CN101275164A - 试样调制法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供试样调制法及装置，具体方法是把作为分析对象的含有DNA分子1的试样溶液划分成比DNA分子总数N还多的M个微小液滴，使含有微小液滴的乳剂进行PCR等的扩增反应以后，通过使用嵌入剂等的荧光检测来检测出各微小液滴中得到的扩增产物的有无(量)。

Description

试样调制法及装置
技术领域
本发明涉及用于基因分析技术的试样调制法。更详细地讲，涉及用于1个细胞中包含的mRNA的数据分析或同时逐个分析多个标的分子的方法的试样调制法。
背景技术
随着人类基因组序列译解的完成，来到了深入地研究种种基因组的信息并活用它们的时代。基因组信息被mRNA复制，翻译成蛋白质。这样进行的基因的表达轮廓分析，对详细研究生命活动是不可缺少的。到现在为止，成为主流的分析方法是从多个细胞取出mRNA，进行了荧光标识之后让DNA探针阵列(DNA芯片)起作用，在具有与mRNA互补序列的捕获在探针标识mRNA的检测方法。与此相对，也有从多个细胞取出mRNA，制造该cDNA，并对其进行电泳分离而测量的方法。这个方法是模拟地测量种种的mRNA的量的方法，不过，从测量灵敏度问题考虑，必须使用多个细胞取出mRNA进行测量。
另外，生命活动被认为以多个细胞协调构成一个系统而成立，组织中的各个细胞有各自不同的作用。要理解真正的生命，监视这样的各个细胞的作用是重要的，开始重视1个细胞中包含的mRNA或蛋白质的测量。而且把1个细胞中微量包含的mRNA的种类和量进行正确定量分析是必要的。但这样的方法尚没有。
发明者们为了克服这个问题，把通过把1个细胞中包含的全部的mRNA或认为必需测量的多种类的mRNA进行数字计数进行定量分析作为目标。所谓数字计数，是确定各自的mRNA(或cDNA片断)的序列而确定种类，统计具有该序列的mRNA包含几个的定量分析的方法。
即，通过对在细胞这样的小区域中包含的多个mRNA或各DNA片断进行序列分析进行数字计数，不过，为此必须能个别地扩增各个的mRNA(或cDNA片断)进行序列分析。在这里重要的是无遗漏地独立扩增全部的mRNA(或cDNA片断)。
上述的方法，并列一分子的DNA或mRNA作为原材料进行多个PCR扩增，不过，试样以溶液状在其中包含从数十到百万级的mRNA或cDNA片断。当把这些一起进行PCR扩增，在得到多个扩增产物的混合物情况下，不能得到目的测量试样。需要使各个mRNA独立，没有遗漏地扩增，并将它们分别取出。为了独立扩增各个的mRNA，以各自被分离了的状态个别进行PCR反应，不过，为此每一反应体积的反应开始时的DNA或RNA分子数的期望值到成为1以下，必须在进行了稀释划分试样溶液之后，对各个的区划独立进行PCR扩增反应。譬如，估计某试样中的扩增对象分子数为10万分子时，由于把试样溶液稀释划分成数十万以上，通过各自个别进行PCR(polymerase chain reaction)等的扩增反应独立扩增试样中的全部的分子，即能克隆扩增。
用这样的方法个别地扩增多个DNA的试验近几年尝试了几个。譬如在平面板上设置非常多的微小反应孔，使包含靶DNA片断和扩增必要的酶和反应底物等的溶液流到板上，划分成微小反应孔。划分的PCR溶液因为被互相分离，能独立扩增。通过调整为进入1个区划的DNA试样的量成为平均1个以下而能个别地扩增。这个方法的一例，在分析化学中被公开(非专利文献1)。本例，在硅基板上构筑1万个孔实现高集成化。可是，为了扩增100万个DNA片断需要更多个反应孔。另外，不可能把成为对象的试样溶液全部不剩注入微小反应孔，溶液剩余或被反应孔的内壁等吸附，产生了在PCR扩增反应中没有使用的DNA。
另外，不是以来自1个分子的扩增作为目标的尝试，不过，也有不使用微小容量的滴定板而使用平面的凝胶点阵进行PCR的例(专利文献1)。以前，采用在低温进行凝胶化的材料使PCR产物试样溶液凝胶化提高试样的操作性的方法是公知的(专利文献2)，但在该例中，利用矩阵配置了凝胶化试样的基因检验用芯片。可是，由于该方法采用了空间固定的反应孔，所以在反应孔中也存在包含目的扩增产物的东西，不过，也存在完全不包含的东西。为此，出现了没有被扩增的目标试样，怎么区分目的扩增产物成为问题。
进而，作为一个更有力的方法，有被称作为乳剂PCR的方法。该方法代替使用每试样独立的反应容器，在油中形成多个的微小液滴内进行反应。用该方法，由于液滴的微小化通过搅拌等容易进行，所以在100微升左右的一个容器内能形成数十万个以上的相当反应容器的微小液滴。
