KR20170102354A - 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 주형 핵산 서열, dNTP, dUTP, 프라이머, 중합효소, dUTP 절단 효소, 및 올리고뉴클레오타이드 어댑터 서열 세그먼트를 포함하는 복수의 비드를 제공하는 단계; 중합효소, dNTP, dUTP 및 무작위 6량체를 이용하여 주형 핵산을 증폭시켜 임시적 dUTP를 포함하는 상보성 핵산 서열을 제공하는 단계; 및 시퀀싱 라이브러리를 제공하기 위해 dUTP 절단 효소를 이용하여 혼입된 dUTP를 절단하여 상보성 핵산 서열에서 틈을 제공하는 단계의 단계들을 포함하는 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법을 제공한다.

Description

핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리
본 출원은 2015년 1월 12일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/102,420호, 및 2015년 12월 3일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/262,769호의 유익을 주장하며, 상기 출원은 그들의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
핵산 시퀀싱(sequencing) 기법은 최근 몇 년에 걸쳐 빠르고, 엄청난 진보를 경험하였다. 종결된 서열 연장 생성물의 내재 세트(nested set)가 과학자에 의해 시각적으로 해석되는 겔 기반 분리 방법에 비해서, 오늘날의 시퀀싱 기법은 엄청난 양의 서열 데이터를 생성하고, 시퀀싱된 게놈 및 게놈 영역 앞에서 결코 발광을 허용하지 않으며, 일상적인 생물학적 연구 및 진단으로 시퀀싱의 광범위한 채택을 허용하는 처리량 및 비용을 제공한다.
진단, 예후, 생물공학 및 법 생물학을 포함하는 매우 다양한 생물의학적 상황에서 정보를 얻기 위해 게놈 시퀀싱을 사용할 수 있다. 시퀀싱은 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱 및 사슬 종결법을 포함하는 기본적 방법, 또는 샷건(shotgun) 시퀀싱 및 브릿지 PCR을 포함하는 드노보(de novo) 시퀀싱 방법, 또는 폴로니 시퀀싱(polony sequencing)을 포함하는 차세대 방법, 454 파이로시퀀싱, 일루미나(Illumina) 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱, 이온 토렌트(Ion Torrent) 반도체 시퀀싱, 헬리스코프(HeliScope) 단일 분자 시퀀싱, SMRT(등록상표) 시퀀싱 및 기타를 수반할 수 있다. 대부분의 시퀀싱 적용을 위해, 핵산 샘플과 같은 샘플은 시퀀싱 기계에 대한 도입 전에 처리된다. 샘플은, 예를 들어 증폭에 의해 또는 독특한 식별자를 부착시킴으로써 처리될 수 있다. 종종 독특한 식별자는 특정 샘플의 유래를 동정하는 데 사용된다.
시퀀싱 기법에서의 엄청난 진보에도 불구하고, 또는 이러한 엄청난 진보에 의한 발광 가능성에도 불구하고, 핵산 샘플로부터 광범위하고, 다양하며, 대표적인 시퀀싱 라이브러리를 생성할 필요가 존재한다. 추가로, 서열분석 기법의 적용이 확장됨에 따라, 매우 다양한 샘플 유형을 처리하기 위한 이들 라이브러리 방법에 대한 필요가 또한 증가한다. 예를 들어, 전체 게놈의 정보를 균일하게 얻는 능력, 또는 적어도 관심 대상의 게놈의 전체 부분은 분자 생물학자에 대한 어려움의 상당한 원인이다. 균일함의 결여는 수많은 처리 입력으로부터 모든 다양한 시퀀싱 기법까지 퍼진다. 예를 들어, 단편 크기 편향은 시퀀싱 기법이 게놈의 짧은 단편만을 시퀀싱할 가능성을 더 크게 할 수 있다. 마찬가지로, 특정 서열 내용은 게놈 부분이 사전 시퀀싱 단계에서 프라이밍 및 시퀀싱, 또는 증폭되지 않아서, 얻어진 서열 데이터에서 균일하지 않은 서열 범위를 야기할 가능성을 증가 또는 감소시킬 것이다. 최종적으로, 서열의 다수의 다른 특징, 예를 들어, 2차 또는 3차 구조, 또는 시퀀싱 기법, 예를 들어, 긴 판독 대 짧은 판독 기법은 시퀀싱 라이브러리 내에서 유래된 서열의 편향된 제시를 야기할 수 있다.
이들 도전에 의해, 샘플 핵산을 시퀀싱 가능한 라이브러리로 전환시키는 과정은 상당한 복잡성 및 시간 구속(commitment), 예를 들어, 단편화, 분리, 증폭, 시퀀서 특이적 라이브러리 성분의 혼입 및 세정에 대해 취해졌다. 단순화된 작업 흐름의 추가적인 이점을 갖는, 개선된 시퀀싱 라이브러리뿐만 아니라 제조한 라이브러리를 제조하기 위한 방법 및 시스템이 본 명세서에 제공된다.
시퀀싱 라이브러리로서 사용하기 위한 핵산의 라이브러리뿐만 아니라 이들 방법을 이용하여 제조된 라이브러리를 제조하기 위한 개선된 방법 및 시스템이 제공된다. 본 명세서에 기재된 라이브러리는 개선된 범위, 낮은 오류율 및 더 짧은 판독 서열 데이터로부터의 긴 범위의 서열 정보의 생성을 위한 적용 가능성의 이점을 가진다.
본 개시내용은 일반적으로, 예를 들어, NGS(차세대 시퀀싱)를 이용하는 접근에 의해 유용한 시퀀싱 라이브러리, 예를 들어, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법을 제공한다. 틈 부위(무 프라이밍 증폭)에서 중합에 의한 무 프라이밍 증폭을 이용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 시퀀싱 라이브러리는 통상적인 프라이머 기반 증폭(프라이밍된 증폭) 라이브러리 제조 접근에 비교할 때, 우수한 시퀀싱 결과, 예를 들어, 게놈 시퀀싱 결과를 제공한다.
일반적으로, 일 양상에서 주형 핵산으로부터 복수의 바코드 핵산 단편을 생성하는 단계로서, 각각의 복수의 바코드 핵산 단편은 통상적인 바코드 서열을 포함하는, 핵산 단편을 생성하는 단계; 및 각각의 복수의 바코드된 핵산 단편에 제1 어댑터 서열을 덧붙이는 단계로서, 제1 어댑터는 하나 이상의 기능성 서열을 포함하는, 덧붙이는 단계를 포함하는 시퀀싱 라이브러리를 생성하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 생성하는 단계는 주형 핵산을 올리고뉴클레오타이드의 제1 세트와 접촉시키는 단계로서, 올리고뉴클레오타이드의 제1 세트는 복수의 바코드 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 복수의 바코드 올리고뉴클레오타이드는 그의 3' 말단에서 통상적인 바코드 서열 및 프라이머 서열을 갖는, 접촉시키는 단계; 및 복수의 바코드 올리고뉴클레오타이드 상의 프라이머 서열을 주형 핵산에 대해 어닐링하는 단계 및 복수의 바코드 올리고뉴클레오타이드가 주형 핵산을 따라서 연장되어 주형 핵산으로부터 복수의 바코드 핵산 단편을 생성하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 덧붙이는 단계는 복수의 바코드 핵산 단편을 올리고뉴클레오타이드의 제2 세트와 접촉시키는 단계로서, 올리고뉴클레오타이드의 제2 세트는 복수의 바코드 핵산 단편의 적어도 일부에 대해 상보성인 복수의 프라이머 서열, 및 적어도 하나의 기능성 서열을 포함하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 올리고뉴클레오타이드의 제2 세트를 복수의 바코드 핵산 단편에 대해 어닐링하는 단계 및 올리고뉴클레오타이드의 제2 세트가 복수의 바코드 핵산 단편을 따라서 연장되어 적어도 하나의 기능성 서열을 포함하는 복제 바코드 단편을 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 덧붙이는 단계는 각각의 복수의 바코드 핵산 단편에 제1 어댑터 서열을 결찰시키는 단계를 포함한다. 각각의 복수의 바코드 핵산 단편에 대해 제1 어댑터 서열을 결찰시키는 단계는 각각의 복수의 바코드 핵산 단편을 전단하여 전단된 단편을 생성하는 단계 및 제1 어댑터 서열을 전단된 단편의 3' 말단에 결찰시키는 단계를 포함한다는 것이 생각된다.
일반적으로, 일 양상에서 하기 단계들을 포함하는 시퀀싱 라이브러리를 제조하는 방법이 제공된다: (a) 주형 핵산 서열, dNTP, dUTP, 프라이머, 중합효소, dUTP 절단 효소, 및 올리고뉴클레오타이드 어댑터 서열 세그먼트를 포함하는 복수의 비드를 제공하는 단계; (b) 중합효소, dNTP, dUTP 및 무작위 6량체를 이용하여 주형 핵산을 증폭시켜 임시적(occasional) dUTP를 포함하는 상보성 핵산 서열을 제공하는 단계; 및 (c) 시퀀싱 라이브러리를 제공하기 위해 dUTP 절단 효소를 이용하여 혼입된 dUTP를 절단하여 상보성 핵산 서열에서 틈을 제공하는 단계.
일 실시형태에서, 상기 방법은 틈이 있는 상보성 핵산 서열을 증폭시키는 단계 (d), 및 핵산 연장 수단을 이용하여 증폭된 핵산 서열의 서열을 연장시키는 단계 (e)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법의 단계는 단일 반응으로 수행된다.
다른 실시형태에서, 복수의 비드는 풀링된 비드 집단이다. 특정 실시형태에서, 풀링된 비드 집단의 비드는 단계 (a)에서 열거된 성분 중 하나 이상과 함께 공동 분할되고, 파티션은 선택적으로 에멀전에서 액적을 포함한다.
일부 실시형태에서, 분해 가능한 비드를 포함하는 비드는 화학적으로 분해 가능한 비드, 광 분해성 비드 및 열 분해성 비드로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 비드는 화학적으로 환원 가능한 가교제를 포함한다. 더 구체적으로, 화학적으로 환원 가능한 가교제는 이황화 결합을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 단계 (b)에서의 증폭은 등온성이다.
추가 실시형태에서, 중합효소는 phi29 DNA 중합효소이다.
상이한 실시형태에서, 핵산 연장 수단은 결찰 효소, 핵산 연장 효소 및 트랜스포사제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 관련된 실시형태에서, 증폭된 핵산 서열의 라이브러리는 단일 가닥 DNA를 포함하고, 결찰 효소는 ATP 독립적 효소를 포함한다. ATP 독립적 효소는 내열성 5' App DNA/RNA 리가제를 포함할 수 있다. 다른 관련된 실시형태에서, 결찰 효소는 토포아이소머라제를 포함한다. 특이적으로, 토포아이소머라제는 토포아이소머라제 I일 수 있다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 결찰 효소는 T4 DNA 리가제를 포함한다.
일반적으로, 다른 양상에서, (a) 주형 핵산 서열, dNTP, dUTP, 프라이머, 중합효소, dUTP 절단 효소, 핵산 연장 수단 및 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열 세그먼트를 포함하는 복수의 비드를 제공하는 단계; (b) 중합효소, dNTP, dUTP 및 무작위 6량체를 이용하여 주형 핵산을 증폭시켜 임시적 dUTP를 포함하는 상보성 핵산 서열을 제공하는 단계; 및 (c) dUTP 절단 효소를 이용하여 혼입된 dUTP를 절단하여 상보성 핵산 서열에서 틈을 제공하는 단계; (d) 틈이 있는 상보성 핵산 서열을 증폭시켜 증폭된 핵산 서열의 라이브러리를 제공하는 단계; 및 (e) 풀링된 비드 집단으로부터 바코드 서열 세그먼트를 방출하는 단계; 및 (f) 바코드 서열 세그먼트 및 핵산 연장 수단을 이용하여 증폭된 핵산 서열의 서열을 연장시켜 바코드 라이브러리를 제공하거나 또는 대안적으로, 핵산 결찰 효소를 이용하여 바코드 서열 세그먼트를 증폭된 핵산 서열의 라이브러리에 연결하여 바코드 라이브러리를 제공하는 단계를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리를 제조하는 방법이 제공된다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 단계들은 단일 반응으로 수행된다. 일 실시형태에서, 복수의 비드는 풀링된 비드 집단이다. 다른 실시형태에서, 풀링된 비드 집단의 비드는 단계 (a)에서 열거된 성분 중 하나 이상과 함께 공동 분할되고, 파티션은 선택적으로 에멀전에서 액적을 포함한다. 추가 실시형태에서, 분해 가능한 비드를 포함하는 비드는 화학적으로 분해 가능한 비드, 광 분해성 비드 및 열 분해성 비드로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 비드는 화학적으로 환원 가능한 가교제를 포함한다. 화학적으로 환원 가능한 가교제는 이황화 결합을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 단계 (b)에서의 증폭은 등온성이다. 일부 실시형태에서, 중합효소는 phi29 DNA 중합효소이다. 다른 실시형태에서, 핵산 연장 수단은 결찰 효소, 핵산 연장 효소 및 트랜스포사제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 증폭된 핵산 서열의 라이브러리는 단일 가닥 DNA를 포함하고, 결찰 효소는 ATP 독립적 효소를 포함한다. 구체적 실시형태에서, ATP 독립적 효소는 내열성 5' App DNA/RNA 리가제를 포함한다. 상이한 실시형태에서, 결찰 효소는 토포아이소머라제를 포함한다. 토포아이소머라제는 토포아이소머라제 I일 수 있다는 것이 상정된다.
또 다른 실시형태에서, 결찰 효소는 T4 DNA 리가제를 포함한다.
일 실시형태에서, 바코드 서열 세그먼트는 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 10개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 바코드 서열 세그먼트는 적어도 1000개의 상이한 바코드 서열 세그먼트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 1,000,000개의 올리고뉴클레오타이드 분자는 각각의 비드에 부착된다. 다른 실시형태에서, 풀링된 비드 집단은 적어도 10개의 상이한 비드 집단을 포함한다. 상이한 실시형태에서, 풀링된 비드 집단은 적어도 100개의 상이한 비드 집단을 포함한다. 일 특정 실시형태에서, 풀링된 비드 집단은 적어도 500개의 상이한 비드 집단을 포함한다.
추가 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열 세그먼트는 적어도 하나의 기능성 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 기능성 서열은 어댑터, 프라이머 서열, 프라이머 어닐링 서열, 부착 서열, 및 시퀀싱 프라이머 서열로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 기능성 서열은 열 증가 및 화학적 절단으로 이루어진 목록으로부터 선택된 자극을 포함하는 방출 단계에서 격리 및 방출 가능하다. 상이한 실시형태에서, 상기 방출하는 단계는 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열 세그먼트를 포함하는 비드 집단의 비드의 적어도 일부를 분해하는 것을 포함한다. 구체적 실시형태에서, 비드를 분해하는 것은 바코드 서열 세그먼트와 비드 사이의 이황화 브릿지 결합을 포함하는 화학적 결합을 절단하는 단계를 포함하고, 방출하는 단계는 비드를 환원제에 노출시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 환원제는 DTT 및 TCEP로 이루어진 군으로부터 선택된 환원제를 포함한다.
참고문헌에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개개 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타나는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
도 1은 주형의 무 프라이밍 증폭 과정을 도시하는 다이어그램.
도 2a는 연장 바코팅 접근을 이용하여 주형의 바코딩을 도시하는 다이어그램.
도 2b는 결찰 접근을 이용하는 단일 또는 이중 가닥 주형의 바코딩을 도시하는 다이어그램.
도 2c는 APP DNA/RNA 리가제 접근을 이용하는 단일 가닥 라이브러리 분자의 바코딩을 도시하는 다이어그램.
도 3은 전체 게놈 시퀀싱 데이터에 기반한 T 염기 편향에 대한 시험 결과를 도시한 도면.
도 4A는 인간 게놈의 GC 함량을 저장한 1000개 염기쌍에 걸쳐 범위 균일성을 나타내는 프라이밍된 증폭의 플롯을 도시한 도면.
도 4B는 인간 게놈의 GC 함량을 저장한 1000개 염기쌍에 걸쳐 범위 균일성을 나타내는 무 프라이머 증폭의 플롯을 도시한 도면.
도 5A는 dUTP를 첨가하지 않은 반응에 대한 GC 범위 플롯을 도시한 도면.
도 5B는 0.5% dUTP를 첨가한 반응에 대한 GC 범위 플롯을 도시한 도면.
도 5C는 1% dUTP를 첨가한 반응에 대한 GC 범위 플롯을 도시한 도면.
도 5D는 2% dUTP를 첨가한 반응에 대한 GC 범위 플롯을 도시한 도면.
도 5E는 3% dUTP를 첨가한 반응에 대한 GC 범위 플롯을 도시한 도면.
도 6은 dUTP 적정의 결과 및 키메라 비율에 대한 효과, 사멸 위치 CV(DPCV)를 도시한 도면.
도 7은 DPCV 및 증폭률에 대한 DTT 첨가 결과를 도시한 도면.
도 8a는 표준 조건을 이용하는 DPCV에 대한 SSB, DTT 또는 둘 다의 효과를 도시한 도면.
도 8b는 증폭률에 대한 SSB의 첨가 효과를 도시한 도면.
도 8c는 키메라 감소에 대한 SSB의 첨가 효과를 도시한 도면.
도 9는 DPCV 및 증폭률에 대한 시간 효과를 도시한 도면.
도 10은 변성 단계가 있는 그리고 변성 단계가 없는 DPCV 및 증폭률을 도시한 도면.
도 11은 중복 비율에 대한 어댑터 농도의 효과(라이브러리 복잡성의 측정), 및 DPCV를 도시한 도면.
도 12a는 DPCV에 대한 바코딩 결찰 반응 시간의 효과를 도시한 도면.
도 12b는 삽입 크기에 대한 바코딩 결찰 반응 시간의 효과를 도시한 도면.
도 12c는 키메라에 대한 바코딩 결찰 반응 시간의 효과를 도시한 도면.
도 12d는 비맵핑 분획에 대한 바코딩 결찰 반응 시간의 효과를 도시한 도면.
도 12e는 키메라에 대한 바코딩 결찰 반응 시간의 효과를 도시한 도면.
도 13은 T4 리가제 기반 바코딩의 특이성을 시험하기 위한 대조군 실험 결과를 도시한 도면.
도 14A는 프라이밍된 증폭 반응에서 시퀀싱 범위 균일성을 도시하는 히스토그램.
도 14B는 무 프라이머 증폭에서 시퀀싱 범위 균일성을 도시하는 히스토그램.
도 15는 5개의 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대한 n량체 농도(uM) 효과를 도시한 도면.
도 16은 6개의 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대한 SPRI(고체상 가역적 고정) 엄격성의 효과를 도시한 도면.
도 17은 5개의 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대한 DPCV에 대한 총 반응 시간 효과를 도시한 도면.
도 18은 6개의 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대해 DPCV에 대한 유라실-특이적 절단 시약(Uracil-Specific Excision Reagent: USER(등록상표)) 농도의 효과를 도시한 도면.
도 19는 바코딩된 시퀀싱 라이브러리의 제조를 위한 과정을 개략적으로 도시한 도면.
도 20a, 도 20b 및 도 20c는 바코딩된 시퀀싱 라이브러리를 제조하기 위한 대안의 과정을 개략적으로 도시한 도면.
도 21은 시퀀싱 라이브러리를 제조함에 있어서 상이한 효소 성능의 비교를 도시한 도면.
도 22는 시퀀싱 라이브러리의 제조에서 핵산의 바코딩된 단편의 가공을 개략적으로 도시한 도면.
도 23은 시퀀싱 라이브러리의 제조에서 단편을 추가로 가공하기 위한 대한의 과정을 개략적으로 도시한 도면.
도 24는 대안의 라이브러리 생성 과정을 개략적으로 도시한 도면.
도 25는 프라이머 연장 과정 대신에 결찰 과정을 이용하는 라이브러리 바코딩 과정을 개략적으로 도시한 도면.
I. 일반적 개요
틈 부위에서 중합에 의한 무 프라이밍 증폭을 이용하는 라이브러리 제조
틈 부위(무 프라이밍 증폭(priming free amplification))에서 중합에 의한 무 프라이밍 증폭을 이용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 시퀀싱 라이브러리는 통상적인 프라이머 기반 증폭(프라이밍된 증폭) 라이브러리 제조 접근에 비교할 때, 우수한 시퀀싱 결과, 예를 들어, 게놈 시퀀싱 결과를 제공한다. 유리하게는, 예를 들어, 무 프라이밍 증폭 접근은 프라이밍된 증폭 결과에 비교할 때 넓은 범위의 GC 염기에 걸쳐 더 균일한 시퀀싱 범위를 초래한다. 추가적으로, 개선된 시퀀싱 범위 균일성은 무 프라이밍 증폭에서 달성되어, 프라이밍된 증폭에 대한 분포에 비교할 때 더 많은 푸아송 분포(poissonian distribution)를 초래한다.
본 발명의 설계는 일반적으로 도 1에 나타내는데, 이는 주형의 무 프라이밍 증폭을 이용하는 라이브러리 제조 과정을 도시한다. 도시한 접근은 또한 이하의 실시예에 개시한 바와 같은 실험적 또는 예언적 예시적 뒷받침에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 시퀀싱 라이브러리는 분자 바코드로 태그되고, NGS(차세대 시퀀싱) 반응에서 사용하기에 적합하다.
도 1에서 일련의 패널로서 도시하였지만, 도시한 반응 공정은 중합 공정에 의해 무 프라이밍 증폭에서 함께 존재하는 모든 시약과 동시에 수행될 수 있다. 이 공정은 시퀀싱 라이브러리를 제조하기 위한 표준 프라이밍 증폭 공정과 대조적일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 일 방법은 도 1에 나타낸다. 도 1의 (i)에서, 균일한 범위 및 낮은 오차율을 초개하는 매우 높은 진행도 및 충실도를 갖는 6량체(짧은 화살표) 및 phi29 DNA 중합효소(타원)를 이용하는 개시를 포함하는, DNA 중합효소는, 예를 들어, 등온 증폭을 수행하기 위해 사용한 phi29 DNA 중합효소(매사추세츠주 입스위치에 소재한 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(등록상표) 인코포레이티드(NEB))를 나타낸다. 중합효소가 표적 서열(긴 선)을 따라 처리함에 따라, 복제된 DNA 주형이 생성된다. 도 1의 (ii)는 모든 dNTP 및 소량의 dUTP의 존재 하에서 초기 증폭 시 길어지는 주형 가닥(긴 화살표)에서 dUTP(U)의 중합효소 기반 혼입을 도시한다. 도 1의 (iii)은 dUTP를 절단하고 복제된 주형 DNA 가닥(긴 화살표)에서 틈을 생성할 수 있지만, 본래의 표적 서열(긴 선)에서는 그렇지 않은 효소(볼트가 있는 타원)의 반응에서의 포함을 나타낸다. 도 1의 (iv)는 dUTP를 절단할 수 있는 효소에 의한 틈내기의 결과를 나타내되, (iii)으로부터의 본래의 증폭된 가닥은 이제, 예를 들어, 4개의 더 짧은 증폭 가닥(짧은 화살표)이다. 추가적으로, phi29 DNA 중합효소(타원)는 프라이밍 독립적 증폭 과정에서 추가적인 증폭을 위한 틈 부위에서 맞물림을 나타낸다. 도 1의 (v)는 고도로 전진적인 phi29 DNA 중합효소(타원)에 기인하여 방출된 증폭 단편(짧은 화살표)의 가닥 전위 시 주형(긴 선)으로서 본래 표적 서열의 재이용을 도시한다. 후속적 증폭은 추가적인 방출 증폭 단편(짧은 화살표)을 생성하기 위해 (ii)에 나타낸 과정을 반영한다.
본 개시내용은 샘플 성분의 서브세트에 대한 시약의 제어된 전달, 다음에 부분적으로 전달된 시약을 사용하는 해당 샘플 성분의 분석을 통한 샘플 물질의 가공에서 유용한 방법, 시스템 및 조성물을 제공한다. 다수의 경우에, 방법 및 조성물은 특히 샘플 가공, 일반적으로 핵산 분석 용도, 특히 핵산 시퀀싱 용도를 위해 사용된다. 다양한 세트의 시약을 포함하는 비드 조성물, 예컨대 바코드 서열을 포함하는 매우 다수의 올리고뉴클레오타이드에 부착된 비드의 다양한 라이브러리, 및 이를 제조 및 이용하는 방법이 본 개시내용에 포함된다.
비드의 제조 방법은 일반적으로, 예를 들어 수용액 중에서 비드 전구체(예컨대 단량체 또는 중합체), 프라이머 및 가교제를 조합하는 단계, 때때로 미세유체 장치 또는 액적 발생기를 이용하여 상기 수용액을 오일상과 조합하는 단계 및 유중수 액적이 형성되도록 야기하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 촉매, 예컨대 촉진제 및/또는 개시제는 액적 형성 전에 또는 후에 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 개시는, 예를 들어, 열 또는 광(예를 들어, UV 광)의 첨가를 통한 에너지의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 일부 경우에 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 프라이머)의 하나 이상의 복제물에 공유 결합된 비드를 생성하기 위한 액적 내 중합 반응이 일어날 수 있다. 추가적인 서열은 다양한 방법을 이용하여 기능화된 비드에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 기능화된 비드는 주형 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 바코드를 포함)와 조합되며, 평균적으로 하나 또는 더 소수의 주형 올리고뉴클레오타이드가 기능화된 비드와 동일한 파티션을 점유하도록 분할된다. 파티션이 임의의 다양한 상이한 유형의 파티션, 예를 들어, 웰, 마이크로웰, 관, 바이알, 마이크로캡슐 등일 수 있지만, 바람직한 양상에서, 파티션은 에멀전 내의 액적(예를 들어, 수성 액적)일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 바코드) 서열은 반응, 예컨대 프라이머 연장 반응, 결찰 반응, 또는 기타 방법에 의해 파티션 내에서 비드에 부착될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 프라이머에 의해 기능화된 비드는 프라이머에 대한 결합 부위를 포함하는 주형 바코드 올리고뉴클레오타이드와 조합되어, 프라이머가 비드 상에서 연장될 수 있게 한다. 증폭의 다회 라운드 후에, 단일 바코드 서열의 복제물은 비드에 부착된 다중 프라이머에 부착된다. 비드에 대한 바코드 서열의 부착 후에, 에멀전은 파괴될 수 있고, 바코딩된 비드(또는 다른 유형의 증폭 산물에 연결된 비드)는 증폭된 바코드 없이 비드로부터 분리될 수 있다. 추가적인 서열, 예컨대 무작위 서열(예를 들어, 무작위 N-량체) 또는 표적화된 서열은, 이어서, 예를 들어, 프라이머 연장 방법 또는 다른 증폭 반응을 이용하여 비드-결합 바코드 서열에 첨가될 수 있다. 이 과정은 바코딩된 비드의 크고 다양한 라이브러리를 생성할 수 있다.
기능성 서열은, 예를 들어, 표면 상에 서열을 포함하는 바코드를 고정시키기 위해, 예를 들어, 시퀀싱 적용을 위해 고정 서열을 포함하는 것으로 생각된다. 논의의 용이함을 위해, 다수의 특정 기능성 서열, 예컨대 P5, P7, R1, R2, 샘플 지표, 무작위 N량체 등, 및 이들에 대한 부분적 서열뿐만 아니라 임의의 앞서 언급한 것의 상보체가 이하에 기재된다. 그러나, 이들 설명은 논의의 목적을 위한 것이며, 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 바코드 내에 포함된 임의의 다양한 기능성 서열은, 제한 없이, 상이한 부착 서열, 상이한 시퀀싱 프라이머 영역, 상이한 n-량체 영역(표적화 및 무작위)을 포함하는 이들 특정 서열뿐만 아니라 상이한 기능을 갖는 서열, 예를 들어, 2차 구조 형성, 예를 들어, 헤어핀 또는 다른 구조, 프로브 서열이, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재의 의문을 허용하거나 또는 얻어진 앰플리콘 또는 임의의 다양한 다른 기능성 서열의 풀 다운(pull down)을 허용하도록 치환될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
또한 본 개시내용 내에 핵산 분석을 위한 샘플 제조 방법 및 특히 시퀀싱 적용을 위한 샘플 제조 방법이 포함된다. 샘플 제조는 일반적으로, 예를 들어, 공급원으로부터 샘플 핵산을 포함하는 샘플을 얻는 단계, 선택적으로 추가로 샘플을 가공하는 단계, 샘플 핵산을 바코딩된 비드와 조합하는 단계 및 샘플 핵산 및 바코딩된 비드를 포함하는 유체 액적을 함유하는 에멀전을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 액적은, 예를 들어, 미세유체 장치의 도움으로 그리고/또는 임의의 적합한 에멀전화 방법을 통해 생성될 수 있다. 유동 액적은 또한 바코딩된 비드를 용해, 분해 또는 달리 파괴하고/하거나 부착된 서열에 대한 결합을 방해함으로써, 부착된 바코드 서열을 비드로부터 방출시킬 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 바코드 서열은 비드를 분해함으로써, 비드로부터 올리고뉴클레오타이드를 분리시킴으로써, 예컨대 절단 반응에 의해, 또는 둘 다의 조합에 의해 방출될 수 있다. (예를 들어, 본 명세서에 기재된 증폭 방법을 통해) 증폭시킴으로써, 유동 액적 중의 샘플 핵산, 예를 들어, 유리 바코드 서열이 샘플 핵산에 부착될 수 있다. 이어서, 유동 액적을 포함하는 에멀전이 파괴될 수 있고, 원한다면, 추가적인 서열(예를 들어, 특히 시퀀싱 방법에 도움을 주는 서열, 추가적인 바코드 서열 등)은, 이어서, 예를 들어, 추가적인 증폭 방법을 이용하여 바코딩된 샘플 핵산에 첨가될 수 있다. 이어서, 시퀀싱은 바코딩, 증폭된 샘플 핵산 및 시퀀싱 데이터를 설명하기 위해 적용된 하나 이상의 시퀀싱 알고리즘에 대해 수행될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 샘플 핵산은, 예를 들어, DNA 및 RNA를 포함하고, 구체적으로, 예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, mRNA 총 RNA 및 mRNA 또는 총 RNA 전사체로부터 생성된 cDNA를 포함하는 임의의 매우 다양한 핵산을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 임의의 적합한 디지털 처리기와 함께 사용될 수 있다. 디지털 처리기는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 장치 및/또는 실행 방법의 임의의 성분을 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드 제형은 액적 발생기와 연통하는 디지털 처리기의 도움으로 실행될 수 있다. 디지털 처리기는 액적이 형성된 속도를 제어하거나 또는 생성된 액적의 총 수를 제어할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 핵산에 바코드 서열을 부착하는 것은 미세유체 장치 및 미세유체 장치와 연통하는 디지털 처리기의 도움으로 완료될 수 있다. 일부 경우에, 디지털 처리기는 미세유체 장치의 통로에 제공되는 샘플 및/또는 비드의 양, 통로 내의 물질의 유속, 및 바코드 서열 및 샘플 핵산을 포함하는 액적이 생성되는 속도를 제어할 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물은 핵산 시퀀싱, 단백질 시퀀싱, 핵산 정량화, 시퀀싱 최적화, 유전자 발현 검출, 유전자 발현 정량화, 후성적 적용, 및 게놈 또는 발현 마커의 단일 세포 분석을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 상이한 분자 생물학 적용분야에 대해 유용할 수 있다. 게다가, 본 개시내용의 방법 및 조성물은 암을 포함하는 다양한 유전적 및 비유전적 질환 및 장애의 동정, 검출, 진단, 치료, 병기화 또는 위험 예측을 포함하는 수많은 의학적 용도를 가진다.
II. 비드 또는 입자
본 개시내용의 방법, 조성물, 장치 및 키트는 겔 비드 및 다른 유형의 비드를 포함하는 임의의 적합한 비드 또는 입자와 함께 사용될 수 있다. 비드는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 전달될 시약에 대한 담체로서 작용할 수 있다. 특히, 이들 비드는 시약이 방출 가능하게 부착되는 표면, 또는 시약이 비말동반 또는 달리 방출 가능하게 분할되는 용적을 제공할 수 있다. 이어서, 이들 시약은, 예를 들어, 별개의 파티션 내로의 시약의 제어된 전달에서, 목적으로 하는 방법에 따라 전달될 수 있다. 매우 다양한 상이한 시약 또는 시약 유형은 이러한 시약을 파티션에 전달하도록 요망할 수 있는 경우에, 비드와 회합될 수 있다. 이러한 시약의 비제한적 예는, 예를 들어, 효소, 폴리펩타이드, 항체 또는 항체 단편, 표지 시약, 예를 들어, 염료, 형광단, 발색단 등, 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 및 앞서 언급한 것 중 둘 이상의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 비드는 올리고뉴클레오타이드 서열을 합성 또는 부착하는 표면을 제공할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드, 바코드 서열, 프라이머, 가교제 등을 포함하는 다양한 독립체는 비드의 외부 표면과 회합될 수 있다. 다공성 비드의 경우에, 독립체는 비드의 외면과 내면 둘 다에 회합될 수 있다. 독립체는 (예를 들어, 공유 결합, 이온 결합, 반데르발스 상호작용 등을 통해) 비드의 표면에 직접적으로 부착될 수 있고/있거나, 비드의 표면에 부착되는 다른 올리고뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 어댑터 또는 프라이머)에 부착될 수 있고/있거나, 비드의 내면 전체적으로 확산될 수 있고/있거나 파티션 내 비드(예를 들어, 유동 액적)와 조합될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 비드의 중합체 기질 내의 부위에 공유 부착되고, 따라서 비드의 내부와 외부 내에 존재한다. 일부 경우에, 독립체, 예컨대 세포 또는 핵산은 비드 내에서 캡슐화된다. 증폭 시약(예를 들어, PCR 시약, 프라이머)를 포함하는 다른 독립체는 또한 비드 전체적으로 확산되거나 또는 비드의 내부 내에서 (예를 들어, 기공, 중합체 기질에 대한 공유 부착을 통해) 화학 결합될 수 있다.
비드는 독립체 또는 샘플을 국소화하는 작용을 할 수 있다. 일부 실시형태에서,독립체(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 바코드 서열, 프라이머, 가교제, 어댑터 등)는 비드의 외면 및/또는 내면과 회합될 수 있다. 일부 경우에, 독립체는 비드 전체적으로 위치될 수 있다. 일부 경우에, 독립체는 비드의 전체 표면과 또는 비드 표면의 적어도 절반과 회합될 수 있다.
비드는 올리고뉴클레오타이드 서열을 합성하기 위한 지지체로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드의 합성은 결찰 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드의 합성은 2개의 더 작은 올리고뉴클레오타이드를 함께 결찰시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프라이머 연장 또는 다른 증폭 반응은 비드에 부착된 프라이머를 통해 비드 상에서 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 비드에 부착되는 프라이머는 주형 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 결합 부위에 혼성화할 수 있다. 이어서, 프라이머는 프라이머 연장 반응 또는 다른 증폭 반응에 의해 연장될 수 있고, 이에 의해 올리고뉴클레오타이드에 대해 상보성인 올리고뉴클레오타이드는 비드에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 동일한 올리고뉴클레오타이드가 올리고뉴클레오타이드의 다양한 세트의 상이한 구성원에 부착되도록, 비드에 회합되는 동일한 올리고뉴클레오타이드의 세트는 다양한 올리고뉴클레오타이드의 세트에 결찰될 수 있다. 다른 경우에, 비드에 회합되는 다양한 올리고뉴클레오타이드의 세트는 동일한 올리고뉴클레오타이드의 세트에 결찰될 수 있다.
