸(例如，多聚C)可以与转换寡核苷酸上的附加核苷酸(例如，多聚G)杂交，由此逆转录酶可以将转换寡核苷酸用作模板以进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可以包含杂交区和模板区。杂交区可以包含能够与靶标杂交的任何序列。在一些情况下，如先前所述，杂交区包含一系列G碱基，以与cDNA分子的3’末端的悬垂C碱基互补。该系列G碱基可以包括1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或超过5个G碱基。模板序列可以包含要掺入到cDNA中的任何序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可以包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；经修饰的核酸，包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、倒位dT、5-甲基dC、2’-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔-2’-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA，例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2’氟代碱基(例如，氟代C、氟代U、氟代A和氟代G)或任何组合。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以为至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249或250个核苷酸。
一旦细胞的内容物释放到它们相应的液滴中，就可以在这些液滴内进一步处理其中包含的大分子组分(例如，生物颗粒的大分子成分，诸如RNA、DNA或蛋白质)。
如上所述，各个生物颗粒(例如，细胞)的大分子组分(例如，生物分析物)可以具有唯一标识符(例如，条形码)，使得在表征那些大分子组分时，此时来自细胞异质群体的组分可能已经混合并且散布或溶解在共同液体中，任何给定的组分(例如，生物分析物)可以追溯到从其获得该组分的生物颗粒(例如，细胞)。通过将独特标识符特异性地分配给单独生物颗粒或生物颗粒群来提供将特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒群的能力。可以为各个生物颗粒(例如，细胞)或生物颗粒(例如，细胞)的群体分配或关联例如核酸条形码形式的唯一标识符，以便用这些唯一标识符为生物颗粒的大分子组分(因此其特征)加标签或进行标记。然后，这些独特标识符可以用于将生物颗粒的组分和特征归属于单独生物颗粒或生物颗粒群。如本文的方法中所述，这可以通过形成包括具有唯一标识符的各个生物颗粒或生物颗粒组的液滴(经由颗粒，例如珠粒)来实现。
在一些情况下，以寡核苷酸的形式提供独特标识符，所述核酸分子包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可以与单独生物颗粒的核酸内容物连接或以其他方式相关联，或与生物颗粒的其他组分连接，特别是与这些核酸的片段连接。将寡核苷酸分隔开，使得在给定液滴中的寡核苷酸之间，其中所含有的核酸条形码序列相同，但在不同液滴之间，寡核苷酸可以具有并且确实具有不同的条形码序列，或者至少代表给定分析中所有液滴上的大量不同条形码序列。在一些情况下，仅一个核酸条形码序列可以与给定液滴相关联，但在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可以在寡核苷酸序列内包含6个至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以为至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单段中，或者它们可以被分成两个或更多个被1个或更多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以为约4至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以为至多4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸或更短。
液滴中的分析物部分(例如，寡核苷酸)也可以包括在处理来自包含在液滴中的生物颗粒的核酸时有用的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，以用于扩增来自液滴内各个生物颗粒的基因组DNA，同时附接相关联的条形码序列、测序引物或引物识别位点、杂交或探测序列，例如用于鉴别这些序列的存在或者用于下拉加条形码的核酸或许多其他潜在功能序列中的任何一个。
也可以采用形成含有寡核苷酸的液滴的其他机制，包括例如使两个或更多个液滴(其中一个液滴包含寡核苷酸)聚结，或者将寡核苷酸微分散到液滴(例如微流体系统内的液滴)中。
在一个实例中，提供了颗粒(例如珠粒)，其各自包括大量可释放地附接到珠粒的上述加条形码的寡核苷酸，其中附接到特定珠粒的所有寡核苷酸将包括相同的核酸条形码序列，但是在所使用的珠粒群体中代表了大量不同的条形码序列。在一些实施方案中，水凝胶珠粒(例如具有聚丙烯酰胺聚合物基质的珠粒)用作寡核苷酸进入液滴的固体载体和递送媒介物，因为它们能够携带大量寡核苷酸分子，并且可以被构造成在暴露于特定刺激时释放那些寡核苷酸，如本文别处所述。在一些情况下，珠粒群体将提供多样的条形码序列文库，该文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列或至少约10,000,000个不同的条形码序列或更多。此外，每个珠粒可以具有大量附着的寡核苷酸分子。特别地，各个珠粒上包含条形码序列的寡核苷酸分子的数目可以为至少约1,000个寡核苷酸分子、至少约5,000个寡核苷酸分子、至少约10,000个寡核苷酸分子、至少约50,000个寡核苷酸分子、至少约100,000个寡核苷酸分子、至少约500,000个寡核苷酸分子、至少约1,000,000个寡核苷酸分子、至少约5,000,000个寡核苷酸分子、至少约10,000,000个寡核苷酸分子、至少约50,000,000个寡核苷酸分子、至少约100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少约十亿个寡核苷酸分子，或更多个寡核苷酸分子。