但是，采用乳剂的方法，由于不容易从各个微小液滴中个别回收试样，所以在微小液滴中使DNA或RNA固定，通过放入带探针的珠，从溶液分离在生成反应物之后捕获了反应物的珠(beads)，回收各微小液滴中的DNA或RNA。这样，在回收使用这样的珠固相的试样时，为了回收由酶反应等得到的DNA或RNA，必须分开回收得到生成物的固相与没能得到的固相。为此，使用准备把具有由PCR反应得到的DNA的一部分互补序列的探针固定化的磁珠，使探针与被扩增了的DNA片断杂交后，用磁铁区分回收的方法。活用这个方法扩增多个DNA片断决定基因组序列的使用例，在“自然”等有刊载(专利文献3及非专利文献2)。可是，把该技术用于全部的mRNA扩增和测量其序列还存在重大的问题。该系统必须在乳剂中的1反应液滴中包含珠和靶DNA1拷贝，在生成的液滴中包含2个以上的珠，重复1个mRNA计数，不能数字计数。为了解除这个问题，使珠的量和DNA同样很少时产生了大量包含DNA、但不包含珠的液滴，还是不合适。采用固体珠回收生成的DNA是好的方法，对使用重复的DNA试样决定基因组序列等目的是可以充分地使用的方法，不过，其不适于数字计数。
【专利文献1】特开2004-337064号公报
【专利文献2】特开平10-004963号公报
【专利文献3】WO2005/10145(PCT/US2004/015587)
【非专利文献1】Anal.Chem.2001，73，p1043-1047
【非专利文献2】Nature.2005，437，p376-380，SupplementaryInformation)
发明内容
如前所述，以前的方法全都存在问题。首先，使用了滴定板的技术没有考虑同时处理多个试样取出扩增产物时的液体处理，为了识别被扩增了的反应产物，照流体状态原样个别回收多个试样，存在必须有对应试样数的大量的试样容器和繁杂的处理工作的问题。
在珠表面捕获扩增产物回收的方法，在珠里需要预先固定对反应必要的引物等，不过，存在把固定在固相的引物作为扩增用的引物使用，在固相表面打算得到扩增产物时扩增效率下降的问题。这是因为由于通过成为酶反应的底物的DNA或是RNA等的分子被固定化，分子运动的自由度下降，比溶液系反应效率更大地下降。进而，还存在对固相表面的DNA或RNA的非特异性吸附问题。即，成为最初的扩增的模板的DNA片断被吸附在固相上时，作为模板不能灵巧地活动，得不到在乳剂中包含DNA模板1个拷贝的物质的扩增产物。特别在把用于克隆扩增的目的的每1反应液1个分子的极低浓度的DNA或RNA试样作为开始原材料使用时，由于非特异性吸附产生的影响变得相对地大而严重。进而，如前述所示，在各个微小乳剂反应液中均匀地放入珠是困难的。特别，在通过搅拌操作乳剂调制时不可能在全部的液滴中放入相同数目的珠等的固相，时而多个珠进入一个液滴，时而一个也没进入。当不能控制每个液滴的珠等的固相的数时，以试样中的全分子为对象精度很好地进行一分子测量变得困难。
这样，以前的方法并不适用对于同时扩增构成为全部试样的DNA片断池(从1细胞得到的mRNA或cDNA片断的集合)的全部的成分并回收的目的。
本发明，是为了克服这以前的技术的问题而提出的，取出包含在1个细胞中的mRNA，将其转录成cDNA上，对每1分子扩增回收，调制DNA序列试样来作为课题。即，以提供这种技术作为目的，即该技术用简便的方法把DNA片断池中包含的全部的成分以每1分子进行扩增并个别回收。
为了解决上述课题，发明者们通过专心讨论，通过确实实现每1分子的扩增，只取出被扩增了的反应产物的这样的办法，成功地把1个细胞中包含的全部的mRNA(cDNA)在每1分子中扩增并将它们个别回收。
即，本发明，涉及一种个别地扩增并取出试样中的多种核酸的方法，其特征在于，对稀释成在1个微小液滴内中包含不超过1种核酸的试样，在疏水性溶剂中的微小液滴内进行PCR反应，在PCR反应结束后以固体或凝胶的状态分离反应液。
上述方法，包括以下工序：通过在PCR反应液中预先添加与扩增产物结合或插入的荧光试剂、只分别选取含扩增产物的液滴。作为这样的荧光试剂，能举出嵌入剂、作了荧光标记的分子信标等。
对于试样中的多种核酸，以可预先由单一的PCR引物扩增的方式导入接头序列。
在本发明，为了在每液滴独立进行扩增，PCR反应是在分散于疏水性溶剂中的微小液滴乳剂中进行或是在序列有互相分离的微小反应孔的板的微小反应孔内进行。