비드 특징
본 개시내용의 방법, 조성물, 장치 및 키트는 임의의 적합한 비드와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 다공성, 비다공성, 고체, 반고체, 반유체 또는 유체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 용해 가능하거나, 붕괴 가능하거나 또는 분해 가능할 수 있다. 일부 경우에, 비드는 분해 가능하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 비드는 겔 비드일 수 있다. 겔 비드는 하이드로겔일 수 있다. 겔 비드는 분자 전구체, 예컨대 중합체 또는 단량체 종으로부터 형성될 수 있다. 반고체 비드는 리포좀 비드일 수 있다. 고체 비드는 산화철, 금 및 은을 포함하는 금속을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비드는 실리카 비드이다. 일부 경우에, 비드는 강성이다. 일부 경우에, 비드는 가요성일 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드는 분자 전구체(예를 들어, 단량체 또는 중합체)일 수 있는데, 이는 전구체의 중합을 통해 중합체 네트워크를 형성할 수 있다. 일부 경우에, 전구체는, 예를 들어, 화학적 가교 결합을 통해 추가적인 중합을 겪을 수 있는 이미 중합된 종일 수 있다. 일부 경우에, 전구체는 아크릴아마이드 또는 메타크릴아마이드 단량체, 올리고머 또는 중합체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 경우에, 비드는 추가로 중합할 수 있는 올리고머인 예비중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리우레탄 비드는 예비중합체를 이용하여 제조될 수 있다. 일부 경우에, 비드는 추가로 함께 중합될 수 있는 개개 중합체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 비드는 그들이 혼합된 중합체, 공중합체 및/또는 블록 공중합체를 포함하도록, 상이한 전구체의 중합을 통해 생성될 수 있다.
비드는 천연 및 합성 중합체를 포함하는 천연 및/또는 합성 물질을 포함할 수 있다. 천연 중합체의 예는 단백질 및 당, 예컨대 데옥시리보핵산, 고무, 셀룰로스, 전분(예를 들어, 아밀로스, 아밀로펙틴), 단백질, 효소, 다당류, 실크, 폴리하이드록시알카노에이트, 키토산, 덱스트란, 콜라겐, 카라기난, 이스파귤라, 아카시아, 한천, 젤라틴, 셸락, 스테르콜리아 검, 잔탄검, 옥수수 당 검, 구아검, 카라야 검, 아가로스, 알긴산, 알기네이트 또는 이들의 천연 중합체를 포함한다. 합성 중합체의 예는 아크릴, 나일론, 실리콘, 스판덱스, 비스코스 레이온, 폴리카복실산, 폴리비닐 아세테이트, 폴리아크릴아마이드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리우레탄, 폴리락트산, 실리카, 폴리스타이렌, 폴리아크릴로나이트릴, 폴리부타다이엔, 폴리카보네이트, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리(클로로트라이플루오로에틸렌), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리에틸렌, 폴리아이소뷰틸렌, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(옥시메틸렌), 폴리폼알데하이드, 폴리프로필렌, 폴리스타이렌, 폴리(테트라플루오로에틸렌), 폴리(비닐), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(비닐리덴 다이클로라이드), 폴리(비닐리덴 다이플루아세테이트 오라이드 물질), 폴리(비닐 플루오라이드) 및 이들의 조합물(예를 들어, 공중합체)을 포함한다. 비드는 또한 지질, 마이셀, 세라믹, 유리-세라믹, 물질 복합재료, 금속, 기타 무기 물질 및 기타를 포함하는 중합체 이외로부터 형성될 수 있다.
일부 경우에, 화학적 가교제는 단량체의 중합 동안 단량체를 가교하기 위해 사용된 전구체일 수 있고/있거나 종과 함께 비드를 기능화하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 중합체는 추가 중합체 네트워크를 생성하기 위해 가교제 종 또는 다른 유형의 단량체에 의해 추가로 중합될 수 있다. 화학적 가교제(또한 본 명세서에서 "가교제" 또는 "가교 제제"로서 지칭됨)의 비제한적 예는 시스타민, 글루테르알데하이드, 다이메틸 수베리미데이트, N-하이드록시숙신이미드 가교제 BS3, 폼알데하이드, 카보다이이미드(EDC), SMCC, 설포-SMCC, 비닐실란스, N,N'다이알릴타르타르다이아마이드(DATD), N,N'-비스(아크릴로일)시스타민(BAC) 또는 이들의 상동체를 포함한다. 일부 경우에, 본 개시내용에서 사용되는 가교제는 시스타민을 포함한다.
가교는 사용되는 특정 가교제에 따라서 영구적 또는 가역적일 수 있다. 가역적 가교는 적절한 조건 하에서 중합체가 선형화 또는 해리되게 할 수 있다. 일부 경우에, 가역적 가교는 또한 비드 표면에 결합된 물질의 가역적 부착을 허용할 수 있다. 일부 경우에, 가교제는 이황화 결합을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 이황화 결합을 형성하는 화학적 가교제는 시스타민 또는 변형된 시스타민일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이황화 결합은 분자 전구체 단위(예를 들어, 단량체, 올리고머, 또는 선형 중합체) 사이에 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이황화 결합은 분자 전구체 단위(예를 들어, 단량체, 올리고머 또는 선형 중합체) 또는 비드 내에 혼입된 전구체와 올리고뉴클레오타이드 사이에 형성될 수 있다.
시스타민(변형된 시스타민을 포함)은, 예를 들어, 개개 단량체 또는 비드의 중합체 전구체 사이의 가교제로서 사용될 수 있는 이황화 결합을 포함하는 유기 제제이다. 폴리아크릴아마이드는 이황화 결합을 포함하는 폴리아크릴아마이드 겔 비드(예를 들어, 화학적으로 환원 가능한 가교제를 포함하는 화학적으로 분해 가능한 비드)를 생성하기 위해 시스타민 또는 시스타민을 포함하는 종(예를 들어, 변형된 시스타민)의 존재 하에 중합될 수 있다. 이황화 결합은 환원제에 비드의 노출 시 비드가 분해(또는 용해)되게 할 수 있다.
적어도 하나의 대안의 실시예에서, 키토산, 선형 다당류 중합체는 비드를 형성하기 위해 친수성 사슬을 통해 글루타르알데하이드와 가교될 수 있다. 키토산 중합체의 가교는 열, 압력, pH의 변화 및/또는 방사선에 의해 개시되는 화학 반응에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드는 중합체 전구체(예를 들어, 단량체, 올리고머, 선형 중합체), 올리고뉴클레오타이드, 프라이머, 및 기타 독립체 사이에 공유 또는 이온 결합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 공유 결합은 탄소-탄소 결합 또는 티오에터 결합을 포함한다.
일부 경우에, 비드는 특정 양상에서 비드에 하나 이상의 종(예를 들어, 바코드 서열, 프라이머, 기타 올리고뉴클레오타이드)을 부착하는 데 사용될 수 있는 아크릴다이트 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 아크릴다이트 모이어티는 아크릴다이트와 하나 이상의 종과의 반응, 예를 들어, 중합 반응 동안 아크릴다이트와 기타 단량체 및 가교제와의 반응으로부터 생성된 아크릴다이트 유사체를 지칭할 수 있다. 아크릴다이트 모이어티는 올리고뉴클레오타이드와 같이 부착될 종(예를 들어, 바코드 서열, 프라이머, 기타 올리고뉴클레오타이드)과 화학 결합을 형성하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 아크릴다이트 모이어티는 이황화 결합을 형성할 수 있는 티올기에 의해 변형될 수 있거나, 또는 이미 이황화 결합을 포함하는 기에 의해 변형될 수 있다. 티올 또는 이황화물은 (이황화물 교환을 통해) 부착될 종에 대한 앵커(anchor) 지점으로서 사용될 수 있거나 또는 아크릴다이트 모이어티의 다른 부분은 부착을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 이황화 결합이 (예를 들어, 환원제의 존재 하에) 파괴될 때, 제제가 비드로부터 방출되도록 부착은 가역적이다. 다른 경우에, 아크릴다이트 모이어티는 부착을 위해 사용될 수 있는 반응성 하이드록실기를 포함한다.
다른 종, 예를 들어, 핵산의 부착을 위한 비드의 기능화는 중합체 내에서 화학기의 활성화, 중합체 구조에서 활성 또는 활성화 가능한 기능기의 혼입, 또는 비드 생성에서 예비중합체 또는 단량체 단계에서의 부착을 포함하는 매우 다양한 상이한 접근을 통해 달성될 수 있다.
예를 들어, 일부 예에서, 비드가 생성될 때, 비드가 또한 아트릴다이트 모이어티를 포함하도록, 비드를 형성하기 위해 중합되는 전구체(예를 들어, 단량체, 가교제)는 아크릴다이트 모이어티를 포함할 수 있다. 종종, 아크릴다이트 모이어티는 올리고뉴클레오타이드 서열, 예컨대 비드에 혼입될 것이 요망되는 프라이머(예를 들어, 표적 핵산 및/또는 시퀀싱 표적 핵산 바코드 서열, 결합 서열 등을 증폭시키는 것 중 하나 이상에 대한 프라이머)에 부착된다. 일부 경우에, 프라이머는 P5 서열을 포함한다. 예를 들어, 아크릴아마이드 전구체(예를 들어, 가교제, 단량체)는 그들이 비드를 형성하도록 중합될 때, 비드가 또한 아크릴다이트 모이어티를 포함하도록, 아크릴다이트 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 전구체, 예컨대 단량체 및 가교제는, 예를 들어, 단일 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 프라이머 또는 기타 서열) 또는 기타 종을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 전구체, 예컨대 단량체 및 가교제는 다중 올리고뉴클레오타이드, 기타 서열 또는 다른 종을 포함할 수 있다. 각각의 전구체가 부하될 종의 다중 복제물을 포함할 수 있기 때문에 각각의 전구체에서 다중 아크릴다이트 모이어티 또는 기타 링커 종의 포함은 연결되는 종(예를 들어,올리고뉴클레오타이드)의 전구체로부터 생성되는 비드 내로의 부하를 개선시킬 수 있다.
일부 경우에, 반응성인 또는 반응성이되도록 활성화될 수 있는 작용기를 포함하는 전구체는 활성화된 또는 활성화 가능한 작용기를 포함하는 겔 비드를 생성하기 위해 다른 전구체에 의해 중합될 수 있다. 이어서, 작용기는 추가적인 종(예를 들어, 이황화물 링커, 프라이머, 기타 올리고뉴클레오타이드 등)을 겔 비드에 부착하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 카복실산(COOH) 기를 포함하는 일부 전구체는 또한 COOH 작용기를 포함하는 겔 비드를 형성하기 위해 다른 전구체와 공중합될 수 있다. 일부 경우에, 아크릴산(유리 COOH 기를 포함하는 종), 아크릴아마이드, 및 비스(아크릴로일)시스타민은 유리 COOH 기를 포함하는 겔 비드를 생성하기 위해 함께 공중합될 수 있다. 겔 비드의 COOH 기는 그들이 반응성이 되도록(예를 들어, EDC/NHS 또는 DMTMM이 활성화를 위해 사용되는 경우에 아민 작용기에 대해 반응성)(예를 들어, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 또는 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 클로라이드(DMTMM)를 통해) 활성화될 수 있다. 이어서, 활성화된 COOH 기는 비드에 연결될 모이어티를 포함하는 적절한 종(예를 들어, 카복실산기가 아민 작용기와 반응성이 되도록 활성화되는 경우 아민 작용기를 포함하는 종)과 반응할 수 있다.
중합체 네트워크에서 이황화 결합을 포함하는 비드는 일부 이황화 결합의 유리 티올로의 환원을 통해 추가적인 종으로 기능화될 수 있다. 이황화 결합은 비드의 용해 없이 유리 티올기를 생성하기 위해, 예를 들어, 환원제(예를 들어, DTT, TCEP 등)의 작용을 통해 환원될 수 있다. 이어서, 비드의 유리 티올은 종이 (예를 들어, 생성된 이황화 결합을 통해) 비드에 연결될 수 있도록 (예를 들어, 티올-이황화물 교환을 통해)) 종 또는 다른 이황화 결합을 포함하는 종의 유리 티올과 반응할 수 있다. 일부 경우에, 그렇기는 하지만, 비드의 유리 티올은 임의의 다른 적합한 기와 반응할 수 있다. 예를 들어, 비드의 유리 티올은 아크릴다이트 모이어티를 포함하는 종과 반응할 수 있다. 아크릴다이트를 포함하는 종이 비드에 연결되도록 비드의 유리 티올기는 마이클(Michael) 첨가 화학을 통해 아크릴다이트와 반응될 수 있다. 일부 경우에, 비제어 반응은, 예를 들어, N-에틸말레이미드 또는 요오도아세테이트와 같은 티올 캡핑제의 포함에 의해 예방될 수 있다.
비드 내에서 이황화 결합의 활성화는 소수의 이황화 결합 만이 활성화되도록 제어될 수 있다. 예를 들어, 유리 티올기를 생성하기 위해 사용되는 환원제의 농도 및/또는 비드 중합에서 이황화 결합을 형성하기 위해 사용되는 시약의 농도를 제어함으로써 제어될 수 있다. 일부 경우에, 환원을 위해 저농도(예를 들어, 환원제 분자:겔 비드비가 약 10000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000, 10000000000 또는 100000000000 미만)의 환원제가 사용될 수 있다. 유리 티올로 환원되는 이황화 결합 수의 제어는 기능화 동안의 비드 구조적 완전성을 보장하는 데 유용할 수 있다. 일부 경우에, 선택적 활성제, 예컨대 형광 염료는 비드의 유리 티올기를 통해 비드에 결합될 수 있고, 비드에 존재하는 유리 티올의 수를 정량화하기 위해 그리고/또는 비드를 추적하기 위해 사용된다.
일부 경우에, 겔 비드 형성 후에 겔 비드에 대한 모이어티의 첨가는 유리할 수 있다. 예를 들어, 겔 비드 형성 후에 종의 첨가는 중합 동안 생길 수 있는 연쇄 이동 종결 동안 종의 상실을 회피할 수 있다. 게다가, 더 작은 전구체(예를 들어, 측쇄기 및 연결된 모이어티를 포함하지 않는 단량체 또는 가교제)가 중합을 위해 사용될 수 있고, 점성 효과에 기인하여 점점 길어지는 사슬말단으로부터 최소로 방해될 수 있다. 일부 경우에, 겔 비드 합성 후의 기능화는 제제(예를 들어, 유리 라디칼) 및/또는 화학적 환경을 잠재적으로 손상시키면서 부하될 종(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)의 노출을 최소화할 수 있다. 일부 경우에, 생성되는 겔은 비드의 온도 유도 팽창 및 붕괴를 허용할 수 있는 상부 임계 용액 온도(UCST)를 가질 수 있다. 이러한 기능성은 종에 의한 비드의 후속적 기능화 동안 비드 내로 종(예를 들어, 프라이머, P5 프라이머) 침윤에 도움을 줄 수 있다. 생성 후 기능화는 또한, 예를 들어, 부하 비의 가변성이 최소화되도록 비드 내 종의 부하 비를 제어하는 데 유용할 수 있다. 또한, 복수의 비드가 단일 배취에서 종에 의해 기능화될 수 있도록 종 부하는 배취 공정에서 수행될 수 있다.
일부 경우에, 전구체에 연결된 아크릴다이트 모이어티, 전구체에 연결되는 다른 종, 또는 전구체 그 자체는 불안정한 결합, 예를 들어, 화학적, 열적, 또는 광민감성인 결합 예를 들어, 이황화 결합, UV 민감성 결합 등을 포함한다. 일단 아크릴다이트 모이어티 또는 불안정한 결합을 포함하는 기타 모이어티가 비드 내로 혼입되면, 비드는 또한 불안정한 결합을 포함할 수 있다. 불안정한 결합은, 예를 들어, 비드에 대해 종(예를 들어, 바코드, 프라이머 등)을 가역적으로 연결하는데(예를 들어, 공유적으로 연결하는 데) 유용할 수 있다. 일부 경우에, 열적으로 불안정한 결합은, 예를 들어, 혼성체의 열 용융이 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 바코드 포함 서열을 비드 또는 마이크로캡슐로부터 방출하도록 비드에 부착되는 상보성 서열에 올리고뉴클레오타이드가 혼성화되는, 핵산 혼성화 기반 부착을 포함할 수 있다. 게다가, 겔 비드에 대한 불안정한 결합의 다수 유형의 첨가는 변화된 자극에 반응할 수 있는 비드의 생성을 초래할 수 있다. 각각의 불안정한 결합을 통해 비드에 부착된 종의 방출이 적절한 자극의 적용에 의해 제어될 수 있도록 각각의 유형의 불안정한 결합은 관련된 자극(예를 들어, 화학적 자극, 광, 온도 등)에 대해 민감할 수 있다. 이러한 기능성은 겔 비드로부터 종의 제어된 방출에서 유용할 수 있다. 일부 경우에, 불안정한 결합을 포함하는 다른 종은, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 겔 비드의 활성화된 작용기를 통해 겔 비드 형성 후에 겔 비드에 연결될 수 있다. 인식될 바와 같이, 본 명세서에 기재된 비드에 방출 가능하게, 절단 가능하게 또는 가역적으로 부착된 바코드는 바코드 분자와 비드 사이의 결합의 절단을 통해 방출되거나 또는 방출 가능한 바코드, 또는 다른 시약에 의해 바코드에 접근되거나 또는 접근 가능하게 되는 기저 비드 그 자체의 분해를 통해 방출되는 바코드, 또는 둘 다를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같이 방출 가능한 바코드는 일반적으로 활성화 가능한 것으로 지칭될 수 있으며, 즉, 그들은 일단 방출되면 반응에 대해 이용 가능하다. 따라서, 예를 들어, 활성화 가능한 바코드는 비드(또는 본 명세서에 기재된 다른 적합한 유형의 파티션)로부터 바코드를 방출함으로써 활성화될 수 있다. 인식될 바와 같이, 기재한 방법 및 시스템과 관련하여 다른 활성화 가능한 입체배치가 또한 생각된다. 특히, 일단 시약의 요망되는 세트에, 예를 들어, 공동 파티션화를 통해 전달된다면, 활성화 가능한 기가 목적으로 하는 시약과 반응될 수 있도록, 회합된 활성화 가능한 기에 의해 비드에 방출 가능하게 부착된 또는 파티션 내에 달리 배치된 시약이 제공될 수 있다. 이러한 활성화 가능한 기는 가둬진(caging) 기, 제거 가능한 차단 또는 보호기, 예를 들어, 광불안정성 기, 열 불안정성 기 또는 화학적으로 제거 가능한 기를 포함한다.
열적으로 절단 가능한 결합에 추가로, 이황화 결합 및 UV 민감성 결합, 전구체 또는 비드에 결합될 수 있는 기타 비제한적 예는 에스터 결합(예를 들어, 산, 염기 또는 하이드록실아민에 의해 절단 가능함), 인접한 다이올 결합(예를 들어, 과요오드산나트륨을 통해 절단 가능), 딜스알더(Diels-Alder) 결합(예를 들어, 열을 통해 절단 가능), 설폰 결합(예를 들어, 염기를 통해 절단 가능), 실릴 에터 결합(예를 들어, 산을 통해 절단 가능), 글리코시딕 결합(예를 들어, 아밀라제를 통해 절단 가능), 펩타이드 결합(예를 들어, 프로테아제를 통해 절단 가능), 또는 포스포다이에스터 결합(예를 들어, 뉴클레아제(예를 들어, DNA 분해 효소)를 통해 절단 가능)을 포함한다.
비드는 다양한 수의 아크릴다이트 모이어티에 연결될 수 있다. 예를 들어, 비드는 비드에 연결된 약 1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000 또는 10000000000개의 아크릴다이트 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 비드는 비드에 연결된 적어도 1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000 또는 10000000000개의 아크릴다이트 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비드는, 예컨대 아크릴다이트를 통해 비드에 공유 결합된 약 1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000 또는 10000000000개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 비드는, 예컨대 아크릴다이트를 통해 비드에 공유 결합된 적어도 1, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 100000000, 1000000000 또는 10000000000개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
중합에 참여하지 않는 종은 또한 비드 생성 동안(예를 들어, 전구체의 중합 동안) 비드에서 캡슐화될 수 있다. 이러한 종은 생성된 비드가 비드 형성 시 종을 포함하도록 중합 반응 혼합물에 유입될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 종은 형성 후에 겔 비드에 첨가될 수 있다. 이러한 종은, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 핵산 증폭 반응에 필수적인 종(예를 들어, 프라이머, 중합효소, dNTP, 보인자(예를 들어, 이온성 보인자)), 효소 반응에 필수적인 종(예를 들어, 효소, 보인자, 기질) 또는 핵산 변형 반응에 필수적인 종, 예컨대 중합, 결찰 또는 분해를 포함할 수 있다. 이러한 종의 트래핑은 전구체의 중합 동안 생성된 중합체 네트워크 밀도, 겔 비드 내에서 이온 전하의 제어(예를 들어, 중합되니 종에 연결된 이온성 종을 통함), 또는 다른 종의 방출에 의해 제어될 수 있다. 캡슐화된 종은 비드 분해 시 비드로부터 및/또는 비드로부터 종을 방출할 수 있는 자극의 적용에 의해 방출될 수 있다.
비드는 균일한 크기 또는 이질적 크기를 가질 수 있다. 일부 경우에, 비드의 직경은 약 1㎛, 5㎛, 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 45㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 90㎛, 100㎛, 250㎛, 500㎛ 또는 1mm일 수 있다. 일부 경우에, 비드는 직경이 적어도 약 1㎛, 5㎛, 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 45㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 90㎛, 100㎛, 250㎛, 500㎛, 1mm 이상일 수 있다. 일부 경우에, 비드는 직경이 약 1㎛, 5㎛, 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 45㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 90㎛, 100㎛, 250㎛, 500㎛ 또는 1mm 미만일 수 있다. 일부 경우에, 비드는 직경이 약 40 내지 75㎛, 30 내지 75㎛, 20 내지 75㎛, 40 내지 85㎛, 40 내지 95㎛, 20 내지 100㎛, 10 내지 100㎛, 1 내지 100㎛, 20 내지 250㎛ 또는 20 내지 500㎛의 범위일 수 있다.
특정 바람직한 양상에서, 비드는 상대적으로 단분산 크기 분포를 갖는 비드 집단으로서 제공된다. 인식될 바와 같이, 일부 적용에서, 파티션 내에서 상대적으로 일관된 양의 시약을 제공하는 것이 바람직한 경우에, 상대적으로 일관된 비드 특징, 예컨대 크기를 유지하는 것은 전반적인 일반성에 기여한다. 특히, 본 명세서에 기재된 비드는 그들의 횡단면 치수의 변동계수가 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 그리고 일부 경우에 15%미만, 10% 미만, 또는 심지어 5% 미만인 크기 분포를 가질 수 있다.
비드는 규칙적 형상 또는 불규칙적 형상을 가질 수 있다. 비드 형상의 예는 구체, 비구체, 타원, 긴타원형, 비정형, 원형, 원통형 및 이들의 상동체를 포함한다.
분해 가능한 비드
비드와 회합 분자, 예를 들어, 상기 기재한 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 바코드 사이의 절단 가능한 결합에 추가로, 또는 이에 대한 대안으로서, 비드는 하나 이상의 자극(예를 들어, 온도 변화, pH 변화, 특정 화학 종 또는 상에 대한 노출, 광에 대한 노출, 환원제 등)과 동시에 또는 자극에 대한 노출 시 분해 가능하거나, 파괴 가능하거나 또는 용해 가능할 수 있다. 일부 경우에, 비드의 물질 성분은 특정 화학 종 또는 환경적 변화, 예를 들어, 온도 또는 pH에 노출될 때 가용화되도록, 비드는 용해 가능할 수 있다. 예를 들어, 겔 비드는 승온 및/또는 염기성 조건에서 분해되거나 또는 용해될 수 있다. 일부 경우에, 비드가 온도의 적절한 변화(예를 들어, 열)에 노출될 때, 비드가 분해되도록, 비드는 열적으로 분해 가능할 수 있다. 종(예를 들어, 핵산 종)에 결합된 비드의 분해 또는 용해는 비드로부터 종의 방출을 초래할 수 있다.
비드/종이 적절한 자극에 노출될 때, 결합이 파괴되고, 비드가 분해되도록 분해 가능한 비드는 불안정한 결합을 지니는 하나 이상의 종을 포함할 수 있다. 불안정한 결합은 화학적 결합(예를 들어, 공유 결합, 이온성 결합)일 수 있거나 또는 다른 유형의 물리적 상호작용(예를 들어, 반데르 발스 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 등)일 수 있다. 일부 경우에, 비드를 생성하기 위해 사용되는 가교제는 불안정한 결합을 포함할 수 있다. 적절한 조건에 대한 노출 시, 불안정한 결합은 파괴되고, 비드는 분해된다. 예를 들어, 폴리아크릴아마이드 겔 비드는 시스타민 가교제를 포함할 수 있다. 환원제에 대한 비드의 노출 시, 시스타민의 이황화 결합은 파괴되고, 비드는 분해된다.
분해 가능한 비드는 적절한 자극이 비드에 적용될 때 비드로부터 부착된 종(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 바코드 서열)을 더 빠르게 방출하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 다공성 비드의 내면에 또는 캡슐화된 종의 경우에 결합된 종에 대해, 종은 비드의 분해 시 용액 중의 다른 종에 대한 더 큰 이동성 및 접근 가능성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 종은 또한 분해 가능한 링커(예를 들어, 이황화물 링커)를 통해 분해 가능한 비드에 부착될 수 있다. 분해 가능한 링커는 분해 가능한 비드와 동일한 자극에 반응할 수 있거나 또는 2개의 분해 가능한 종은 상이한 자극에 반응할 수 있다. 예를 들어, 바코드 서열은 이황화 결합을 통해 시스타민을 포함하는 폴리아크릴아마이드 비드에 부착될 수 있다. 바코딩된 비드의 환원제에 대한 노출 시, 비드는 분해되고, 바코드 서열은 바코드 서열과 비드 사이의 이황화 결합과 비드 내 시스타민의 이황화 결합 둘 다의 파괴 시 방출된다.
비드가 파티션 내에서 분해되고, 적절한 자극이 적용될 때 임의의 회합된 종이 액적 내에서 방출되도록 분해 가능한 비드는 에멀전의 액적 또는 웰과 같은 파티션 내로 도입될 수 있다. 유리 종은 다른 종과 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 시스타민을 포함하고 이황화 결합을 통해 바코드 서열에 연결된 폴리아크릴아마이드 비드는 유중수 에멀전의 액적 내에서 환원제와 조합될 수 있다. 액적 내에서, 환원제는 다양한 이황화 결합을 파괴하여 비드 분해 및 액적의 수성, 내부 환경으로 바코드 서열의 방출을 초래한다. 다른 예에서, 염기성 용액 중에서 비드-결합 바코드 서열을 포함하는 액적의 가열은 또한 비드 분해 및 액적의 수성, 내부 환경으로의 부착된 바코드 서열의 방출을 초래할 수 있다.
상기 개시내용으로부터 인식되는 한편, 비드의 분해로서 언급되는 바와 같이, 상기 주목한 바와 같은 다수의 예에서, 분해는 물리적 비드 그 자체를 구조적으로 분해하면서, 그리고 구조적으로 분해하는 일 없이 비드로부터 결합 또는 비말동반된 종의 해리를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 비말동반된 종은, 예를 들어, 화학적 환경 변화에 기인하여 삼투압 차이를 통해 비드로부터 방출될 수 있다. 예로서, 삼투압 차이에 기인하는 비드 기공 크기의 변경은 일반적으로 비드 그 자체의 구조적 변화 없이 일어날 수 있다. 일부 경우에, 비드의 삼투성 팽윤에 기인하는 기공 크기의 증가는 비드 내에서 비말 동반된 종의 방출을 허용할 수 있다. 다른 경우에, 비드의 삼투성 수축은 기공 크기 수축에 기인하여 비드가 비말 동반된 종을 더 양호하게 유지하게 할 수 있다.
인식될 바와 같이, 분해 가능한 비드가 제공되는 경우, 조기 비드 분해 및, 예를 들어, 불량한 유동 특징, 클럼핑 및 응집을 포함하는 이러한 분해로부터 생기는 문제를 회피하기 위해 목적으로 하는 시간 전에 이러한 분해를 야기하는 자극 또는 자극들에 대한 이러한 비드의 노출을 회피하는 것이 바람직할 수 있다. 예로서, 비드가 환원성 가교기, 예컨대 이황화기를 포함하는 경우, 이러한 비드를 환원제, 예를 들어, DTT 또는 다른 이황화물 절단 시약과 접촉시키는 것을 회피하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 경우에, 본 명세서에 기재된 비드에 대한 치료는, 일부 경우에 환원제, 예컨대 DTT가 없도록 제공될 것이다. 환원제는 종종 상업적 효소 제제에서 제공되기 때문에, 종종 본 명세서에 기재된 비드를 처리함에 있어서 무 환원제(또는 무 DTT) 효소 제제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 효소의 예는, 예를 들어, 중합효소 효소 제제, 리가제 효소 제제뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 비드를 처리하기 위해 사용될 수 있는 다수의 다른 효소 제제를 포함한다. "무 환원제" 또는 "무 DTT" 제제는 제제가 비드를 분해하는 데 사용되는 이러한 물질에 대해 하한의 1/10 미만, 1/50 미만, 및 심지어 1/100 미만일 것임을 의미한다. 예를 들어, DTT에 대해, 무 환원제 제제는 전형적으로 0.01mM, 0.005mM, 0.001mM DTT, 0.0005mM DTT 미만 또는 심지어 0.0001mM DTT 미만일 것이다. 다수의 경우에, DTT의 양은 검출 가능하지 않을 것이다.
비드를 분해하기 위한 방법
일부 경우에, 자극은 비드의 분해를 촉발하기 위해 사용될 수 있는데, 이는 비드로부터의 내용물의 방출을 초래할 수 있다. 일반적으로, 자극은 비드 구조의 분해, 예컨대 공유 결합 또는 다른 유형의 물리적 상호작용의 분해를 야기할 수 있다. 이들 자극은 비드가 분해되고/되거나 그의 내용물을 방출함에 있어서 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 자극의 예는 이하에 더 완전하게 기재하는 바와 같은 화학적 자극, 열 자극, 광 자극 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
수많은 화학적 촉발제는 비드의 분해를 촉발하기 위해 사용될 수 있다. 이들 화학적 변화의 예는 비드 내에서 성분의 완전함에 대한 pH-매개 변화, 가교 결합의 절단을 통한 비드 성분의 분해 및 비드 성분의 탈중합을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 비드는 분해 가능한 화학적 가교제, 예컨대 BAC 또는 시스타민을 포함하는 물질로부터 형성될 수 있다. 이러한 분해 가능한 가교제의 분해는 다수의 메커니즘을 통해 달성될 수 있다. 일부 예에서, 비드는 산화, 환원 또는 다른 화학적 변화를 유도할 수 있는 화학적 분해제와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 화학적 분해제는 환원제, 예컨대 다이티오트레이톨(DTT)일 수 있다. 환원제의 추가적인 예는 β-머캅토에탄올, (2S)-2-아미노-1,4-다이머캅토부탄(다이티오뷰틸아민 또는 DTBA), 트리스(2-카복시에틸) 포스핀(TCEP) 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 환원제는 비드를 형성하는 겔 전구체 사이에 형성된 이황화 결합을 분해할 수 있고, 따라서 비드를 분해한다. 다른 경우에, 용액의 pH 변화, 예컨대 pH 증가는 비드 분해를 촉발할 수 있다. 다른 경우에, 수용액, 예컨대 물에 대한 노출은 가수분해를 촉발할 수 있고, 따라서 비드를 분해한다.
비드는 또한 열 자극의 적용 시 그들의 내용물을 방출하도록 유도될 수 있다. 온도 변화는 비드에 대한 다양한 변화를 야기할 수 있다. 예를 들어, 열은 고체 비드가 액화되는 것을 야기할 수 있다. 열 변화는 비드의 일부가 분해되도록 비드의 용융을 야기할 수 있다. 다른 경우에, 열은 비드가 파괴되거나 또는 터지도록 비드 성분의 내부 압력을 증가시킬 수 있다. 열은 또한 비드를 구성하기 위한 물질로서 사용되는 열 민감성 중합체에 대해 작용할 수 있다.
본 개시내용의 방법, 조성물, 장치 및 키트는 비드를 분해하기 위한 임의의 적합한 제제와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 온도 또는 pH의 변화는 비드 내에서 열 민감성 또는 pH 민감성 결합을 분해하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 분해제는 산화, 환원 또는 기타 화학적 변화에 의해 비드 내에서 화학적 결합을 분해하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 화학적 분해제는 환원제, 예컨대 DTT일 수 있되, DTT는 가교제와 겔 전구체 사이에 형성된 이황화 결합을 분해할 수 있고, 따라서 비드를 분해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 환원제는 비드를 분해하기 위해 첨가될 수 있는데, 이는 비드가 그의 내용물을 방출하게 할 수도 있고 방출하지 않게 할 수도 있다. 환원제의 예는 다이티오트레이톨(DTT), β-머캅토에탄올, (2S)-2-아미노-1,4-다이머캅토부탄(다이티오뷰틸아민 또는 DTBA), 트리스(2-카복시에틸) 포스핀(TCEP) 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 환원제는 0.1mM, 0.5mM, 1mM, 5mM 또는 10mM로 존재할 수 있다. 환원제는 0.1mM, 0.5mM, 1mM, 5mM, 10mM 이상으로 제공될 수 있다. 환원제는 0.1mM, 0.5mM, 1mM, 5mM 또는 10mM 미만으로 제공될 수 있다.
분해 단계의 시간
비드는 비드에 부착되고 비드 내에 포함된 내용물을 방출하기 위해 분해될 수 있다. 이 분해 단계는 샘플이 비드와 조합됨과 동시에 일어날 수 있다. 이 분해 단계는 샘플이 미세유체 장치에서 형성될 수 있는 유체 액적과 조합될 때 동시에 일어날 수 있다. 이 분해 단계는 샘플이 미세유체 장치에서 형성될 수 있는 유체 액적과 조합된 후에 일어날 수 있다. 인식될 바와 같이, 다수의 용도에서, 분해 단계는 일어나지 않을 수도 있다.
환원제는 샘플과 조합될 수 있고, 이어서, 비드와 조합될 수 있다. 일부 경우에, 환원제는 샘플과 동시에 미세유체 장치에 도입될 수 있다. 일부 경우에, 환원제는 샘플이 도입된 후에 미세유체 장치에 도입될 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 미세유체 장치에서 환원제와 혼합될 수 있고, 이어서, 미세유체 장치에서 겔 비드와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 환원제와 사전 혼합될 수 있고, 이어서, 장치에 첨가되고 나서, 겔 비드와 접촉될 수 있다.