此外，当珠粒群体包含在液滴中时，所得的液滴群体也可以包括多样的条形码文库，该条形码文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列，或至少约10,000,000个不同的条形码序列。此外，群体中的每个液滴可以包含至少约1,000个寡核苷酸分子、至少约5,000个寡核苷酸分子、至少约10,000个寡核苷酸分子、至少约50,000个寡核苷酸分子、至少约100,000个寡核苷酸分子、至少约500,000个寡核苷酸分子、至少约1,000,000个寡核苷酸分子、至少约5,000,000个寡核苷酸分子、至少约10,000,000个寡核苷酸分子、至少约50,000,000个寡核苷酸分子、至少约100,000,000个寡核苷酸分子，并且在一些情况下至少约十亿个寡核苷酸分子。
在一些情况下，可能期望将多个不同的条形码掺入给定的液滴内，这些条形码附接到液滴内的单个或多个颗粒(例如珠粒)。例如，在一些情况下，混合但已知的条形码序列组可以在随后的处理中为鉴别提供更大的保证，例如，通过向给定液滴提供更强的条形码地址或归属，作为对来自给定液滴的输出的重复确认或独立确认。
在施加特定刺激时，寡核苷酸可以能够从颗粒(例如珠粒)释放。在一些情况下，该刺激可以是光刺激，例如通过光不稳定键的裂解，由此释放寡核苷酸。在其他情况下，可以使用热刺激，其中颗粒(例如珠粒)环境的温度升高将导致键断裂，或者寡核苷酸从颗粒(例如珠粒)的其他释放。在还有其他情况下，使用化学刺激物来裂解寡核苷酸与珠粒的键联，或以其他方式导致寡核苷酸从颗粒(例如珠粒)释放。在一种情况下，此类组合物包括上述用于封装生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT))而降解以释放附接的寡核苷酸。
本文所述的液滴可以包含一个或多个生物颗粒(例如，细胞)、一个或多个携带条形码的颗粒(例如，珠粒)，或者至少包含一个生物颗粒和一个携带条形码的颗粒(例如，珠粒)两者。在一些情况下，液滴可以是未被占据的，既不包含生物颗粒也不包含携带条形码的颗粒(例如珠粒)。如前所述，通过控制在液滴源区域处结合的每种液体的流动特性，以及控制液滴源区域的几何形状，可以优化液滴形成，以在所生成的液滴内实现所需的颗粒(例如珠粒、生物颗粒或两者)占据水平。
试剂盒和系统
由本发明的方法提供的装置能够以试剂盒和系统的形式与各种外部部件(例如，泵、储器或控制器)、试剂(例如，分析物部分)、液体、颗粒(例如，珠粒)和/或样品组合。本发明还提供了如本文所述的第一液体、第二液体和任选的第三液体的试剂盒。
方法
本文所述的用于生成例如具有均匀且可预测的内容物的液滴并且具有高通量的方法可以用于极大地提高单细胞应用和/或接收基于液滴的输入的其他应用的效率。此类单细胞应用和其他应用通常可能能够处理一定范围的液滴尺寸。这些方法可以用于生成用作微型化学反应器的液滴，其中化学反应物的体积很小(约数pL)。
本发明的方法包括允许一种或多种液体从通道(例如，第一通道、第二通道和任选的第三通道)流到液滴源区域的步骤。
本文所公开的方法通常可以产生乳液，即连续相中的分散相的液滴。例如，液滴可以包括第一液体(和任选地第三液体，以及进一步任选地第四液体)，而另一种液体可以是第二液体。第一液体可以基本上与第二液体不可混溶。在一些情况下，第一液体可以是水性液体或者可以基本上与水可混溶。根据本文所公开的方法产生的液滴可以结合多种液体。例如，液滴可以结合第一液体和第三液体。第一液体可以基本上与第三液体可混溶。如本文所述，第二液体可以是油。
多种应用需要评估生物颗粒群内不同生物颗粒或生物体类型的存在和定量，包括例如微生物组分析和表征、环境测试、食品安全性测试、例如在污染物溯源中的流行病学分析等。
本文所述的方法可以允许产生包含单个颗粒(例如，珠粒)和/或单个生物颗粒(例如，细胞)并具有均匀且可预测的液滴含量的一个或多个液滴。本文所述的方法可以允许产生包含单个颗粒(例如，珠粒)和/或单个生物颗粒(例如，细胞)并具有均匀且可预测的液滴尺寸的一个或多个液滴。这些方法还可以允许产生包含单个生物颗粒(例如，细胞)和多于一个颗粒(例如，珠粒)的一个或多个液滴、包含多于一个生物颗粒(例如，细胞)和单个颗粒(例如，珠粒)的一个或多个液滴，以及/或者包含多于一个生物颗粒(例如，细胞)和多于一个颗粒(例如，珠粒)的一个或多个液滴。这些方法还可以允许增加液滴形成的通量。
一般来讲，液滴通过允许第一液体或者第一液体与第三液体和任选地第四液体的组合流入液滴源区域中的第二液体中来形成，在液滴源区域处，液滴如本文所述自发地形成。可以使用例如漏斗(例如，包括栅栏的漏斗)、侧通道和/或混合器来控制液滴含量均匀性。
这些液滴可以包括在非水性连续相(诸如油相)内的水性液体分散相。在一些情况下，液滴形成可以在没有外部驱动的连续相(例如第二液体，例如油)运动的情况下发生。如上文所论述的，尽管连续相不是液滴形成所必需的，但是其仍然可以被外部驱动。用于在非水性(例如油)连续相中产生稳定液滴的乳液体系在例如美国专利号9,012,390中有详细描述，该专利全文以引用方式并入本文用于所有目的。替代性地或除此之外，液滴可以包括例如具有内部液体中心或核心与其周围的外部屏障的微囊泡。在一些情况下，液滴可以包括能够将材料夹带和/或保持在其基质内的多孔基质。在例如美国专利申请公开号2014/0155295中描述了多种不同的容器，该美国专利申请公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。液滴可以被收集在基本上静止的液体体积中，例如收集在液滴收集储器中，利用所形成液滴的浮力将它们移出初生液滴的路径(向上或向下，具体取决于液滴和连续相的相对密度)。替代性地或除此之外，所形成的液滴可以主动地移出初生液滴的路径，例如使用连续相(例如，液体料流或温和搅拌的液体)的温和流动。