在PCR反应液中，为了以固体或凝胶的状态分离反应后的液，预先添加用于形成水凝胶的、琼脂糖、明胶、淀粉、角叉菜胶、果胶、琼脂胶、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮等的水溶性合成聚合物等的凝胶化剂。
作为在本发明能使用的疏水性溶剂，以硅油或石蜡油作为主剂是优选的。
另外，在PCR反应液中，为了提高在疏水性媒体中的微小液滴的稳定性，把表面活性剂(两亲性物质等)及/或覆膜形成剂预先添加到PCR反应液中是优选的。
本发明另外也提供一种核酸分析方法，其包括检测或定量用上述的方法个别地扩增并取出的多种核酸的工序。
进而，本发明提供是用于上述方法的装置，其具有：1)由用于以溶液状态保存凝胶化剂的调温机构、用于混合凝胶化剂和反应液的液体处理机构、和搅拌机构构成的试样分注混合装置，2)由振荡或转动式的搅拌机、喷墨式及细微流路的任意一个构成的微小液滴调制装置，3)用于PCR反应的具有热循环功能的调温装置，及4)具备图像检测方式或流式细胞方式的检测器的荧光检测装置。
在上述装置，在4)的流式细胞方式中，具备流式细胞通过流路转换的分配功能。
另外，本发明提供一种核酸分析系统，其包括所述的装置和DNA测序仪及/或流式细胞仪。
发明的效果
根据本发明，可以同时分别用PCR扩增象在1个细胞中包含的全部的mRNA的多个微量试样，用荧光确认得到的扩增产物，回收作为凝胶的微小液滴。为了回收，不需要在反应液中设置固相，由此引起的成本和工夫可以被节省减少。同时，能防止由于使用固相而导致的试样损失和反应效率的降低。
附图说明
图1是本发明的方法的示意图。
图2是把本发明的方法用于cDNA时的示意图。
图3是本发明的方法的工序图。
图4是本发明的实施例1的数据。
图5是本发明的实施例1的说明图。
图6是本发明的实施例1的数据。
图7是本发明的实施例1的数据。
图8是本发明的实施例2的说明图。
图9是本发明的实施例2的说明图。
图10是本发明的实施例2的说明图。
图11是本发明的实施例3的说明图。
图12是本发明的实施例4的说明图。
图13是本发明的实施例5的说明图。
符号说明
1-3：DNA分子，4，5，7：DNA进入了的微小液滴，6，8：DNA没进入的微小液滴，9：反应容器，10：油，11：乳剂，12：荧光，13：有来自DNA1-3的扩增产物的微小液滴，14：没有扩增产物的微小液滴，21：1个细胞，22：从1个细胞得到的mRNA，23：磁珠，24：聚T低聚物，25：互补链DNA，26：cDNA，27：切断处，28：接头序列，29：DNA片断，30：游离了的单链DNA，31：在珠上固定化了的单链DNA，32，33，34：引物，35：引导序列，41：在同样反应容器内的疏水性溶剂中比扩增对象的模板分子数还多地调制多个含有凝胶化剂及荧光色素的扩增用反应液的微小液滴的工序，42：进行扩增反应的工序，43：确认含有扩增产物的凝胶化了的微小液滴的工序，44：分取含有扩增产物的凝胶化了的微小液滴的工序，45，46，47：目的PCR产物的带，48，49：凝胶化了的反应液的微小液滴，50：油，51：乳剂，71：荧光检测的液滴数与模板分子数的关系(40循环)，72：荧光检测的液滴数与模板分子数的关系(60循环)，80，85：板，81，82，88：微小液滴，83，86：孔，84，89：疏水性溶剂，87：凸部，100：喷墨式单元，101：储箱，102：喷嘴，103：微小液滴，104：疏水性溶剂，105：容器，106：乳剂，110：试样，111：流式细胞流路，112：流液，113，114：微小液滴，115：激发光源，116：激发光，117：荧光检测机构，118：流路，119，120：微小液滴，121：流动的方向，122：液流，131：试样分注混合装置，132：微小液滴调制装置，133：热循环装置，134：荧光检测装置，135：分取装置
序列表
序列号1：引物
序列号2：引物
具体实施方式
本发明，不在PCR反应中添加成为扩增的阻碍主要原因的固体珠或不使用由固体构成的微小反应孔，用乳剂反应液在微小液滴内同时进行多个PCR反应，只回收进行了DNA互补链合成的反应溶液。
在本发明中所谓“微小液滴”意味着1个液滴含有1种核酸的微小的液滴，其大小不特别限定，不过，直径1μm～150μm左右是优选的。同时，所谓“微小孔”是容纳上述1个微小液滴的孔，其大小不特别限定，不过，直径为3μm～250μm左右，能设置10万个以上是优选的。
另外，试样充分稀释使用，以使在上述的微小液滴内包含的核酸不超过1种。同时，在试样中的核酸里预先导入接头序列，以便用单一引物就能扩增。接头序列的引进，譬如，在从mRNA合成cDNA时，使用包含接头序列的引物来进行等，可以根据公知的方法实施。