분해 가능한 비드는 적절한 자극의 적용과 동시에 분해 가능할 수 있다. 다른 경우에, 비드의 분해는 시간에 걸쳐 일어날 수 있다. 예를 들어, 비드는 적절한 자극의 적용 즉시 또는 약 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20분 내에 분해될 수 있다. 다른 예에서, 비드는 적절한 자극의 적용 즉시 또는 약 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20분 이내에 분해될 수 있다.
비드는 또한 샘플과의 조합에 대해 상이한 시간에 분해될 수 있다. 예를 들어, 비드는 샘플과 조합될 수 있고, 후속적으로 이후의 시점에 분해될 수 있다. 샘플과 비드를 조합하는 것과 후속적으로 비드를 분해하는 것 사이의 시간은 약 0.0001, 0.001, 0.01, 1, 10, 30, 60, 300, 600, 1800, 3600, 18000, 36000, 86400, 172800, 432000, 또는 864000초일 수 있다. 샘플과 비드를 조합하는 것과 후속적으로 비드를 분해하는 것 사이의 시간은 약 0.0001, 0.001, 0.01, 1, 10, 30, 60, 300, 600, 1800, 3600, 18000, 36000, 86400, 172800, 432000, 864000초 이상일 수 있다. 샘플과 비드를 조합하는 것과 후속적으로 비드를 분해하는 것 사이의 시간은 약 0.0001, 0.001, 0.01, 1, 10, 30, 60, 300, 600, 1800, 3600, 18000, 36000, 86400, 172800, 432000, 또는 864000초 미만일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드를 이용하는 사전 기능화된 비드의 제조
본 명세서에 기재된 비드는 다양한 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 적합한 비드는 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 특허 공개 제20140378350호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 경우에, 비드는 분자 전구체(예를 들어, 선형 중합체, 단량체, 가교제)를 함유하는 액체로부터 형성될 수 있다. 이어서, 액체에 중합 반응이 실시되며, 이에 의해 경화되고, 비드(또는 겔 비드)로 겔화된다. 액체는 또한 중합 동안 비드에 혼입될 올리고뉴클레오타이드와 같은 독립체를 함유할 수 있다. 이 혼입은 비드와의 공유 또는 비공유 결합을 통할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 형성 동안 비드 내에서 비말동반될 수 있다. 대안적으로, 그들은 형성 동안 또는 형성 후에 비드 또는 비드 프레임워크에 결합될 수 있다. 종종, 올리고뉴클레오타이드는 중합 과정 동안 비드에 가교되는 아크릴다이트 모이어티에 연결된다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 이황화 결합에 의해 아크릴다이트 모이어티에 부착된다. 그 결과, 비드-아크릴다이트-S-S-올리고뉴클레오타이드 결합을 포함하는 조성물이 형성된다.
일 예시적 과정에서, 기능화된 비드는 복수의 중합체 및/또는 단량체를 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 프라이머(예를 들어, 보편적 프라이머, 시퀀싱 프라이머)를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 혼합함으로써 생성될 수 있다. 중합체 및/또는 단량체는 아크릴아마이드를 포함할 수 있고, 중합체 및/또는 단량체 사이에서 이황화 결합이 형성되어 경화된 비드 형성을 초래하도록 가교될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 경화 비드의 형성 동안(예를 들어, 동시에) 복수의 중합체 및/또는 단량체에 공유 연결될 수 있거나 또는 경화된 비드의 형성 후에(예를 들어, 후속적으로) 복수의 중합체 및/또는 단량체에 공유 결합될 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 아크릴다이트 모이어티를 통해 비드에 연결될 수 있다.
대부분의 경우에, 비드 집단은 동일한 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 보편적 프라이머 또는 프라이머 결합 부위에 의해 기능화될 수 있다. 일부 경우에, 비드 집단 내 비드는 다수의 상이한 올리고뉴클레오타이드에 의해 사전 기능화된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 선택적으로, 예를 들어, 비드의 후속적 가공 또는 적용에서 사용하기 위한 임의의 다양한 상이한 기능성 서열을 포함할 수 있다. 기능성 서열은, 예를 들어, 프라이머 서열, 에컨대 표적화된 프라이머 서열, 보편적 프라이머 서열, 예를 들어, 샘플 핵산 상의 다수의 상이한 위치로부터의 프라이머 연장에 혼성화할 수 있을 만큼 충분히 짧은 프라이머 서열, 또는 무작위 프라이머 서열, 부착 또는 고정 서열, 결찰 서열, 헤어핀 서열, 태깅 서열, 예를 들어, 바코드 또는 샘플 지표 서열, 또는 임의의 다수의 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
예로서, 일부 경우에, 보편적 프라이머(예를 들어, P5 또는 다른 적합한 프라이머)는 비드에 추가적인 내용물(예를 들어, 바코드, 무작위 N-량체, 기타 기능성 서열)을 부착하기 위해 각각의 비드 상에서 프라이머로서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 보편적 프라이머(예를 들어, P5)는 또한 시퀀싱 장치와 양립 가능할 수 있고, 이후에 시퀀싱 장치 내에서 유세포에 대한 목적으로 하는 가닥의 부착을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 부착 또는 고정 서열은 시퀀싱을 위해 해당 표면에 서열을 고정시키기 위해 시퀀싱 장치 내 유세포 표면에 현수된 올리고뉴클레오타이드에 대한 상보성 서열을 제공할 수 있다. 대안적으로, 이러한 부착 서열은 추가적으로 비드에 부착되는 올리고뉴클레오타이드 서열 내에서 제공되거나 또는 이에 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 비드 및 그들의 부착 종은 후속적 분석 과정, 예컨대 시퀀싱 장치 또는 시스템과 양립 가능하게 제공될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드뿐만 아니라, 상이한 순차적 또는 병행 가공 단계에서, 해당 서열에 결합하는 임의의 추가적인 서열의 상이한 가공을 허용하기 위해, 하나 초과의 프라이머가 비드에 부착될 수 있고, 하나 초과의 프라이머는 보편적 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 증폭 산물의 시퀀싱을 위한 제2 프라이머와 함께 표적 서열의 증폭을 위한 제1 프라이머). 예를 들어, 일부 경우에, 비드에 부착되는 올리고뉴클레오타이드는 증폭된 바코딩된 표적 서열(들)을 생성하기 위해, 예를 들어, 표적 핵산 서열을 따라 프라이머를 연장시키는 제1 증폭 또는 복제 과정을 수행하기 위한 제1 프라이머 서열을 포함할 것이다. 또한 올리고뉴클레오타이드 내에서 시퀀싱 프라이머를 포함함으로써, 얻어진 증폭 표적 서열은 이러한 프라이머를 포함할 것이고, 시퀀싱 시스템에 용이하게 전달될 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 예를 들어, 일루미나(Illumina) 시퀀싱 시스템을 이용하여 증폭된 표적을 시퀀싱하기를 바라는 경우에, R1 프라이머 또는 프라이머 결합 부위가 또한 비드에 부착될 수 있다.
비드에 혼입된 독립체는 상기 기재한 바와 같은 임의의 다양한 기능성 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 올리고뉴클레오타이드는 P5, R1 및 R2 서열, 비절단성 5'아크릴다이트-P5, 절단성 5' 아크릴다이트-SS-P5, R1c, 시퀀싱 프라이머, 판독 프라이머, 보편적 프라이머, P5_U, 보편적 판독 프라이머, 및/또는 임의의 이들 프라이머에 대한 결합 부위 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 모방체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오타이드 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이들 올리고뉴클레오타이드는 추가적으로 또는 대안적으로 그들의 적용의 상이한 단계에서 차별적인 가공을 허용하기 위해, 상이하게 처리될 수 있는 뉴클레오타이드 또는 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 하나 이상의 기능성 서열은 특정 중합효소에 의해 처리되지 않는 뉴클레오타이드 또는 유사체를 포함할 수 있고, 따라서 해당 효소를 이용하는 처리 단계에서 복제되지 않는다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드의 기능성 서열 성분 중 하나 이상은, 예를 들어, 유라실 함유 뉴클레오타이드, 비천연 염기를 함유하는 뉴클레오타이드, 차단제 올리고뉴클레오타이드, 차단된 3' 말단, 3'ddCTP를 포함할 것이다. 인식될 바와 같이, 임의의 이들 독립체의 서열은 특정 용도에 따라서 프라이머 또는 프라이머 결합 부위로서 작용할 수 있다.
중합은 동시에 일어날 수 있다. 일부 경우에, 중합은 개시제 및/또는 촉진제에 의해, 전자기 복사에 의해, 온도 변화(예를 들어, 열의 첨가 또는 제거)에 의해, pH 변화에 의해, 다른 방법에 의해 및 이들의 조합에 의해 개시될 수 있다. 개시제는 중합 반응에서 사용되는 하나 이상의 전구체를 (예를 들어, 유리 라디칼의 생성을 통해) 활성화시킴으로써 중합 반응을 개시할 수 있는 종을 지칭할 수 있다. 촉진제는 중합 반응이 일어나는 속도를 가속화시킬 수 있는 종을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 촉진제는 (예를 들어, 유리 라디칼의 생성을 통해) 사용되는 개시제의 활성화 속도를 높여서, 그 다음에 (예를 들어, 유리 라디칼의 생성을 통해) 단량체를 활성화시키고, 따라서 중합 반응을 개시할 수 있다. 일부 경우에, 개시제의 더 빠른 활성화는 더 빠른 중합속도가 생기게 할 수 있다. 일부 경우에, 그렇지만, 가속화는 비화학적 수단, 예컨대 열적(예를 들어, 열의 첨가 및 제거) 수단, 다양한 유형의 방사성 수단(예를 들어, 가시광선, UV 광 등) 또는 임의의 다른 적합한 수단을 통해 달성될 수 있다. 그 다음에 경질 비드를 형성하도록 중합될 수 있는 분자 전구체를 함유하는 액적을 생성하기 위해, 에멀전 기법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 분자 전구체가 수용액에 첨가될 수 있다. 이어서, 수용액은 오일에 의해(예를 들어, 교반, 미세유체 액적 발생기 또는 기타 방법에 의해) 유화될 수 있다. 이어서, 분자 전구체는 비드를 형성하기 위해 유화된 액적에서 중합될 수 있다.
에멀전은, 예를 들어, 당업계에 공지된 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법, 예컨대 대규모 진탕, 대규모 교반, 유동 포커싱 및 마이크로시브에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Weizmann et al., Nature Methods, 2006, 3(7):545-550]; 웨이츠(Weitz) 등의 미국 특허 공개 제2012/0211084호 참조). 일부 경우에, 에멀전은 미세유체 장치를 이용하여 제조될 수 있다. 일부 경우에, 유중수 에멀전이 사용될 수 있다. 이들 에멀전은 비스 트리톡스 페그(bis krytox peg: BKP)와 같은 PEG-함유 화합물과 함께 크리톡스(Krytox) FSH와 같은 형광계면활성제를 혼입할 수 있다. 　　일부 경우에, 수중유 에멀전이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 다분산 에멀전이 형성될 수 있다. 일부 경우에, 단분산 에멀전이 형성될 수 있다. 일부 경우에, 단분산 에멀전은 미세유체 유동 초점 조정 장치에서 형성될 수 있다. (Gartecki et al., Applied Physics Letters, 2004, 85(13):2649-2651).
적어도 하나의 예에서, 비드를 제조하기 위한 미세유체 장치는 분자 전구체 및 오일을 함유하는 수용액과 같은 비혼화성 유체의 2 이상의 스트림을 조합하는 단일 교차 지점에서 교차되는 통로 세그먼트를 수용할 수 있다.
단일 교차 지점에서 두 비혼화성 유체를 조합하는 것은 유동 액적이 형성되게 할 수 있다. 형성된 유동 액적의 크기는 유체 교차점에 유입되는 유체 스트림의 유속, 두 유체의 특성 및 미세유체 통로의 크기에 의존할 수 있다. 유체 교차점을 나간 유동 액적의 형성 후에 중합의 개시는 경화된 비드가 유동 액적으로부터 형성되게 할 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 바와 같이 비드의 형성을 위한 그리고 별개의 액적으로 비드를 분할하기 위한 미세유체 장치, 통로 네트워크 및 액적을 생성하기 위한 시스템의 예는, 예를 들어 미국 특허 공개 제20150292988호에 기재되어 있으며, 이의 전문은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
개개의 분자 전구체, 올리고머 또는 중합체가 경화된 비드를 형성하도록 중합되기 시작할 때를 조작하기 위해, 개시제 및/또는 촉진제는 비드 형성 과정에서 상이한 시점에 첨가될 수 있다. 촉진제는 (예를 들어, 일부 경우에, 중합 개시제의 활성화를 통해) 중합 공정을 개시할 수 있고, 따라서 비드가 경화되는 시간을 감소시킬 수 있는 제제일 수 있다. 일부 경우에, 단일 촉진제 또는 복수의 촉진제가 중합을 위해 사용될 수 있다. 적합한 중합 반응을 달성함에 있어서 가속화의 주의 깊은 조율이 중요할 수 있다. 예를 들어, 가속화가 너무 빠르다면, 중량 및 과도한 연쇄 전달은 임의의 목적으로 하는 종의 불량한 겔 구조 및 낮은 부하를 야기할 수 있다. 가속화가 너무 느리다면, 고분자량 중합체는 중합체 뒤엉킴 및 고점도에 기인하여 트랩핑된 활성화 부위(예를 들어, 유리 라디칼)를 생성할 수 있다. 고점도는 비드 부하를 위해 의도된 종의 확산을 지연시켜서, 종의 낮은 부하 내지는 부하 없음을 야기할 수 있다. 촉진제 작용의 조율은, 예를 들어, 적절한 촉진제, 촉진제의 적절한 조합을 선택함으로써, 또는 촉진제를 조절할 수 있는 적절한 촉진제(들) 및 임의의 자극(예를 들어, 열, 전자기 복사(예를 들어, 광, UV 광), 다른 화학종 등)을 선택함으로써 달성될 수 있다. 개시제 작용의 조율은 또한 유사한 방식으로 달성될 수 있다.
촉진제는 수용성, 지용성일 수 있거나 또는 수용성과 지용성 둘 다일 수 있다. 예를 들어, 촉진제는 테트라메틸에틸렌다이아민(TMEDA 또는 TEMED), 다이메틸에틸렌다이아민, N,N,N,'N'-테트라메틸메탄다이아민, N,N'-다이몰폴리노메탄 또는 N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필)에틸렌다이아민일 수 있다. 아조계 개시제는 TEMED 및 APS의 부재 시 사용될 수 있으며, 열 기반 개시제로서 작용할 수 있다. 열 기반 개시제는 (예를 들어, 유리 라디칼의 생성을 통해) 열적으로 종을 활성화할 수 있고, 따라서, 개시제의 작용 속도는 개시제의 온도 및/또는 농도에 의해 조율될 수 있다. 중합 촉진제 또는 개시제는 포스폰산염, 설폰산염, 카복실산염, 하이드록실, 알부민 결합 모이어티, N-비닐기 및 인지질을 포함하는 작용기를 포함할 수 있다. 중합 촉진제 또는 개시제는 저분자량 단량체 화합물일 수 있다. 촉진제 또는 개시제는 a) 액적 생성 전에 오일에 첨가될 수 있거나, b) 액적 생성 후에 공정 중에 첨가될 수 있거나, c) 액적 생성 후에 배출구 저장소에 첨가될 수 있거나, 또는 d) 이들의 조합일 수 있다.
중합은 또한 전자기 복사에 의해 개시될 수 있다. 단량체, 올리고머 또는 중합체의 특정 유형은 광 민감성 특성을 포함할 수 있다. 따라서, 중합은 이러한 단량체, 올리고머, 또는 중합체를 UV 광, 가시광선, 증감제와 조합된 UV 광, 증감제와 조합된 가시광선 또는 이들의 조합에 노출시킴으로써 개시될 수 있다. 증감제의 예는 리보플라빈일 수 있다.
완전히 중합 또는 경화시키기 위한 비드에 대한 시간은 비드의 크기, 촉진제가 첨가될 수 있는지의 여부, 촉진제가 첨가될 수 있는 때, 개시제의 유형, 전자기 복사가 적용될 수 있는 때, 용액의 온도, 중합체 조성, 중합체 농도 및 다른 적절한 매개변수에 따라서 다를 수 있다. 예를 들어, 중합은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20분 후에 완료될 수 있다. 중합은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20분 이상 후에 완료될 수 있다. 중합은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20분 미만에 완료될 수 있다.
비드는 연속적 상 교환에 의해 에멀전(예를 들어, 겔-물-오일)으로부터 회수될 수 있다. 과량의 수성 유체는 에멀전(예를 들어, 겔-물-오일)에 첨가될 수 있고, 경화된 비드에 침강이 실시될 수 있되, 비드는 응집될 수 있고, 과량의 오일을 함유하는 상청액은 제거될 수 있다. 과량의 수성 유체를 첨가하는 이런 과정 다음에 침강 및 과량의 오일의 제거는 연속상 오일에 대해 비드가 수성 완충제의 주어진 순도에서 현탁될 때까지 반복될 수 있다. 수성 완충제의 순도는 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(v/v)일 수 있다. 수성 완충제의 순도는 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상(v/v)일 수 있다. 수성 완충제의 순도는 약 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%(v/v) 미만일 수 있다. 침강 단계는 약 2, 3, 4 또는 5회 반복될 수 있다. 침강 단계는 약 2, 3, 4, 5회 이상 반복될 수 있다. 침강 단계는 약 2, 3, 4 또는 5회 미만으로 반복될 수 있다. 일부 경우에, 상청액의 침강 및 제거는 또한 비반응 출발 물질을 제거할 수 있다.
액적 발생기의 예는 단일 유동 초점 조절 장치, 병행 흐름 초점 조절 장치, 및 마이크로시브 막, 예컨대 나노미 비.브이(Nanomi B.V.)에 의해 사용되는 것 및 기타를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 미세유체 장치는 액적을 생성하기 위해 사용된다.
바코드 및 무작위 N- 량체 (도입)
특정 적용 분야, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 라이브러리 시퀀싱은 서열을 동정하기 위해 그리고, 예를 들어, 시퀀싱된 단편으로부터 더 큰 서열을 조립하기 위해 독특한 식별자("바코드")에 의존할 수 있다. 따라서, 시퀀싱 전에 폴리뉴클레오타이드 단편에 바코드를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 적용분야의 경우에, 이러한 바코드는 전형적으로 샘플 서열에 부착된 뉴클레오타이드의 상대적으로 짧은 서열을 포함하며, 바코드 서열은 그의 위치 또는 서열 요소에 의해 알려지거나 또는 식별 가능할 수 있다. 일부 경우에, 독특한 식별자는 샘플 지표화에 유용할 수 있다. 일부 경우에, 그렇지만, 바코드가 또한 다른 내용에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 바코드는 가공 내내 샘플을 추적하는 작용을 하고(예를 들어, 실험실 내 샘플의 위치, 복수의 반응 용기 내 샘플의 위치 등); 제조 정보를 제공하며; 시간에 따른(사용을 위한 바코드 제조로부터) 그리고 필드 내에서의 바코드 성능을 추적하고; 필드 내에서 시간에 따른 바코드 로트 성능을 추적하며; 시퀀싱 동안 산물 정보를 제공하고, 산물과 관련된 바코드가 시퀀싱 동안 판독될 때 자동화된 프로토콜(예를 들어, 컴퓨터의 도움으로 개시 및 실행된 자동화된 프로토콜)을 촉발할 가능성이 있고; 문제가 있는 바코드 서열 또는 산물 로트를 추적 및 고장 고치기(troubleshoot)하며; 바코드를 수반하는 반응에서 분자 촉발자 및 이들의 조합으로서 작용할 수 있다. 특히 바람직한 양상에서, 상기 시사한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바코드 서열 세그먼트는 2개의 별개의 결정된 핵산 서열 간의 결합 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이 결합 정보는, 예를 들어, 통상적인 샘플에 대한 결합, 통상적인 반응 용기, 예를 들어, 웰 또는 파티션, 또는 심지어 통상적인 시작 핵산 분자를 포함할 수 있다. 특히, 특정 샘플 성분 또는 주어진 반응 용적 내의 샘플 성분의 서브세트에 통상적인 바코드를 부착함으로써, 해당 바코드를 보유하는 얻어진 서열은 해당 반응 용적에 기인할 수 있다. 결국, 샘플이 그의 본래 샘플, 그것이 후속적으로 노출되는 가공 단계, 또는 개개 분자를 기준으로 해당 반응 용적에 할당되는 경우, 해당 반응 용적으로부터 유래된 바와 같은 얻어진 서열을 더 양호하게 동정할 수 있다.
바코드는 벌크 합성된 폴리뉴클레오타이드 바코드, 무작위 합성된 바코드 서열, 마이크로어레이 기반 바코드 합성, 천연 뉴클레오타이드, N-량체, 무작위 N-량체, 위 무작위 N-량체와의 부분적 상보체 또는 이들의 조합을 포함하는 다양한 상이한 형식으로부터 생성될 수 있다. 바코드의 합성은 본 명세서뿐만 아니라, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20140228255호에 기재되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 그의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함된다.
상기 기재한 바와 같이, 독특한 식별자로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드 혼입 바코드 서열 세그먼트는 또한 추가적인 서열 세그먼트를 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 서열 세그먼트는 프라이머 서열, 프라이머 어닐링 부위 서열, 고정 서열, 또는 후속적 가공에 유용한 기타 인식 또는 결합 서열, 예를 들어, 시퀀싱 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 바코드가 부착되는 샘플의 시퀀싱에서 사용하기 위한 프라이머 결합 부위와 같은 기능성 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 서열을 함유하는 바코드 내에 포함되는 바와 같은 특정 기능성 서열에 대한 언급은 또한 상보성 복제 시 특정 기재된 서열을 수득하도록 임의의 이러한 서열에 대한 상보체의 포함을 생각한다.
일부 예에서, 바코드 또는 부분적 바코드는 올리고뉴클레오타이드 어레이, 예컨대 마이크로어레이 또는 비드 어레이로부터 얻어지거나 또는 이들의 사용에 적합한 올리고뉴클레오타이드로부터 생성될 수 있다. 이러한 경우에, (예를 들어, 어레이에 올리고뉴클레오타이드를 고정시키는 절단성 결합 또는 모이어티(예컨대 광절단성, 화학적으로 절단성 또는 달리 절단성 결합)를 이용하여) 유리 올리고뉴클레오타이드가 바코드 또는 부분적 바코드로서 작용할 수 있도록, 마이크로어레이의 올리고뉴클레오타이드는 절단될 수 있다. 일부 경우에, 바코드 또는 부분적 바코드는 어레이로부터 얻어지면, 알려진 서열을 가진다. 어레이로부터 얻어진 것을 포함하는 알려진 서열의 사용은, 예를 들어, 알려지지 않은 서열의 바코드와 관련된 시퀀싱 오류를 회피하는 데 유리할 수 있다. 마이크로어레이는 바코드 또는 부분적 바코드로서 사용될 수 있는 적어도 약 10,000,000, 적어도 약 1,000,000, 적어도 약 900,000, 적어도 약 800,000, 적어도 약 700,000, 적어도 약 600,000, 적어도 약 500,000, 적어도 약 400,000, 적어도 약 300,000, 적어도 약 200,000, 적어도 약 100,000, 적어도 약 50,000, 적어도 약 10,000, 적어도 약 1,000, 적어도 약 100 또는 적어도 약 10개의 상이한 서열을 제공할 수 있다.
본 명세서에 제공된 비드는 독특한 식별자(예를 들어, 바코드)로서 거동할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열에 부착될 수 있다. 종종, 본 명세서에 제공된 비드 집단은 바코드의 다양한 라이브러리를 포함하되, 각각의 비드는 단일 바코드 서열의 다중 복제물에 부착된다. 일부 경우에, 바코드 서열은 알려진 서열을 이용하여 사전 합성 및/또는 설계된다. 일부 경우에, 라이브러리 내에서 각각의 비드는 독특한 바코드 서열에 부착된다. 일부 경우에, 복수의 비드는 그들에 부착된 동일한 바코드 서열을 가질 것이다. 예를 들어, 일부 경우에 라이브러리 내 비드의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 100%는 라이브러리 내 상이한 비드에 부착된 바코드 서열과 동일한 바코드 서열에 부착된다. 때때로, 비드의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 25% 또는 30%는 동일한 바코드 서열에 부착된다.
바코드 서열의 길이는 적용분야에 따라서 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열은 길이로 약 2 내지 약 500개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 2 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 2 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 2 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 6 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 또는 길이로 약 4 내지 16개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열은 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 바코드 서열은 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 5000 또는 10000개 초과의 뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 바코드 서열은 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 또는 1000개 미만의 뉴클레오타이드이다.
하나 이상의 바코드가 특정 비드 내로 도입되도록 바코드는 비드에 부하될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 동일한 세트의 바코드를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 각각의 비드는 상이한 세트의 바코드를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 각각의 비드는 동일한 바코드 세트를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 각각의 비드는 상이한 바코드 세트를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 비드는 하류 공정에서 샘플(예를 들어, 게놈 샘플)을 프라이밍할 수 있는 무작위, 위-무작위 또는 표적화된 N-량체인 올리고뉴클레오타이드 서열에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 동일한 n-량체 서열은 단일 비드 또는 비드 집단에 부착되는 올리고뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있다. 이는 표적화된 프라이밍 방법에 대한 경우, 예를 들어, 프라이머가 더 큰 표적 서열 내에서 특정 서열 세그먼트를 표적화하도록 선택되는 경우일 수 있다. 다른 경우에, 본 명세서의 비드 집단 내에서 각각의 비드는 특히 이러한 무작위 n-량체 서열이 샘플 핵산의 상이한 부분에 대해 무작위로 프라이밍될 것이기 때문에, 주형 분자에 대해 이들 프라이머의 샘플링을 다양화하도록 크고 다양한 수의 N-량체 서열에 부착된다.
N-량체의 길이는 다를 수 있다. 일부 경우에, N-량체(예를 들어, 무작위 N-량체, 위-무작위 N-량체 또는 표적화된 N-량체)는 길이로 약 2 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 2 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 2 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 또는 길이로 약 5 내지 약 15개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, N-량체(예를 들어, 무작위 N-량체, 위-무작위 N-량체 또는 표적화된 N-량체)는 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, N-량체(예를 들어, 무작위 N-량체, 위-무작위 N-량체, 또는 표적화된 N-량체)는 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 5000 또는 10000개 초과의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 경우에, N-량체(예를 들어, 무작위 N-량체, 위-무작위 N-량체 또는 표적화된 N-량체)는 길이로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 또는 1000개 미만의 뉴클레오타이드일 수 있다.
N-량체(무작위 N-량체를 포함함)는 특정 샘플 유형을 프라이밍하기 위해 공학 처리될 수 있다. 예를 들어, 각각의 N-량체 길이가 각각 상이한 유형의 샘플 핵산 또는 각각 상이한 영역의 샘플 핵산에 대응하도록, 상이한 길이의 N-량체는 상이한 유형의 샘플 핵산 또는 상이한 영역의 샘플 핵산에 대해 생성될 수 있다. 예를 들어, 하나의 길이의 N-량체는 하나의 종의 게놈(예를 들어, 인간 게놈)으로부터 유래된 샘플 핵산에 대해 생성될 수 있고, 다른 길이의 N-량체는 다른 종(예를 들어, 효모 게놈)으로부터 유래된 샘플 핵산에 대해 생성될 수 있다. 다른 예에서, 하나의 길이의 N-량체는 게놈의 특정 서열 영역을 포함하는 샘플 핵산에 대해 생성될 수 있고, 다른 길이의 N-량체는 게놈의 다른 서열 영역을 포함하는 샘플 핵산에 대해 생성될 수 있다. 게다가, N-량체 길이에 추가로 또는 대안으로서, N-량체의 염기 조성(예를 들어, N-량체의 GC 함량)은 또한 특정 유형 또는 영역의 샘플 핵산에 대응하도록 공학 처리될 수 있다. 염기 함량은, 예를 들어, 특정 유형의 샘플 핵산에서 또는 특정 영역의 샘플 핵산에서 다를 수 있고, 따라서, 상이한 염기 함량의 N-량체는 상이한 샘플 유형의 핵산 또는 상이한 영역의 샘플 핵산을 프라이밍하는 데 유용할 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 비드 집단은 특정 샘플 유형 또는 특정 샘플 서열 영역에 대해 공학 처리된 N-량체에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, N-량체 길이 및 함량에 대해 비드의 혼합된 집단(예를 들어, 하나의 샘플 유형 또는 서열 영역에 대해 공학 처리된 N-량체를 포함하는 비드와 다른 샘플 유형 또는 서열 영역에 대해 공학 처리된 다른 N-량체를 포함하는 비드의 혼합물)이 생성될 수 있다. 일부 경우에, 비드 중 하나 이상이 복수의 샘플 유형 또는 서열 영역에 대해 공학 처리된 N-량체의 혼합 집단을 포함할 수 있는 경우, 비드 집단이 생성될 수 있다.
앞서 주목한 바와 같이, 일부 경우에, 무작위이든 또는 표적화되든 N-량체는 후속 가공 단계에서 개선된 성능을 갖는 프라이머를 제공하기 위해 뉴클레오타이드 유사체, 모방체 또는 비천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, n-량체 서열의 상대적 프라이밍 효율을 향상시키기 위해 열 순환이 실시될 때, 예를 들어 증폭 동안 상이한 용융/어닐링 프로파일을 갖는 N-량체 프라이머를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 뉴클레오타이드 유사체 또는 비천연 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드를 포함하는 대응하는 프라이머에 비해 프라이머 서열의 용융 온도 프로파일을 변경시키기 위해 N-량체 프라이머 서열에 혼입될 수 있다. 특정 경우에, 프라이머 서열, 예컨대 본 명세서에 기재된 N-량체 서열은 주형 서열에 혼성화될 뿐만 아니라 일반적으로 향상된 이중가닥 안정성을 제공할 때 프라이머에 대해 승온 안정성을 제공하기 위해 서열 내의 하나 이상의 위치에서 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 예를 들어, LNA 염기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 해당되는 더 약한 결합 염기를 더 강한 결합 LNA 유사체로 대체하기 위해 프라이머 합성에서 A 또는 T 대신에 LNA 뉴클레오타이드가 사용된다. 향상된 혼성 프라이머 서열을 제공함으로써, 이러한 프라이머를 이용하여 더 큰 효율의 증폭 공정을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 상이한 온도 체제 내에서 작동할 수 있다.
상기 기재한 올리고뉴클레오타이드에 다른 변형이 또한 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 임의의 존재하는 엑소뉴클레아제 활성을 통해, 올리고뉴클레오타이드의 임의의 분해를 방지 또는 감소시키기 위해 보호된 말단 또는 다른 영역이 제공될 수 있다. 일 예에서, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 서열 내의 하나 이상의 위치에서, 예를 들어, 3' 및/또는 5' 말단 위치에 인접 또는 근접하여 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드 유사체가 제공될 수 있다. 이들 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드는 전형적으로, 예를 들어, 3'-5' 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 상에서 뉴클레아제 활성을 감소 또는 제거하기 위해 올리고뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드 간 결합에서 비연결 산소 대신 황 기를 제공한다. 일반적으로, 포스포로티오에이트 유사체는, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3'-5' 및/또는 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공하는 것을 포함하여, 포스포로티오에이트 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 대한 엑소 및/또는 엔도뉴클레아제 저항을 부여하는 데 유용한다. 따라서, 일부 양상에서, 이들 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합은 올리고뉴클레오타이드의 3' 또는 5' 말단 중 하나에서 마지막 5 내지 10개의 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나 이상에 있을 것이며, 바람직하게는 3'-5' 또는 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 대한 보호를 제공하기 위해 마지막 3' 또는 5' 말단 뉴클레오타이드 간 결합 중 하나 이상 및 마지막 5' 말단의 뉴클레오타이드 간 결합에 대해 두 번째를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드 내의 다른 위치는 또한 마찬가지로 포스포로티오에이트 결합이 제공될 수 있다. 바코드 서열(및 임의의 관련된 기능성 서열)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 상에서 이러한 보호를 제공하는 것에 추가로, 상기 기재된 변형은 또한 본 명세서에 기재된 차단 서열과 관련하여, 예를 들어, 차단 서열 내에, 예를 들어, 3' 및/또는 5' 말단 위치뿐만 아니라 잠재적으로 올리고뉴클레오타이드 내의 다른 위치에 인접 또는 근접하여 포스포로티오에이트 유사체를 혼입하는 데 유용하다.
사전 기능화된 비드에 대한 내용물의 부착
올리고뉴클레오타이드에 의해 기능화된 비드를 포함하는 본 명세서에 기재된 비드에 다양한 내용물이 부착될 수 있다. 종종, 올리고뉴클레오타이드, 특히 목적으로 하는 서열(예를 들어, 바코드, 무작위 N-량체)을 지니는 올리고뉴클레오타이드가 부착된다. 본 명세서에 제공된 다수의 방법에서, 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 연장 반응을 통해 비드에 부착된다. 프라이머에 의해 사전 기능화된 비드는 올리고뉴클레오타이드 주형과 접촉될 수 있다. 이어서, 올리고뉴클레오타이드 주형의 상보체의 복제물이 프라이머에 부착되도록 프라이머가 연장되게 증폭 반응이 수행될 수 있다. 다른 부착 방법, 예컨대 결찰 반응이 또한 가능하다.
일부 경우에, 상이한 서열(또는 동일한 서열)을 지니는 올리고뉴클레오타이드가 별개의 단계에서 비드에 부착된다. 예를 들어, 일부 경우에, 각각의 비드는 그에 대해 제1 바코드 서열의 다중 복제물을 갖도록 독특한 서열을 지니는 바코드가 비드에 부착된다. 제2 단계에서, 비드는 제2 서열에 의해 추가로 기능화될 수 있다. 제1 서열과 제2 서열의 조합은 비드에 부착되는 독특한 바코드 또는 독특한 식별자로서 작용할 수 있다. 바코드 서열로서 거동하는 추가적인 서열을 첨가하도록 상기 공정이 계속될 수 있다(일부 경우에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 초과의 바코드 서열이 각각의 비드에 순차적으로 첨가된다). 비드는 또한, 예를 들어, 하류의 전체 게놈 증폭 반응에 대해 무작위 프라이머로서 작용할 수 있는 추가로 기능화된 무작위 N-량체일 수 있다.
일부 경우에, 특정 올리고뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 바코드 서열)에 의한 기능화 후에, 비드는 풀링되고, 이어서, 더 큰 집단의 무작위 N량체와 접촉된 다음, 비드에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 특히 비드가 무작위 N량체의 부착 전에 풀링될 때, 각각의 비드는 그것에 하나의 바코드 서열이 부착되지만, (종종 다중 복제물로서), 다수의 상이한 무작위 N량체 서열이 그것에 부착된다.