在一些实施方案中，通过向装置施加一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)压差来实现连续相的减少。可以使用正压或负压来施加压差。在一些实施方案中，压差的范围可以从约0.01PSI至约10PSI(例如，约0.1至约1PSI、约1PSI至约10PSI，或约0.01PSI、约0.02PSI、约0.03PSI、约0.04PSI、约0.05PSI、约0.06PSI、约0.07PSI、约0.08PSI、约0.09PSI、约0.1PSI、约0.2PSI、约0.3PSI、约0.4PSI、约0.5PSI、约0.6PSI、约0.7PSI、约0.8PSI、约0.9PSI、约1.0PSI、约1.1PSI、约1.2PSI、约1.3PSI、约1.4PSI、约1.5PSI、约1.6PSI、约1.7PSI、约1.8PSI、约1.9PSI、约2.0PSI、约2.1PSI、约2.2PSI、约2.3PSI、约2.4PSI、约2.5PSI、约2.6PSI、约2.7PSI、约2.8PSI、约2.9PSI、约3.0PSI、约3.1PSI、约3.2PSI、约3.3PSI、约3.4PSI、约3.5PSI、约3.6PSI、约3.7PSI、约3.8PSI、约3.9PSI、约4.0PSI、约4.1PSI、约4.2PSI、约4.3PSI、约4.4PSI、约4.5PSI、约4.6PSI、约4.7PSI、约4.8PSI、约4.9PSI、约5.0PSI、约5.1PSI、约5.2PSI、约5.3PSI、约5.4PSI、约5.5PSI、约5.6PSI、约5.7PSI、约5.8PSI、约5.9PSI、约6.0PSI、约6.1PSI、约6.2PSI、约6.3PSI、约6.4PSI、约6.5PSI、约6.6PSI、约6.7PSI、约6.8PSI、约6.9PSI、约7.0PSI、约7.1PSI、约7.2PSI、约7.3PSI、约7.4PSI、约7.5PSI、约7.6PSI、约7.7PSI、约7.8PSI、约7.9PSI、约8.0PSI、约8.1PSI、约8.2PSI、约8.3PSI、约8.4PSI、约8.5PSI、约8.6PSI、约8.7PSI、约8.8PSI、约8.9PSI、约9.0PSI、约9.1PSI、约9.2PSI、约9.3PSI、约9.4PSI、约9.5PSI、约9.6PSI、约9.7PSI、约9.8PSI、约9.9PSI或约10.0PSI)。在一些实施方案中，施加压差介于约1秒与约600秒之间(例如，介于约1秒与约10秒之间、介于约10秒与约100秒之间、介于约1秒与约60秒之间、介于约15秒与约45秒之间、介于约45秒与约75秒之间、介于约100秒与180秒之间，或者介于约180秒与540秒之间)。约0.01PSI至约10PSI的任何压差(例如，约0.1至约1PSI、约1PSI至约10PSI，或约0.01PSI、约0.02PSI、约0.03PSI、约0.04PSI、约0.05PSI、约0.06PSI、约0.07PSI、约0.08PSI、约0.09PSI、约0.1PSI、约0.2PSI、约0.3PSI、约0.4PSI、约0.5PSI、约0.6PSI、约0.7PSI、约0.8PSI、约0.9PSI、约1.0PSI、约1.1PSI、约1.2PSI、约1.3PSI、约1.4PSI、约1.5PSI、约1.6PSI、约1.7PSI、约1.8PSI、约1.9PSI、约2.0PSI、约2.1PSI、约2.2PSI、约2.3PSI、约2.4PSI、约2.5PSI、约2.6PSI、约2.7PSI、约2.8PSI、约2.9PSI、约3.0PSI、约3.1PSI、约3.2PSI、约3.3PSI、约3.4PSI、约3.5PSI、约3.6PSI、约3.7PSI、约3.8PSI、约3.9PSI、约4.0PSI、约4.1PSI、约4.2PSI、约4.3PSI、约4.4PSI、约4.5PSI、约4.6PSI、约4.7PSI、约4.8PSI、约4.9PSI、约5.0PSI、约5.1PSI、约5.2PSI、约5.3PSI、约5.4PSI、约5.5PSI、约5.6PSI、约5.7PSI、约5.8PSI、约5.9PSI、约6.0PSI、约6.1PSI、约6.2PSI、约6.3PSI、约6.4PSI、约6.5PSI、约6.6PSI、约6.7PSI、约6.8PSI、约6.9PSI、约7.0PSI、约7.1PSI、约7.2PSI、约7.3PSI、约7.4PSI、约7.5PSI、约7.6PSI、约7.7PSI、约7.8PSI、约7.9PSI、约8.0PSI、约8.1PSI、约8.2PSI、约8.3PSI、约8.4PSI、约8.5PSI、约8.6PSI、约8.7PSI、约8.8PSI、约8.9PSI、约9.0PSI、约9.1PSI、约9.2PSI、约9.3PSI、约9.4PSI、约9.5PSI、约9.6PSI、约9.7PSI、约9.8PSI、约9.9PSI或约10.0PSI)能够以任何组合施加介于约1秒与约600秒之间的任何时间长度(例如，介于约1秒与约10秒之间、介于约10秒与约100秒之间、介于约1秒与约60秒之间、介于约15秒与约45秒之间、介于约45秒与约75秒之间、介于约100秒与180秒之间，或者介于约180秒与540秒之间)。在一些实施方案中，以第一压力和第一持续时间施加第一压差，随后以不同的压力(例如，更高或更低)以及任选的不同持续时间(例如，更短或更长)施加第二压差。可以在相同或不同的持续时间(例如，更短或更长)下采用额外的压差(例如，更高或更低)。例如，施加范围为约0.01PSI至约10PSI(例如，约2PSI至约6PSI)的第一压差持续介于约1秒与约600秒之间(例如，约20秒至约60秒)，随后施加范围为约0.01PSI至约10PSI(例如，约0.1PSI至约1PSI)的第二压差持续介于约1秒与约600秒之间(例如，约10秒至约60秒)。在一些实施方案中，第一压差之后是连续施加更低的压力的后续压差。在一些实施方案中，第一压差之后是连续施加更低的压力并持续更长时间的后续压差。在一个实施方案中，第一压差为约1至约10PSI，例如持续15至75秒，并且第二压差为约0.1至约1PSI，例如持续45至90秒。在另一个实施方案中，施加范围为约0.01PSI至约10PSI(例如，约2PSI至约6PSI)的第一压差持续约1秒至约600秒(例如，约20秒至约60秒)，施加范围为约0.01PSI至约10PSI(例如，约0.1PSI至约1PSI)的第二压差持续约1秒至约600秒(例如，约10秒至约60秒)，并且施加范围为约0.01PSI至约10PSI(例如，约0.1PSI至约0.5PSI)的第二压差持续约1秒至约600秒(例如，约10秒至约60秒)。在某些实施方案中，第三压差低于第二压差。在另一个实施方案中，第一压差为约0.1至约1PSI，例如持续5至75秒，并且第二压差为约1至约10PSI，例如持续45至100秒。