PCR反应在使珠等固体相不共存的溶液状态下进行，高效率地进行PCR反应。其次，包含扩增产物的乳剂，使温度下降，以固体或凝胶状态下取出。因为PCR通常在50～96℃的高温下进行，在室温或其以下的温度能把乳剂作成固体或凝胶取出。即，可以实现在使高温下成液体，在低温下成固体或凝胶的物质共存。
存在各种识别是否进行了互补链合成的方法，但本发明的实施例展示了使用了进入双链DNA之间发出荧光的嵌入剂的荧光检测的例。作为嵌入剂可举出SYBR绿色I，Pico绿色，溴化乙锭等。检测不限于嵌入剂，在进行了互补链合成时可以象分子信标一样利用发生荧光的探针。
区分捕获在取出的凝胶或反应溶液珠(因为是固体状态或凝胶状态，故这样称呼)上照射激光发出荧光之物。为此，除能使用流式细胞仪等既存的装置以外，可以利用采用了微流路的珠波段器(beadsselector)等。
在上述的方法中，作为用于使反应物固化或凝胶化并取出的素材，可以使用琼脂糖，明胶，淀粉(直链淀粉)，聚丙烯酰胺等的亲水性凝胶化剂。由于这些凝胶化剂是热溶解性的，故能在反应效率好的溶液系统中实现反应。即，这些凝胶化剂的水溶液在作为一般的耐热酶的反应温度的50℃以上的条件下是溶液状态，在反应产物取出时的室温条件下凝胶化。当需要在37℃左右成溶液状态时，也能使用低熔点琼脂糖。当然，除此之外也可以随着DNA互补链合成添加成为固体状的物质。
以下，根据实施例详细说明本发明，不过，本发明不限于这些实施例。
实施例1：
本实施例表示在油中搅拌调制包含琼脂糖的乳剂的例。
在图1中表示了本方法的基本概念。通过把包含作为分析对象的DNA分子1-3的试样溶液区分成比DNA分子的总数N多的M个微小液滴4-8，形成DNA进入了的微小液滴4，5，7，DNA没进入的微小液滴6，8。微小液滴4-8分散在反应容器9的油10中形成乳剂11。包含该微小液滴的乳剂进行了PCR等的扩增反应之后，根据使用嵌入剂等的荧光检测检测出在各微小液滴中得到的扩增产物的有无(量)，分成有荧光12检测出的来自各DNA1-3的扩增产物的微小液滴13和荧光检测不出的没有扩增产物的微小液滴14。由于使微小液滴含有预先在常温下形成凝胶或固体的凝胶化剂，故能分取各个微小液滴。即根据只回收照射激光发光的液滴(凝胶)，或溶化不发光的液滴(凝胶)并除去，可以得到目的扩增产物。
其次，用图2说明以来自1个细胞的cDNA为对象的情况。把在磁珠23等上固定从1个细胞21得到的mRNA22的聚T低聚物24作为探针捕获，用逆转录酶合成互补链DNA25(第一链合成)。用RNaseH分解mRNA22之后，用随机引物形成cDNA双链26(第二链合成)。接着用MboI等的限制酶切断序列特异性的DNA双链。在切断处27通过连接结合序列已知的接头序列28，而作成PCR引发位点。使包含这样得到的珠固定的双链DNA片断29的溶液升温，溶离双链，得到从在珠23中固定化的单链31游离了的单链DNA 30。该单链DNA两端的序列在5′末端是接头序列28的已知序列，在3′末端是聚A，故可以共用接头序列28和聚T引物来进行PCR扩增。加上游离的单链DNA30和二个引物32，33及互补链合成底物·酶，在如图1所示的微小液滴中进行PCR扩增。这时，在上述的低温下加凝胶化的琼脂糖和嵌入剂。关于PCR反应的细节将在后面说明，不过，因为在50-96℃左右的热循环中进行，所以在该温度下，琼脂糖是液体状。PCR结束后，使其在室温，把包含琼脂糖的反应液作成凝胶珠回收。另一方面，在计算具有特定的序列的多个mRNA时，使用对这些序列具有特异性的序列的引物34，不过，也可以固定具有没有特异性的引导序列35的部分，把该部分用作PCR扩增引物。
本实施例中，为了了解加入的DNA模板数，而使用模型样品进行了实验，不过，在实际的cDNA测量中也可以使用同样的引物进行个别地扩增。
以下根据图3对扩增工序进行说明。本扩增工序由以下工序组成。(1)在同一反应容器内的疏水性溶剂中，调制比扩增对象的模板分子数多的多个含有凝胶化剂及荧光色素的扩增用反应液的微小液滴的工序41，(2)进行扩增反应的工序42，(3)确认包含扩增产物的凝胶化了的微小液滴的工序43，(4)分取包含扩增产物的凝胶化了的微小液滴的工序44。下面，详述4个工序。
(1)在同一反应容器内的疏水性溶剂中调制比扩增对象的模板分子数多的多个含有凝胶化剂及荧光色素的扩增用反应液的微小液滴的工序：