평균적으로 바코드와 같은 하나 이하의 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열에 비드가 부착되도록 올리고뉴클레오타이드를 비드에 부착하기 위해 한계희석법이 사용될 수 있다. 종종, 이 공정에서 비드는 이미 특정 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 프라이머에 의해 기능화된다. 예를 들어, 프라이머(예를 들어, 보편적 프라이머) 및 복수의 주형 올리고뉴클레오타이드에 의해 기능화된 비드는 종종 높은 비의 비드: 주형 올리고뉴클레오타이드로 조합하여 비드와 주형 올리고뉴클레오타이드 혼합물을 생성할 수 이다. 이어서, 혼합물은, 예컨대 플레이트 내에서 벌크 에멀전화 공정, 플레이트 내의 에멀전에 의해, 또는 미세유체 장치, 예를 들어, 미세유체 액적 발생기에 의해 복수의 파티션(예를 들어, 유중수 에멀전 내의 수성 액적)으로 분할될 수 있다. 일부 경우에, 평균적으로 각각의 파티션은 하나 이하의 주형 올리고뉴클레오타이드를 포함하도록 혼합물은 복수의 파티션으로 분할될 수 있다.
바코드는 바코딩될 비드 당 기대 또는 예측되는 바코드의 비로 비드에 부하될 수 있다. 일부 경우에, 약 0.0001, 0.001, 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 100000000, 500000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개 바코드의 비가 비드마다 부하되도록 바코드가 부하된다. 일부 경우에, 0.0001, 0.001, 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 30000000, 40000000, 50000000, 60000000, 70000000, 80000000, 90000000, 100000000, 200000000, 300000000, 400000000, 500000000, 600000000, 700000000, 800000000, 900000000, 1000000000, 2000000000, 3000000000, 4000000000, 5000000000, 6000000000, 7000000000, 8000000000, 9000000000, 10000000000, 20000000000, 30000000000, 40000000000, 50000000000, 60000000000, 70000000000, 80000000000, 90000000000, 100000000000개 이상의 바코드의 비가 비드마다 부하되도록 바코드가 부하된다. 일부 경우에, 약 0.0001, 0.0002, 0.0003, 0.0004, 0.0005, 0.0006, 0.0007, 0.0008, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 100000000, 500000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개 미만의 바코드 비가 비드마다 부하되도록 바코드가 부하된다.
본 명세서에 기재된 것을 포함하는 비드(예를 들어, 실질적으로 용해 가능한 비드, 일부 경우에, 환원제에 의해 실질적으로 환원 가능한 비드)는 복수의 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결될 수 있되, 적어도 올리고뉴클레오타이드의 서브세트는 불변 영역 또는 도메인(예를 들어, 바코드 서열, 바코드 도메인, 통상적인 바코드 도메인, 또는 서브세트의 올리고뉴클레오타이드 중에서 일정한 기타 서열) 및 가변 영역 또는 도메인(예를 들어, 무작위 서열, 무작위 N-량체, 또는 서브세트의 올리고뉴클레오타이드 중에서 가변적인 다른 서열)을 포함한다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 비드에 방출 가능하게 결합될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 공유 및 비공유적 결합 유형을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 임의의 적합한 결합을 통해 비드에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 절단 가능한 결합, 예를 들어, 화학적으로 절단 가능한 결합(예를 들어, 이황화 결합), 광절단성 결합 또는 열적으로 절단 가능한 결합을 통해 비드에 공유적으로 연결될 수 있다. 비드는 불변 영역 또는 도메인 및 가변 영역 또는 도메인을 포함하는 약 또는 적어도 약 1, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 100000000, 500000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000, 100000000000, 500000000000 또는 1000000000000개 초과의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 동일한 불변 영역 또는 도메인(예를 들어, 동일한 바코드 서열, 동일한 바코드 도메인, 통상적인 도메인 등)을 각각 포함할 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 상이한 서열을 지니는 가변 도메인을 각각 포함할 수 있다. 일부 경우에, 동일한 불변 영역(또는 통상적인 도메인)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 백분율은 적어도 약 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있다. 일부 경우에, 상이한 서열을 지니는 가변 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 백분율은 적어도 약 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있다. 일부 경우에, 상이한 뉴클레오타이드 서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드(가변 및 불변 영역 또는 도메인을 포함하는 것을 포함)를 포함하는 복수의 비드 내 비드의 백분율은 적어도 약 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 이상의 추가적인 서열, 예를 들어 프라이머 결합 부위(예를 들어, 시퀀싱 프라이머 결합 부위), 보편적 프라이머 서열(예를 들어, 이러한 길이의 서열 내에 존재하는 이러한 좌위의 확률에 기반하여, 특정 길이의 임의의 핵산 단편에 대해 하나 이상의 좌위에 혼상화하고 프라이밍하는 것으로 예상되는 프라이머 서열) 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 추가적인 서열 유형을 포함하는 임의의 다른 목적으로 하는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 비드 라이브러리(예를 들어, 바코딩된 비드 라이브러리)를 형성하기 위해 복수의 비드가 생성될 수 있다. 일부 경우에, 통상적인 도메인(예를 들어, 통상적인 바코드 도메인) 또는 영역의 서열은 적어도 복수의 개개 비드의 서브세트 사이에서 변할 수 있다. 예를 들어, 복수의 비드의 개개 비드 사이의 통상적인 도메인 또는 영역의 서열은 2개 이상, 10개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 500개 이상, 1000개 이상, 5000개 이상, 10000개 이상, 50000개 이상, 100000개 이상, 500000개 이상, 1000000개 이상, 5000000개 이상, 10000000개 이상, 50000000개 이상, 100000000개 이상, 500000000개 이상, 1000000000개 이상, 5000000000개 이상, 10000000000개 이상, 50000000000개 이상 또는 100000000000개 이상의 복수의 비드 간에 상이할 수 있다. 일부 경우에, 복수의 비드의 각각의 비드는 상이한 통상적인 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상이한 통상적인 도메인 또는 영역을 포함하는 복수의 비드 중 개개 비드의 백분율은 적어도 약 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있다. 일부 경우에, 복수의 비드는 복수의 상이한 비드에 결합된 적어도 약 2, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 100000000, 500000000개 이상의 상이한 통상적인 도메인을 포함할 수 있다.
한계 희석법에 대한 대안으로서(예를 들어, 에멀전의 액적을 통해), 비드에 올리고뉴클레오타이드를 부착하기 위해 다른 분할 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 플레이트의 웰이 사용될 수 있다. 프라이머(예를 들어, 아크릴다이트 및 선택적으로 이황화 결합을 통해 비드에 연결된 프라이머인 P5)를 포함하는 비드는 플레이트의 웰에서 주형 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 바코드 서열을 포함하는 주형 올리고뉴클레오타이드) 및 증폭 시약과 조합될 수 있다. 각각의 웰은 독특한 주형 바코드 서열의 하나 이상의 복제물 및 하나 이상의 비드를 포함할 수 있다. 비드가 올리고뉴클레오타이드 주형에 대해 상보성인 서열을 지니는 올리고뉴클레오타이드를 포함하도록 플레이트의 열 순환은 프라이머에 대한 주형 올리고뉴클레오타이드의 혼성화를 통해 프라이머를 연장시킨다. 열 순환은 모든 프라이머가 연장될 때까지 목적으로 하는 수의 순환(예를 들어, 적어도 약 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50회 이상의 순환) 동안 계속될 수 있다.
열 순환의 완료 시, 비드는 통상적인 용기에 풀링되고, (예를 들어, 원심분리, 자기 분리 등을 통해) 세척되고 나서, 상보성 가닥이 변성되고, 다시 세척된 다음, 이어서, 원한다면 벌크 가공의 추가적인 라운드가 실시된다. 예를 들어, 무작위 N-량체 서열은 한계 희석법에 대해 상기 기재한 프라이머 연장 방법을 이용하여 비드 결합 올리고뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다.
PCR 시약은 임의의 적합한 PCR 시약을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드 산물이 티민 함유 뉴클레오타이드보다 유라실 함유 뉴클레오타이드를 포함하도록, dUTP는 프라이머 연장 또는 다른 증폭 반응 동안 dTTP로 치환될 수 있다. 보편적 서열의 이런 유라실-함유 부문은 이후에 원치않는 증폭 산물을 이동시키기 위해 유라실-함유 주형을 받아들이거나 또는 처리하지 않는 중합효소와 함께 사용될 수 있다.
증폭 시약은 보편적 프라이머, 보편적 프라이머 결합 부위, 시퀀싱 프라이머, 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 보편적 판독 프라이머, 보편적 판독 결합 부위, 또는 시퀀싱 장치, 예를 들어 일루미나 시퀀서, 이온 토렌트 시퀀서 등과 양립 가능한 다른 프라이머를 포함할 수 있다. 증폭 시약은 P5, 비 절단성 5'아크릴다이트-P5, 절단성 5' 아크릴다이트-SS-P5, R1c, 바이오틴 R1c, 시퀀싱 프라이머, 판독 프라이머, P5_보편적, P5_U, 52-BioR1-rc, 무작위 N-량체 서열, 보편적 판독 프라이머 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 변형된 뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA), LNA 뉴클레오타이드, 유라실 함유 뉴클레오타이드, 비천연 염기를 함유하는 뉴클레오타이드, 차단제 올리고뉴클레오타이드, 차단된 3' 말단, 3'ddCTP를 함유할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 경우에 각각의 비드가 평균적으로 1개 미만의 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열, 2개 미만의 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열, 3개 미만의 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열, 4개 미만의 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열, 5개 미만의 독특한 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 10개 미만의 올리고뉴클레오타이드 서열과 함께 분할되도록 올리고뉴클레오타이드 포함 바코드가 분할된다. 따라서, 일부 경우에, 비드의 분획은 올리고뉴클레오타이드 주형을 함유하지 않고, 따라서 증폭된 올리고뉴클레오타이드를 함유할 수 없다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드를 포함하지 않는 비드로부터 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 분리하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 이는 포획 모이어티를 이용하여 행해질 수 있다.
일부 실시형태에서, 바코드를 함유하지 않을 수도 있는 비드로부터 바코드를 함유하는 비드를 분리하기 위해 자기 분리와 같은 단리 방법에 의해 포획 모이어티가 사용될 수 있다. 그렇게 해서, 일부 경우에, 증폭 시약은 프라이머 또는 프로브에 부착된 포획 모이어티를 포함할 수 있다. 포획 모이어티는 비드에 대한 프라이머 및 하류의 증폭 산물의 부착을 확인하기 위해 비표지 비드로부터 표지된 비드의 분류를 허용할 수 있다. 예시적인 포획 모이어티는 바이오틴, 스트렙타비딘, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), cMyc, HA 등을 포함한다. 포획 모이어티는 형광 표지 또는 자기 표지일 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 포획 모이어티는 포획 모이어티의 다수 분자, 예를 들어, 바이오틴, 스트렙타비딘 등의 다수 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프라이머가 증폭 산물과 혼성화하고, 증폭 반응의 추가적인 주기 동안 포획 모이어티가 추가적인 증폭된 올리고뉴클레오타이드에 통합되도록, 증폭 반응은 (본 명세서의 다른 곳에서 기재되는 바와 같은) 포획 모이어티에 부착되는 포획 프라이머를 사용하게 할 수 있다. 다른 경우에, 포획 모이어티가 증폭된 올리고뉴클레오타이드와 회합되도록, 포획 모이어티를 포함하는 프로브는 증폭 반응의 완료 후에 증폭된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화될 수 있다.
포획 모이어티가 분리 동안 그의 결합쌍과 결합할 수 있도록 포획 모이어티는 결합쌍의 구성원일 수 있다. 예를 들어, 결합쌍의 구성원(예를 들어, 바이오틴)인 포획 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 비드가 생성될 수 있다. 두 결합쌍 구성원이 얻어진 혼합물에서 결합되도록 비드는 결합쌍의 다른 구성원(예를 들어, 스트렙타비딘)을 포함하는 포획 비드와 혼합될 수 있다. 이어서, 비드-포획 비드 복합체는, 예를 들어 원심분리 및 자기 분리를 포함하는(예를 들어, 포획 비드가 자기 비드인 경우를 포함) 임의의 적합한 수단을 이용하여 혼합물의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다.
III. 바코드 라이브러리
비드는 하나 이상의 부착된 바코드 서열을 함유할 수 있다. 단일 비드에 부착된 바코드 서열은 동일 또는 상이할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 약 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 100000000, 500000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개의 동일한 바코드 서열에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 약 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 100000000, 500000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개의 상이한 바코드 서열일 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 적어도 약 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 30000000, 40000000, 50000000, 60000000, 70000000, 80000000, 90000000, 100000000, 200000000, 300000000, 400000000, 500000000, 600000000, 700000000, 800000000, 900000000, 1000000000, 2000000000, 3000000000, 4000000000, 5000000000, 6000000000, 7000000000, 8000000000, 9000000000, 10000000000, 20000000000, 30000000000, 40000000000, 50000000000, 60000000000, 70000000000, 80000000000, 90000000000, 100000000000개 이상의 동일한 바코드 서열에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 적어도 약 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 30000000, 40000000, 50000000, 60000000, 70000000, 80000000, 90000000, 100000000, 200000000, 300000000, 400000000, 500000000, 600000000, 700000000, 800000000, 900000000, 1000000000, 2000000000, 3000000000, 4000000000, 5000000000, 6000000000, 7000000000, 8000000000, 9000000000, 10000000000, 20000000000, 30000000000, 40000000000, 50000000000, 60000000000, 70000000000, 80000000000, 90000000000, 100000000000개 이상의 상이한 바코드 서열에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개 미만의 동일한 바코드 서열에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개 미만의 상이한 바코드 서열에 부착될 수 있다.
개개 바코드 라이브러리는 하나 이상의 바코딩된 비드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 개개 바코드 라이브러리는 약 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 100000000, 500000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개의 개개 바코딩된 비드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 라이브러리는 적어도 약 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 30000000, 40000000, 50000000, 60000000, 70000000, 80000000, 90000000, 100000000, 200000000, 300000000, 400000000, 500000000, 600000000, 700000000, 800000000, 900000000, 1000000000, 2000000000, 3000000000, 4000000000, 5000000000, 6000000000, 7000000000, 8000000000, 9000000000, 10000000000, 20000000000, 30000000000, 40000000000, 50000000000, 60000000000, 70000000000, 80000000000, 90000000000, 100000000000개 이상의 개개 바코딩된 비드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 라이브러리는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000, 1000000000, 5000000000, 10000000000, 50000000000 또는 100000000000개 미만의 개개 바코딩된 비드를 포함할 수 있다. 라이브러리 내의 바코딩된 비드는 동일한 서열 또는 상이한 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 비드는 독특한 바코드 서열을 가질 수 있다. 그러나, 바코드 라이브러리 내에서 독특한 바코드 서열 내의 비드 수는 조합적 제한에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 4가지 상이한 뉴클레오타이드를 이용하여, 바코드가 길이로 12개의 뉴클레오타이드라면, 독특한 작제물의 수는 412 = 16777216개의 독특한 작제물로 제한될 수 있다. 바코드 라이브러리는 1677216개보다 더 많은 비드를 포함할 수 있기 때문에, 동일한 바코드의 다수 복제물을 지니는 일부 라이브러리가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 주어진 라이브러리 내에서 동일한 바코드의 다수 복제물의 백분율은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50%일 수 있다. 일부 경우에, 주어진 라이브러리 내에서 동일한 바코드의 다수 복제물의 백분율은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 이상일 수 있다. 일부 경우에, 주어진 라이브러리 내에서 동일한 바코드의 다수 복제물의 백분율은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40% 또는 50% 미만일 수 있다.
일부 실시형태에서, 각각의 비드는 다수의 상이한 무작위 N-량체를 제외하고 하나의 독특한 바코드 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 비드는 하나 이상의 상이한 무작위 N-량체를 가질 수 있다. 또한, 바코드 라이브러리 내에서 상이한 무작위 N-량체가 있는 비드의 수는 조합적 제한에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 4가지 상이한 뉴클레오타이드를 이용하여, N-량체 서열이 길이로 12개의 뉴클레오타이드라면, 상이한 작제물의 수는 412 = 16777216개의 상이한 작제물로 제한될 수 있다. 바코드 라이브러리는 16777216개보다 더 많은 비드를 포함할 수 있기 때문에, 동일한 N-량체 서열의 다수 복제물을 지니는 일부 라이브러리가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 주어진 라이브러리 내에서 동일한 N-량체 서열의 다수 복제물의 백분율은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50%일 수 있다. 일부 경우에, 주어진 라이브러리 내에서 동일한 N-량체 서열의 다수 복제물의 백분율은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 이상일 수 있다. 일부 경우에, 주어진 라이브러리 내에서 동일한 N-량체 서열의 다수 복제물의 백분율은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40% 또는 50% 미만일 수 있다.
일부 실시형태에서, 바코드 내의 독특한 식별자 서열은 각각의 비드 내의 각각의 프라이머와 상이할 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열 내의 독특한 식별자 서열은 각각의 비드 내의 각각의 프라이머와 동일할 수 있다.
IV. 샘플
샘플 유형
본 개시내용의 방법, 조성물, 장치 및 키트는 임의의 적합한 샘플 또는 종과 함께 사용될 수 있다. 샘플(예를 들어, 샘플 물질, 샘플 물질의 성분, 샘플 물질의 단편 등) 또는 종은, 예를 들어, 샘플 가공에서 사용되는 임의의 물질, 예컨대 시약 또는 분석물일 수 있다. 예시적인 샘플은 전체 세포, 염색체, 폴리뉴클레오타이드, 유기 분자, 단백질, 핵산, 폴리펩타이드, 탄수화물, 당류, 당, 지질, 효소, 제한 효소, 리가제, 중합효소, 바코드(예를 들어, 바코드 서열, 핵산 바코드 서열, 바코드 분자를 포함함), 어댑터, 소분자, 항체, 형광단, 데옥시뉴클레오타이드 삼인산염(dNTP), 다이데옥시뉴클레오타이드 삼인산염(ddNTP), 완충제, 산성 용액, 염기성 용액, 온도-민감성 효소, pH-민감성 효소, 광-민감성 효소, 금속, 금속 이온, 염화마그네슘, 염화나트륨, 망간, 수성 완충제, 약한 완충제, 이온성 완충제, 저해제, 오일, 염, 이온, 세정제, 이온성 세정제, 비이온성 세정제, 올리고뉴클레오타이드, 주형 핵산 분자(예를 들어, 주형 올리고뉴클레오타이드, 주형 핵산 서열), 핵산 단편, 주형 핵산 단편(예를 들어, 단편화 동안 주형 핵산을 단편화하는 것으로부터 생성된 주형 핵산의 단편, 핵산 증폭 반응으로부터 샌성된 주형 핵산의 단편), 뉴클레오타이드, DNA, RNA, 펩타이드 폴리뉴클레오타이드, 상보성 DNA(cDNA), 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA (ssDNA), 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 염색체 DNA, 게놈 DNA(gDNA), 바이러스 DNA, 박테리아 DNA, mtDNA(미토콘드리아 DNA), mRNA, rRNA, tRNA, nRNA, siRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, microRNA, dsRNA, 라이보자임, 리보스위치 및 바이러스 RNA, 프로테아제, 전체 또는 부분적으로 잠금 핵산, 잠금 핵산 뉴클레오타이드, 뉴클레아제, 프로테아제 저해제, 뉴클레아제 저해제, 킬레이팅제, 환원제, 산화제, 프로브, 발색단, 염료, 유기물, 유화제, 계면활성제, 안정제, 중합체, 물, 약제, 방사성 분자, 보존제, 항생제, 앱타머 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 요약하면, 사용되는 샘플은 특정 가공 필요에 따라서 다를 것이다.
샘플은 인간 및 비인간 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 포유류, 비인간 포유류, 설치류, 양서류, 파충류, 개, 고양이, 소, 말, 염소, 양, 암탉, 조류, 마우스, 토끼, 곤충, 민달팽이, 미생물, 박테리아, 기생충 또는 어류로부터 유래된다. 샘플은 진핵세포, 원핵세포, 진균, 세포, 심장 세포, 폐세포, 신장 세포, 간 세포, 췌장 세포, 생식 세포, 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 위장세포, 혈액 세포, 암 세포, 박테리아 세포, 인간 마이크로바이옴 샘플로부터 단리된 박테리아 세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 세포 내용물, 예를 들어, 단일 세포의 내용물 또는 다중 세포의 내용물을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재되니 방법 및 시스템의 단일세포 적용의 예는 미국 특허 공개 제20140378345호에 기재되어 있다. 샘플은 또한 무 세포, 예컨대 순환 핵산(예를 들어, DNA, RNA)일 수 있다.
샘플은 천연 유래 또는 합성일 수 있다. 샘플은 유기체, 전체 세포, 세포 제제, 및 임의의 유기체, 조직, 세포 또는 환경으로부터의 무 세포 조성물을 포함하는 임의의 적합한 위치로부터 얻을 수 있다. 샘플은 환경적 생검, 흡입물, 포말린 고정 포매 조직, 공기, 농업 샘플, 토양 샘플, 석유 샘플, 물 샘플 또는 분진 샘플로부터 얻을 수 있다. 일부 예에서, 샘플은 혈액, 소변, 분변, 혈청, 림프, 타액, 점막 분비물, 땀, 중추 신경계, 질액, 또는 정액을 포함하는 체액으로부터 얻을 수 있다. 샘플은 또한 제조 제품, 예컨대 화장료, 식품, 개인 관리 제품 등으로부터 얻을 수 있다. 샘플은 재조합 클로닝, 폴리뉴클레오타이드 증폭, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 정제 방법(예컨대, 게놈 DNA 또는 RNA의 정제) 및 합성 반응을 포함하는 실험 조작 제품일 수 있다.
샘플에 바코드를 부착하는 방법
바코드(또는 기타 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 무작위 N-량체)는 효소의 작용을 통해 함께 2개의 핵산 세그먼트를 결합함으로써 샘플에 부착될 수 있다. 이는 프라이머 연장, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 중합효소를 이용하는 다른 유형의 반응에 의해 또는 리가제를 이용하는 결찰에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 도 2a, 도 2b 및 도 2c 및 실시예에서 논의하는 바를 참조.
샘플을 바코드에 부착하기 위해 결찰 방법이 사용될 때, 샘플은 결찰 단계 전에 단편화될 수도 있거나 단편화되지 않을 수도 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 바코드, 무작위 N-량체)는 샘플에 부착되는 반면, 올리고뉴클레오타이드는 여전히 비드에 부착된다. 일부 경우에, 예를 들어, 비드로부터 및/또는 비드의 분해를 통해 바코드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 올리고뉴클레오타이드가 비드로부터 방출된 후에 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 바코드, 무작위 N-량체)는 샘플에 부착된다.
올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 무작위 N-량체 서열을 포함할 수 있다. 독특한 무작위 N-량체 서열의 수집은 DNA 세그먼트의 무작위 부분을 프라이밍함으로써 샘플(예를 들어, 전체 게놈)을 증폭시킬 수 있다. 얻어진 산물은 전체 샘플(예를 들어, 게놈)을 나타내는 바코딩된 단편의 수집물일 수 있다.
샘플은 바코딩된 비드에 대한 결찰 전에 단편화될 수도 있거나 또는 단편화되지 않을 수도 있다. DNA 단편화는 DNA 가닥을 작은 조각 또는 세그먼트로 분리 또는 파괴하는 단계를 수반할 수 있다. 제한 분해 또는 전단력을 생성하는 다양한 방법을 포함하는 DNA 단편화에 다양한 방법이 사용될 수 있다. 제한 분해는 가닥 둘 다에 대한 평활 절단에 의해 또는 접착성 말단을 생성하기 위한 불균일 절단에 의해 DNA 서열에서 의도적인 절단을 하도록 제한 효소를 이용할 수 있다. 전단력 매개 DNA 가닥 붕괴의 예는 음파처리, 음향 전단, 바늘 전단, 피펫팅 또는 분무화를 포함할 수 있다. 음파처리는 약 700 bp 단편 크기를 초래할 수 있는 전단력의 짧은 기간에 DNA를 노출시키는 유체역학적 전단 유형이다. 음향 전단은 반달형 변환기 내에서 DNA 샘플에 고주파수 음향 에너지를 적용한다. 바늘 전단은 DNA를 더 작은 세그먼트로 물리적으로 찢기 위해 작은 직경의 바늘을 통해 DNA를 통과시킴으로써 전단력을 생성한다. 분무력은 얻어진 DNA 단편이 장치를 나가는 미세한 분무로부터 수집되는 에어로졸 단위의 작은 구멍을 통해 DNA를 보냄으로써 생성될 수 있다.
일부 경우에, 결찰 반응은 올리고뉴클레오타이드를 샘플에 결찰시키기 위해 사용된다. 일 예는 (실시예에서 논의하는 바와 같이) 도 2b에서 도시된다. 결찰은 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매함으로써 2개의 핵산 세그먼트, 예컨대 바코드 서열 및 샘플을 함께 결합하는 것을 수반할 수 있다. 결찰 반응은 DNA 리가제, 예컨대 이콜라이(E. coli) DNA 리가제, T4 DNA 리가제, 포유류 리가제, 예컨대 DNA 리가제 I, DNA 리가제 III, DNA 리가제 IV, 내열성 리가제 등을 포함할 수 있다. T4 DNA 리가제는 DNA, 올리고뉴클레오타이드, RNA, 및 RNA-DNA 혼성체를 함유하는 세그먼트를 결찰할 수 있다. 결찰 반응은 토포아이소머라제와 같은 대안을 이용하는 DNA 리가제를 포함하지 않을 수도 있다. 샘플을 바코드 서열에 결찰시키기 위해, 높은 DNA 리가제 농도를 이용하는 것 및 PEG를 포함하는 것은 빠른 결찰을 달성할 수 있다. 37℃일 수 있는 DNA 리가제에 대한 최적의 온도, 및 변할 수 있는 결찰될 DNA의 용융 온도는 결찰 반응을 위한 바람직한 온도에 대해 선택하도록 고려될 수 있다. 샘플 및 바코딩된 비드는 결찰에 영향을 미칠 수 있는 이온 효과를 최소화하기 위해 완충제에서 현탁될 수 있다.
상기에 샘플 핵산 성분에 대한 바코드 서열의 결찰 또는 직접적 부착에 대해 기재하였지만, 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에서 더 상세하게 기재되는 바와 같이 바코드가 샘플 핵산을 복제하기 위해 사용되는 프라이머 서열과 회합될 때, 본 명세서에 사용한 바와 같은 샘플 핵산에 대한 바코드의 부착은 또한 샘플의 상보체 또는 해당 상보체의 복제물 또는 상보체에 대한 바코드 서열의 부착을 포함한다. 특히, 프라이머 서열을 함유하는 바코드가 주형으로서 샘플 핵산(또는 샘플 핵산의 복제물)을 이용하여 프라이머 연장 반응에서 사용되는 경우, 얻어진 연장 산물은, 샘플 핵산의 상보체이든 또는 샘플 핵산의 복제물이든, 바코드 서열이 그에 부착된 것으로 언급될 것이다.
일부 경우에, 샘플은 (수동으로 또는 미세유체 장치의 도움으로) 바코딩된 비드와 조합되고, 조합된 샘플 및 비드는, 예컨대 미세유체 장치에서 분할된다. 파티션은 유중수 에멀전 내에서 수성 액적일 수 있다. 샘플이 바코딩된 비드와 조합될 때, 평균적으로 2개 미만의 표적 분석물이 각각의 유체 액적에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 평균적으로, 3개 미만의 표적 분석물이 유체 액적마다 나타날 수 있다. 일부 경우에, 평균적으로, 2개 초과의 표적 분석물이 유체 액적 당 나타날 수 있다. 다른 경우에, 평균적으로, 3개 초과의 표적 분석물이 유체 액적 당 나타날 수 있다. 일부 경우에, 동일한 표적 분석물의 하나 이상의 가닥이 동일한 유체 액적에서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 1000, 5000, 10000 또는 100000개 미만의 표적 분석물이 유체 액적 내에서 존재한다. 일부 경우에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 1000, 5000, 10000 또는 100000개 초과의 표적 분석물이 유체 액적 내에서 존재한다. 본 명세서에 기재된 파티션은 종종 극도로 작은 용적을 갖는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 액적 기반 파티션의 경우에, 액적은 전체 용적이 1000pL 미만, 900pL 미만, 800pL 미만, 700pL 미만, 600pL 미만, 500pL 미만, 400pL 미만, 300pL 미만, 200pL 미만, 100pL 미만, 50pL 미만, 20pL 미만, 10pL 미만, 또는 심지어 1pL 미만일 수 있다. 비드와 함께 공동 분할된 경우에, 파티션 내의 샘플 유체 용적은 상기 기재한 용적의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 심지어 10% 미만일 수 있다는 것이 인식될 것이다.
샘플이 바코딩된 비드와 조합될 때, 평균적으로 하나 미만의 비드가 각각의 유체 액적에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 평균적으로, 2개 미만의 비드가 각각의 유체 액적 내에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 평균적으로, 3개 미만의 비드가 유체 액적 당 존재할 수 있다. 일부 경우에, 평균적으로, 1개 초과의 비드가 각각의 유체 액적에 존재할 수 있다. 다른 경우에, 평균적으로, 2개 초과의 비드가 각각의 유체 액적에 존재하는 것으로 나타날 수 있다. 다른 경우에, 평균적으로, 3개 초과의 비드가 유체 액적 당 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유체 액적 당 평균적으로 1개 미만의 바코딩된 비드의 비가 한계 희석법 기법을 이용하여 달성될 수 있다. 여기서, 바코딩된 비드는 샘플과 혼합하기 전에 희석되거나, 샘플과 혼합하는 동안 희석되거나, 또는 샘플과 혼합된 후에 희석될 수 있다.
분할되는 상이한 바코드 또는 상이한 세트의 바코드(예를 들어, 상이한 세트의 바코드, 각각 상이한 세트가 비드에 결합됨)의 수는, 예를 들어, 분할 및/또는 적용될 특정 바코드에 따라 다를 수 있다. 상이한 세트의 바코드는, 예를 들어, 동일한 바코드가 각각의 세트 간에 상이한 경우, 동일한 바코드의 세트일 수 있다. 또는 상이한 세트의 바코드는, 예를 들어, 각각의 세트가 그의 포함된 바코드에서 상이한 경우의 상이한 바코드의 세트일 수 있다. 일부 경우에, 상이한 바코드는 상이한 바코드를 상이한 비드(예를 들어, 겔 비드)에 부착함으로써 분할된다. 일부 경우에, 상이한 세트의 바코드는 상이한 파티션에서 각각의 상이한 세트를 배치함으로써 분할된다. 일부 경우에, 그렇지만 파티션은 하나 이상의 상이한 바코드 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각의 상이한 세트의 바코드는 상이한 비드(예를 들어, 겔 비드)에 결합될 수 있다. 각각 상이한 세트의 바코드가 상이한 유체 액적으로 분할되도록 각각의 상이한 비드는 유체 액적으로 분할될 수 있다. 예를 들어, 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000, 100000000개 이상의 상이한 바코드 또는 상이한 세트의 바코드는 분할될 수 있다. 일부 예에서, 적어도 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000, 100000000개 이상의 상이한 바코드 또는 상이한 세트의 바코드는 분할될 수 있다. 일부 예에서, 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000 또는 100000000개 미만의 상이한 바코드 또는 상이한 세트의 바코드는 분할될 수 있다. 일부 예에서, 약 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 1000, 1000 내지 10000, 10000 내지 100000, 100000 내지 1000000, 10000 내지 1000000, 10000 내지 10000000 또는 10000 내지 100000000개의 상이한 바코드 또는 상이한 세트의 바코드가 분할될 수 있다.
바코드는 특정 밀도로 분할될 수 있다. 예를 들어, 각각의 파티션이 파티션 당 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000 또는 100000000개의 바코드를 함유하도록 바코드는 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 적어도 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000, 100000000개 이상의 바코드를 함유하도록 바코드가 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000 또는 100000000개 미만의 바코드를 함유하도록 바코드는 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 약 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 1000, 1000 내지 10000, 10000 내지 100000, 100000 내지 1000000, 10000 내지 1000000, 10000 내지 10000000 또는 10000 내지 100000000개의 바코드를 함유하도록 바코드가 분할될 수 있다. 일부 경우에, 분할된 바코드는 하나 이상의 비드, 예를 들어, 겔 비드에 결합될 수 있다. 일부 경우에, 파티션은 유동 액적이다.
동일한 바코드가 특정 밀도에서 분할되도록 바코드는 분할될 수 있다. 예를 들어, 각각의 파티션이 파티션 당 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000 또는 100000000개의 동일한 바코드를 함유하도록 동일한 바코드는 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 적어도 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000, 100000000개 이상의 동일한 바코드를 함유하도록 바코드가 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000 또는 100000000개 미만의 동일한 바코드를 함유하도록 바코드는 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 약 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 1000, 1000 내지 10000, 10000 내지 100000, 100000 내지 1000000, 10000 내지 1000000, 10000 내지 10000000 또는 10000 내지 100000000개의 동일한 바코드를 함유하도록 바코드가 분할될 수 있다. 일부 경우에, 분할된 동일한 바코드는 비드, 예를 들어, 겔 비드에 결합될 수 있다. 일부 경우에, 파티션은 유동 액적이다.
상이한 바코드가 특정 밀도에서 분할되도록 바코드는 분할될 수 있다. 예를 들어, 각각의 파티션이 파티션 당 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000 또는 100000000개의 상이한 바코드를 함유하도록 상이한 바코드는 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 적어도 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000, 100000000개 이상의 상이한 바코드를 함유하도록 바코드가 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 약 1, 5, 10, 50, 100, 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 6000000, 7000000, 8000000, 9000000, 10000000, 20000000, 50000000 또는 100000000개 미만의 상이한 바코드를 함유하도록 바코드는 분할될 수 있다. 각각의 파티션이 파티션 당 약 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 1000, 1000 내지 10000, 10000 내지 100000, 100000 내지 1000000, 10000 내지 1000000, 10000 내지 10000000 또는 10000 내지 100000000개의 상이한 바코드를 함유하도록 바코드가 분할될 수 있다. 일부 경우에, 분할된 상이한 바코드는 비드, 예를 들어, 겔 비드에 결합될 수 있다. 일부 경우에, 파티션은 유동 액적이다.