例如，在液滴形成之后和第一压差之前和/或介于一个或多个后续压差之间，可以采用休息期。合适的休止期介于约1秒与约600秒之间(例如，介于约1秒与约10秒之间、介于约10秒与约100秒之间、介于约1秒与约60秒之间、介于约15秒与约45秒之间、介于约45秒与约75秒之间、介于约100秒与180秒之间，或者介于约180秒与540秒之间)。
可以选择性地向装置中的储器施加压力，以将连续相引导至期望位置。
在一些实施方案中，在连续相减少之后，通过抽吸(例如，使用手动或自动移液)从装置移除液滴。在一些实施方案中，收集多种抽吸物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10种)。
在一些实施方案中，连续相(例如，油)构成初始乳液体积的至多约0.5(例如，约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4或约0.5)。在一些实施方案中，施加一个或多个压差将连续相减少至乳液体积的小于约10％(例如小于约10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％)。在一些实施方案中，连续相的减少生成了液滴乳液，该液滴乳液为按体积计至少80％的分散相(例如，水性)，例如，80％-90％，诸如81％-85％。
将颗粒(例如珠粒(例如，携带加条形码的寡核苷酸的微胶囊)或生物颗粒(例如，细胞))分配到离散的液滴通常可以通过将水性液体中的颗粒(例如珠粒)的流动料流引入非水性液体的流动料流或非流动储器中，使得生成液滴来完成。在一些情况下，可以通过提供具有特定浓度或频率的颗粒(例如珠粒)的水性料流来控制所得液滴的占据率(例如，每个液滴中的颗粒(例如珠粒)数量)。在一些情况下，还可以通过相对于给定颗粒(例如珠粒)的直径调节液滴形成点处的一个或多个几何特征(诸如运送颗粒(例如珠粒)的流体通道的宽度)来控制所得液滴的占据率。
在需要包含单个颗粒(例如珠粒)的液滴的情况下，可以选择液体的相对流速，使得平均起来，每个液滴包含少于一个颗粒(例如珠粒)，以确保那些已被占据的液滴主要被单独占据。在一些实施方案中，可以选择液体的相对流速，使得大多数液滴被占据，例如，仅允许小百分比的液滴未被占据。可以控制流动和通道体系结构，以确保被单独占据的液滴具有期望的数量、未被占据的液滴小于一定水平，并且/或者被多重占据的液滴小于一定水平。
可以操作本文所述的方法，使得大多数已被占据的液滴在每个已被占据的液滴中包括不超过一个生物颗粒。在一些情况下，进行该液滴形成过程，使得少于25％的已被占据的液滴包含多于一个生物颗粒(例如，被多重占据的液滴)，并且在许多情况下，少于20％的已被占据的液滴具有多于一个生物颗粒。
例如，从成本角度和/或效率角度来看，可能希望避免产生过多数量的空液滴。然而，尽管这可以通过将足够数量的颗粒(例如珠粒)提供到液滴源区域中来实现，但是在意料之中，泊松分布可能使可以包括多个生物颗粒的液滴的数量增加。因此，至多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更小百分比的所生成液滴可以未被占据。在一些情况下，可以使用本发明的方法引导一种或多种颗粒或液体向液滴源区域中的流动，使得在许多情况下，不多于约50％的所生成液滴、不多于约25％的所生成液滴或不多于约10％的所生成液滴未被占据。可以控制这些流动，以便呈现被单独占据的液滴的非泊松分布，同时提供较低水平的未被占据的液滴。可以实现未被占据的液滴的上述范围，同时仍然提供上述单独占据率中的任何一者。例如，在许多情况下，使用本文所述的方法得到的液滴具有小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％并且在许多情况下小于约5％的多重占据率，同时未被占据的液滴少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或更小百分比。
第一流体的流动可以使得液滴包含单个颗粒(例如，珠粒)。在某些实施方案中，包含单个颗粒的液滴的收率为至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
应当理解，上述占用率也适用于包括生物颗粒(例如细胞)和珠粒两者的液滴。已被占据的液滴(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的已被占据的液滴)可以包括珠粒和生物颗粒两者。通道(例如，颗粒通道)内的颗粒(例如，珠粒)能够以基本上规则的流动剖面(例如，以规则的流速，例如，由一个或多个侧通道和/或一个或多个漏斗控制的流动剖面)流动，以提供在形成时具有单个颗粒(例如，珠粒)和单个细胞或其他生物颗粒的液滴。此类规则的流动剖面可以允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的双重占据率(例如，液滴具有至少一个珠粒和至少一个细胞或生物颗粒)。此类规则的流动剖面可以允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的1:1双重占据率(例如，液滴具有至少一个珠粒和至少一个细胞或生物颗粒)。例如在美国专利公开号2015/0292988中提供了此类规则流型和可以用于提供此类规则流型的装置，该美国专利公开全文以引用方式并入本文。
在一些情况下，附加颗粒可以用于将附加试剂输送到液滴。在此类情况下，将不同的颗粒(例如，珠粒)从不同的珠粒源(例如，容纳不同的相关试剂)通过不同的通道入口引入共同通道(例如，在液滴源区域近侧或在液滴源区域上游)或液滴形成相交部中可能是有利的。在此类情况下，可以控制每个不同颗粒(例如，珠粒)源进入通道或流体连接部的流量和/或频率，以提供来自每个源的颗粒(例如，珠粒)的期望比率，同时任选地确保将此类颗粒(例如，珠粒)的期望配对或组合形成为具有期望数量的生物颗粒的液滴。