准备以下组成的PCR反应液：120mM Tris-SO4(pH8.9)，36mM硫酸铵，4mM MgSO4，0.4mM dNTPs，F引物0.4μM(GTTTTCCCAGTCACGACGTTG：序列号1)，R引物0.4μM(ATGACCATGATTACGCCAAGC：序列号2)，扩增用酶Platinum Taq DNA聚合酶High Fidelity(Invitrogen公司)0.04unit/μL(每一反应的体积50μl)。
在上述反应液中可以使用作为模板DNA能估计拷贝数的市售的pUC19质粒DNA(2686碱基，宝生物)。实际上调制成该模板在每一反应包含104～108分子，确认了扩增效率等。质粒DNA的分子数由产品的附加资料的原液的浓度(0.5μg/μl，1.7x1011分子/μl)求出。在反应液中作为PCR产物的荧光检测用色素添加了SYBR绿色(SYBR Green)I溶液(Invitrogen公司，S7563)，以形成原液的2500倍的稀释度。再者，因为本品的摩尔浓度没被公布，因此稀释度不是绝对的数值。
作为荧光色素，除SYBR绿色I之外，也可以使用通过Pico绿色，溴化乙锭等与双链DNA结合使荧光强度增强的嵌入剂。除此以外，可以使用象分子信标一样地在进行互补链合成时产生荧光的探针。
作为凝胶化剂采用了琼脂糖。在琼脂糖中使用了凝胶强度为1800g/平方厘米(1％(w/v)凝胶)以上的高凝胶强度的Seakem GoldAgarose(宝生物公司)。
凝胶浓度若考虑反应开始(セツトアツプ)时液体的容易处理和在取出时的凝胶状态下处理所必需的硬度双方，则琼脂糖的情况优选为1-1.5％(w/v)。但，由于凝胶强度即使是同样的凝胶材料，根据产品的不同差异也很大，所以每种材料最佳的浓度不同。对于想确保在取出后的凝胶的硬度，或是，除去凝胶的水分后的干燥状态下的尺寸的情况，也可以采用更高浓度的凝胶。对琼脂糖到2.5％(w/v)，对明胶到5.0％(w/v)，对于PCR反应没有大的障碍。
因为琼脂糖很难从粉末溶化，故预先采用高压锅加热到121℃调制2.5％(w/v)的均匀的水溶液，准备形成容易吸移的粘度的50℃以上的溶液。使该2.5％琼脂糖水溶液与每50℃左右的上述PCR反应液等体积(每一反应各50μl)快速地混合，最终调制琼脂糖浓度1.25％(w/v)的反应液(每一反应计100μl)。混合时的温度是对耐热性酶没有影响的90℃以下。
乳剂调制用的油使用了硅油系混合油。组成参考上述文献(Nature，2005，437，p376-380，(Supplementary Information)中的记述，作成以下的组成：(1)聚苯基甲基硅氧烷(Polyphenylmethylsiloxane)(Fluka公司，商品名AR20)为25％(v/v)(2)10％(v/v)PEG/PPG-18/18二甲基硅氧烷(Dimethicone)聚合物，十甲基五环硅氧烷(Decamethylpentacyclosiloxane)溶液(东丽·Dowcorning公司，商品名DC5225C)为50％(v/v)(3)50％(v/v)三甲基甲硅烷硅酸酯(Trimethylsiloxysilicate)，十甲基五环硅氧烷溶液(东丽·Dowcorning公司，商品名BY11-018)为25％(v/v)。
各成分，聚苯基甲基硅氧烷是基油，十甲基五环硅氧烷是溶剂，PEG/PPG-18/18二甲基硅氧烷聚合物是具有表面活性作用及增加粘性的聚合物，三甲基甲硅烷硅酸酯是在和水的界面上形成硅酸的覆盖膜的成分。
把该混合油与加入上述的凝胶化剂的反应液同量(每一反应100μl)混合，调制乳剂(混合后，每一反应200μl)。把混合液放入2ml的样品管中，通过在旋涡搅拌器(Titec公司，2500rpm)中搅拌2-5秒左右，能得到直径50-100μm左右的微小液滴。
液滴的尺寸，可以根据作为目的的扩增倍率及扩增对象的分子数而变化，直径20-200μm是优选的，特别对于在把与一个细胞中存在的基因数相当的10万左右的分子作为对象时，因为确保了直径50-100μm左右对扩增必要的充分的试剂成分量，且总反应液量在操作容易的1ml以下，所以是优选的。
形成反应液的微小液滴乳剂的方法没有特别限制，除了使用上述的搅拌机搅拌以外，可使用喷墨法，使用细微流路的方法(Angew.Chem.Int.Ed.2005，44，p724-728)等。
得到的乳剂在一般的塑料制反应容器中进行扩增反应就可以。在一般的反应容器之外，也可以根据容易进行反应后的观察的目的，在序列了互相分离的微小反应孔的板的微小反应孔内进行扩增反应。