바코드 또는 상이한 세트의 바코드를 분할하기 위해 사용되는 파티션의 수는, 예를 들어, 적용분야 및/또는 상이한 바코드의 수 또는 분할될 상이한 세트의 바코드에 따라서 다를 수 있다. 예를 들어, 바코드 또는 상이한 세트의 바코드를 분할하기 위해 사용되는 파티션의 수는 약 5, 10, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 또는 10,000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100,000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1,000,000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개 이상일 수 있다. 바코드 또는 상이한 세트의 바코드를 분할하기 위해 사용되는 파티션의 수는 적어도 약 5, 10, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 10,000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개 이상일 수 있다. 바코드 또는 상이한 세트의 바코드를 분할하기 위해 사용되는 파티션의 수는 약 5, 10, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 5000, 7500, 10,000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000, 2000000, 3000000, 4000000, 5000000, 10000000, 20000000개 미만일 수 있다. 바코드를 분할하기 위해 사용되는 파티션의 수는 약 5 내지 10000000, 5 내지 5000000, 5 내지 1,000,000, 10 내지 10,000, 10 내지 5,000, 10 내지 1,000, 1,000 내지 6,000, 1,000 내지 5,000, 1,000 내지 4,000, 1,000 내지 3,000 또는 1,000 내지 2,000일 수 있다. 일부 경우에, 파티션은 유동 액적일 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, 각각의 파티션이 일반적으로 상이한 바코드 또는 상이한 바코드 세트를 포함하도록 상이한 바코드 또는 상이한 세트의 바코드(예를 들어, 복수의 동일한 바코드 또는 상이한 바코드를 포함하는 각각의 세트)는 분할될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 파티션은 상이한 세트의 동일한 바코드, 예컨대 비드(예를 들어, 겔 비드)에 결합된 동일한 세트의 바코드를 포함할 수 있다. 상이한 세트의 동일한 바코드가 분할되는 경우, 파티션 당 동일한 바코드의 수는 다를 수 있다. 예를 들어, 각각의 파티션이 상이한 세트의 동일한 바코드를 포함하도록(예를 들어, 각각의 파티션이 상이한 세트의 동일한 바코드에 결합된 비드를 포함하도록) 약 100,000개 이상의 상이한 세트의 동일한 바코드(예를 들어, 비드에 부착된 동일한 바코드의 세트)는 약 100,000개 이상의 상이한 파티션에 걸쳐 분할될 수 있다. 각각의 파티션에서, 바코드 세트 당 동일한 바코드의 수는 약 1,000,000개 이상의 동일한 바코드일 수 있다(예를 들어, 각각의 파티션은 하나 이상의 비드에 결합된 1,000,000개 이상의 동일한 바코드를 포함한다). 일부 경우에, 상이한 세트의 바코드의 수는 파티션의 수와 동일하거나 또는 실질적으로 동일하거나 또는 파티션의 수 미만일 수 있다. 임의의 적합한 수의 상이한 바코드 또는 상이한 바코드 세트, 파티션 당 바코드의 수, 및 파티션의 수가 조합될 수 있다. 따라서, 인식할 바와 같이, 임의의 상기 기재한 상이한 수의 바코드는 파티션 당 임의의 상기 기재한 바코드 밀도 및 임의의 상기 기재한 수의 파티션이 제공될 수 있단.
마이크로유체 장치 및 액적
일부 경우에, 본 개시내용은, 예를 들어, 샘플 성분 및 비드를 공동 분할하기 위한 비드를 제조하기 위한 그리고 비드(또는 다른 유형의 파티션)를 샘플과 조합하기 위한 장치를 제공한다. 이러한 장치는 미세유체 장치(예를 들어, 액적 발생기)일 수 있다. 장치는 임의의 적합한 물질로부터 형성될 수 있다. 일부 예에서, 장치는 용융 실리카, 소다 석회 유리, 붕규산 유리, 폴리(메틸 메타크릴레이트) PMMA, PDMS, 사파이어, 실리콘, 게르마늄, 사이클릭 올레핀 공중합체, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리카보네이트, 플라스틱, 열경화성 수지, 하이드로겔, 열가소성 수지, 종이, 탄성중합체 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 물질로부터 형성될 수 있다.
장치는 유체의 유동을 위한 통로를 포함하는 방식으로 형성될 수 있다. 임의의 적합한 통로가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 장치는 하나 이상의 유체 유입 통로(예를 들어, 유입 통로) 및 하나 이상의 유체 배출구 통로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유체 통로의 내부 직경은 약 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 85㎛, 90㎛, 100㎛, 125㎛ 또는 150㎛일 수 있다. 일부 경우에, 유체 통로의 내부 직경은 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 85㎛, 90㎛, 100㎛, 125㎛, 150㎛ 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유체 통로의 내부 직경은 약 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 85㎛, 90㎛, 100㎛, 125㎛ 또는 150㎛ 미만일 수 있다. 유체 통로 내의 용적 유동 속도는 당업계에 공지된 임의의 유동 속도일 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 미세유체 장치는 하나 이상의 겔 전구체, 하나 이상의 가교제, 선택적으로 개시제, 및 선택적으로 수성 계면활성제를 포함하는 유체 액적을 형성함으로써 비드를 형성하는 데 이용될 수 있다. 유체 액적은 추가로 계면활성제 및/또는 촉진제를 포함할 수 있는 비혼화성 연속 유체, 예컨대 오일에 의해 둘러싸일 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치는 비드와 샘플을 둘 다 포함하는 유체 액적(또는 본 명세서에 기재된 임의의 적합한 유형의 파티션을 포함하는 다른 유형의 제2 파티션)을 형성함으로써 비드(예를 들어, 바코딩된 비드 또는 본 명세서에 기재된 임의의 적합한 유형의 파티션을 포함하는 다른 유형의 제1 파티션)를 샘플(예를 들어, 핵산 샘플)과 조합하기 위해 사용될 수 있다. 유체 액적은 오일상, 예를 들어, 유중수 에멀전 내의 수성 액적에 의해 둘러싸인 수성 코어를 가질 수 있다. 유체 액적은 하나 이상의 바코딩된 비드, 샘플, 증폭 시약 및 환원제를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 유체 액적은 물, 뉴클레아제가 없는 물, 아세토나이트릴, 비드, 겔 비드, 중합체 전구체, 중합체 단량체, 폴리아크릴아마이드 단량체, 아크릴아마이드 단량체, 분해성 가교제, 비분해성 가교제, 이황화 결합, 아크릴다이트 모이어티, PCR 시약, 프라이머, 중합효소, 바코드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드, DNA, RNA, 펩타이드 폴리뉴클레오타이드, 상보성 DNA(cDNA), 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 염색체 DNA, 게놈 DNA, 바이러스 DNA, 박테리아 DNA, mtDNA(미토콘드리아 DNA), mRNA, rRNA, tRNA, nRNA, siRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, 마이크로RNA, dsRNA, 프로브, 염료, 유기물, 유화제, 계면활성제, 안정제, 중합체, 어댑터, 환원제, 개시제, 바이오틴 표지, 형광단, 완충제, 산성 용액, 염기성 용액, 광 민감성 효소, pH-민감성 효소, 수성 완충제, 오일, 염, 세정제, 이온 세정제, 비이온성 세정제 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 요약하면, 유체 액적의 조성물은 특정 가공 필요에 따라 다를 것이다.
유동 액적은 균일한 크기 또는 이질적 크기를 가질 수 있다. 일부 경우에, 유체 액적의 직경은 약 1㎛, 5㎛, 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 45㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 90㎛, 100㎛, 250㎛, 500㎛ 또는 1mm일 수 있다. 일부 경우에, 유체 액적은 직경이 적어도 약 1㎛, 5㎛, 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 45㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 90㎛, 100㎛, 250㎛, 500㎛, 1mm 이상일 수 있다. 일부 경우에, 유체 액적은 직경이 약 1㎛, 5㎛, 10㎛, 20㎛, 30㎛, 40㎛, 45㎛, 50㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 80㎛, 90㎛, 100㎛, 250㎛, 500㎛ 또는 1mm 미만일 수 있다. 일부 경우에, 유체 액적은 직경이 약 40 내지 75㎛, 30 내지 75㎛, 20 내지 75㎛, 40 내지 85㎛, 40 내지 95㎛, 20 내지 100㎛, 10 내지 100㎛, 1 내지 100㎛, 20 내지 250㎛ 또는 20 내지 500㎛의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 장치는 2 이상의 유체 유입 통로의 하나 이상의 교차 지점을 포함할 수 있다. 예를 들어, 교차 지점은 유체 교차점일 수 있다. 유체 교차점은 2 이상의 유입 통로 및 하나 이상의 유체 배출구 통로를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유체 교차점은 두 유체 유입 통로 및 두 유체 배출구 통로를 포함할 수 있다. 다른 경우에, 유체 교차점은 3개의 유체 유입 통로 및 하나의 유체 배출구 통로를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유체 교차점은 교차점을 형성하는 2 이상의 유체 통로 사이에서 실질적으로 수직인 각도를 형성할 수 있다.
일부 경우에, 미세유체 장치는 배출구 통로에 유체 연결된 접점에서 만나는 제1 유입 통로 및 제2 유입 통로를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 배출구 통로는, 예를 들어, 접점에서 제3 유입 통로에 유체 연결될 수 있다. 일부 경우에, 제4 유입 통로가 포함될 수 있고, 접점에서 제3 유입 통로 및 배출구 통로를 교차할 수 있다. 일부 경우에, 미세유체 장치는 제1, 제2, 및 제3 유입 통로를 포함할 수 있되, 제3 유입 통로는 제1 유입 통로 및 제2 유입 통로 또는 제1 유입 통로와 제2 유입 통로의 접점을 교차한다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 미세유체 장치는 액체로부터 겔 비드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유체 유입 통로 내에서 하나 이상의 겔 전구체, 하나 이상의 가교제 및 선택적으로 수성 계면활성제 및 선택적으로 알코올을 포함하는 수성 유체는 유체 교차점에 유입될 수 있다. 제2 유체 유입 통로 내에서, 선택적으로 계면활성제 및 촉진제를 지니는 오일은 동일한 유체 교차점에 유입될 수 있다. 수성 화합물과 오일 성분은 둘 다 연속 오일 상 내에서 유동 액적이 형성되도록 유체 교차점에서 혼합될 수 있다. 유체 교차점을 나간 유동 액적 내의 겔 전구체는 비드 형성을 중합할 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 미세유체 장치(예를 들어, 액적 발생기)는, 원한다면, 샘플을 비드(예를 들어, 바코딩된 비드의 라이브러리)뿐만 아니라 비드를 분해할 수 있는 제제(예를 들어, 비드가 이황화 결합으로 연결된다면 환원제)와 조합하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플(예를 들어, 핵산의 샘플)은 제1 유체 교차점(예를 들어, 제1 유체 접점)에 유동 가능하게 연결된 제1 유체 유입 통로에 제공될 수 있다. 사전 형성된 비드(예를 들어, 바코딩된 비드, 분해 가능한 바코딩된 비드)는 제1 유체 유입 통로 및 제2 유체 유입 통로가 만나는 경우, 제1 유체 교차점에 또한 유체 연결된 제2 유체 유입 통로에 제공될 수 있다. 샘플 및 비드는 혼합물(예를 들어, 수성 혼합물)을 형성하기 위해 제1 유체 교차점에서 혼합될 수 있다. 일부 경우에, 환원제는 제1 유체 교차점에 또한 유체 연결되고 제1 유체 교차점에서 제1 유체 유입 통로와 제2 유체 유입 통로와 만나는 제3 유체 유입 통로에 제공될 수 있다. 이어서, 환원제는 제1 유체 교차점에서 비드 및 샘플과 혼합될 수 있다. 다른 경우에, 환원제는 그것이 샘플을 지니는 제1 유체 유입 통로를 통해 및/또는 비드를 지니는 제2 유체 유입 통로를 통해 미세유체 장치에 제공되도록, 미세유체 장치에 유입되기 전에 샘플 및/또는 비드와 사전혼합될 수 있다. 다른 경우에, 환원제는 첨가되지 않을 수도 있다.
일부 실시형태에서, 샘플과 비드 혼합물은 제1 유체 교차점(따라서, 제1 유체 교차점을 형성하는 임의의 유체 통로)에 유체 연결된 제1 배출구 통로를 통해 제1 유체 교차점을 나갈 수 있다. 혼합물은 제1 배출구 통로에 유체 연결된 제2 유체 교차점(예를 들어, 제2 유체 접점)에 제공될 수 있다. 일부 경우에, 오일(또는 다른 적합한 비혼화성) 유체는 제2 유체 교차점(따라서, 교차점을 형성하는 임의의 유체 통로)에 유체 연결되고, 제2 유체 교차점에서 제1 배출구 통로와 만나는 하나 이상의 별개의 유체 유입 통로로부터 제2 유체 교차점에 유입될 수 있다. 일부 경우에, 오일(또는 다른 적합한 비혼화성 유체)은 제1 배출구 통로 및 서로 제2 유체 교차점에서 만나는 제2 유체 교차점(따라서 제1 배출구 통로)에 유체 연결된 1 또는 2개의 별개의 유체 유입 통로에서 제공될 수 있다. 성분, 즉 오일 및 샘플과 비드 혼합물은 제2 유체 교차점에서 혼합될 수 있다. 이 혼합은 샘플 및 비드 혼합물을 복수의 유동 액적(예를 들어, 유중수 에멀전 내의 수성 액적)으로 혼합하며, 이때 적어도 형성되는 액적의 서브세트는 바코딩된 비드(예를 들어, 겔 비드)를 캡슐화한다. 형성되는 유동 액적은 제2 유체 교차점을 나가서 제2 유체 배출구 통로를 통해 오일 내에서 운반될 수 있다. 일부 경우에, 제2 유체 교차점으로부터 제2 배출구 통로를 나간 유동 액적은 추가 가공(예를 들어, 열순환)을 위해 웰로 분할될 수 있다.
다수의 경우에, 비드(또는 제1 파티션)에 대해 얻어진 액적(또는 제2 파티션)의 점유율을 제어하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 제어는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20150292988호에 기재되어 있으며, 이의 전체 개시내용은 그의 전문이 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된다. 일반적으로, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 액적(또는 제2 파티션)은 하나 이하의 비드(또는 제1 파티션)을 함유하도록 액적(또는 제2 파티션)이 형성될 것이다. 추가적으로, 또는 대안적으로 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 액적(또는 제2 파티션)이 정확하게 하나의 비드(또는 제1 파티션)를 포함하도록 액적(또는 제2 파티션)이 형성될 것이다. 일부 경우에, 얻어진 액적(또는 제2 파티션)은 각각 평균적으로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이하의 비드(또는 제1 파티션)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 얻어진 액적(또는 제2 파티션)은 각각, 평균적으로, 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 비드(또는 제1 파티션)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 수성 반응 혼합물을 생성하기 위해 미세유체 장치 내로 혼합물의 유입 전에 바코드 및 임의의 다른 시약(예를 들어, 샘플 증폭에 필수적인 시약, 환원제 등)을 포함하는 비드(예를 들어, 분해 가능한 비드)와 사전 혼합될 수 있다. 유체 장치에 대한 수성 혼합물의 유입 시, 혼합물은 제1 유체 유입 통로로부터 그리고 유체 교차점으로 유동할 수 있다. 일부 경우에, 오일상은 또한 유체 교차점에 유체 접촉되는 제2 유체 유입 통로(예를 들어, 제1 유체 유입 통로에 수직이거나 또는 실질적으로 수직인 유체 통로)로부터 유체 교차점으로 유입될 수 있다. 에멀전(예를 들어, 겔-물-오일 에멀전)이 형성되도록 수성 혼합물 및 오일은 유체 교차점에서 혼합될 수 있다. 에멀전은 연속 오일상에서 복수의 유동 액적(예를 들어, 수성 반응 혼합물을 포함하는 액적)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 유체 액적은 단일 비드(예를 들어, 동일한 세트의 바코드에 부착된 겔 비드), 샘플의 분취액, 및 임의의 다른 시약의 분취액(예를 들어, 환원제, 샘플 증폭에 필수적인 시약 등)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 그렇지만, 유체 액적은 복수의 비드를 포함할 수 있다. 액적 형성 시, 액적은 유체 교차점으로부터 나간 유체 배출구 통로를 통해서 오일 연속상을 통해 운반될 수 있다. 배출구 통로를 나간 유체 액적은 추가 가공(예를 들어, 열순환)을 위해 웰로 분할될 수 있다.
환원제가 미세유체 장치에 유입되기 전에 샘플에 첨가될 수 있거나 또는 제1 유체 교차점에서 첨가될 수 있는 경우에, 제2 유체 교차점에서 형성된 유동 액적은 환원제를 함유할 수 있다. 이 경우에, 액적이 제2 유체 교차점을 떠나서 배출구 통로를 통해 이동함에 따라 환원제는 유체 액적 내에 함유된 비드를 분해 또는 용해할 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치는 3개의 별개의 유체 교차점을 동시에 포함할 수 있다. 유체 액적은 3개의 유체 교차점 중 임의의 하나에서 형성될 수 있다. 샘플 및 비드는 3개의 유체 교차점 중 임의의 하나 내에서 조합될 수 있다. 환원제는 3개의 유체 교차점 중 임의의 하나에서 첨가될 수 있다. 오일은 3개의 유체 교차점 중 임의의 하나에서 첨가될 수 있다.
본 개시내용의 방법, 조성물, 장치 및 키트는 임의의 적합한 오일과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 오일은 에멀전을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 오일은 플루오린화된 오일, 실리콘 오일, 광유, 식물성 오일 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치 내의 수성 유체는 또한 알코올을 함유할 수 있다. 예를 들어, 알코올은 글리세롤, 에탄올, 메탄올, 아이소프로필 알코올, 펜탄올, 에탄, 프로판, 부탄, 펜탄, 헥산 및 이들의 조합물일 수 있다. 알코올은 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%(v/v)로 수성 유체 내에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 알코올은 수성 유체 내에서 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 이상(v/v)으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 알코올은 수성 유체 내에서 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%(v/v) 미만으로 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 오일은 또한 에멀전을 안정화시키기 위해 계면활성제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 계면활성제는 불소계면활성제, 크리톡스 윤활제, 크리톡스 FSH, 공학 처리된 유체, HFE-7500, 실리콘 화합물, PEG를 함유하는 실리콘 화합물, 예컨대 비스 크리톡스 페그(BKP)일 수 있다. 계면활성제는 약 0.1%, 0.5%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 5% 또는 10%(w/w)로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제는 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 5%, 10%(w/w) 이상으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제는 약 0.1%, 0.5%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2%, 5% 또는 10%(w/w) 미만으로 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 촉진제 및/또는 개시제는 오일에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 촉진제는 테트라메틸에틸렌다이아민(TMEDA 또는 TEMED)일 수 있다. 일부 경우에, 개시제는 과황산암모늄 또는 칼슘 이온일 수 있다. 촉진제는 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9% 또는 2%(v/v)로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 촉진제는 적어도 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9% 또는 2%(v/v) 이상으로 존재할 수 있다. 일부 경우에, 촉진제는 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9% 또는 2%(v/v) 미만으로 존재할 수 있다.
V. 증폭
DNA 증폭은 DNA의 짧은 또는 긴 세그먼트의 다중 복제물을 생성하는 방법이다. 본 개시내용의 방법, 조성물, 장치 및 키트는 개개의 비드, 예컨대 바코드 서열 또는 무작위 N-량체 서열에 하나 이상의 목적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 부착하기 위해 DNA 증폭을 사용할 수 있다. 샘플 서열의 단편을 생성하고 해당 단편에 대해 프라이머와 회합된 바코드를 결합하기 위해 DNA 증폭은 무작위 N-량체 서열을 이용하여 관심 대상의 샘플, 예컨대 게놈 DNA를 프라이밍 및 연장하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 핵산 서열은 주형 핵산 서열 및 복수의 부착된 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 방출 가능하게 부착된 올리고뉴클레오타이드)를 포함하는 비드를 파티션(예를 들어, 에멀전의 액적, 마이크로캡슐 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 적합한 유형의 파티션을 포함하는 임의의 다른 적합한 유형의 파티션)으로 공동분할함으로써 증폭될 수 있다. 부착된 올리고뉴클레오타이드는 주형 핵산 서열 중 하나 이상의 영역에 대해 상보성인 프라이머 서열(예를 들어, 가변 프라이머 서열, 예를 들어, 무작위 N-량체, 또는 표적화된 프라이머 서열, 예를 들어, 표적화된 N-량체)을 포함할 수 있고, 추가로 또한 통상적인 서열(예를 들어, 바코드 서열)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 제1 복제물이 프라이머 서열 및 통상적인 서열을 포함하도록, 프라이머 서열은 주형 핵산 서열로 어닐링될 수 있고, 주형 핵산의 적어도 일부의 하나 이상의 제1 복제물을 생성하기 위해 (예를 들어, 프라이머 연장 반응 또는 임의의 다른 적합한 핵산 증폭 반응에서) 연장될 수 있다. 프라이머 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 비드에 방출가능하게 부착된 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 서열이 주형 핵산 서열로 어닐링되기 전에 비드로부터 방출될 수 있다. 게다가, 일반적으로, 프라이머 서열은 또한 파티션에서 제공되는 중합효소(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재되는 바와 같은 중합효소를 대체하는 가닥, 본 명세서에 다른 곳에 기재된 바와 같은 엑소뉴클레아제 결여 중합효소, 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 유형의 중합효소를 포함하는 임의의 다른 유형의 적합한 중합효소)를 통해 연장될 수 있다. 더 나아가, 비드에 방출 가능하게 부착된 올리고뉴클레오타이드는 엑소뉴클레아제 저항성일 수 있고, 따라서, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합은 올리고뉴클레오타이드에서 말단 뉴클레오타이드 간 결합에서 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 하나 이상의 제1 복제물의 생성 후에, 프라이머 서열은 제1 복제물 중 하나 이상으로 어닐링될 수 있고, 프라이머 서열은 다시 하나 이상의 제2 복제물을 생성하도록 연장된다. 하나 이상의 제2 복제물은 프라이머 서열, 통상적인 서열을 포함할 수 있고, 또한 하나 이상의 제1 복제물의 개개 복제물의 적어도 일부에 상보성인 서열, 및/또는 가변 프라이머 서열에 대해 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 앞서 언급한 단계들은 증폭 핵산을 생성하기 위해 목적으로 하는 수의 순환 동안 반복될 수 있다.
상기 기재한 올리고뉴클레오타이드는 연장 반응(예컨대 상기 기재한 제1 복제물 또는 제2 복제물을 생성하는 연장 반응) 동안 복제되지 않은 서열 세그먼트를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이러한 서열 세그먼트는 하나 이상의 유라실 함유 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 또한 어닐링 조건 하에서 헤어핀(또는 부분적 헤어핀) 분자를 형성하는 앰플리콘의 생성을 초래할 수 있다.
다른 예에서, 제2 파티션(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 유형의 비드를 포함하는 비드)을 각각 포함하는 별개의 제1 파티션(예를 들어, 에멀전 내 액적)으로 상이한 핵산을 분할함으로써 복수의 상이한 핵산이 증폭될 수 있다. 제2 파티션은 복수의 올리고뉴클레오타이드와 방출 가능하게 회합될 수 있다. 제2 파티션은 임의의 적합한 수의 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 파티션 당 1,000개 초과의 올리고뉴클레오타이드, 10,000개 초과의 올리고뉴클레오타이드, 100,000개 초과의 올리고뉴클레오타이드, 1,000,000개 초과의 올리고뉴클레오타이드, 10,000,000개 초과의 올리고뉴클레오타이드, 또는 임이의 다른 수의 올리고뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다. 게다가, 제2 파티션은 임의의 적합한 수의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 적어도 1,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 10,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 100,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 1,000,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 10,000,000개의 상이한 바코드 서열, 또는 임의의 다른 수의 본 명세서의 다른 곳에 기재된 상이한 바코드 서열)을 포함할 수 있다.
더 나아가, 주어진 제2 파티션과 회합된 복수의 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 서열(예를 들어, 가변 프라이머 서열, 표적화된 프라이머 서열) 및 통상적인 서열 (예를 들어, 바코드 서열)을 포함할 수 있다. 게다가, 상이한 제2 파티션과 회합된 복수의 올리고뉴클레오타이드는 상이한 바코드 서열을 포함할 수 있다. 복수의 제2 파티션과 회합된 올리고뉴클레오타이드는 제1 파티션으로 방출될 수 있다. 방출 후에, 제1 파티션 내의 프라이머 서열은 제1 파티션 내에서 핵산으로 어닐링될 수 있고, 이어서, 프라이머 서열은 제1 파티션에 의해 핵산의 적어도 일부의 하나 이상의 복제물을 생성하도록 연장될 수 있다. 일반적으로, 하나 이상의 복제물은 제1 파티션으로 방출된 바코드 서열을 포함할 수 있다.
액적 내의 증폭 및 샘플 지표화
핵산(예를 들어, DNA) 증폭이 유동 액적 내의 내용물에 대해 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 유동 액적은 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 유체 액적은 샘플을 추가로 포함할 수 있다. 유체 액적은 또한 카파 하이파이 유라실 플러스(Kapa HiFi Uracil Plus), 변형된 뉴클레오타이드, 천연 뉴클레오타이드, 유라실 함유 뉴클레오타이드, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP, dATP, DNA 중합효소, 태그 중합효소, 돌연변이체 프로프 판독 중합효소, 북위 9도, 변형된(NEB), 엑소(-), 엑소 (-) Pfu, 딥 벤트(Deep Vent) 엑소(-), 벤트 엑소(-) 및 아사이클로뉴클레오타이드(acyNTPS)를 포함할 수 있는 증폭 반응에 적합한 시약을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드가 샘플 핵산에 부착되도록 유체 액적 내의 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드는 샘플 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 샘플 핵산은 사실상, 예를 들어, 전체 게놈, 엑솜, 앰플리콘, 표적화된 게놈 세그먼트 예를 들어, 유전자 또는 유전자 패밀리, 세포 핵산, 순환 핵산 등을 포함하는 분석되도록 추구되는 임의의 핵산을 포함할 수 있고, 상기 기재한 바와 같이, DNA(gDNA, cDNA, mtDNA 등을 포함), RNA(예를 들어, mRNA, rRNA, 총 RNA 등)를 포함할 수 있다. 바코딩을 위한 이러한 핵산의 제조는 일반적으로 용이하게 이용 가능한 방법, 예를 들어, 풍부화 또는 풀 다운 방법, 단리 방법, 증폭 방법 등에 의해 달성될 수 있다. 목적으로 하는 샘플, 예컨대 gDNA를 증폭시키기 위해, 유체 액적 내의 올리고뉴클레오타이드의 무작위 N-량체 서열은 목적으로 하는 표적 서열을 프라이밍하는데 사용될 수 있고, 표적 서열의 상보체로서 연장될 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 프라이밍 전에 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 액적에서 비드로부터 방출될 수 있다. 이들 프라이밍 및 연장 과정에 대해, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 디지털 PCR, 역전사 PCR, 다중 PCR, 네스티드 PCR, 중복-연장 PCR, 정량적 PCR, 다중 전위 증폭 (MDA) 또는 리가제 연쇄 반응(LCR)을 포함하는 임의의 적합한 DNA 증폭 방법이 이용될 수 있다. 일부 경우에, 바코드를 포함하는 특정 양의 샘플 핵산이 생성될 때까지 유동 액적 내의 증폭이 생성될 수 있다. 일부 경우에, 증폭은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 주기 동안 수행될 수 있다. 일부 경우에, 증폭은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 초과의 주기 동안 수행될 수 있다. 일부 경우에, 증폭은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 미만의 주기 동안 수행될 수 있다.
일부 경우에, 파티션의 사용 또는 추가적인 파티션의 생성과 함께 또는 이들 없이 샘플 핵산에 대한 본래의 바코드의 첨가 후에 샘플 지표는 샘플 핵산에 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 샘플 지표는 대량으로 첨가된다. 일부 경우에, 샘플 핵산에 대한 샘플 지표의 첨가는 샘플 핵산에 대한 바코드의 첨가 전에 생길 수 있다. 일부 경우에, 샘플 핵산에 대한 샘플 지표의 첨가는 샘플 핵산에 대한 샘플 지표의 첨가와 동시에 또는 병행하여 일어날 수 있다.
대안의 양상에서, 추가적인 서열 세그먼트는 부분적 헤어핀 구조의 5' 말단에 결찰될 수 있으며, 여기서 이러한 서열 세그먼트는 헤어핀 구조의 비중복 구조에 대해 상보성이 아니다. 프라이머 연장 조건이 실시될 때, 부분적 헤어핀 구조는 그 자체의 프라이머로서 작용할 수 있고, 그것이 완전한 또는 거의 완전한 헤어핀 구조(예를 들어 돌출 서열이 거의 없거나 또는 전혀 없음)를 형성할 때까지, 파선 화살표로 나타내는 바와 같이 그의 연장된 5' 서열을 가진다. 이 완전한 헤어핀 구조는, 더 높은 친화도 프라이머, 예를 들어, LNA 함유 프라이머/프로브를 사용할 때조차, 훨씬 더 큰 이중가닥 안정성을 가짐으로써, 그의 복제를 프라이밍하기 위한 헤어핀 구조를 파괴하는 능력에 잠재적으로 부정적으로 영향을 미칠 것이다.
일부 경우에, 미세유체 장치(예를 들어, 미세유체 칩)는 샘플 지표화를 병행함에 있어서 유용할 수 있다. 이러한 장치는 바코드 서열과 샘플 지표를 둘 다 포함하는 프라이머를 통해 샘플의 핵산 분자에 대해 바코드 서열 및 샘플 지표를 각각 첨가할 수 있는 병행 모듈을 포함할 수 있다. 각각의 모듈에서 처리되는 샘플은 상이한 샘플 지표 및 바코드의 세트와 회합되도록 각각의 병행 모듈은 상이한 샘플 지표를 포함하는 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 8개의 모듈을 지니는 미세유체 장치는 8개의 상이한 샘플을 샘플 지표화할 수 있다. 샘플 핵산에 대한 서열의 부착을 통한 바코딩 및 샘플 지표화 후에, 예를 들어, 연속 증폭을 통한 추가적인 서열(예를 들어, R2, P7, 기타 바코드 서열)의 대량 첨가는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 시퀀서-준비 산물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
시퀀서-준비 산물은 서열 판독을 정렬하고 샘플 핵산에 대한 서열을 제공하기 위해 사용될 수 있는 바코드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 위상 증폭 및 후속적 대량 증폭을 이용하여 시퀀서-준비 산물이 생성될 수 있다. 게다가, 바코드 서열은 특정 세트의 알려진 바코드 서열에 속할 수 있다. 특정 시퀀싱 판독으로부터 유래된 샘플의 동정이 판독 바코드 서열을 통해 달성될 수 있도록, 바코드 서열의 세트는 특정 샘플과 회합될 수 있다. 각각의 샘플은 공지된 바코드 서열의 세트와 회합될 수 있으며, 각각의 바코드 서열 세트는 다른 샘플과 회합된 다른 바코드 세트에서 중복되지 않는 바코드 서열을 포함한다. 따라서, 바코드 서열의 독특성 및 상이한 세트의 바코드 서열 중에서의 그의 독특성은 다중화를 위해 사용될 수 있다.
다른 경우에, 샘플 지표는 샘플 핵산에 대한 바코드 서열의 첨가 전에 샘플 핵산에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 얻어진 앰플리콘이 바코딩 전에 샘플 지표 서열에 부착되도록 샘플 핵산은 대량으로 사전 증폭될 수 있다. 예를 들어, 샘플 지표 서열이 샘플 핵산에 부착될 수 있도록 샘플은 샘플 지표 서열을 포함하는 프라이머에 의해 증폭될 수 있다. 일부 경우에, 프라이머는 무작위 프라이머(예를 들어, 무작위 N-량체를 포함)일 수 있고, 증폭은 무작위일 수 있다. 이어서, 샘플 지표를 포함하는 생성된 앰플리콘은 본 명세서에 기재된 바코딩 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 바코딩될 수 있다.
샘플 핵산 분자는 상기 기재한 프라이머에 의해 파티션(예를 들어, 에멀전의 액적) 내로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 파티션은 복수의 샘플 핵산 분자(예를 들어, 더 큰 핵산의 더 작은 조각)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 독특한 샘플 핵산 분자의 하나 이상의 복제물은 파티션마다 존재한다. 일부 경우에, 각각의 파티션은 일반적으로 동일한 바코드 서열 및 샘플 프라이밍 서열(예를 들어, 가변적 무작위-N량체, 표적화된 N-량체)을 포함하는 프라이머를 포함할 수 있고, 바코드 서열은 일반적으로 파티션 간에 상이하다. 이러한 경우에, 각각의 파티션(따라서, 파티션 내 샘플 핵산)은 독특한 바코드 서열과 회합될 수 있고, 독특한 바코드 서열은 파티션 내에서 생성된 바코딩된 샘플 핵산을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 바코딩된 샘플 핵산의 생성 시, 바코딩된 샘플 핵산은 그들의 개개 파티션으로부터 방출될 수 있고, 풀링된 다음에, 모든 하류의 시퀀서-준비 산물에 대해 통상적인 추가적인 서열(예를 들어, 추가적인 시퀀싱 프라이머 결합 부위, 추가적인 시퀀서 프라이머 결합 부위, 추가적인 바코드 서열, 샘플 지표 서열)을 첨가하기 위한 대량 증폭 계획을 실시한다. 파티션이 에멀전의 액적인 경우에, 에멀전은 파괴되고, 바코딩된 샘플 핵산은 풀링될 수 있다. 샘플 지표는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 연속 증폭 방법을 이용하여 방출, 바코딩된 샘플 핵산에 대량으로 첨가될 수 있다. 샘플 지표가 대량으로 첨가되는 경우, 동일한 샘플로부터 생성된 각각의 시퀀서-준비 산물은 시퀀서-준비 산물에 대한 판독으로부터 생성되는 샘플을 동정하기 위해 사용될 수 있는 동일한 샘플 지표를 포함할 것이다. 샘플 지표가 바코딩 동안 첨가되는 경우, 동일한 샘플로부터 생성된 각각의 시퀀서-준비 산물이 동일한 샘플 지표 서열을 포함하도록, 바코딩을 위해 사용되는 각각의 프라이머는 동일한 샘플 지표 서열을 포함할 수 있다.
바코딩된(또는 바코딩된 및 샘플 지표화된) 샘플 핵산 및 바코딩된 샘플 핵산에 대한 추가적인 서열의 후속적 첨가(예를 들어, 샘플 지표를 포함)를 생성하기 위한 샘플 핵산의 분할은 각각의 샘플에 대해 상이한 샘플 지표를 이용하여 각각의 샘플에 대해 반복될 수 있다. 일부 경우에, 미세유체 액적 발생기는 샘플 핵산을 분할하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 상이한 샘플이 각각의 액적 발생기에서 가공되어 병행 샘플 지표를 허용하도록 미세유체 칩은 다중 액적 발생기를 포함할 수 있다. 각각의 상이한 샘플 지표를 통해, 시퀀싱 동안 다중복합화가 달성될 수 있다.
시퀀서-준비 올리고뉴클레오타이드의 생성 시, 이어서, 시퀀서-준비 올리고뉴클레오타이드는 시퀀싱을 위한 시퀀싱 장치에 제공될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 시퀀싱 장치에 제공된 전체 서열은 시퀀싱 장치와 양립 가능한 하나 이상의 어댑터(예를 들어, P5, P7), 하나 이상의 바코드 서열, 하나 이상의 프라이머 결합 부위(예를 들어, Read1 (R1) 서열 프라이머, 판독2(R2) 시퀀싱 프라이머, 지표 프라이머), N-량체 서열, 보편적 서열, 관심 대상의 서열 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바코드 서열은 서열의 말단 중 하나에 위치될 수 있다. 일부 경우에, 바코드 서열은 P5와 판독1 서열 프라이머 결합 부위 사이에 위치될 수 있다. 다른 경우에, 바코드 서열은 P7과 판독2 서열 프라이머 결합 부위 사이에 위치될 수 있다. 일부 경우에, 제2 바코드 서열은 P7과 판독 2 서열 프라이머 결합 부위 사이에 위치될 수 있다. 지표 서열 프라이머 결합 부위는 바코드 서열을 결정하기 위해 시퀀싱 장치에서 이용될 수 있다.