本文所述的液滴可以具有小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL，或更小的值。例如，液滴的总体积可以小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL，或更小的值。在液滴还包含颗粒(例如，珠粒或微胶囊)的情况下，应当理解，液滴内的样品液体体积可以小于上述体积的约90％，小于上述体积(例如分配液体的上述体积)的约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％，例如为上述体积的1％至99％、5％至95％、10％至90％、20％至80％、30％至70％，或40％至60％，例如1％至5％、5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％，或95％至100％。
可以生成任何合适数量的液滴。例如，在本文所述的方法中，可以生成多个液滴，包括至少约1,000个液滴、至少约5,000个液滴、至少约10,000个液滴、至少约50,000个液滴、至少约100,000个液滴、至少约500,000个液滴、至少约1,000,000个液滴、至少约5,000,000个液滴、至少约10,000,000个液滴、至少约50,000,000个液滴、至少约100,000,000个液滴、至少约500,000,000个液滴、至少约1,000,000,000个液滴或更多个液滴。此外，多个液滴可以包括未被占据的液滴(例如，空液滴)和已被占据的液滴两者。
要分散成液滴的流体可以从储器输送到液滴源区域。替代性地，要分散成液滴的流体通过在由本发明的方法提供的装置中结合两种或多种流体而原位形成。例如，要分散的流体可以通过将包含一种或多种试剂的一种流体与包含一种或多种试剂的一种或多种其他流体结合而形成。在这些实施方案中，混合这些流体料流可以引起化学反应。例如，当采用颗粒时，具有使颗粒破裂的试剂的流体可以与颗粒结合，例如，在紧邻液滴生成区域的上游。在这些实施方案中，颗粒可以是细胞，其可以与裂解试剂(诸如表面活性剂)结合。当采用颗粒(例如珠粒)时，颗粒(例如珠粒)可以溶解或化学降解，例如通过改变pH(酸或碱)、氧化还原电位(例如添加氧化剂或还原剂)、酶活性、盐或离子浓度，或者其他机制。
第一流体以足以在液滴源区域中产生液滴的流速输送通过第一通道。第一流体的较快流速通常增加液滴产生的速率；然而，在足够高的速率下，第一流体将会形成射流，该射流可能不会分解为液滴。通常，通过第一通道的第一流体的流速可以介于约0.01μL/min至约100μL/min之间，例如介于0.1μL/min至50μL/min之间、介于0.1μL/min至10μL/min之间，或者介于1μL/min至5μL/min之间。在一些情况下，第一液体的流速可以介于约0.04μL/min与约40μL/min之间。在一些情况下，第一液体的流速可以介于约0.01μL/min与约100μL/min之间。替代性地，第一液体的流速可以小于约0.01μL/min。替代性地，第一液体的流速可以大于约40μL/min，例如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min，或更大的值。在较低的流速(诸如约小于或等于10μL/min的流速)下，液滴半径可能不取决于第一液体的流速。替代性地或除此之外，对于任何前面提到的流速，液滴半径可以与第一液体的流速无关。
由本发明的方法提供的装置中单个通道的典型液滴形成速率介于0.1Hz至10,000Hz之间，例如介于1Hz至1000Hz之间，或者介于1Hz至500Hz之间。使用多个第一通道可以通过增加形成位置的数量来增加液滴形成的速率。
如上文所论述的，液滴形成可以在没有外部驱动的连续相运动的情况下发生。在此类实施方案中，连续相响应于第一流体的前进料流的位移或其他力而流动。通道可以存在于液滴源区域(例如包括搁板区域)中，以允许连续相围绕第一流体更快速地输送。连续相的这种输送增加可以增加液滴形成的速率。替代性地，可以主动输送连续相。例如，连续相可以被主动输送到液滴源区域(例如包括搁板区域)中，以增加液滴形成的速率；连续相可以被主动输送以在第一流体离开远侧端部时形成围绕第一流体的鞘流；或者连续相可以被主动输送以将液滴从形成点移走。
影响液滴形成速率的附加因素包括第一流体和连续相的粘度，其中增加任一流体的粘度都会降低液滴形成速率。在某些实施方案中，连续相的粘度介于0.5至10cP之间。此外，较低的界面张力导致液滴形成较慢。在某些实施方案中，界面张力介于0.1mN/m与100mN/m之间(例如，1mN/m至100mN/m或2mN/m至60mN/m)。搁板区域的深度也可以用于控制液滴形成速率，其中较浅的深度导致较快的形成速率。
这些方法可以用于产生直径在1μm至500μm(例如，1μm至250μm、5μm至200μm、5μm至150μm，或12μm至125μm)范围内的液滴。影响液滴大小的因素包括形成速率、第一通道远侧端部的横截面尺寸、搁板的深度，以及流体特性和动态效应，诸如界面张力、粘度和流速。
第一液体可以是水性的，第二液体可以是油(或者反过来)。油的实例包括全氟化油、矿物油和硅油。例如，氟化油可以包括用于稳定所得液滴(例如，抑制所得液滴随后的聚结)的含氟表面活性剂。特别有用的液体和含氟表面活性剂的实例在例如美国专利号9,012,390中有所描述，该专利全文以引用方式并入本文用于所有目的。具体的实例包括氢氟醚，诸如HFE 7500、7300、7200或7100。合适的液体是US2015/0224466和US 62/522,292中描述的那些，这些专利的液体据此以引用方式并入。在一些情况下，液体包括附加组分，诸如颗粒，例如细胞或凝胶珠粒。如上文所论述的，第一流体或连续相可以包括用于进行各种反应(诸如核酸扩增、裂解或珠粒溶解)的试剂。第一液相或连续相可以包括稳定或以其他方式影响液滴或液滴内的组分的附加组分。此类附加组分包括表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂、缓冲剂、抗生素、盐、离散剂、酶、纳米颗粒和糖。