油的各成分的混合比的变化对反应液的微小液滴自身的形成没有大的影响，但对作为乳剂的稳定性多少有些影响。在油是基油成分的聚苯基甲基硅氧烷100％的情况，由于乳剂形成后油部分也不白浊而透明，故对于光学的检测特别适合，不过，反应液的微小液滴彼此变得容易紧贴在一起。但，因为凝胶化剂加入到反应液中，微小液滴彼此不会融合成一个。在基油成分的聚苯基甲基硅氧烷中，当三甲基甲硅烷硅酸酯以成分量超过5％左右(在50％溶液中1/10容量)添加时，微小液滴彼此的紧贴被解除。以把该成分增加到成分量的25％(在50％溶液中1/2容量)，效果也同样。
另外，在基油成分的聚苯基甲基硅氧烷中，若按成分量添加1％(v/v)(在10％溶液中1/10容量)以上的PEG/PPG-18/18，则乳剂形成后整体白浊，不过，与乳剂中的微小液滴的油的分离被抑制，乳剂的稳定性提高。使PEG/PPG-18/18在成分量中增加到7％(v/v)(在10％溶液中7/10容量)，效果也没有大的变化。
上述使用的表面活性剂成分，增加粘性成分，形成覆膜成分也可以用类似的物质代替。
作为疏水性溶剂，除了上述的硅油(有机硅)系油以外，也能使用矿物油等的石蜡系油等。由于硅油系油比重为0.98左右，接近作为反应液的溶剂的水的比重1，由温度产生的粘度的变化少，能形成反应液和稳定的乳剂，故特别优选。
(2)进行扩增反应的工序
调制成上述的乳剂状态的反应溶液，每次50μl分注到0.2ml的管中，在94℃15秒，55℃30秒，70℃1分钟的热循环条件下进行通过PCR的扩增反应。循环数是40个循环。作为热循环用装置可以使用热循环炉9700(Apuraido生物系统公司)。
在热循环装置中，最好在PCR的热循环的功能以外，还附加在反应进行时用于使凝胶化剂水溶液、反应液、混合油保持在高温状态的50℃以上的恒温槽功能。
(3)确认包含扩增产物的凝胶化了的微小液滴的工序
反应后，对乳剂添加5倍容量的异丙醇，使乳剂一次液化，停止旋转，回收凝胶化了的微小液滴的珠。
包含回收的扩增产物的凝胶化微小液滴珠，用凝胶电泳(安捷伦公司生物分析器，DNA500试剂盒，或2％琼脂糖凝胶)进行电泳，可以确认扩增产物的尺寸及量。图4是使用了模板以1x106分子添加时的扩增产物的安捷伦公司生物分析器的电泳分析的结果。按同样的反应液组成，还并行调制和比较了没加凝胶化成分的试样(试样1)和没有作成微小液滴的乳剂状态的试样(试样2)。
在与上述回收的试样(试样3)的带47，没加凝胶化成分的试样(试样1)的带45，在与有凝胶化成分没作成乳剂状态的试样(试样2)的带46同样的111碱基的位置泳动，可以确认生成与比较对象相同尺寸的产物。
反应后的乳剂状态的反应溶液不用荧光显微镜(构成例：奥林巴斯BX51，U1S-2光学系，物镜UplanSApo，反射镜单元WIB-UMWIB3)进行象上述一样的精制，可以直接观察。在图5中模式性地表示观察的状态。图6表示模板以1x105分子添加时用荧光观察的结果的一例。在凝胶化了的反应液的微小液滴48，49中，有扩增产物的微小液滴48用SYBR绿色I的荧光观测明亮，没有扩增产物的微小液滴49观测暗黑。
使每一反应的模板数变化，按与上述图5及以图6同样的要领进行观察，对热循环数是40循环的场合71、热循环数是60循环的场合72将由扩增产物产生的荧光被观测的微小液滴48数量的比例，分别绘出的图表示在图7中。
如图7所示，显示热循环数是40循环的情况和60循环的情况的变化小而效率高地被扩增并以40循环大体上达到平稳。
假定微小液滴的平均直径为50μm，每一个的平均体积是以65pl，每1反应(100μl)的微小液滴的个数是1.5x106个，在反应开始时模板以105个添加时，在小于1成的微小液滴中包含一分子的模板，在模板107个添加时，可以期待在几乎全部的微小液滴中包含一分子以上的模板，不过，图7所示的扩增产物检测出的微小液滴的比例的实测结果，模板以105个添加时为几％，以106个添加时为十几％，以107个添加时几乎接近100％的上述的期望值，表示在本实施例中的扩增顺利地进行。
另外，对于扩增产物的量也进行了研究。由于上述图4所示的回收的扩增产物(试样3)的电泳分析结果中的111碱基产物的带47的浓度定量为约1ng/μl(由安捷伦生物分析器2100测出的定量值)，所以每1反应100μl会回收约100ng的扩增产物。111碱基的双链DNA的100ng相当于1.4pM，8x1011分子。