시퀀서 장치에 제공될 서열의 다양한 성분(예를 들어, 어댑터, 바코드 서열, 샘플 지표 서열, 샘플 서열, 프라이머 결합 부위 등)의 입체배치는, 예를 들어 목적으로 하는 특정 입체배치 및/또는 서열의 다양한 성분이 첨가되는 순서에 따라서 다를 수 있다. 시퀀싱을 위한 임의의 적합한 입체배치가 사용될 수 있고, 임의의 서열은 임의의 적합한 순서로 올리고뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다. 추가적인 서열은 샘플 핵산의 바코딩 전에, 동안에 그리고 후에 샘플 핵산에 첨가될 수 있다. 예를 들어, P5 서열은 바코딩 동안 샘플 핵산에 첨가될 수 있고, P7은 샘플 핵산의 바코딩 후 대량 증폭에서 첨가될 수 있다. 대안적으로, P7 서열은 바코딩 동안 샘플 핵산에 첨가될 수 있고, P5 서열은 샘플 핵산의 바코딩 후에 대량 증폭에서 첨가될 수 있다. 본 명세서에서 예로서 나타내는 예시적인 입체배치는 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 게다가, 증폭을 통한 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열 성분의 첨가는 또한 제한을 의미하지 않는다. 다른 방법, 예를 들어, 결찰이 또한 사용될 수 있다. 더 나아가, 본 명세서에 기재된 어댑터, 바코드 서열, 샘플 지표 서열, 프라이머 결합 부위, 시퀀서-준비 산물 등은 제한을 의미하지 않는다. 시퀀서-준비 산물을 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 유형의 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 임의의 적합한 유형의 시퀀싱 플랫폼(예를 들어, 일루미나 시퀀싱(Illumina sequencing), 라이크 테크놀로지즈 이온 토렌트(Life Technologies Ion Torrent), 퍼시픽 바이오사이언시즈(Pacific Biosciences) SMRT, 로슈(Roche) 454 시퀀싱, 라이프 테크놀로지즈 솔리드 시퀀싱(Life Technologies SOLiD sequencing) 등)을 위해 생성될 수 있다.
시퀀서-준비 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 특정 시퀀싱 플랫폼에 적합한 임의의 어댑터에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 라이프 테크놀로지즈 이온 토렌트 시퀀싱에 유용한 하나 이상의 바코드 서열 및 P1 및 A 어댑터 서열을 포함하는 시퀀서-준비 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 일 예에서, 이황화 결합을 통해 P1 서열에 연결된 아크릴다이트 모이어티를 포함하는 비드(예를 들어, 겔 비드)가 생성될 수 있다. P1서열, 바코드 서열, 및 무작위 N-량체 서열을 포함하는 바코드 작제물이 생성될 수 있다. 바코드 작제물은 바코드 샘플 핵산에 대한 증폭 반응에 (예를 들어, 파티션, 예컨대 유체 액적에서) 유입될 수 있다. 이어서, 바코딩된 앰플리콘은 A 서열 및 목적으로 하는 임의의 다른 서열, 예컨대 샘플 지표를 첨가하기 위해 대량으로 추가 증폭을 실시할 수 있다. 대안적으로, A가 샘플 바코딩 동안 첨가되고, P1이 대량으로 첨가되도록 P1 및 A 서열은 상호 교환될 수 있다. 이어서, 완전한 서열이 이온 토렌트 시퀀서에 유입될 수 있다. 다른 시퀀싱 플랫폼에 대한 다른 어댑터 서열(예를 들어, 라이프 테크놀로지즈 솔리드 시퀀싱에 대한 P1 어댑서 서열, 로슈 454에 대한 A 및 B 어댑터 서열 등)은 유사한 방식으로 첨가될 수 있다.
부분적 헤어핀 분자를 생성하는 것으로, 일부 경우에, 완전한 헤어핀의 형성을 방지하는 것으로 본 명세서에서 기재하였지만, 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 바코드 서열을 포함하는 완전한 헤어핀 단편을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 이러한 완전한 헤어핀 분자는 통상적인 시퀀싱 작업 흐름에서 이중 가닥 듀플렉스 분자 중 하나의 말단으로서 단일 헤어핀 분자의 3' 및 5' 말단을 처리함으로써 통상적인 샘플 제제 단계를 추가로 실시할 수 있다. 특히, 통상적인 결찰 단계를 이용하여, 듀플렉스 분자의 3' 및 5' 말단에 부착된 것과 동일한 방식으로 헤어핀 분자의 3'과 5' 말단 둘 다에 적절한 어댑터 서열을 용이하게 부착할 수 있다. 예를 들어, 일루미나 기반 시퀀싱 공정의 경우에, 표준 일루미나 프로토콜을 이용하여 듀플렉스 분자 중 하나의 말단과 같이 헤어핀 중 하나의 말단에 P5 및 P7 어댑터와 R1 및 R2 프라이머 서열을 포함하는 표준 Y 어댑터를 부착할 수 있다.
VII. 디지털 처리기
본 개시내용의 방법, 조성물, 장치 및 키트는 임의의 적합한 처리기, 디지털 처리기 또는 컴퓨터와 함께 이용될 수 있다. 디지털 처리기는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 장치 및/또는 실행 방법의 임의의 성분을 작동시키도록 프로그래밍될 수 있다. 디지털 처리기는 컴퓨터 네트워크, 예를 들어, 인터넷을 통한 전자 신호를 전송 또는 수신하고/하거나 원거리 컴퓨터와 통신할 수 있다. 하나 이상의 주변장치, 예컨대 스크린 디스플레이, 프린터, 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자적 디스플레이 어댑터는 디지털 처리기와 통신할 수 있다. 하나 이상의 입력 장치, 예컨대 키보드, 마우스 또는 조이스틱은 디지털 처리기와 통신할 수 있다. 검출기가 목적으로 하는 또는 다르게 사전결정한 시점에 또는 전처리 장치 또는 기타 장치로부터 수신한 피드백으로부터 결정한 시점에 측정을 수행하도록 디지털 처리기는 또한 검출기와 통신할 수 있다.
일 예에서, 제어기는 제어 어셈블리에 대한 중앙 허브로서 작용하는 컴퓨터를 포함한다. 컴퓨터는 디스플레이, 하나 이상의 입력 장치(예를 들어, 마우스, 키보드, 카메라 등), 및 선택적으로 프린터와 통신한다. 제어 어셈블리는 그의 컴퓨터를 통해 하나 이상의 장치: 선택적으로 샘플 전처리 장치, 하나 이상의 샘플 처리 장치(예컨대 서열, 서모사이클러(thermocycler), 또는 미세유체 장치), 및 선택적으로 검출기와 통신한다. 제어 어셈블리는 네트워크화, 예를 들어, 이터넷(Ethernet) 연결될 수 있다. 사용자는 입력 장치를 사용하여 컴퓨터에 대한 입력(예를 들어, 목적으로 하는 세트의 핵산 증폭 반응 또는 미세유체 장치에 대한 유속에 필요한 매개변수)을 제공할 수 있다. 입력은 설명서를 생성하기 위해 컴퓨터에 의해 해석된다. 컴퓨터는 이러한 지시를 선택적 샘플 전처리 장치, 하나 이상의 샘플 처리 장치 및/또는 실행을 위한 선택적 검출기에 대해 통신한다.
게다가, 선택적 샘플 전처리 장치, 하나 이상의 샘플 처리 장치 및/또는 선택적 검출기의 작업 동안, 각각의 장치는 신호가 다시 컴퓨터와 통신할 수 있다. 이러한 신호는 임의의 장치가 추가적인 지시를 필요로 하는지의 여부를 결정하기 위해 컴퓨터에 의해 해석되고 사용될 수 있다. 컴퓨터는 또한 샘플 성분이 적절하게 혼합되고, 목적으로 하는 또는 달리 사전 결정된 속도로 샘플 처리 장치(예컨대 미세유체 장치)에 공급되도록 샘플 전처리 장치를 조절할 수 있다.
검출기가 목적으로 하는 또는 다르게 사전결정한 시점에 또는 전처리 장치 또는 샘플 처리 장치로부터 수신한 피드백으로부터 결정한 시점에 측정을 수행하도록 컴퓨터는 또한 검출기와 통신할 수 있다. 컴퓨터는 또한 추가 분석 및 해석을 위해 다시 측정 동안 얻어진 미가공 데이터를 통신할 수 있다.
분석은 디스플레이 및/또는 프린터에 의해 생성된 인쇄를 통해 최종 사용자에게 유용한 형식으로 요약될 수 있다. 샘플 전처리 장치, 샘플 가공 장치 및/또는 검출기를 제어하기 위해 사용되는 설명서 또는 프로그램; 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 실행함으로써 획득되는 데이터; 또는 분석 및/또는 해석되는 데이터는, 예를 들어 인터넷일 수 있는 네트워크를 통해 하나 이상의 원거리 컴퓨터로부터 전송 또는 수신될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비드 형성 방법은 액적 발생기와 통신하는 디지털 발생기의 도움으로 실행될 수 있다. 디지털 처리기는 액적이 형성된 속도를 제어하거나 또는 생성된 액적의 총 수를 제어할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코딩된 비드에 샘플을 부착하는 방법은 미세유체 장치와 통신하는 디지털 처리기의 도움에 의해 실행될 수 있다. 구체적으로, 디지털 처리기는 주입 통로 내로 주입된 샘플 및/또는 비드의 용적 양을 제어할 수 있고, 또한 통로 내에서 유속을 제어할 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드, 프라이머 등을 부착하는 방법은 열순환기(thermocycler) 또는 다른 프로그램 가능한 가열 요소와 통신하는 디지털 처리기의 도움으로 실행될 수 있다. 구체적으로, 디지털 처리기는 결찰 또는 증폭 동안 순환 시간 및 온도를 제어할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플을 시퀀싱하는 방법은 시퀀싱 장치와 통신하는 디지털 처리기의 도움으로 실행될 수 있다.
VIII. 키트
일부 경우에, 본 개시내용은 미세유체 장치, 복수의 바코딩된 비드, 및 미세유체 장치를 이용하고 바코딩된 비드를 고객 샘플과 조합하여 둘 다 함유하는 유동 액적을 생성하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용 전체적으로 구체화되는 바와 같이, 임의의 적합한 샘플이 유동 액적에 혼입될 수 있다. 본 개시내용 전체적으로 기재된 바와 같이, 비드는 검출 가능하거나 또는 검출 가능하지 않도록 설계될 수 있다. 이 경우에, 키트는 비드 분해를 위해 환원제를 포함할 수도 있거나 포함하지 않을 수도 있다.
일부 경우에, 본 개시내용은, 복수의 바코딩된 비드, 적합한 증폭 시약(예를 들어, 선택적으로 중합효소 효소, 뉴클레오사이드 삼인산염 또는 그들의 유사체, 프라이머 서열, 완충제 등 중 하나 이상을 포함) 및 바코딩된 비드를 고객 샘플과 조합하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다. 본 개시내용 전체적으로 구체화되는 바와 같이, 임의의 적합한 샘플이 사용될 수 있다. 본 개시내용 전체적으로 구체화된 바와 같이, 증폭 시약은 유라실-함유 주형을 수용하거나 또는 처리하지 않는 중합효소를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 키트는 또한 오일 및 계면활성제를 포함하는 에멀전을 형성하기 위한 제제를 제공할 수 있다.
IX. 적용분야
샘플 물질의 바코딩
본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 시스템은 바코드 및 특히 바코드 핵산 서열을 샘플 물질 및 해당 샘플 물질의 성분에 부착하는데 특히 유용하다. 일반적으로, 이는 샘플 물질 성분을 복수의 바코드로 공동 분할되고, 이어서 동일한 파티션 내에서 샘플 성분에 부착되는 별개의 파티션으로 분할함으로써 수행된다.
예시적 공정에서, 통상적인 핵산 바코드 서열을 각각 포함하는 복수의 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 핵산 바코드 분자)를 포함하는 제1 파티션이 제공된다. 제1 파티션은 올리고뉴클레오타이드가 방출 가능하게 부착되거나, 방출 가능하게 결합되거나 또는 방출 가능하게 회합되는 임의의 다양한 휴대용 파티션, 예를 들어, 비드(예를 들어, 분해 가능한 비드, 겔 비드), 액적(예를 들어, 에멀전 중의 수성 액적), 마이크로캡슐 등을 포함할 수 있다. 게다가, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 파티션 당 올리고뉴클레오타이드 수를 포함하는 임의의 적합한 수의 올리고뉴클레오타이드가 제1 파티션에 포함될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 절단 가능한 결합, 예를 들어, 화학적으로 절단 가능한 결합(예를 들어, 이황화 결합, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 유형의 화학적으로 절단 가능한 결합), 광 절단성 결합 및/또는 열 절단성 결합을 통해 제1 파티션에 방출 가능하게 부착되거나, 방출 가능하게 결합되거나, 또는 방출 가능하게 회합될 수 있다. 일부 경우에, 제1 파티션은 비드일 수 있고, 비드는 분해 가능한 비드(예를 들어, 광 분해성 비드, 화학적으로 분해 가능한 비드, 열적으로 분해 가능한 비드 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 다른 유형의 분해 가능한 비드)일 수 있다. 게다가, 비드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 화학적으로 절단 가능한 가교(예를 들어, 이황화물 가교)를 포함할 수 있다.
이어서, 제1 파티션은 샘플 물질, 샘플 물질 성분, 샘플 물질의 단편, 또는 샘플 물질 성분의 단편에 의해 제2 파티션으로 공동 분할된다. 샘플 물질(또는 이들의 성분 또는 단편)은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 예시적 샘플 유형을 포함하는 임의의 적절한 샘플 유형일 수 있다. 샘플 물질 또는 샘플 물질의 성분이 하나 이상의 핵산 단편을 포함하는 경우에, 하나 이상의 핵산 단편은, 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 핵산 단편 길이를 포함하는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 제2 파티션은, 예를 들어, 웰, 마이크로웰, 나노웰, 관 또는 용기, 또는 바람직한 경우에 액적(예를 들어, 에멀전 중의 수성 액적) 또는 마이크로캡슐을 포함하는 임의의 다양한 파티션을 포함할 수 있으며, 이때 제1 파티션은 공동 분할될 수 있다. 일부 경우에, 제1 파티션은 제1 수성 유체 중에서 제공될 수 있고, 샘플 물질, 샘플 물질 성분, 또는 샘플 물질 성분의 단편은 제2 수성 유체 중에 제공될 수 있다. 공동 분할 동안, 제1 수성 유체 및 제2 수성 유체는 비혼화성 유체 내의 액적 내에서 조합될 수 있다. 일부 경우에, 제2 파티션은 1개 이하의 제1 파티션을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 제2 파티션은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이하의 제1 파티션을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 제2 파티션은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 제1 파티션을 포함할 수 있다.
일단 공동 분할되면, 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 제1 파티션으로부터 (예를 들어, 올리고뉴클레오타이드와 제1 파티션 사이의 화학적 결합을 절단하는 제1 파티션의 분해, 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 방출 유형을 포함하는 임의의 다른 적합한 유형의 방출을 통해) 제2 파티션으로 방출될 수 있고, 그와 함께 공동 분할된 샘플 성분에 부착될 수 있다. 일부 경우에, 제1 파티션은 비드를 포함할 수 있고, 비드의 가교는 이황화 결합을 포함할 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드는 이황화 결합을 통해 비드에 연결될 수 있다. 경우 중 하나에서, 올리고뉴클레오타이드는 제1 파티션을 환원제(예를 들어, DTT, TCEP, 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 다른 예시적 환원제)에 노출시킴으로써 제1 파티션으로부터 방출될 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에서 언급하는 바와 같이, 샘플 성분에 대한 바코드의 부착은 샘플 물질, 예를 들어, 결찰, 혼성화 또는 다른 회합을 통한 샘플 물질에 대한 바코드 올리고뉴클레오타이드의 직접적 부착을 포함한다. 추가적으로, 다른 경우에, 예를 들어, 핵산 샘플 물질(예를 들어, 주형 핵산 서열, 주형 핵산 분자), 성분 또는 이들의 단편의 바코딩에서, 이러한 부착은 또한 프라이밍 서열로서 포함되는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 바코드의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 프라이밍 서열은 핵산 샘플 물질의 적어도 일부에 대해 상보성일 수 있고, 이러한 샘플 물질에 대한 상보체뿐만 아니라 해당 서열 또는 그들의 상보체의 적어도 부분적인 증폭 산물을 생성하기 위해 핵산 샘플 물질을 따라 연장될 수 있다.
다른 예시적 공정에서, 복수의 상이한 핵산 바코드 서열을 포함하는 복수의 제1 파티션이 제공될 수 있다. 각각의 제1 파티션은 그와 회합된 동일한 핵산 바코드 서열을 갖는 복수의 핵산 바코드를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 수의 핵산 바코드 분자는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 파티션 당 핵산 바코드 분자의 수를 포함하는 각각의 제1 파티션과 회합될 수 있다. 제1 파티션은, 예를 들어, 적어도 약 2, 10, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 또는 1000000000개 이상의 상이한 핵산 바코드 서열을 포함하는 임의의 적합한 수의 상이한 핵산 바코드 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 복수의 제1 파티션은 복수의 상이한 제1 파티션을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 상이한 제1 파티션은 상이한 바코드 서열을 포함하는 각각의 상이한 제1 파티션과 회합된 올리고뉴클레오타이드와 함께 통상적인 바코드 서열을 포함하는 복수의 방출 가능하게 부착되거나, 방출 가능하게 결합되거나 또는 방출 가능하게 회합된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상이한 제1 파티션의 수는, 예를 들어, 적어도 약 2, 10, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 또는 1000000000개 이상의 상이한 제1 파티션일 수 있다.
제1 파티션은 샘플 물질, 샘플 물질의 단편, 샘플 물질의 성분, 또는 샘플 물질의 성분(들)의 단편을 복수의 제2 파티션으로 공동분할할 수 있다. 일부 경우에, 제2 파티션의 서브세트는 동일한 핵산 바코드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제2 파티션의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상은 동일한 핵산 바코드 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 제2 파티션 당 제1 파티션의 분포는 또한, 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 점유율에 따라 다를 수 있다. 복수의 제1 파티션이 복수의 상이한 제1 파티션을 포함하는 경우에, 각각의 상이한 제1 파티션은 별개의 제2 파티션 내에 배치될 수 있다.
공동 분할 후에, 제1 파티션과 회합된 핵산 바코드 분자는 복수의 제2 파티션에 방출될 수 있다. 이어서, 방출된 핵산 바코드 분자는 제2 파티션 내에서 샘플 물질, 샘플 물질 성분, 샘플 물질의 단편, 또는 샘플 물질 성분의 단편에 부착될 수 있다. 바코딩된 핵산 종(예를 들어, 바코딩된 샘플 핵산, 바코딩된 주형 핵산, 하나 이상의 주형 핵산 서열의 바코딩된 단편 등)의 경우에, 바코딩된 핵산종은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 시퀀싱될 수 있다.
다른 예시적 공정에서, 활성화 가능한 핵산 바코드 서열이 제공되고, 하나 이상의 샘플 물질, 샘플 물질의 성분, 샘플 물질의 단편, 또는 샘플 물질의 구성성분(들)을 단편의 제1 파티션으로 분할할 수 있다. 제1 파티션에 의해, 활성화 가능한 핵산 바코드 서열은 활성 핵산 바코드 서열을 생성하도록 활성화될 수 있다. 이어서, 활성 핵산 바코드 서열은 하나 이상의 샘플 물질, 샘플 물질의 성분, 샘플 물질의 단편, 또는 샘플 물질의 성분(들)의 단편에 부착될 수 있다.
일부 경우에, 활성화 가능한 핵산 바코드 서열은 활성화 가능한 핵산 바코드 서열에 의해 제1 파티션으로 또한 분할되는 제2 파티션에 결합될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 활성화 가능한 핵산 바코드 서열은 회합된 파티션(예를 들어, 비드)으로부터 활성화 가능한 핵산 바코드를 방출함으로써 활성화될 수 있다. 따라서, 활성화 가능한 핵산 바코드 서열이 제1 파티션(예를 들어, 유체 액적)에서 분할되는 제2 파티션(예를 들어, 비드)과 회합되는 경우에, 활성화 가능한 핵산 바코드 서열은 그의 회합된 제2 파티션으로부터 활성화 가능한 핵산 바코드 서열을 방출함으로써 활성화될 수 있다. 추가로, 또는 대안으로서, 활성화 가능한 바코드는 또한 활성화 가능한 핵산 바코드 서열로부터 제거 가능한 차단 또는 보호기를 제거함으로써 활성화될 수 있다.
다른 예시적 공정에서, 핵산 샘플은 바코딩된 비드(본 명세서의 다른 곳에 기재된 비드 유형을 포함함)의 라이브러리와 조합되어 혼합물을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 비드의 바코드는, 바코드 서열에 추가적으로, 하나 이상의 추가적인 서열, 예를 들어, 보편적 서열 및/또는 기능성 서열(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 무작위 N-량체 또는 표적화된 N-량체)을 각각 포함할 수 있다. 혼합물은 복수의 파티션으로 분할될 수 있는데, 적어도 파티션의 서브세트는 하나 이상의 바코딩된 비드를 포함할 수 있다. 파티션 내에서, 바코드는 본 명세서에 기재된 방출 유형을 포함하는 임의의 적합한 경로를 이용하여 비드로부터 방출될 수 있다. 바코딩된 비드의 라이브러리는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 방법 및 조성물의 사용을 포함하는 임의의 적합한 경로를 통해 생성될 수 있다. 일부 경우에, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 핵산 샘플은 바코딩된 비드의 라이브러리와 조합될 수 있고/있거나 얻어진 혼합물은 미세유체 장치의 도움으로 분할될 수 있다. 방출된 바코드가 또한 프라이머 서열(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재한 바와 같은 표적화된 N-량체 또는 무작위 N-량체)을 포함하는 경우에, 바코드의 프라이머 서열은 샘플 핵산과 혼성화될 수 있고, 원한다면, 증폭 반응은 파티션에서 완료될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 시퀀싱
일반적으로, 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 시퀀싱과 같은 하류 적용을 위한 올리고뉴클레오타이드 단편의 제조에 유용하다. 특히, 이들 방법, 조성물 및 시스템은 시퀀싱 라이브러리의 제조에 유용하다. 시퀀싱은 임의의 입수 가능한 기법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱은 고전적 생어 시퀀싱 방법에 의해 수행될 수 있다. 시퀀싱 방법은 또한 고속 대량 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 결찰에 의한 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 혼성화에 의한 시퀀싱, RNA-Seq(일루미나), 디지털 유전자 발현(Digital Gene Expression)(헬리코스(Helicos)), 차세대 시퀀싱, 합성에 의한 단일 분자 시퀀싱(SMSS)(헬리코스), 대량 병렬 시퀀싱, 클론 단일 분자 어레이(솔렉사(Solexa)), 샷건 시퀀싱, 막심-길버트(Maxim-Gilbert) 시퀀싱, 프라이머 워킹 및 당업계에 공지된 임의의 다른 시퀀싱 방법을 포함할 수 있다.
예를 들어, 복수의 표적 핵산 서열을 제공하고, 표적 핵산 서열을 복수의 별개의 파티션으로 분리함으로써 복수의 표적 핵산 서열은 시퀀싱될 수 있다. 각각의 별개의 파티션은 하나 이상의 표적 핵산 서열 및 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 별개의 파티션은 임의의 적합한 수의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 적어도 1,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 10,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 100,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 1,000,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 10,000,000개의 상이한 바코드 서열, 또는 임의의 다른 수의 본 명세서의 다른 곳에 기재된 상이한 바코드 서열)을 포함할 수 있다. 게다가, 주어진 파티션 내 올리고뉴클레오타이드는 통상적인 바코드 서열을 포함할 수 있다. 주어진 파티션에서 올리고뉴클레오타이드 및 회합된 통상적인 바코드 서열은 하나 이상의 표적 핵산의 단편에 또는 주어진 파티션 내의 표적 핵산 서열의 일부의 복제물에 부착될 수 있다. 부착 후에, 이어서, 별개의 파티션이 풀링될 수 있다. 이어서, 표적 핵산의 단편 또는 표적 핵산 일부의 복제물 및 부착된 바코드 서열이 시퀀싱될 수 있다.
다른 예에서, 복수의 표적 핵산 서열은 표적 핵산 서열을 제공함으로써, 그리고 그들을 복수의 별개의 파티션으로 분리함으로써 시퀀싱될 수 있다. 복수의 별개의 파티션의 각각의 파티션은 표적 핵산 서열 중 하나 이상 및 복수의 부착된 올리고뉴클레오타이드를 갖는 비드를 포함할 수 있다. 주어진 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드는 통상적인 바코드 서열을 포함할 수 있다. 주어진 파티션의 단편 또는 복제물이 또한 비드와 회합된 통상적인 바코드 서열에 부착되도록, 비드와 회합된 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산 서열의 단편에 또는 주어진 파티션 내의 표적 핵산 서열의 일부의 복제물에 부착될 수 있다. 표적 핵산 서열의 단편 또는 표적 핵산 서열의 일부의 복제물에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착 후에, 이어서, 별개의 파티션은 풀링될 수 있다. 이어서, 표적 핵산 서열의 단편 또는 표적 핵산 서열의 일부의 복제물 및 임의의 부착된 바코드 서열은 (예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 것을 포함하는 임의의 적합한 시퀀싱 방법을 이용하여) 바코딩된 단편 서열 또는 바코딩된 복제물 서열을 제공하도록 시퀀싱할 수 있다. 바코딩된 단편 서열 또는 바코딩된 복제물 서열은 바코딩된 단편 서열 또는 바코딩된 복제물 서열의 바코드 부분에 부분적으로 기반하여 하나 이상의 연속적 핵산 서열로 조립될 수 있다.
일부 경우에, 다양한 수의 바코딩된-올리고뉴클레오타이드가 시퀀싱된다. 예를 들어, 일부 경우에 바코딩된-올리고뉴클레오타이드의 약 30% 내지 90%가 시퀀싱된다. 일부 경우에, 바코딩된-올리고뉴클레오타이드의 약 35% 내지 85%, 40% 내지 80%, 45% 내지 75%, 55% 내지 65% 또는 50% 내지 60%가 시퀀싱된다. 일부 경우에, 바코딩된-올리고뉴클레오타이드의 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 시퀀싱된다. 일부 경우에, 바코딩된-올리고뉴클레오타이드의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만이 시퀀싱된다.
일부 경우에, 단편으로부터의 서열은 개개 서열 판독보다 더 길 수 있는 본래의 표적 폴리뉴클레오타이드의 연속 영역에 대해 서열 정보를 제공하도록 조립된다. 개개 서열 판독은 길이로 약 10 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 200, 200 내지 300, 300 내지 400개 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 서열 조립 방법의 예는 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제14/752,773호에 제시된 것을 포함한다.
바코드의 동일성은 개개 단편으로부터의 서열 판독을 명령할 뿐만 아니라 단상형 사이의 차별화를 위한 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 유동 액적 내에서 개개 샘플 단편 및 바코딩된 비드를 조합할 때, 모 폴리뉴클레오타이드 단편은 상이한 액적으로 분리될 수 있다. 유동 액적 및 액적 내의 비드의 수가 증가함에 따라, 동일한 비드와 회합된 동일한 유체 액적 내에 함유한 모계 단상형과 부계 단상형 둘 다로부터의 단편의 우도는 무시할 만하게 작을 수 있다. 따라서, 동일한 유체 액적 내의 그리고 동일한 비드와 회합된 단편으로부터의 서열 판독은 조립되고, 정리될 수 있다.
적어도 하나의 예에서, 본 개시내용은 서열 어셈블리와 판독 길이 동등물 둘 다에서 무수한 이점을 제공함에 있어서 유용하지만, 매우 고속대량으로 행해지며, 샘플 제조 시간 및 비용이 감소된 핵산 시퀀싱 방법, 시스템 조성물 및 이들의 조합을 제공한다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 시퀀싱 방법은 유전자 서열 단편의 국소화된 태깅 또는 바코딩을 제공한다. 더 큰 유전자 서열 내의 동일한 위치로부터 유래된 단편을 태깅함으로써, 상기 나타낸 바와 같이 조립 공정을 알리기 위해 태그 또는 바코드의 존재를 이용할 수 있다. 추가로, 본 명세서에 기재된 방법은 단일의, 긴 핵산 분자로부터 더 짧은 단편을 생성 및 바코딩하는 데 사용될 수 있다. 이들 더 짧은 단편의 시퀀싱 및 어셈블리는 낮은 고속대량의 더 긴 판독 길이 시퀀싱 기법에 대한 필요 없이 긴 판독 등가 서열을 제공한다.
앞서 언급한 큰 유전자 성분, 예컨대 긴 핵산 단편, 예를 들어, 길이로 1, 10, 20, 40, 50, 75, 100, 1000개 이상의 kb에 따르면, 염색체 단편 또는 전체 염색체 또는 부분적 또는 전체 게놈(예를 들어, 게놈 DNA)은 더 작은 제1 단편으로 단편화된다. 전형적으로, 이들 단편은 길이로 어디에서나 약 1000 내지 약 100000개 염기일 수 있다. 특정 바람직한 양상에서, 단편은 약 1kb 내지 약 100kb, 또는 약 5kb 내지 약 50kb, 또는 약 10kb 내지 약 30kb, 일부 경우에, 약 15kb 내지 약 25kb일 것이다. 이들 더 큰 유전자 성분의 단편화는 상업적으로 입수 가능한 전단 기반 단편화 시스템, 예를 들어, 코바리스(Covaris) 단편화 시스템, 크기 표적화된 단편화 시스템, 예를 들어, 블루 핍핀(Blue Pippin)(세이지 사이언시즈(Sage Sciences)), 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 등을 이용하는 효소 단편화 공정을 포함하는 임의의 다양한 편리한 입수 가능한 공정에 의해 수행될 수 있다. 상기 주목한 바와 같이, 더 큰 유전자 성분의 제1 단편은 중복 또는 비중복 제1 단편을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 분할 전에 단편화되는 것으로 기재하였지만, 단편화는 시퀀싱 적용을 위해 목적으로 하는 크기의 단편을 수득하기 위해, 예를 들어, 하나 이상의 증폭 단계 후에 공정에서 이후에 선택적으로 및/또는 추가적으로 수행될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
바람직한 양상에서, 중복 제1 단편이 생성되도록 제1 단편화는 더 큰 유전자 성분 또는 이의 일부의 다중 복제물로부터 생성된다. 바람직한 양상에서, 중복 단편은 근본적인 더 큰 유전자 성분 또는 이의 일부의 1X 초과의 범위, 2X 초과의 범위, 5X 초과의 범위, 10X 초과의 범위, 20X 초과의 범위, 40 X 초과의 범위 또는 심지어 더 큰 범위를 구성할 것이다. 이어서, 제1 단편은 상이한 반응 용적으로 분리된다. 일부 경우에, 반응 용적이 하나 이하의 제1 단편을 함유하도록 제1 단편은 분리될 수 있다. 이는, 상이한 반응 용적에 대한 용액의 분배는 하나 초과의 단편이 주어진 반응 용적에 침착될 매우 낮은 확률을 초래하도록 용액 중에서 한계 희석법으로 단편을 제공함으로써 달성된다. 그러나, 대부분의 경우에, 주어진 반응 용적은 다수의 상이한 제1 단편을 포함할 수 있고, 주어진 반응 용적에서 심지어 2, 5, 10, 100, 100 또는 심지어 10,000개 이상의 상이한 제1 단편을 가질 수 있다. 또한, 개개 반응 용적 내에서 목적으로 하는 범위의 단편 수를 달성하는 것은 전형적으로 해당 출발 물질에서 핵산 농도의 이해에 기반하여 제1 단편으로부터 유래된 용액의 적절한 희석을 통해 달성된다.
반응 용적은 임의의 다양한 상이한 유형의 용기 또는 파티션을 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 용적은 통상적인 반응 용기, 예컨대 시험관, 반응웰, 마이크로웰, 나노웰을 포함할 수 있거나, 또는 그들은 덜 통상적인 반응 용적, 예컨대 안정화된 에멀전, 예를 들어,유중수 에멀전 시스템 내의 액적을 포함할 수 있다. 바람직한 양상에서, 액적은 그들의 극도로 높은 다중복합 능력에 대해 반응 용적으로서 바람직하며, 예를 들어, 단일 용기 내에서 수십만, 수백만, 수천만 또는 심지어 더 많은 별도의 액적/반응 용적의 사용을 허용한다. 각각의 반응 용적 내에서, 이어서, 그에 함유된 단편은 각각의 제1 단편의 중복되는 제2 단편의 세트로부터 유래된 가공이 실시되며, 또한 부착된 바코드 서열을 지니는 제2 단편을 제공한다. 인식될 바와 같이, 바람직한 양상에서, 제1 단편은 제2 단편을 생성 및 바코딩하기 위해 사용되는 바코드 라이브러리의 구성원을 포함하는 하나 이상의 마이크로캡슐 또는 비드를 또한 함유하는 액적으로 분할된다.
바람직한 양상에서, 이들 제2 단편의 생성은 바코드 서열을 포함하고 제1 단편의 일부에 혼성화할 수 있는 프라이머 서열의 도입을 통해 수행되고, 바코드 서열을 포함하는 제2 단편을 제공하기 위해 제1 단편을 따라서 연장된다. 이들 프라이머는, 예를 들어, 제1 단편의 특정 부분과 중복되는 단편을 유도하기 위해 표적화된 프라이머 서열을 포함할 수 있거나, 또는 그들은 제1 단편을 확장하고 다중폴딩 중복 범위를 제공하는 제2 단편의 크고 다양한 세트를 생성하기 위해 제1 단편의 다수의 상이한 영역을 프라이밍하는 보편적 프라이밍 서열, 예를 들어 무작위 프라이머를 포함할 수 있다. 이들 연장된 프라이머 서열은 제2 단편으로서 사용될 수 있거나, 또는 그들은 추가로 복제 또는 증폭될 수 있다. 예를 들어, 바코딩된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 동일한 프라이머를 이용하는, 예를 들어, 연장된 서열에 대한 반복적 프라이밍. 특정 바람직한 양상에서, 단편의 제2 세트의 생성은 바코드 서열, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 위상 증폭을 각각 포함하는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 제1 단편의 일부의 부분적 헤어핀 복제물을 생성한다. 본 명세서의 다른 곳에서 주목한 바와 같이, 부분적 헤어핀의 형성은 일반적으로 복제된 가닥의 재프라이밍, 예를 들어, 복제물의 복제물의 제조를 방지하는 것이 요망된다. 그렇게 해서, 부분적 헤어핀은 전형적으로 증폭 산물에 대한 프라이머 어닐링에 비해 어닐링 동안 증폭 산물로부터 우선적으로 형성되며, 예를 들어, 헤어핀은 프라이머 산물 쌍보다 더 높은 Tm을 가질 것이다.