本发明的方法可以用于各种应用，诸如处理来自单个细胞的单种分析物(例如生物分析物，例如RNA、DNA或蛋白质)或多种分析物(例如生物分析物，例如DNA和RNA、DNA和蛋白质、RNA和蛋白质，或者RNA、DNA和蛋白质)。例如，生物颗粒(例如，细胞或病毒)可以在液滴中形成，并且来自生物颗粒(例如，细胞)的一种或多种分析物(例如，生物分析物)可以被修饰(例如，被分析物部分结合、标记或以其他方式修饰)用于后续处理。所述多种分析物可以来自单个细胞。该过程可以实现例如对细胞或其群体的蛋白质组、转录组和/或基因组分析(例如，对细胞或其群体同时进行蛋白质组、转录组和/或基因组分析)。
修饰分析物的方法包括在液体载体(例如，水性载体)中提供多个颗粒(例如，珠粒)；提供在样品液体中含有分析物(例如，作为细胞或者其组分或产物的一部分)的样品；以及使用由本发明的方法提供的装置来结合这些液体并且形成含有一种或多种颗粒和一种或多种分析物(例如，作为一个或多个细胞或其组分或产物的一部分)的分析物液滴。液滴中一种或多种颗粒与分析物(例如，与细胞相关联的生物分析物)的这种隔离使得能够对大的异源样品(例如，异源群体内的单个细胞)的离散部分进行标记。液滴一旦被标记或以其他方式进行修饰，就可以被结合(例如，通过破坏乳液)，并且可以分析所得的液体以确定与众多单个细胞中的每一者相关联的多种特性。
在具体实施方案中，本发明的特征在于使用具有在液滴源区域上游相交的颗粒通道(例如，第一通道)和样品通道(例如，第二通道或与第二通道相交的第一侧通道)的由上述方法提供的装置产生分析物液滴的方法。液体载体中的具有分析物部分的颗粒从近侧到远侧(例如，朝向液滴源区域)流过颗粒通道(例如，第一通道)，并且包含分析物的样品液体在从近侧到远侧的方向上(例如，朝向液滴源区域)流过样品通道(例如，第二通道或与第二通道相交的第一侧通道)，直到这两种液体在液滴源区域的上游(和/或近侧)在样品通道和颗粒通道的相交部处相遇并结合。液体载体与样品液体的组合产生了分析物液体。在一些实施方案中，这两种液体是可混溶的(例如，它们都含有溶于水或水性缓冲液的溶质)。这两种液体可以在如本文所述的混合器中混合。这两种液体的结合能够以受控的相对速率发生，使得分析物液体具有期望的颗粒液体与样品液体的体积比、期望的颗粒与细胞的数值比，或它们的组合(例如，每50pL每细胞中有一个颗粒)。当分析物液体流过液滴源区域进入分隔液体(例如，与分析物液体不可混溶的液体，诸如油)时，形成分析物液滴。这些分析物液滴可以继续流过一个或多个通道。替代性地或除此之外，分析物液滴可以在液滴收集区域中积聚(例如，作为基本上静止的群体)。在一些情况下，液滴群体的积聚可以通过液滴收集区域内的流体的平缓流动而发生，例如，以将形成的液滴移出初生液滴的路径。
可用于分析的方法的特征可以在于本文所述的要素的任何组合。例如，在这些方法中可以采用各种液滴源区域。在一些实施方案中，分析物液滴在具有搁板区域的液滴源区域处形成，在该搁板区域处，分析物液体在其穿过液滴源区域时在至少一个维度上膨胀。本文所述的任何搁板区域均可以用于本文所提供的分析物液滴形成方法中。除此之外或替代性地，液滴源区域可以在液滴源区域的入口处或远侧(例如，在液滴源区域内或液滴源区域远侧)具有台阶。在一些实施方案中，分析物液滴在没有外部驱动的连续相流动的情况下(例如，通过液滴源区域处的一个或多个液体交叉流动)形成。替代性地，分析物液滴在存在外部驱动的连续相流动的情况下形成。
可用于形成液滴的通过本发明的方法所描述的装置的特征可以在于多个液滴源区域(例如，(例如，作为独立的并联回路)彼此流体连通或不流体连通)。例如，这种装置可以具有2个至100个、3个至50个、4个至40个、5个至30个、6个至24个、8个至18个，或者9个至12个，例如2个至6个、6个至12个、12个至18个、18个至24个、24个至36个、36个至48个，或者48个至96个，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个或更多个被配置为产生分析物液滴的液滴源区域。
源储器可以在液滴形成之前和期间储存液体。在一些实施方案中，可用于形成分析物液滴的由本发明的方法提供的装置包括在近侧连接到一个或多个颗粒通道的一个或多个颗粒储器。在分析物液滴形成之前，颗粒悬浮液可以储存在颗粒储器(例如，第一储器)中。颗粒储器可以被配置为储存含有分析物部分的颗粒。例如，颗粒储器可以包括例如防止颗粒或分析物部分吸附或结合(例如，特异性或非特异性结合)的涂层。除此之外或替代性地，颗粒储器可以被配置为相应地最小化分析物部分(例如，通过包含核酸酶，例如，DNA酶或RNA酶)或颗粒基质本身的降解。
除此之外或替代性地，装置包括在近侧连接到一个或多个样品通道的一个或多个样品储器。在分析物液滴形成之前，包含细胞和/或可用于分析物和/或液滴形成的其他试剂的样品可以储存在样品储器中。样品储器可以被配置为减少样品组分的降解，例如通过包括核酸酶(例如，DNA酶或RNA酶)。
本发明的方法可以包括将样品和/或颗粒添加到由上述方法提供的装置中，例如，(a)通过将样品液体或者其组分或浓缩物移液到样品储器(例如第二储器)中，以及/或者(b)通过将液体载体(例如水性载体)和/或颗粒移液到颗粒储器(例如第一储器)中。在一些实施方案中，该方法包括在将样品液体或者其组分或浓缩物添加(例如移液)到样品储器中之前，首先将液体载体(例如水性载体)和/或颗粒添加(例如移液)到颗粒储器中。在一些实施方案中，添加到颗粒储器中的液体载体包括裂解试剂。替代性地，本发明的方法包括将含有裂解试剂的液体(例如，第四液体)添加到裂解试剂储器(例如，第三储器)中。
样品储器和/或颗粒储器可以在适于维持或促进其内容物活性的条件下孵育，直到液滴形成启动或开始。
如本文所提供的生物分析物液滴形成方法可以用于各种应用。特别地，通过使用本文的方法形成生物分析物液滴，用户可以执行标准的下游处理方法以对细胞的异质群体加条形码，或者执行单细胞核酸测序。
在对细胞群体加条形码的方法中，使具有细胞群体的水性样品在样品通道和颗粒通道的相交部处与水性载体中的具有核酸引物序列和条形码的生物分析物颗粒结合，以形成反应液体。在一些实施方案中，这些生物分析物颗粒处于包含裂解试剂的液体载体中。在一些实施方案中，裂解试剂包含在裂解液体中。裂解试剂(例如，在第一液体中)可以在通道相交部(例如，第一通道和第二通道之间的相交部)处与样品液体(例如，第三液体)结合。这些结合的液体可以在设置于该相交部下游的混合器中混合。