对扩增率也进行了考察。根据图7所示的结果，因为在反应开始时模板以106个添加的情况由约10％的微小液滴确认扩增产物，若把每1反应100μl的微小液滴的个数根据上述的假定作成1.5x106个，则得到扩增产物的微小液滴是其10％的1.5x105个，每一个得到扩增产物的微小液滴的PCR产物约为5x106分子，这表示扩增率为5x106倍，是良好的。扩增产物的观察除了上述以外也可以用后述的流式细胞仪。
(4)分取包含扩增产物的凝胶化了的微小液滴的工序
本实施例，含扩增产物的凝胶化了的微小液滴在显微镜观察下采用安装了毛细管的移液管(德朗蒙德公司制测序移液管等)进行了回收。
回收的上述的微小液滴能实时地用PCR确定其中包含的扩增产物的量。另外，对扩增产物，也可以供给加上再次扩增过程的Sanger法或Pyrosequencing法来进行碱基序列确定。
在回收方法中，除了上述以外也可以使用后述的流式细胞仪。根据本实施例，可以同时个别地用PCR扩增106个的多个微量试样到5x106倍，用荧光确认得到的扩增产物，作为凝胶的微小液滴回收。为了个别回收，不需要在反应液中设置固相，节省了为此的成本和工费。另外，能防止由于使用固相产生的反应效率的降低。
实施例2：反应容器的形状
本实施例在互相分离的微小反应孔序列的板上构成反应容器的形状。用图8-10说明本实施例。象图8一样，在板80上设置多个收集各个微小液滴81，82的孔83。孔83如图9所示，2维序列构成板80。微小液滴直接进入孔83，可以用疏水性溶剂84等为盖，也可以进入孔83中的疏水性溶剂84中。
这个情况的疏水性溶剂84，除形成乳剂的目的以外，也能实现防止反应液中的水分蒸发的功能，保持微小液滴的形状为球状的功能，在凝胶取出时防止凝胶和容器表面的粘接的功能。
微小液滴81或82需要被互相分离，不过，不一定需要使孔83本身被互相分离，象图10的板85一样，也可以用在孔86间具有的凸部87来限制微小液滴88移动，用充满各孔的疏水性溶剂89使多个微小液滴88间分离。
各孔的直径由于多个试样从5μm至150μm同时扩增是优选的。对孔的数量没有特别限制，但在把来自一个细胞的全表达基因的扩增作为目的时，10万以上最好。
板的材质，聚碳酸酯等耐热性、透明的塑料或玻璃对热循环及光学测量最优选的。
根据本实施例，由于反应后的微小液滴在板平面上被展开，扩增反应后的观察容易。另外，由于平面上的各微小液滴的位置固定，故可以根据其位置识别各微小液滴。
实施例3：
本实施例表示微小液滴的制法的另一例。
用图11对本实施例进行说明。本实施例为了形成微小液滴使用喷墨式单元100。喷墨式单元100，由用于贮存为调制微小液滴103的溶液的储箱101和使微小液滴化而喷出的喷嘴102构成。通过在喷嘴内瞬间加热反应液，喷出一定量的反应液。微小液滴103对着容器105配置，使其直接向疏水性溶剂104中喷出或落下。微小液滴103通过向疏水性溶剂104中喷出或落下，调制乳剂106。
本实施例适合微小液滴的尺寸和数量的控制，特别适合调制从0.5pl到10pl左右(直径10μm-30μm左右)的液滴。在向疏水性溶剂中直接喷出微小液滴时，对防止试样的互相混合有效。
实施例4：
本实施例涉及使用了得到扩增产物的微小液滴的检测·分取的流式细胞的构成。
用图12对本实施例进行说明。使包含扩增反应后的微小液滴113，114的试样110随着液流112流动的方向121向形成光学单元的流式细胞流路111流动。液流除自然落下流动外，也可以采用泵。使来自激发光源115的激发光116照射在微小液滴上，用由光检测器、透镜、过滤器等构成的荧光检测机构117检测得到的荧光。根据得到的荧光强度判定扩增产物的量(或有无)。在流路中流动的液流112在上述实施例1的乳剂组成的情况，硅油系的油(例：聚苯基甲基硅氧烷)是优选的。
通过在另外的流路118上产生液流122，把荧光强度一定水平以上的微小液滴119与荧光强度一定水平以下的微小液滴120分离，进行回收。对荧光强度一定水平以下的微小液滴也可以进行同样的分离回收。在另外的流路118上进行回收时，也可以用激光等局部性地加热微小液滴119，溶化凝胶进行回收。
根据本实施例，可以根据包含的扩增产物的量连续、自动地进行分离回收扩增反应后的微小液滴的操作。
实施例5：
本实施例对用于实施本发明的方法的装置进行说明。
在图13中表示装置的方块图。本实施例的装置，具有：试样分注混合装置131、微小液滴调制装置132、热循环装置133、荧光检测装置134和分取装置135。
试样分注混合装置131，具有用于以溶液状态保存凝胶化剂的调温机构、用于使凝胶化剂与反应液混合的液体处理机构、及搅拌机构。调温机构的调温范围是0-120℃，对应与凝胶化剂迅速溶解所必需的温度。