제2 단편은 일반적으로 후속적 시퀀싱에 적합한 길이를 갖도록 선택된다. 짧은 판독 시퀀싱 기법에 대해, 이러한 단편은 전형적으로 바코드 서열 세그먼트, 및 시퀀싱 공정이 실시된 기능성 서열을 포함하여 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 1000개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 900개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 800개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 700개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 600개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 500개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 400개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 300개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 250개의 염기, 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 200개의 염기, 또는 시퀀싱 가능한 길이로 약 50개의 염기 내지 약 100개의 염기일 것이다.
일단 중복되면, 바코딩된 제2 단편 세트가 생성되며, 그들은 후속적 가공 및 궁극적으로 시퀀싱을 위해 풀링될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 바코딩된 단편은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 추가적인 증폭, 예를 들어, PCR 증폭이 후속적으로 실시될 수 있다. 마찬가지로, 이들 단편은 추가적으로 또는 동시에 바코딩된 단편의 수집물로부터 유래된 샘플을 동정할 뿐만 아니라 시퀀싱 공정에서 사용하기 위한 추가적인 기능성 서열을 제공함에 있어서 샘플 지표 서열이 제공될 수 있다.
추가로, 세정 단계는 또한 선택적으로, 예를 들어, 다른 불순물로부터 핵산 성분을 정제하기 위해, 시퀀싱 등을 위해 단편 세트의 크기 선택을 위해 수행될 수 있다. 이러한 세정 단계는 SPRI 비드(예컨대 베그칸 쿨터 인코포레이티드(Beckman Coulter, Inc.)로부터 입수 가능한 앰퓨어(Ampure)(등록상표) 비드)에 대한 정제 및/또는 크기 선택을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 다중 공정 단계는 통합 공정으로 수행될 수 있는 반면, 단편은, 예를 들어, 모든 목적을 위하여 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 문헌[Fisher et al., Genome Biol. 2011:12(1):R1 (E-pub Jan 4, 2011)]에 기재된 바와 같은 SPRI 비드와 회합된다.
앞서 주목한 바와 같이, 다수의 경우에, 짧은 판독 시퀀싱 기법은 제2 단편 세트에 대한 서열 정보를 제공하기 위해 사용된다. 따라서, 바람직한 양상에서, 제2 단편 세트는 전형적으로, 바코드 서열을 포함할 때 사용되는 시퀀싱 시스템의 판독 길이 내에 있을 단편을 포함할 것이다. 예를 들어, 일루미나 HiSeq(등록상표) 시퀀싱을 위해, 이러한 단편은 짝지어진 말단 시퀀싱을 수행할 때 일반적으로 길이로 약 100개의 염기 내지 약 200개 염기의 범위일 수 있다. 일부 경우에, 시퀀싱 공정에 의해 단편의 말단 부분만을 접근할 때 더 긴 제2 단편은 시퀀싱될 수 있다.
인식될 바와 같이, 짧은 서열 데이터에 기반함에도 불구하고, 특히 이러한 서열이 인접한 서열 세그먼트에 달리 조합할 수 있는 경우, 예를 들어, 통상적인 바코드를 보유하는 다른 중복 서열을 이용하여, 동일한 더 긴 제1 단편 서열로부터 유래될 가능성이 있는 동일한 바코드를 공유하는 2개의 서열을 추론할 수 있다. 일단 제1 단편이 조립되면, 그들은 더 큰 서열 세그먼트, 예를 들어, 전장 유전자 성분에 조립될 수 있다.
하나의 예시적인 과정에서, 하나 이상의 주형 핵산의 하나 이상의 단편은 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 바코딩될 수 있다. 하나 이상의 단편의 단편은 그에 부착된 핵산 바코드 서열에 적어도 부분적으로 기반하여 특성 규명될 수 있다. 단편의 특성규명은 또한 주형 핵산 서열로부터 유래된 각각의 주형 핵산 서열 또는 게놈에 대한 맵핑을 포함할 수 있다. 게다가, 특성규명은 또한 개개 핵산 바코드 서열 및 그에 부착된 주형 핵산 서열의 단편의 서열을 동정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본 명세서에 기재된 시퀀싱 방법은 핵산 세그먼트 또는 표적 핵산을 특성규명하는 데 유용할 수 있다. 일부 예시적 방법에서, 핵산 세그먼트는 통상적인 핵산 바코드 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 세그먼트 및 비드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 적합한 유형의 비드를 포함)를 파티션(본 명세서에 기재된 임의의 적합한 유형의 파티션, 예를 들어, 액적을 포함)으로 공동분할함으로써 특성규명될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 비드(예를 들어, 비드에 대한 자극, 예를 들어, 열 자극, 광 자극 및 화학적 자극의 적용 시 비드로부터 방출 가능)에 방출 가능하게 부착될 수 있고/있거나 하나 이상의 기능성 서열(예를 들어, 프라이머 서열, 프라이머 어닐링 서열, 고정 서열, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 다른 적합한 기능성 서열 등) 및/또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 하나 이상의 시퀀싱 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 임의의 적합한 수의 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 수를 포함하는 비드에 부착될 수 있다.
파티션 내에서, 단편 또는 복제물이 또한 통상적인 핵산 바코드 서열에 부착되도록 올리고뉴클레오타이드는 핵산 세그먼트의 단편에 또는 핵산 세그먼트의 일부의 복제물에 부착될 수 있다. 단편은 핵산 세그먼트의 중복 단편일 수 있고, 예를 들어, 2X 초과의 범위, 5X 초과의 범위, 10X 초과의 범위, 20X 초과의 범위, 40X 초과의 범위 또는 심지어 더 큰 범위의 핵산 세그먼트를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 핵산 세그먼트의 일부 또는 이의 상보체를 어닐링할 수 있는 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 세그먼트의 적어도 일부의 복제물 및 그에 따른 통상적인 핵산 바코드 서열을 생성하기 위해 올리고뉴클레오타이드는 핵산 세그먼트의 적어도 일부 또는 이의 상보체를 복제하기 위해 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 서열을 연장시킴으로써 부착될 수 있다.
복수의 바코딩된 단편 서열 또는 바코딩된 복제물 서열을 제공하기 위해 핵산 세그먼트의 단편에 대한 또는 핵산 세그먼트의 일부의 복제물에 대한 올리고뉴클레오타이드의 부착 후에, 핵산 세그먼트의 단편 또는 핵산 세그먼트 일부의 복제물 및 부착된 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드의 바코드 서열을 포함)는 본 명세서에 기재된 임의의 유형의 시퀀싱 방법을 포함하는 임의의 적합한 시퀀싱 방법을 통해 시퀀싱될 수 있다. 시퀀싱 후에, 핵산 세그먼트의 단편 또는 핵산 세그먼트 일부의 복제물은 적어도 부분적으로 통상적인 핵산 바코드 서열에 대한 그들의 부착 시 핵산 세그먼트 내에 연결되는 것을 특징으로 할 수 있다. 인식될 바와 같이, 이러한 특징은 연결되고 인접한 것을 특징으로 하는 서열뿐만 아니라 동일한 단편 내에서 연결되지만 인접한 서열은 아닐 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 시퀀싱 동안 생성된 바코딩된 단편 서열 또는 바코딩된 복제물 서열은 통상적인 핵산 바코드 서열 및/또는 바코딩된 단편 서열 또는 바코딩된 복제물 서열의 비-바코드 부분에 적어도 부분적으로 기반하여 하나 이상의 인접한 핵산 서열로 조립될 수 있다.
일부 경우에, 별개의 파티션의 복수의 상이한 파티션의 각각의 파티션이 단일 비드를 함유하도록, 복수의 핵산 세그먼트(예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 게놈의 적어도 일부의 단편)는 복수의 별개의 파티션에서 복수의 상이한 비드와 함께 공동 분할될 수 있다. 복수의 상이한 비드는 복수의 상이한 바코드 서열(예를 들어, 적어도 1,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 10,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 100,000개의 상이한 바코드 서열, 적어도 1,000,000개의 상이한 바코드 서열 또는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 임의의 다른 수의 상이한 바코드 서열)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상의 복수의 별개의 파티션은 동일한 바코드 서열을 포함하는 비드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 별개의 파티션은 동일한 바코드 서열을 갖는 비드를 포함할 수 있다. 게다가, 각각의 비드는 통상적인 핵산 바코드 서열을 포함하는 복수의 부착된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
공동 분할 후에, 바코드 서열은 각각의 파티션에서 핵산 세그먼트의 단편 또는 핵산 세그먼트 일부의 복제물에 부착될 수 있다. 이어서, 핵산 세그먼트의 단편 또는 핵산 세그먼트 일부의 복제물은 별개의 파티션으로부터 풀링될 수 있다. 풀링 후에, 핵산 세그먼트의 단편 또는 핵산 세그먼트 일부의 복제물 및 임의의 회합된 바코드 서열은 시퀀싱된 단편 또는 시퀀싱된 복제물을 제공하기 위해 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 임의의 적합한 시퀀싱 방법을 이용하여) 시퀀싱될 수 있다. 시퀀싱된 단편 또는 시퀀싱된 복제물은 통상적인 바코드 서열을 포함하는 시퀀싱된 단편 또는 시퀀싱된 복제물에 적어도 부분적으로 기반하여 통상적인 핵산 세그먼트로부터 유래되는 것을 특징으로 할 수 있다. 게다가, 시퀀싱된 단편 또는 시퀀싱된 복제물로부터 얻어진 서열은 시퀀싱된 단편 또는 시퀀싱된 복제물로부터 유래된 서열(예를 들어, 게놈의 적어도 일부)의 인접한 서열을 제공하기 위해 조립될 수 있다. 시퀀싱된 단편 또는 시퀀싱된 복제물로부터의 서열 조립체는 시퀀싱된 단편 및 시퀀싱된 단편의 통상적인 바코드 서열의 각각의 뉴클레오타이드 서열에 적어도 부분적으로 기반하여 완전하게 될 수 있다.
다른 예시적 방법에서, 표적 핵산은 표적 핵산의 단편을 복수의 액적으로 분할하는 것을 특징으로 할 수 있다. 각각의 액적은 통상적인 바코드 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오타이드에 부착된 비드를 포함할 수 있다. 통상적인 바코드 서열은 액적에서 표적 핵산의 단편의 단편에 부착될 수 있다. 이어서, 액적은 풀링되고, 풀링된 액적의 단편 및 회합된 바코드 서열은 본 명세서에 기재된 시퀀싱 방법을 포함하는 임의의 적합한 시퀀싱 방법을 이용하여 시퀀싱된다. 시퀀싱 후에, 표적 핵산의 단편의 단편은 통상적인 바코드 서열을 포함하는 표적 핵산의 단편의 단편에 적어도 부분적으로 기반하여 표적 핵산의 단편에 대해 맵핑될 수 있다.
시퀀싱에서 본 명세서에 기재된 방법, 조성물 및 시스템의 적용은 일반적으로 NGS 시퀀싱 기법, 예컨대 일루미나 MiSeq, HiSeq 및 X10 시퀀싱 시스템뿐만 아니라 라이프 테크놀로지즈 인코포레이티드사로부터 입수 가능한 시퀀싱 시스템, 예컨대 시퀀싱 시스템의 이온 토렌트 라인을 포함하는 임의의 다양한 상이한 시퀀싱 기법에 적용 가능할 수 있다. 바코드 서열에 관해 논의하였지만, 시퀀싱된 바코드 서열은, 예를 들어, 시퀀싱 오류를 설명하는 것을 포함하는 전체 바코드 서열을 포함하지 않을 수도 있다는 것이 인식될 것이다. 그렇게 해서, 동일한 바코드 서열인 두 바코드 서열의 특징에 대해 언급할 때, 이는, 예를 들어, 5, 4, 3, 2보다 더 소수로 또는 심지어 단일 염기로 변화시키는 바코드 서열의 실질적인 부분의 인식에 기반할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
소수의 세포로부터의 시퀀싱
본 명세서에 제공된 방법은 또한 세포 특이적 정보가 얻어지는 방식으로 세포 내에 포함된 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 매우 적은 샘플로부터, 예컨대 약 10 내지 100개의 세포를 포함하는 샘플로부터 유전자 변형의 검출을 가능하게 한다. 일부 경우에, 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 세포는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개의 세포는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 다른 경우에, 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이하의 세포는 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
예에서, 하나 이하의 세포(또는 하나의 세포의 추출물)가 파티션, 예를 들어, 유체 액적 내에 존재하고, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같이 바코드 올리고뉴클레오타이드와 함께 공동 분할되도록 세포 샘플(또는 조질의 세포 추출물)을 분할하는 단계를 포함할 수 있다. 이어서, 가공은 세포의 용해, 세포 내에 포함된 폴리뉴클레오타이드의 단편화, 바코딩된 비드에 대한 단편화된 폴리뉴클레오타이드의 부착, 바코딩된 비드의 풀링 및 얻어진 바코딩된 핵산 단편의 시퀀싱을 수반한다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 바코드 및 기타 시약은 비드(예를 들어, 겔 비드) 내에서 캡슐화되거나, 코팅되거나, 회합되거나 또는 분산될 수 있다. 각각의 세포가 상이한 비드와 접촉되도록 비드는 샘플(예를 들어, 세포)의 부하와 동시에 유체 액적에 부하될 수 있다. 이 기법은 각각의 세포로부터 얻은 올리고뉴클레오타이드에 독특한 바코드를 부착하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 얻어진 태깅된 올리고뉴클레오타이드는 풀링되고, 시퀀싱될 수 있고, 바코드는 올리고뉴클레오타이드의 원점을 추적하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일한 바코드를 지니는 올리고뉴클레오타이드는 동일한 세포로부터 유래되는 것으로 결정될 수 있는 반면, 상이한 바코드를 지니는 올리고뉴클레오타이드는 상이한 세포로부터 유래되는 것으로 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법은 암과 같은 질환의 존재를 나타낼 수 있는 특정 유전자 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 결장 조직 샘플의 BRAF 유전자에서 V600 돌연변이 존재를 검출하는 것은 결장암의 존재를 나타낼 수 있다. 다른 경우에, 예후적 적용은 특정 질환이 발생하는 증가된 위험 인자로서 작용할 수 있는 특정 유전자 또는 유전자들에서 돌연변이의 검출을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유선 조직 샘플에서 BRCA1 돌연변이의 존재를 검출하는 것은 이 돌연변이가 없는 사람보다 유방암이 발생할 더 높은 수준의 위험을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 본 개시내용은 두 상이한 암유전자(예를 들어, KRAS 및 EGRF)에서 돌연변이를 동정하는 방법을 제공한다. 동일한 세포가 돌연변이를 둘 다 지니는 유전자를 포함한다면, 이는 더 공격적인 형태의 암을 나타낼 수 있다. 대조적으로, 돌연변이가 두 상이한 세포에 위치된다면, 이는 암이 더 양성이거나 또는 덜 진행될 수 있다는 것을 나타낼 수 있다.
유전자 발현의 분석
본 개시내용의 방법은 유전자 발현에서 변화의 검출을 위해 가공 샘플에 적용될 수 있다. 샘플은 세포, mRNA, 또는 mRNA로부터 역전사된 cDNA를 포함할 수 있다. 샘플은 몇몇 상이한 세포 또는 조직을 포함하는 풀링된 샘플, 또는 단일 세포 또는 조직으로부터의 추출물을 포함하는 샘플일 수 있다.
세포는 유체 액적에 직접 위치될 수 있고, 용해될 수 있다. 용해 후에, 본 개시내용의 방법은 시퀀싱을 위해 세포의 올리고뉴클레오타이드를 단편화 및 바코딩하는 데 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 본 개시내용의 방법에서 사용되는 유체 액적에 그들을 도입하기 전에 세포로부터 추출될 수 있다. mRNA의 역전사는 본 명세서에 기재된 유체 액적에서, 또는 이러한 유체 액적 밖에서 수행될 수 있다. 시퀀싱 cDNA는 시간에 따라, 또는 특정 조건에 대한 노출 후에 특정 세포에서 특정 전사체의 존재비의 표시를 제공할 수 있다.
세포 또는 단백질로부터 폴리뉴클레오타이드의 분할
일 예에서, 본 개시내용에 제공된 조성물, 방법, 장치 및 키트는 유동 액적 내에서 세포 또는 단백질을 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 일 예에서, 단일 세포 또는 복수의 세포(예를 들어, 2, 10, 50, 100, 1000, 10000, 25000, 50000, 10000, 50000, 1000000개 이상의 세포)는 유체 액적 내에서 용해 완충제를 따라 비드 상에, 비드에 또는 비드 내에 부하될 수 있고, 특정 시간 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 비드는 비드 내용물의 세척 및 비드 내로 시약의 도입을 허용하는 한편 유동 액적 내의 하나 이상의 세포(예를 들어, 염색체)의 폴리뉴클레오타이드를 유지하도록 다공성일 수 있다. 이어서, 하나 이상의 세포(예를 들어, 염색체)의 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드는 본 개시내용에 제공되거나 또는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 처리될 수 있다. 본 방법은 또한 임의의 다른 세포 성분, 예컨대 단백질에 적용될 수 있다.
후성적 적용
본 개시내용의 조성물, 방법, 장치 및 키트는 후성적 적용에서 유용할 수 있다. 예를 들어, DNA 메틸화는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 포함하는 후성적 유전의 지표일 수 있다. 따라서, 핵산을 포함하는 샘플은 시퀀싱 동안 메틸화된 염기를 결정하기 위해 처리될 수 있다. 일부 경우에, 바코딩되도록 핵산을 포함하는 샘플은 두 분취액으로 분할될 수 있다. 샘플의 하나의 분취액은 비메틸화된 사이토신 함유 뉴클레오타이드를 유라실 함유 뉴클레오타이드로 전환시키기 위해 중아황산염으로 처리될 수 있다. 일부 경우에, 중아황산염 처리는 샘플 분할 전에 일어날 수 있거나 또는 샘플 분할 후에 일어날 수 있다. 이어서, 각각의 분취액은 (분할되지 않았다면) 분할될 수 있고, 파티션에서 바코딩되며, 추가적인 서열이 본 명세서에 기재된 바와 같이 대량으로 첨가되어 시퀀서-준비 산물을 생성한다. 각각의 분취액(예를 들어, 중아황산염 처리 샘플 대 비처리 샘플)에 대해 얻은 시퀀싱 데이터의 비교를 사용하여 샘플 핵산 내 염기가 메틸화되는지를 결정할 수 있다.
일부 경우에, 분할 샘플의 하나의 분취액은 메틸화-민감성 제한 효소(MSRE)로 처리될 수 있다. 샘플 핵산이 메틸화 부위로서 절단되도록 메틸화 특이적 효소는 샘플 핵산을 가공할 수 있다. 샘플 분취액의 처리는 샘플 분할 전에 일어날 수 있거나 또는 샘플 분할 후에 생길 수 있고, 바코딩된, 시퀀서-준비 산물을 생성하기 위해 사용되는 각각의 분취액은 분할될 수 있다. 각각의 분취액(예를 들어, MSRE-처리 샘플 대 비처리 샘플)에 대해 얻은 시퀀싱 데이터의 비교를 사용하여 샘플 핵산 내 염기가 메틸화되는지를 결정할 수 있다.
낮은 입력 DNA 적용
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 낮은 폴리뉴클레오타이드 입력 적용의 분석 및 시퀀싱에서 유용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법, 예컨대 위상은 낮은 폴리뉴클레오타이드 입력 적용에서 양호한 데이터 품질을 얻는데 도움을 줄 수 있고/있거나 증폭 오류를 필터링하는 데 도움을 줄 수 있다. 이들 낮은 입력 DNA 적용은 서열에 대한 샘플의 분석을 포함하고, 관심 대상의 서열이 상이한 핵산의 응집에서 존재하는 다수의 상이한 핵산을 개개로 시퀀싱하고 동정할 수 있게 하는 단지 소수의 성분인 부적절한 또는 덜 적절한 핵산의 혼합물에서 관심 대상의 특정 핵산 서열뿐만 아니라 순수한 양의 입력 DNA가 극도로 낮은 분석을 동정한다. 특정 예는 조직 샘플로부터의, 또는 순환 세포로부터의 체세포 돌연변이의 시퀀싱 및 동정을 포함하며, 여기서 방대한 샘플이 정상의 건강한 세포에 기여하는 반면, 소수는 종양 또는 다른 암 세포로부터 유래될 수 있다. 다른 예는, 예를 들어 마이크로바이옴 분석 적용에서 다수 개개 집단 성분의 특징을 포함하며, 개개 집단 구성원의 기여는 미생물 요소의 크고 다양한 집단 중에서 달리 용이하게 동정되지 않을 수도 있다. 추가 예에서, 상이한 염색체, 예를 들어 모계 및 부계 염색체로부터 동일한 영역의 상이한 가닥을 개개로 시퀀싱 및 동정할 수 있는 것은 각각의 염색체에 대해 독특한 변이체의 동정을 허용한다. 본 명세서에 기재된 조성물, 방법 및 시스템의 낮은 폴리뉴클레오타이드 입력 적용의 추가적인 예는 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/017,580호에서 제시된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 시스템의 이점은 당업계의 현재의 상태에서 닥친 문제의 논의에 대해 더 분명하게 된다. 샘플 물질, 예를 들어, 세포 또는 조직 샘플의 유전자 구성을 분석함에 있어서, 대부분의 시퀀싱 기법은 시퀀싱 공정을 위한 충분한 물질을 생성하기 위해 샘플에서 표적 핵산의 광범위 증폭에 의존한다. 불행하게도, 이들 증폭 공정 동안, 다수의 존재하는 물질은 더 낮은 수준으로 존재하는 샘플의 부분을 우선적으로 압도할 것이다. 예를 들어, 샘플로부터의 유전자 물질이 정상 조직 DNA 95%, 및 종양세포로부터의 DNA 5%로 구성되는 경우, 전형적인 증폭 공정, 예를 들어, PCR 기반 증폭은 소수의 존재하는 물질을 제외하고 다수의 존재하는 물질을 빠르게 증폭시킬 것이다. 더 나아가, 이들 증폭 반응은 전형적으로 풀링된 내용물에서 수행되기 때문에, 특정 염색체, 폴리뉴클레오타이드 또는 유기체에 대해 증폭된 서열의 원점은 전형적으로 공정 동안 보존되지 않을 것이다.
대조적으로, 본 명세서에 기재된 방법 및 시스템은 개개 또는 소수의 핵산을 별개의 반응 용적, 예를 들어 액적으로 분할하며, 이때 해당 핵산 성분은 처음에 증폭될 수 있다. 이 초기 증폭 동안, 독특한 식별자는 해당되는 별개의 반응 용적에서의 성분에 대한 성분에 결합될 수 있다. 상이한 성분의 별개의, 분할된 증폭뿐만 아니라 독특한 식별자, 예를 들어, 바코드 서열의 증폭은 각각의 샘플 성분 기여의 보존뿐만 아니라 후속적 증폭 공정, 예를 들어, PCR 증폭을 포함하는 시퀀싱 공정을 통해 그의 원점의 속성의 보존을 허용한다.
본 명세서에서 그리고 개시내용 전체적으로 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 일반적으로 특정 용법의 내용 내에서 언급된 수치적 값의 15% 초과 또는 15% 미만일 수 있는 범위를 지칭한다. 예를 들어, "약 10"는 8.5 내지 11.5 범위를 포함할 것이다.
인식될 바와 같이, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 다양한 적용분야, 용도 및 목적을 포함하는 특정 용도 또는 목적을 위해 본 명세서에 기재된 임의의 조성물, 라이브러리, 방법, 장치 및 키트의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 종의 분할, 올리고뉴클레오타이드의 분할, 파티션으로부터 종의 자극 선택적 방출, 파티션에서 반응(예를 들어, 결찰 및 증폭 반응)의 수행, 핵산 합성 반응의 수행, 핵산의 바코딩, 시퀀싱을 위한 폴리뉴클레오타이드의 제조, 폴리뉴클레오타이드의 시퀀싱, 폴리뉴클레오타이드 위상(예를 들어, 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 가출원 특허 제 62/017,808호 참조), 소수의 세포로부터 폴리뉴클레오타이드의 시퀀싱, 유전자 발현의 분석, 세포로부터 폴리뉴클레오타이드의 분할, 돌연변이 검출, 신경 장애 진단, 당뇨병 진단, 태아 이수성 진단, 암 돌연변이 검출 및 법의학, 질병 검출, 의학적 진단, 낮은 입력 핵산 적용, 예컨대 순환 종양 세포(CTC) 시퀀싱, 이들의 조합에서 그리고 본 명세서에 기재된 임의의 다른 적용분야, 방법, 공정 또는 용도에서 본 명세서에 기재된 조성물, 방법, 라이브러리, 장치 및 키트의 용도를 제공한다.
본 명세서에 제공된 임의의 농도값은 임의의 인시추 전환, 변형, 반응, 격리 등과 상관없이 혼합 농도 값으로서 제공된다. 게다가, 적절하다면, 본 명세서에 기재된 방법(예를 들어, 시퀀싱 방법, 바코딩 방법, 증폭 방법, 표적화된 증폭 방법, 바코딩된 샘플의 분석 방법 등)의 민감도 및/또는 특이성은 다를 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법은 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 초과의 특이성 및/또는 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5% 초과의 민감성을 가질 수 있다.
추가적인 시퀀싱 접근
매우 다양한 상이한 시퀀싱 기법은 생명공학, 약제학적 연구, 의학적 진단, 농업, 기초 연구, 식품 안전성 등을 포함하는 넓은 범위의 산업에 걸쳐 실행된다. 이들 기법은 4가지 상이한 뉴클레오타이드 보유 구별 가능한 표지에 의해 종결된 주형 핵산의 내재 단편이 그들의 크기에 의해 분리되고, 구별 가능한 표지에 의해 그들의 종결 뉴클레오타이드와 같이 동정되는 더 오래된 생어 시퀀싱 방법을 포함한다.
시퀀싱 방법은 또한 더 최근의 "합성에 의한 시퀀싱", 또는 SBS, 주형 핵산의 기저 서열을 제공하기 위해 주형 의존적, 중합효소 매개 연장 반응에서 특정 뉴클레오타이드의 반복적 첨가가 동정되고 사용되는 방법을 포함한다. 이들 SBS 공정은 일반적으로 (1) 예를 들어, 일루미나 HiSeq, MiSeq, 및 NextSeq 시퀀싱 시스템뿐만 아니라 이온 토렌트 프로톤 및 써모피셔(Thermo Fisher)로부터 입수 가능한 PGM 시스템에서 사용되는 짧은 판독 시퀀싱 기법, 및 (2) 단일 분자, 실시간 또는 퍼시픽 바이오사이언시즈(Pacific Biosciences)로부터 입수 가능한 SMRT(등록상표) 시퀀싱 시스템과 같은 긴 판독 시퀀싱 기법으로 나누어진다.
짧은 판독 기법은 일반적으로 단계적 방식으로 첨가된 염기를 동정하기 위해 기질 상에 배열된 동일한 핵산 주형 분자의 패치 또는 클러스터가 뉴클레오타이드 첨가의 별개의 순환에서 관찰 또는 검출되는 총체 접근을 이용한다. 상이한 분자를 각각 나타내는 다수의 클러스터를 제공함으로써, 시퀀싱 실행 동안 다수의 상이한 핵산 단편을 시퀀싱할 수 있다. 추가로, 주어진 클러스터 내의 모든 분자에 걸쳐 첨가된 동정된 염기의 합치에 의존하여, 즉, 수십만개의 분자를 가짐으로써, 예를 들어, 부정확하나 염기를 혼입하는 연장 반응의 임의의 낮은 수준의 부정확성은 정확한 염기 첨가에 의해 압도되어, 서열 판독을 위한 매우 높은 정확성 비율을 야기한다. 그러나, 연장 반응에서 고유한 비효율성 때문에, 임의의 주어진 클러스터 내의 다양한 주형 분자의 연장은 시간에 따라 서로 위상에서 없어져서, 총체적 접근에서조차 몇 백개의 염기 다음에 염기를 정확하게 호출하는 것의 불능을 초래한다.
대조적으로, 긴 판독, 단일 분자 SBS 방법, 예컨대 SMRT 시퀀싱은 단일 핵산 분자 내에서 개개 염기를 검출한다. 주형이 단일 DNA 중합효소에 의해 복제됨에 따라, SMRT 시퀀싱은, 예를 들어, 주형 분자의 복제에서 개개 염기의 혼입의 관찰에 의존하며, 이중 가닥에 대한 염기의 순차적 첨가는 특별한 광학적 검출 기법 및 형광단 표지된 뉴클레오타이드를 이용하여 관찰 가능하다. 단일 길이 핵산 주형 분자의 복제를 관찰함으로써, 예를 들어, 수만개 염기의 규모로 매우 긴 판독 길이를 얻을 수 있다. 그러나, 이들 기법이 단일 핵산 분자의 복제를 관찰하기 때문에, 중합효소 반응에서 이루어진 임의의 실수가 관찰되며, 인지되는 판독에 혼입된다. 더 나아가, 혼재 서열 정보를 피하기 위해, 예를 들어 교정 능력을 갖는 고도로 정확한 중합효소는 사용되지 않는다. 이는 염기 호출의 85%가 정확하게 되는 규모로만 단일 통과 정확성을 초래한다. 원형 분자 주위의 단일 중합효소에 의한 다중 통과가 이루어져서, 개선된 정확성에 대한 총체 접근을 모방하도록, 예를 들어, 동일 분자에 걸친 다중 시퀀싱 통과가 해당 서열의 더 큰 합치 정확성을 제공하도록, 단일 통과 정확성에서 이 결함에 대한 해결책은 원 구조에서 주형 분자를 사용한다.
또 다른 접근에서, 개개 주형 분자는 그 자체가, 예를 들어, 나노포어 시퀀싱 시스템에서 검출 구역을 통과함에 따라 직접적으로 판독될 것이다. 또한, 이들 시스템은 원칙적 실험의 증거에서 기재되었지만, 그들은 일반적으로 상업적으로 입수 가능하지 않으며, 일반적으로 부정확성 및 필요없는 데이터를 생산하는 경향이 있다.
대부분의 이들 시퀀싱 기법에 대해, 사용 중인 시퀀싱 시스템에 대한 시퀀싱 가능한 형식으로 주형 핵산을 제공하기 위해 실제 시퀀싱 공정 전에 취해지는 상당한 단계가 있다. 이들은 시퀀싱될 핵산을 샘플 내 다른 물질로부터 정제하는 단계, 예를 들어, 이를 세포 또는 조직으로부터 추출하는 것, 오염 단백질, 효소 및 기타 세포 파편을 정제하는 것뿐만 아니라 시퀀싱을 허용하기 위한 핵산, 예컨대 프라이머 서열, 어댑터 서열, 헤어핀 서열 및 식별자 서열, 예컨대 올리고뉴클레오타이드 바코드 또는 샘플 지표 올리고뉴클레오타이드 상에 작동 가능한 성분을 혼입하는 것의 통상적인 공정 단계를 수반한다. 다수의 상이한 공정 단계가 핵산 분자의 시퀀싱 가능한 라이브러리(또한 본 명세서에서 "시퀀싱 라이브러리"로 지칭됨)를 제조하도록 진전되었고, 이중 다수는 사용 중인 시퀀싱 시스템에 크게 의존한다.
추가적인 바코딩 라이브러리
일 예에서, 분할 및 바코딩 공정은 긴 판독 시퀀싱 공정에 대한 필요 없이 주형 핵산으로부터 긴 범위 서열 정보를 유도하는 데 사용된다. 요약하면, 샘플, 예를 들어, 세포 또는 조직으로부터 핵산의 긴 단편은 수성 오일 에멀전에서 별개의 수성 액적으로 분할된다. 바코딩된 프라이머 서열의 집단을 보유하는 비드는 샘플 단편, 중합 반응 성분, 예를 들어, 중합효소, 뉴클레오사이드 삼인산염, Mg2+ 등과 함께 이들 액적으로 공동 분할된다. 바코딩된 프라이머는 비드로부터 방출되고, 주형의 복제 단편을 생성하기 위해 주형 핵산의 일부를 따라서 프라이밍되도록 허용된다. 그 결과, 각각의 파티션 또는 액적은 본래의 시작 단편의 복제 단편을 포함하지만, 각각의 단편은 주어진 액적으로 분할되는 단일 비드에 기인하는 바코드 서열을 포함한다. 이어서, 이들 복제물 단편은, 예를 들어, 추가적인 기능성 서열, 예컨대 증폭 프라이머 서열, 기타 시퀀서 특이적 서열, 예를 들어, 유세포 부착 서열, 시퀀싱 프라이머 서열 등을 부착할 뿐만 아니라 그들을 시퀀싱 공정을 통하도록 단편 수를 증폭시키기 위해 추가로 가공된다.
이어서, 복제, 바코딩된 단편의 시퀀싱은 또한 바코드 서열을 포함하는 짧은 서열 판독을 수득한다. 이어서, 회합된 단편 서열이 본래의 시작 단편에 기인하도록 이 바코드 서열은 서열 정보에 따라 사용될 수 있고, 이에 의해 예를 들어, 짧은 판독 서열로부터 본래의 긴 단편에 대해서와 같이 긴 범위의 서열 정보를 제공할 수 있다. 복제 단편이 심지어 다회로 전체 본래의 단편을 아우르는 것을 보장함으로써, 서열을 본래 단편의 실제의 긴 판독으로 용이하게 조립할 수 있다. 추가로, 완전한 드노보 시퀀싱을 위해 사용되는 완전한 멀티폴드 범위가 없을 때조차, 상이한 짧은 서열에 대한 통상적인 바코드의 존재는 두 상이한 짧은 서열 사이의 더 긴 범위 결합의 추론을 허용하여, 짧은 판독 시퀀싱 단독에 대해 수많은 이점을 제공한다, 예를 들어, 게놈 맵핑, 구조적 변이체 검출, 위상 변이체의 동정(예를 들어, 본 명세서에 전문이 모든 목적을 위하여 참고로 포함된 2014년 10월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/072,214호)뿐만 아니라 다른 가치 있는 긴 범위의 서열 결합 정보를 제공할 수 있다. 이들 방법 및 그들의 적용은, 예를 들어, 2014년 6월 26일자로 출원된 공동 계류 중인 미국 특허 출원 제14/316,383호, 2014년 6월 26일자로 출원된 제62/017,808호, 2014년 10월 29일자로 출원된 제62/072,214호, 2014년 10월 29일자로 출원된 제62/072,164호, 및 2014년 6월 26일자로 출원된 제62/017,558호에서 상세하게 논의되며, 이의 전체 개시내용은 그의 전문이 모든 목적을 위하여 본 명세서에 각각 포함된다.
추가적인 단편화 및 바코딩
본 명세서에 기재하는 바와 같이, 샘플 핵산으로부터 개선된 시퀀싱 라이브러리를 제조하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 개선된 시퀀싱 라이브러리는 더 균일한 범위, 더 낮은 서열 오류율, 본래 서열의 더 높은 증폭율 및 더 낮은 키메라 생성 속도 중 하나 이상을 제공한다.