反应液体在穿过液滴源区域时，在液滴形成条件下与分隔液体(例如，分隔油)相遇，以在该反应液体中形成多个反应液滴，每个反应液滴具有一个或多个颗粒和一个或多个细胞。反应液滴在足以允许为反应液滴中的细胞的核酸加条形码的条件下孵育。在一些实施方案中，对于核酸复制、转录和/或扩增，对足以加条形码的条件进行热优化。例如，反应液滴可以在被配置为使得能够用逆转录酶将液滴中的细胞所产生的RNA逆转录成DNA的温度下孵育。除此之外或替代性地，反应液滴可以循环通过一系列温度以促进扩增，例如，如在聚合酶链反应(PCR)中。因此，在一些实施方案中，反应液滴中包含一种或多种核苷酸扩增试剂(例如，PCR试剂)(例如，引物、核苷酸和/或聚合酶)。用于核酸复制、转录和/或扩增的任何一种或多种试剂可以由水性样品、液体载体或两者提供给反应液滴。在一些实施方案中，用于核酸复制、转录和/或扩增的一种或多种试剂处于水性样品中。
本文还提供了单细胞核酸测序的方法，其中细胞的异源群体可以通过它们各自的基因表达例如相对于该群体的其他细胞来表征。本文论述的和本领域已知的为细胞加条形码的方法可以是本文提供的单细胞核酸测序方法的一部分。在加条形码之后，对已经加条形码的核酸转录物进行测序，并且可以根据已知方法对序列进行处理、分析和储存。在一些实施方案中，这些方法能够生成包含异源群体内的任何单个细胞的基因表达数据的基因组文库。
替代性地，本文的方法提供的将单细胞隔离在反应液滴中的能力使得生物分析物能够用于超出基因组表征的范围的应用。例如，包含单细胞和能够结合不同蛋白质的各种分析物部分的反应液滴可以允许单细胞被可检测地标记，以提供相对蛋白质表达数据。在一些实施方案中，分析物部分为抗原结合分子(例如，抗体或其片段)，其中每个抗体克隆被可检测地标记(例如，用具有不同发射波长的荧光标记物)。抗体与蛋白质的结合可以发生在反应液滴内，随后可以根据已知方法分析细胞的结合抗体，以生成蛋白质表达文库。使用本文提供的方法，可以采用本领域已知的其他方法来表征异源群体内的细胞。在一个实例中，在形成液滴之后，可以进行的后续操作可以包括形成扩增产物、纯化(例如，经由固相可逆固定(SPRI))、进一步加工(例如，剪切、连接功能序列和后续扩增(例如，经由PCR))。这些操作可以成批进行(例如，在液滴外部)。使用本发明的方法形成的液滴的示例性用途是进行核酸扩增，例如聚合酶链反应(PCR)，其中进行扩增所必需的试剂包含在第一流体内。在液滴是乳液中的液滴的情况下，可以破坏乳液，然后将液滴的内容物合并，以供附加操作使用。可以连同携带条形码的珠粒一起包括在液滴中的附加试剂可以包括用于封闭核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和用于消化来自细胞的基因组DNA的核酸酶。另选地，可以在附加处理操作期间应用rRNA去除剂。通过这种方法生成的构建体的构型可以帮助在测序期间最小化(或避免)多聚T序列的测序和/或对多核苷酸序列的5’端进行测序。可以对扩增产物(例如第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序以进行序列分析。在一些情况下，可以使用部分发夹式测序扩增(PHASE)方法进行扩增。
实施例
在以下非限制性实施例中进一步描述了本发明。
实施例1
图1A显示了根据本发明的装置的实施方案，该装置包括第一储器、第一通道、第二储器、第二通道、液滴源区域、收集储器、第三储器和第三通道。第一通道和第二通道在液滴源区域的上游相交。在所示的示例性装置中，这些部件都是流体连接的。在该实施方案中，第一液体从第一储器经由第一通道流到与第二通道的相交部处，并且第三流体从第二储器经由第二通道流到相交部处，在相交部处第三流体与第一液体结合。结合的第一液体和第三液体流到液滴源区域，以在第二液体中产生液滴的乳液。将液滴收集在收集储器中。在液滴生成之后，一系列压力差将过量的第二液体从收集储器输送至第三通道并进入第三储器。图1B显示了收集储器与包括过滤器的第三通道之间的界面的实施方案的特写视图。
实施例2
图2是显示具有不同水平的乳液体积的小瓶的照片。管1-2和5-6显示了两次单独的液滴生成运行以及随后施加两个压差的结果。该实验中的第一压差为4.0PSI持续30秒，并且第二压差为0.3PSI持续300秒。将乳液收集在两种抽吸物中，产生两对含有乳液的管(如管1-2和5-6所示)。从收集储器的底部收集每次液滴生成运行的第一抽吸物，并转移至管1和5。从收集储器的顶部收集每次液滴生成运行的第二抽吸物，并转移至管2和6。在该实验中，第二压差部分地减轻了两种抽吸物之间的油体积差，并将油减少至总体积的约4％。使用光学图像分析工具分析油和乳液的体积。
实施例3
图3A是显示含有来自两次液滴生成运行的乳液的八个小瓶的一对照片，其中每次运行收集四种抽吸物。在该实施方案中，采用了4PSI的压差持续30秒。使用这种压差范例，我们不仅在第一抽吸物(用星号表示)中观察到更高水平的油，而且在第二抽吸物(用菱形表示)中观察到更高水平的油，并且在第三抽吸物中观察到残留的乳液体积(用三角形表示)。图3B是显示含有来自四次液滴生成运行的乳液的八个小瓶的一对照片，其中每次运行收集两种第一抽吸物。在该实施方案中，采用了4PSI的第一压差持续30秒、4.0PSI的第二压差持续38秒、0.6PSI的第三压差持续60秒和0.3PSI的第四压差持续60秒，持续时间为188秒。与图3A的压差相比，在第一抽吸物和第二抽吸物中，油体积显著减少。这导致乳液堆积密度整体增加，并且抽吸物之间的可变性更小。然而，总体积并未受到显著影响，导致每次抽吸收集到更多乳液。图3C是显示含有来自四次液滴生成运行的乳液的八个小瓶的一对照片，其中每次运行收集两种第一抽吸物。在该实施方案中，采用了4.0PSI的第一压差持续30秒、4.0PSI的第二压差持续38秒、1.2PSI的第三压差持续60秒、0.6PSI的第四压差持续5秒和0.3PSI的第五压差持续5秒，持续时间为138秒。抽吸物之间的油体积差异小于图3A所示的对照实施方案中观察到的差异，但大于图3B的实施方案中的差异。这种压差范例在填充密度、最少残留油和使用更少时间之间提供了平衡。
实施例4.