微小液滴调制装置132由任意一个方式的搅拌机构构成。即，由振动或转动式的搅拌机、实施例3中所述的喷墨式、使用了细微流路的方法的任意一个构成。
热循环装置133是具有与普通的PCR用热循环炉同样的调温机构的装置。也可以与上述131的调温机构兼用。
荧光检测装置134，由荧光显微镜的图像检测方式，或流式细胞方式的检测器构成。
分取装置135，具有如在实施例4中所述的附随流式细胞设置的流路转换机构。
根据本实施例，可以同时个别地用PCR扩增多个微量试样，用荧光确认得到扩增产物，作为凝胶的微小液滴进行回收的工序省力。
产业上利用的可能性
本发明，是对1个细胞中包含的全部的mRNA或认为有必要测量的多种mRNA进行数字计数的定量分析所必要的要件技术。因此，包括生物领域、医疗领域、化学领域，对有必要进行单分子分析的所有领域是有用的。
                        序列表
<110>HITACHI，LTD.
<120>试样调制法及装置
<130>H750051
<160>2
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>发明人：Murakawa，Katsuji；Takiguchi，Sumiyo；Kanbara，Hideki
<220>
<223>引物
<400>1
gttttcccag tcacgacgtt g                                            21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
atgaccatga ttacgccaag c                                            21

Claims (12)

1.一种方法，该方法是进行个别地扩增并取出试样中的多种核酸的方法，其特征在于，对稀释成在1个微小液滴内包含的不超过1种核酸的试样，在疏水性溶剂中的微小液滴内进行PCR反应，在PCR反应结束后以固体或凝胶的状态分离反应液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下工序：通过在PCR反应液中预先添加与扩增产物结合或插入的荧光试剂、只分别选取含扩增产物的液滴。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR反应在分散于疏水性溶剂中的微小液滴乳剂中进行。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR反应在排列有互相分离的微小反应孔的板的微小反应孔内进行。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，试样中的多种核酸，以能预先由单一的PCR引物扩增的方式导入接头序列。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，为了以固体或凝胶的状态分离反应液，在PCR反应液中，预先添加从琼脂糖、明胶、淀粉、角叉菜胶、果胶、琼脂胶、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮中选出的任一种凝胶化剂。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，上述疏水性溶剂以硅油或石蜡油作为主剂，
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，还把表面活性剂及/或覆膜形成剂预先添加到PCR反应液中。
9.一种核酸分析方法，其包括检测或定量用权利要求1～8的方法个别地扩增并取出的多种核酸的工序。
10.一种用于个别地扩增并取出多种核酸的装置，其具有：1)由用于以溶液状态保存凝胶化剂的调温机构、用于混合凝胶化剂与反应液的液体处理机构、和搅拌机构构成的试样分注混合装置，2)由振荡或转动式的搅拌机、喷墨式及细微流路的任一个构成的微小液滴调制装置，3)用于PCR反应的具有热循环功能的调温装置，及4)具备图像检测方式或流式细胞方式的检测器的荧光检测装置。
11.如权利要求10所述的装置，在上述4)的流式细胞方式中，具备流式细胞通过流路转换的分配功能。
12.一种核酸分析系统，其包括权利要求10所述的装置和DNA测序仪及/或流式细胞仪。
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