图4是一系列图表，显示了四个参数的平均值和标准偏差：油Δ(第一抽吸物的油体积与第二抽吸物的油体积之间的差)、估计的油分数(第一抽吸物和第二抽吸物中油的总体积)、水分数(第一抽吸物和第二抽吸物中液滴乳液的总体积除以总液体体积)以及收集孔中的总体积，以响应不同的压差范例。从收集储器中收集两种抽吸物，并使用光学图像分析工具分析油和乳液的总体积。第1列含有对照运行的这些值，其中在30秒的休息期之后，压差为4PSI持续30秒。产生乳液，并对收集储器施加短时间的高压，以减少收集储器底部的油。收集的抽吸物显示出明显可见的油(特别是抽吸物1)。第2列显示了第二次控制运行的这些值，该值经过重新优化，包括在30秒的休息期后4PSI的压差持续额外8秒，总共38秒。通过显微镜进行的验证显示，这种压差略微改善了收集储器底部的油减少，但没有显著改变水分数。第3列显示了使用4PSI的压差持续38秒，随后使用0.6PSI的第二压差持续30秒，并然后使用0.3PSI的第三压差持续30秒的运行结果。在此，观察到油Δ相对于对照的改善。然而，乳液堆积密度仍然低于相同条件下但第二压差和第三压差各自的运行时间都为60秒的乳液堆积密度。第4列显示了另一次运行的结果，该运行使用4PSI的第一压差持续38秒，随后使用1.2PSI的第二压差持续60秒、0.6PSI的第三压差持续5秒、0.3PSI的第四压差持续5秒。此处，油△在△方面并没有明显优于第3列。第5列显示了使用4PSI的第一压差持续38秒，1.2PSI的第二压差持续30秒以及0.6PSI的第三压差持续30秒的运行结果。此处，更多的水性液滴与油一起被推回，这降低了被推回的总体积。第6列显示了使用4PSI的第一压差持续38秒，0.6PSI的第二压差持续60秒以及0.3PSI的第三压差持续60秒的运行结果。第7列显示了使用4PSI的第一压差持续38秒，0.6PSI的第二压差持续60秒以及1.2PSI的第三压差持续60秒的运行结果。随着这些运行持续时间的增加，抽吸物1和2之间的油体积△减少，并且水分数增加，证实了乳液堆积密度正在增加。由于存在更少的油，收集孔中的总体积减少。
实施例5
图5是一系列图表，显示了四个参数的平均值和标准偏差：油Δ(第一次抽吸物的油体积与第二抽吸物的油体积之间的差)、产品孔中的总体积(推回后孔中的总体积，其包括总的水和剩余的油)、水分数(AQ)(输出中水体积与水和油体积的比率)和水体积(200μL乳液集合中水体积的量)。从收集储器中收集两种抽吸物，并使用光学图像分析工具分析油和乳液的总体积。AQ分数是通过用全氟辛醇(PFO)破坏乳液，并然后使用光学成像计算水的体积以及油和PFO的体积来确定的。
第1列显示了使用4PSI的压差持续38秒的运行结果，但在推回之前允许乳液沉降3分钟。第2列显示了在产品孔上使用4PSI的第一压差持续38秒和0.15PSI的第二压差持续120秒的运行结果。第3列含有对照运行的值，其中在30秒的休息期之后，压差为4PSI下30秒。产生乳液，并对收集储器施加短时间的高压，以减少收集储器底部的油。收集的抽吸物显示出明显可见的油(特别是抽吸物1)。第4列显示了使用4PSI的压差运行38秒的这些值，但将推回时间增加到38秒，以增加去除的油量。此处，大部分剩余的油被截留在水性液滴之间。第5列显示了未使用压力的另一个对照运行的结果。第6列显示了使用4PSI的第一压差持续38秒，0.6PSI的第二压差持续60秒以及0.3PSI的第三压差持续60秒的运行结果。第7列显示了使用4PSI的第一压差持续38秒和0.3PSI的第二压差持续120秒的运行结果。第8列显示了使用4PSI的第一压差持续38秒和0.3PSI的第二压差持续300秒的运行结果。观察到第一抽吸物和第二抽吸物之间的油体积存在显著差异，这是因为孔底有过量的油，并且由于浮力，导致乳液顶部的液滴比底部的液滴更紧密地堆积在一起，从而导致水分数存在梯度。
实施例6
图6是一系列图表，显示了三个参数的平均值和标准偏差：预期的GEMS数量(预期的乳液包凝胶珠粒的总数)、预期的过量体积(抽吸后剩余的预期总体积)和油Δ(第一抽吸物的油体积与第二抽吸物的油体积之间的差)。
权利要求书也包括其他实施方案。
Claims (21)
1.一种浓缩乳液中的液滴的方法，所述方法包括：
a)提供装置，所述装置包括：
i)第一通道，所述第一通道具有第一近侧端部、第一远侧端部、第一深度和第一宽度；
ii)液滴源区域，所述液滴源区域与所述第一通道的所述第一远侧端部流体连通，其中所述液滴源区域的宽度或深度大于所述第一宽度或所述第一深度；以及
iii)收集储器，所述收集储器与所述液滴源区域流体连通并收集在所述液滴源区域中形成的液滴；
b)使第一液体从所述第一近侧端部流向所述液滴源区域，以在所述收集储器中的第二液体中产生所述第一液体的液滴的乳液；以及
c)通过在第一时间段内施加第一压差和在第二时间段内施加第二压差来减少所述乳液中所述第二液体的体积，以产生浓缩乳液。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过移液以大致相等的等分试样的形式移除所述浓缩乳液。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述等分试样中所述第二液体的体积分数大致相同。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第二时间段大于所述第一时间段。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一压差大于所述第二压差。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述第一时间段介于1秒与60秒之间。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述第二时间段介于30秒与600秒之间。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一压差介于1.0PSI与10PSI之间。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第二压差介于0.01PSI与1.0PSI之间。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述装置还包括与所述第一近侧端部流体连通的第一储器，并且所述第一压差和所述第二压差将所述第二液体从所述收集储器输送至所述第一储器。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一液体包含颗粒，并且所述液滴还包含所述颗粒。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述装置还包括第二通道，所述第二通道具有第二近侧端部、第二远侧端部、第二深度、第二宽度；其中所述第二通道在所述第一近侧端部与所述第一远侧端部之间与所述第一通道相交，并且其中步骤(b)还包括使第三液体从所述第二近侧端部流向与所述第一液体结合的相交部处，并且所述液滴还包含所述第三液体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述装置还包括与所述第二近侧端部流体连通的第二储器，并且其中在步骤(c)期间，所述第二储器和所述收集储器中的压力基本上相同。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述装置还包括具有第三近侧端部和第三远侧端部的第三通道，其中所述第三近侧端部与所述收集储器流体连通，并且所述第一压差和所述第二压差将所述第二液体从所述收集储器输送至所述第三远侧端部。
15.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括与所述第三远侧端部流体连通的第三储器。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述收集储器与所述第三近侧端部之间的界面的深度介于10μm与50μm之间。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述装置还包括过滤器，以阻碍液滴进入所述第三通道。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述过滤器包括多个柱。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述第一液体是水性的或能够与水混溶的。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述第二液体是油。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述浓缩乳液包含至少80体积％的液滴。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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