상기 주목한 바와 같이, 시퀀싱 라이브러리로서 사용하기 위한 주형 핵산의 바코딩된 복제물 단편을 제공하는 방법은 2014년 6월 26일자로 출원되고, 앞에서 본 명세서에 참고로 포함된 공동 계류 중인 미국 특허 출원 제14/316,383호에 상세하게 기재되어 있다. 간략하게, 그리고 도 19에 나타내는 바와 같이, 바코드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 샘플 핵산(104)과 함께 에멀전에서 액적(102)에서 공동분할된다. 올리고뉴클레오타이드(108)는 샘플 핵산(104)과 함께 공동 분할되는 비드(106) 상에 제공될 수 있는데, 이 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 패널 A에 나타내는 바와 같이 비드(106)로부터 방출 가능하다. 올리고뉴클레오타이드(108)는 하나 이상의 기능성 서열, 예를 들어, 서열(110, 114 및 116)에 추가로 바코드 서열(112)을 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드(108)는 바코드 서열(112)뿐만 아니라 주어진 시스템에 대해 부착 또는 고정 서열로서 작용할 수 있는 서열(110), 예를 들어, 일루미나 Hiseq 또는 Miseq 시스템의 유동 세포에서 부착을 위해 사용되는 P5 서열을 포함하는 것으로 나타난다. 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 또한 샘플 핵산(104)의 일부의 복제를 프라이밍하기 위한 보편적, 무작위 또는 표적화된 N-량체를 포함할 수 있는 프라이머 서열(116)을 포함한다. 또한 올리고뉴클레오타이드(108) 내에 시퀀싱 시스템에서 합성 반응에 의한 중합효소 매개, 주형 관련 시퀀싱을 프라이밍하기 위해 사용되는 시퀀싱 프라이밍 영역, 예컨대 "판독1" 또는 R1 프라이밍 영역을 제공할 수 있는 서열(114)이 포함된다. 다수의 경우에, 바코드 서열(112), 고정 서열(110) 및 R1 서열(114)은 주어진 비드에 부착된 모든 올리고뉴클레오타이드에 대해 통상적일 수 있다. 프라이머 서열(116)은 무작위 N-량체 프라이머에 대해 다를 수 있거나 또는 특정 표적화된 적용에 대해 주어진 비드 상의 올리고뉴클레오타이드에 대해 통상적일 수 있다. 바코드 올리고뉴클레오타이드 내의 기능성 서열 세그먼트 요소의 구체적 위치 및 유형에 대해 기재하였지만, 바코드 올리고뉴클레오타이드 내의 기능성 세그먼트의 위치 및 특성은 다를 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 상이한 시퀀싱 시스템에 대한 프라이머 서열은 P5, 판독1 등 프라이머 대신 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서의 다른 곳에서 주목한 바와 같이, 표적화된 프라이머 서열은 게놈 또는 샘플 유전자 물질의 표적화된 위치에 대한 바코드 서열의 부착을 허용하기 위해 제공될 수 있다. 추가적으로, 일부 경우에, 상이한 세그먼트의 위치적 내용은 변경될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 예를 들어, 역상보체의 후속적 시퀀싱 판독에 대한 바코드 판독을 얻는 것과 대조적으로 얻어진 바코딩된 단편의 시퀀싱 동안 판독1 서열의 프라이밍 후에 제1 통과 또는 초기 서열 판독에서 바코드가 시퀀싱될 수 있도록, 예를 들어, 세그먼트(114와 116) 사이에서 서열 판독 프라이머의 바코드 서열 세그먼트 5' 또는 R1 세그먼트(114)를 위치화하는 것은 바람직할 수 있다. 이런 그리고 다양한 다른 변형이 본 개시내용에 의해 생각된다.
프라이머 서열(116)의 존재에 기반하여, 올리고뉴클레오타이드는, 비드(106) 및 샘플 핵산(104)에 의해 또한 공동 분할된 중합효소 및 다른 연장 시약을 이용하여 올리고뉴클레오타이드(108 및 108a)를 연장시키는 패널 B에 나타낸 바와 같은 샘플 핵산을 프라이밍할 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 파티션 내의 이중 가닥 샘플 핵산의 초기 변성이 바람직한 경우, 이들 중합효소는 내열성 중합효소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단일 가닥 표적 핵산이 파티션 내에 침착되어, 바람직한 경우 비-내열성 중합효소, 예를 들어, 클레노브(Klenow), phi29, Pol1 등의 사용을 허용하도록 샘플 핵산의 변성은 분할을 진행할 수 있다. 패널 C에서 나타내는 바와 같이, 무작위 N-량체 프라이머에 대해, 샘플 핵산(104)의 다수의 상이한 영역에 대해 어닐링될 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 연장 후에; 핵산의 다중 중복 상보체 또는 단편, 예를 들어, 단편(118 및 120)이 생성된다. 샘플 핵산의 일부에 대해 상보성인 서열 부분, 예를 들어, 서열(122 및 124)(또한 "삽입물"로서 지칭됨)을 포함하지만, 이들 작제물은 일반적으로 본 명세서에서 부착된 바코드 서열을 갖는 샘플 핵산(104)의 단편을 포함하는 것으로 지칭된다. 일부 경우에, 제1 증폭 단계로부터 관리 가능한 단편 크기를 유지하기 위해 생성된 복제 단편의 크기를 인공적으로 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 이는 상기 기재한 바와 같이, 예를 들어, 코바리스(Covaris) 시스템과 같은 단편화 시스템을 이용하여 기계적 수단에 의해 달성될 수 있거나, 또는, 예를 들어, 과도하게 긴 단편의 형성을 방지하기 위해 저농도에서 무작위 연장 종결자를 혼입함으로써 달성될 수 있다.
이어서, 이들 단편에 서열 분석이 실시될 수 있거나 또는 그들은, 예를 들어, 패널 D에 도시하는 공정에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 시퀀싱에 대해 이용 가능한 핵산의 양을 증폭시키기 위해 그리고/또는 추가적인 기능성 서열을 제공하기 위해 추가 가공이 실시될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드(108b)는 또한 비드(106)로부터 방출될 수 있고, 단편(118 및 120)을 프라이밍할 수 있다. 특히, 또한 (다수의 경우에 주어진 파티션에서 다른 무작위 N-량체, 예를 들어, 프라이머 서열(116)과 상이할 수 있는) 올리고뉴클레오타이드(108b)에서 무작위 N-량체 프라이머(116b)의 존재에 기반하여, 올리고뉴클레오타이드는 단편(118)에 의해 어닐링되고, 서열(128)을 포함하고, 샘플 핵산 서열의 일부의 복제물을 포함하는 단편(118)의 적어도 일부에 대한 상보체(126)를 생성하도록 연장된다. 올리고뉴클레오타이드(108b)의 연장은 단편(118)의 올리고뉴클레오타이드 부분(108)을 통해 복제될 때까지 계속된다. 패널 D에 도시되는 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 원하는 시점에, 예를 들어, 단편(118) 내에 포함된 올리고뉴클레오타이드(108)의 서열(116 및 114)을 통해 복제된 후에 중합효소의 복제에서 중단을 촉진시키도록 구성될 수 있다. 일부 경우에, 이는 복제 반응에 대해 사용 중인 중합효소에 의해 처리되지 않는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 혼입을 통해 달성된다. 예를 들어, 다수의 경우에, 유라실 함유 염기는 유라실 함유 염기를 통해 판독되지 않는 중합효소에 의한 복제를 중단시키기 위해 프라이머 서열에 포함될 수 있다. 이는 복제물 및 관련된 편향의 과도한 복제를 방지하기 위해, 예를 들어, 부분적인 내적 상보성을 갖는 부분적 헤어핀의 생성을 제공하기 위해 행해질 수 있으며, 예를 들어, 부분적 헤어핀은 적어도 부분적으로 후속적 복제 단계로부터 제거될 것이다.
본 명세서에 기재한 바와 같이, 이는, 예를 들어, 사용되는 중합효소에 의해 처리될 수 없는 상이한 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드 유사체의 혼입을 포함하는 상이한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 이는 비 유라실 내성 중합효소가 해당 영역의 복제를 중단하도록 야기하는 서열 영역(112) 내의 유라실 함유 뉴클레오타이드의 포함을 포함할 수 있다. 결과로서, 바코드 서열(112), 부착 서열(110), R1 프라이머 영역(114) 및 무작위 n-량체 서열(116b)을 포함하는 하나의 말단에서 전장 올리고뉴클레오타이드(108b)를 포함하는 단편(126)이 생성된다.
서열의 다른 말단에서 제1 올리고뉴클레오타이드(108)의 무작위 n-량체에 대한 상보체(116')뿐만 아니라 서열(114')로서 나타내는 R1 서열의 모두 또는 일부에 대한 상보체가 포함될 수 있다. 이어서, R1 서열(114) 및 그의 상보체(114')는 부분적 헤어핀 구조(128)를 형성하기 위해 함께 혼성화할 수 있다. 무작위-n-량체가 상이한 올리고뉴클레오타이드 중에서 상이하기 때문에 인식될 바와 같이, 이들 서열 및 그들의 상보체는 일반적으로 헤어핀 형성에 참여하는 것으로 예상되지 않으며, 예를 들어, 무작위 N-량체(116)에 대한 상보체인 서열(116')은 일반적으로 무작위 n-량체 서열(116b)에 대해 상보성인 것으로 예상되지 않는다. 이는 일반적으로 다른 적용, 예를 들어, 표적화된 프라이머의 경우는 아니며, 여기서 N-량체는 주어진 파티션 내의 올리고뉴클레오타이드 중에서 통상적일 수 있다.
이들 부분적 헤어핀 구조를 형성함으로써, 예를 들어, 복제물의 반복적 복제 출현율을 감소시켜 추가 복제로부터 샘플 서열의 매우 다수의 제1 수준 복제물의 제거를 허용한다. 부분적 헤어핀 구조는 또한 생성된 단편, 예를 들어, 단편(126)의 후속적 가공에 유용한 구조를 제공한다. 추가적으로, 바코딩 공정에서 U-함유 올리고뉴클레오타이드 및 비-U 가공 중합효소의 사용은 공정 효율을 달리 감소시키는 바코딩 공정 동안 프라이머-이량체 인공물의 양을 감소시킨다(예를 들어, 연장을 위한 주형으로서 작용하는 U-함유 프라이머에 걸쳐 생기는 연장이 거의 없거나 또는 전혀 없음).
개선된 접근의 일 예에서, 바코드 부착을 허용할 수 있지만, 바코드 올리고뉴클레오타이드의 부분이 아닌 충분한 기능성 서열 요소를 또한 포함하는 반응 혼합물에 별개의 프라이머 올리고뉴클레오타이드가 첨가된다는 것을 제외하고 상기 기재한 바와 같은 분할 방법이 사용된다. 이 접근을 개략적으로 도 20a에 도시한다. 나타낸 바와 같이, 샘플 핵산 단편과 함께 공동 분할될 바코드 올리고뉴클레오타이드(208)를 보유하는 비드(206)는 바코드 서열뿐만 아니라 하나 이상의 추가적인 서열, 예를 들어, 부착 서열(210)(예를 들어, P5), 바코드 서열(212) 및 시퀀싱 프라이머 서열(214)(예를 들어, R1)을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 주목한 바와 같이, 서열의 바코드 부분(212)은 상이한 비드 중에서 다를 수 있는 반면, 추가적인 서열의 적어도 하나는 다양한 상이한 비드에 걸쳐 일정하다. 나타낸 예에서, 비드(206) 상의 올리고뉴클레오타이드(208)는 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 부착 서열(210) 및 시퀀싱 프라이머 세그먼트(214)를 포함하는, 가변적 바코드 부분(212) 및 하나 이상의 불변 부분을 포함한다. 또한 바코드 올리고뉴클레오타이드에 의해 프라이머 서열 부분(216a)뿐만 아니라 바코드 올리고뉴클레오타이드(208)의 불변 부분, 예를 들어, 시퀀싱 프라이머(214)의 적어도 일부와 동일한 부분(216b)을 포함하는 별개의 프라이머 올리고뉴클레오타이드(216)가 공동분할된다. 프라이머 서열 부분(216a)은 무작위 N-량체 프라이머로서 도시되지만, 특정 프라이머 서열은 또한, 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 표적화된 유전자, 유전자 패널, 또는 완전히 무작위 미만인 게놈 또는 프라이머 서열의 일부에 대해 시퀀싱 라이브러리를 생성함에 있어서 사용하기 위한, 예를 들어, 표적 특이적 프라이밍 서열 또는 게놈 내 관심 대상의 영역에 인접한 서열을 사용할 수 있다는 것이 또한 인식될 것이다.
일단 주형 핵산(204)과 함께 공동 분할된다면, 프라이머 서열 부분(216a)은 주형(204)의 일부를 어닐링할 수 있고, 바코드 올리고뉴클레오타이드(208)의 불변 부분의 적어도 일부, 예를 들어, 서열(214)과 동일한 프라이밍 서열(216a)과 추가적인 서열 세그먼트(216b)를 둘 다 포함하는 주형(204)의 복제 단편(222)을 생성하도록 연장될 수 있다. 초기 연장 후에, 제2 프라이머 서열(216)은 새로 생성된 복제 단편(222)으로 어닐링되며, (예를 들어, 5' 말단에서) 바코드 올리고뉴클레오타이드(208) 상의 불변 서열 세그먼트(214)의 적어도 일부에 대해 상보성인 서열 부분(226)(뿐만 아니라 본래의 프라이머 서열에 대한 상보체 - nnnn으로 나타냄)을 포함하는 상보성 복제 단편(224)을 생성하도록 연장된다. 이어서, 바코드 올리고뉴클레오타이드는 불변 세그먼트(214)를 통한 상보성 서열 부분(226)에 대해 어닐링할 수 있고, 해당 서열의 연장은 부착된 바코드 서열(212)뿐만 아니라 부착된 불변 부분, 예를 들어, 부착 서열(210) 및 시퀀싱 프라이머 서열(214) 및 부분적 불변 서열(216b)에 대한 상보성 서열(230)을 지니는 샘플 핵산 서열의 복제물(228)을 초래한다. 나타낸 바와 같이, 바코드 올리고뉴클레오타이드(208)와 복제물 단편(224)은 둘 다 복제물(228)과 그의 상보체(228c)를 둘 다 수득하도록 연장된다. 인식될 바와 같이, 일부 경우에, 바코드 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단은 연장을 방지하기 위한, 예를 들어, 단편(228)의 생성을 방지하고, 단지 바코드 올리고뉴클레오타이드의 단편(224)로의 복제를 허용하는 차단기를 제공할 수 있다. 이는 근본적인 샘플 핵산, 예를 들어, 차선의 라이브러리 생성을 초래하는 게놈에 대해 덜 제어된 방식으로 바코드 올리고뉴클레오타이드 프라이밍을 회피하기 위해 일부 예에서 행해질 수 있다. 차단된 핵산, 다이데옥시 말단 핵산 등을 포함하는 다양한 차단기 또는 다른 비 연장성 뉴클레오타이드기가 사용될 수 있다.
공정에서 바코드 서열을 부착하는 능력을 갖는 별개의 프라이머 서열의 사용은 바코드 라이브러리 그 자체와 별개인 프라이밍 작업에 대한 제어 능력의 이점을 제공할 수 있다. 특히, 상이한 적용분야에 대해 적용 가능한 바코드 라이브러리가 구성될 수 있으며, 해당되는 상이한 적용분야는, 예를 들어, 순수한 무작위 n-량체 프라이밍 이외의 상이한 프라이밍 전량이 유리할 수 있다. 이어서, 적용분야 특이적 프라이머 서열은 목적으로 하는 적용을 추구하기 위해 프라이머 서열을 포함하는 전체 바코드 라이브러리를 재구성하기보다는 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 특히, 주어진 적용분야에 대한 라이브러리 생성 공정을 최적화하기 위해, 예를 들어, 프라이머 서열 등의 세그먼트와 같이 정해진 하위-모티프, 하위-편향을 확정한 표적화된 프라이머 서열, 편향 프라이머 서열, 예를 들어, GC 편향, AT 편?? 또는 다른 구조화된 프라이머 서열을 용이하게 대체할 수 있었다.
이하에 더 상세하게 논의하는 바와 같이, 추가적인 가공 단계는 바코딩된 복제 핵산 단편, 예를 들어, 해당 복제 단편 또는 해당 단편의 복제물 또는 상보체에 대해 추가적인 기능성 서열을 제공하기 위해 도 20a에 나타내는 단편(228 및 228c) 상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 이하에 기재하는 바와 같이, 바코딩된 단편의 말단 상에, 예를 들어, 바코딩된 단편(228)의 말단(230)에서 시퀀싱 공정을 위해 사용되는 추가적인 기능성 서열을 결합시키는 추가적인 증폭 단계가 수행될 수 있다. 그러나, 특정 양상에서, 복제 단편의 반대편 말단에서 바코드 올리고뉴클레오타이드 부분과 다른 기능성 서열을 둘 다 포함하는 단편을 수득하기 위해 추가적인 서열의 부착이 바코딩 복제 광정에 혼입될 수 있다. 예로서, 하나의 말단에서 단편을 바코딩하고 다른 말단에서 추가적인 기능성 서열을 부착하기 위한 단일 단계 반응 공정을 허용하는, 본래의 바코딩 반응 혼합물 내에서, 프라이밍 서열을 포함하는 제2 세트의 프라이머 서열, 예를 들어, 목적으로 하는 추가적인 기능성 서열, 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 R2 및 P7 서열에 결합되는 무작위 n-량체 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 이어서, 바코딩된 단편의 말단 둘 다에 대한 기능성 서열의 존재는 단편의 손쉽고 추가적인 가공을 허용할 수 있다. 예를 들어, 바코딩된 단편의 역평행 증폭에서 이들 기능성 서열을 사용할 수 있다.
이는 도 20b에서, 그리고 도 20a를 참조로 하여 개략적으로 도시되며, 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드(250)는 바코드 올리고뉴클레오타이드(208) 및 주형(204)과 함께 반응 혼합물에 도입된다. 제2 프라이머 세트(250)는 프라이머 서열, 예를 들어, 무작위 n-량체(250a)에 추가로 각각 판독2 프라이밍 서열 및 P7 부착 서열일 수 있는 추가적인 목적으로 하는 기능성 서열(250b 및 250c)을 포함한다.
또한, 도 20a에 나타내는 공정에 의해, 제1 프라이머 세트(216)는 주형으로 어닐링되고, 제1 복제 단편(222)을 생성하기 위해 주형(204)의 일부를 따라서 연장된다. 이어서, 제2 프라이머 세트(250)는 복제 단편(222)으로 어닐링되고, 해당 기능성 서열 요소(250b 및 250c)를 포함하는 상보성 복제물(252)뿐만 아니라 바코드 올리고뉴클레오타이드(208) 상의 적어도 일부의 세그먼트(214)에 대한 상보체를 생성하기 위해 해당 복제 단편을 따라서 연장된다. 이어서,바코드 올리고뉴클레오타이드(208)는 단편(252)을 복제하기 위해 어닐링될 수 있고, 바코드 올리고뉴클레오타이드(및 단편(252))의 연장이 바코딩된 복제 단편(254) 및 그의 상보체(254c)를 생성할 수 있는 경우, 이들 둘 다 바코드 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 서열 세그먼트 또는 그들의 상보체뿐만 아니라 제2 프라이머 세트(250)에 의해 전달되는 해당되는 추가적인 기능성 서열 또는 그들의 상보체를 포함할 수 있다. 인식될 바와 같이, 동일한 반응 혼합물에서 제1 프라이머 및 제2 프라이머 세트의 존재는 잠재적으로 목적으로 하는 구조를 포함하는 다수의 구조를 포함하는 복제 단편의 세트를 초래할 수 있으며, 여기서 삽입 세그먼트는 제1 프라이머 세트 또는 그의 상보체에 의해 한 측면 상에서 그리고 제2 프라이머 세트 또는 그의 상보체에 의해 다른 측면 상에서 측접된다. 그러나, 제1 프라이머 또는 제2 프라이머 세트 중 하나만이 삽입 세그먼트의 양 측면에 측접하는 경우를 포함하는 다른 배열이 또한 존재할 수 있다. 일반적으로, 이는 시퀀싱 공정 동안 해결 가능할 수 있으며, 또는 목적으로 하는 서열의 양 말단을 운반하는 서열만이 존재하는 후속적 증폭 과정에 의해, 예를 들어, 증폭 프라이머 서열로서 P5 및 P7을 이용하여 증폭된다. 예를 들어, 복제 단편(254c)에 대해, 세그먼트(250c)로 나타내는 P7 서열에 대해 프라이밍에 의해 이 세그먼트를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 한편, 세그먼트(210c)로 표시하는 바와 같이 P5 서열 세그먼트(예를 들어, 세그먼트(210))에 대한 상보체에 대해 프라이밍한다.
인식될 바와 같이, 도 20b에 기재하는 이런 단순화된 공정은 또한 도 19에 나타내는 공정의 변형된 형태에 적용될 수 있다. 특히, 두 상이한 프라이머 세트는 양 말단에서 기능성 서열을 갖는 바코딩된 단편을 초래하는 "원 포트" 반응을 제공하기 위해 바코딩 반응에서 제공될 수 있다.
이는 도 20c에서 개략적으로 도시된다. 나타낸 바와 같이, 주형 핵산 서열(280)은 바코드/프라이머 올리고뉴클레오타이드(260) 및 제2 어댑터/프라이머 서열(270)과 함께 공동분할된다. 바코드/프라이머(260)는 바람직하게 분할되고, 비드에 그리고, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같이 다양한 바코드 라이브러리의 구성원으로서 방출 가능하게 부착된다. 전형적으로 정해진 또는 통상적인 기능성 서열일 수 있는 어댑터/프라이머 서열(270)은 대량으로, 예를 들어, 핵산 주형(280), 또는 분할 공정에 첨가되는 다른 시약, 예를 들어, 효소, 뉴클레오타이드 등과 함께 분할될 수 있다. 일부 경우에, 그러나, 바코드/프라이머(260)와 동일 또는 상이한 비드에 방출 가능하게 부착된 어댑터/프라이머(270)가 분할될 수 있다.
각각의 바코드/프라이머(260) 및 어댑터/프라이머(270)는 바코드 및 프라이머 부분에 추가로 추가적인 기능성 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 바코드/프라이머 서열(260)은 바코드 서열(264), 및 무작위 n-량체 프라이머 서열(268)을 포함하지만, 또한 하나 이상의 추가적인 기능성 서열, 예컨대 유세포 부착 서열, 시퀀싱 판독 프라이머 서열 등을 포함하는 것으로 나타난다. 논의의 용이함을 위해, 도 20c에서 도시하는 예는, 바코드 프라이머(260)가 P5 부착 서열(262), 바코드 서열(264), 제1 서열 판독 프라이머, 예를 들어, 일루미나 시퀀싱 공정에서 사용되는 판독1 프라이머 서열, 및 무작위 샘플 프라이밍 서열 또는 n-량체(268)을 포함하는 경우가 기재된다. 어댑터 프라이머(270)는, 예를 들어, 일루미나 시퀀싱, 제2 서열 판독 프라이머, 예를 들어, 판독2 프라이머(274) 및 무작위 프라이밍 서열 또는 n-량체(276)에서 사용되는 바와 같은 P7 부착 서열(272)을 포함하는 것에 관해 기재된다.
프라이머 연장 반응의 개시 시, 예를 들어, 필수 시약의 혼합, 비드로부터 바코드 프라이머의 방출 및/또는 반응 혼합물의 열 순환의 개시 중 하나 이상에 대해, 프라이머 서열, 예를 들어, (268 및 276)은 주형 핵산(280)에 의해 어닐링될 수 있고(단지 프라이머(268) 어닐링으로서 나타냄), 연장 산물(282)로서 바코드/프라이머에 부착되는 주형의 복제 부분을 생성하는 주형을 따라서 연정된다. 나타내지 않지만, 연장 산물(282)과 함께, 연장 산물은 주형 서열로 어닐링된 어댑터/프라이머(270)의 연장에 기반하여 생성될 수 있다.
이런 제1 연장 후에, 이어서, 연장 산물은 프라이머 어닐링 및 연장의 후속적 라운드를 위한 주형으로서 작용한다. 나타낸 바와 같이, 어댑터/프라이머(270)는 연장 산물(282)로 어닐링되고, 본래의 주형 서열(삽입 세그먼트(284)로서 나타냄)에 대한 상보성 부분을 포함하는 연장 산물의 부분(282), 및 세그먼트(260c)로서 나타낸 본래의 바코드 프라이머에 대한 상보체를 포함하는 연장 산물(286)을 생성하기 위한 본래의 바코드/프라이머를 복제하기 위해 연장된다. 또한, 나타내지 않았지만, 삽입 서열의 말단에서 바코드 프라이머, 및 삽입물의 다른 말단에서 어댑터/프라이머 서열의 상보체를 생성할 수 있는 주형을 따라서 어댑터/프라이머 서열의 연장으로부터 생성된 연장 산물을 복제하기 위해 유사한 상보성 반응이 수행될 수 있다.
인식될 바와 같이, 상기 언급한 바와 같이, 일부 경우에, 동일한 서열 또는 그의 상보체는 연장 산물의 거의 50%에서 삽입물의 양 말단 상에 존재할 수 있었다. 그러나, 편리하게, 예를 들어, 연장 산물(286), 및 각각의 말단에서 동일한 서열 또는 그의 상보체를 갖는 해당 '산물'을 포함하는 상기 기재한 바코딩 및 어댑터 부착 공정의 산물은 추가적인 가공이 실시될 수 있다. 특히, 적어도 하나의 예에서, 산물에 PCR 공정을 이용하여 P5와 P7 서열 둘 다에 대해 프라이밍에 의한 역평행 증폭이 실시될 수 있다. 그 결과, P5와 P7 서열 둘 다, 또는 그들의 상보체를 포함하는 해당 단편은 빠르고, 전형적으로 증폭되는데, 다른 '산물'은 그렇지 않을 것이다.
인식될 바와 같이, 본 예에서 기능성 서열 및 그들의 상보체에 대한 특정 참고는 예시적이며, 제한적이지 않다. 실행에서, 특정 서열 또는 그의 상보체는 목적으로 하는 산물의 목적으로 하는 산물 상태에 따라서 상기 표시한 임의의 서열 세그먼트, 예를 들어, P5, P7, 판독1, 판독2 등에 대해 선택될 수 있다.
인식될 바와 같이, 일부 경우에, 긴 주형 핵산으로부터 바코딩된 복제물 단편을 생성하기 위한 공정은 근본적인 핵산 단편의 범위의 양의 변화가 있을 수 있고, 예를 들어, 일부 면적은 다른 것보다 더 많은 복제 단편에 의해 표시되고, 범위의 변화는 해당 주형에 대한 시퀀싱 범위로 번역될 수 있다. 일반적으로, 주형 핵산의 전자에 걸쳐 더 균일한 범위를 나타내거나, 또는 주형 서열의 상당한 부분과 같이 최소 범위 역치를 충족시키는 복제 단편을 생성하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 일부 경우에, 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 부분의 구성, 예를 들어, 도 19에 나타낸 바코드 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 세그먼트(116), 또는 도 20a 및 도 20b에 나타낸 프라이머 세그먼트(216)는 라이브러리 제조를 향상시키기 위해 조절될 수 있다. 특히, 일부 경우에, 주형 핵산을 어닐링하기 위해 사용되는 프라이머 서열의 구성은 주형 서열의 더 균일한 샘플링, 및 그 결과, 더 균일한 서열 범위를 제공하기 위해 제어될 수 있다. 특히, 프라이머 서열의 상대적 GC 함량을 제어함으로써, 무작위 프라이머 서열이든 또는 더 표적화된 프라이머 서열이든, 얻어진 시퀀싱 범위를 향상시킬 수 있다. 일부 양상에서, 프라이머 서열은 50% 초과의 GC 함량, 바람직하게는 60% 초과의 GC 함량, 70% 초과의 GC 함량 또는 심지어 80% 초과의 GC 함량이 제공된다. 바람직한 양상에서, 프라이머의 GC 함량은 50% 내지 약 90% 및 이에 의해 정해진 임의의 범위, 또는 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 80% 내지 약 90%일 수 있다.
일부 경우에, 각각 상이한 GC 함량 백분율을 갖는 프라이머 하위 집단의 조합물이 사용될 수 있고, 예를 들어, 전체 혼합물에 함유된 프라이머는 50% 초과 내지 90% 초과의 GC 농도 범위를 가지니다. 다수의 경우에, 프라이머는 50% GC 내지 약 80% GC의 범위일 수 있다. 이들 프라이머 집단은 언급된 범위에서 GC 농도의 전체 범위에 걸쳐있을 수 있거나, 또는 그들은 각각 별도의 GC 백분율을 갖는 프라이머의 세트 하위 집단을 구성할 수 있다.
예를 들어, 일부 경우에, 프라이머의 하위 집단은 프라이머에서 GC 농도의 세트 하위 집단, 예를 들어, 80% GC를 갖는 프라이머 하위 집단과 배합된 60% GC를 갖는 프라이머 하위 집단을 갖는 혼합물을 생성하도록 배합될 수 있다. 인식될 바와 같이, 이러한 경우에, 배합물은, 예를 들어, 상이한 GC 함량을 갖는 프라이머 작제물의 2, 3, 4개 이상의 상이한 하위 집단을 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 하위 집단은 50% GC 내지 90% GC일 수 있는 반면, 각각의 하위 집단은 배합물의 1% 내지 99%일 수 있다. 바람직한 양상에서, 하위 집단은 GC 함량이 약 50% 내지 80% GC(50%와 80%를 포함)일 수 있으며, 각각의 하위 집단은 총 프라이머 집단의 10% 내지 90%, 각각의 하위 집단에 대해 20% 내지 80%, 30% 내지 70%, 40% 내지 60%, 또는 심지어 50%를 구성할 수 있다.
라이브러리 제조를 개선시키기 위한 상기 기재한 공정에 추가로, 또한, 예를 들어, 더 균일한 범위, 더 낮은 오차 및 더 낮은 키메라 형성을 지니는 개선된 라이브러리를 제공하기 위해 중합효소 반응에 대한 변형을 이용할 수 있다. 특히, 적어도 하나의 예에서, 반응 산물을 개선시키기 위하 조합에서 상이한 중합효소를 이용할 수 있다. 특히, 상이하지만 상보적인 특성을 갖는 중합효소를 이용함으로써, 고품질 라이브러리를 생성할 수 있다. 예로서, 주형 서열 단편을 복제함에 있어서 매우 낮은 오류율을 제공하는 제1 중합효소와 더 균일한 범위 또는 더 높은 반응 속도 또는 더 큰 진행도를 제공하는 제2 중합효소의 배합물은 개선된 라이브러리를 제공하는 반응을 제공할 수 있다. 하나의 특정 예에서, 야생형 엑소뉴클레아제 활성(엑소+)을 보유하는 고도로 정확하고 진행적인 중합효소, 예컨대 북위 9° 중합효소의 배합물은 다른 고세균 중합효소와 배합될 수 있고, 예컨대 NEB로부터 입수 가능한 딥 벤트(Deep Vent) 중합효소는 단독으로 사용되는 중합효소 중 하나보다 더 균일한 범위 및 더 낮은 오류율을 갖는 시퀀싱 라이브러리를 제공한다.
도 21은 상이한 중합효소의 키메라 및 Q35 오류율의 비교를 나타낸다. 나타내는 바와 같이, 9°N(엑소+) 중합효소는 상대적으로 낮은 Q35 오류율을 보이지만, 그 자체로 사용될 때 상대적으로 높은 키메라 비율을 보인다(원 A 참조). 대조적으로, 딥 벤트 중합효소는 상대적으로 더 높은 오류율을 도시하지만, 상대적으로 더 낮은 키메라 비율을 나타낸다(원 B 참조). 효소가 둘 다 효소 둘 다의 배합물에서 사용될 때, 키메라 비율과 오류율 둘 다에서 단독 이상으로 이점이 나타난다(원 C 참조).
상기 기재한 가공에 추가로, 본 명세서에 기재된 방법은 또한 표적화된 게놈 라이브러리의 선택적 바코딩을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 나타낸 바코딩 방법을 이용하여 표적화된 유전자 영역, 예를 들어, 유전자, 유전자 패널, 엑솜, 키놈(kinome) 등을 포함하는 표적화된 게놈 라이브러리, 예를 들어, 시퀀싱 라이브러리를 바코딩하기 위한 일 접근은 2014년 10월 31일자로 출원되고, 본 명세서에 모든 목적을 위해 전문이 참고로 포함되는 미국 가출원 특허 제62/073,659호에 기재된다. 특히, 기재된 방법은 본래 분자 내용 또는 속성의 지표를 제공하기 위해 게놈(또는 샘플) 와이드 단편에 바코드를 부착하기 위하여 본 명세서에 기재된 바코딩 접근을 이용한다. 일단 단편이 바코딩된다면, 그들은 통상적인 표적화 공정, 예를 들어, 풀-다운을 이용하여, 예를 들어, 통상적인 키트, 예를 들어, 풀 다운 패널, 엑솜 키트 등, 예컨대 애질런트 테크놀로지즈 인코포레이티드(Agilent Technologies, Inc)로부터 입수 가능한 슈어셀렉트(SureSelect)(등록상표) 엑솜 키트를 이용하여 선택될 수 있다. 대안의 접근에서, 바코드는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 표적화 서열(또한 표적 미끼(bait) 또는 표적화된 프라이머로서 지칭됨)에 부착될 수 있고, 도 24에 대해 도시되며, 이어서, 바코드 서열, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 공정 단계를 이용하여 바코드 서열을 포함하는 표적화된 시퀀싱 라이브러리를 생성하는데 사용된다. 인식될 바와 같이, 표적화된 프라이머에 바코드 서열을 부착하는 것으로 기재하였지만, 기재된 방법은 비드 상의 바코드 올리고뉴클레오타이드에 대한 샘플 프라이밍 서열, 예를 들어, 무작위 n-량체 또는 표적화된 프라이머를 혼입할 필요 없이 사실상 임의의 서열, 예를 들어, 임의의 표적화된, 무작위, 보편적, 또는 다른 프라이머 서열 또는 프로브에 바코드 올리고뉴클레오타이드를 부착하는 데 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 기재한 바와 같은 바코딩된 비드 라이브러리는, 예를 들어, 에멀전에서 액적으로서 개개 파티션에 통상적인 바코드 서열의 집단을 전달하는 데 사용될 수 있다. 비드는 상기 기재한 바와 같은 샘플 핵산과 함께 공동 분할될 수 있다. 추가적으로, 비드는 표적화된 프라이머 서열, 예를 들어, 관심 대상의 특정 표적화된 서열과 동일하거나 또는 상보성인 서열과 함께 공동 분할될 수 있다. 표적화된 프라이머 서열은 전형적으로 바코드 올리고뉴클레오타이드를 따라서 연장될 바코딩된 프라이머에 대해 바코드 올리고뉴클레오타이드의 하류 부분에 혼성화되게 하는 부분을 포함할 수 있고, 따라서 바코드를 표적화된 프라이머 서열로 복제한다. 현재 바코딩된 표적화 서열의 복제는 표적화된 영역에 대해 샘플 핵산의 정보를 얻을 수 있는 바코딩된, 표적화된 프라이머 서열을 생성할 수 있고, 바코드 서열을 포함하는 복제 단편을 생성한다.
이 공정의 예는 도 24에 개략적으로 도시된다. 나타낸 바와 같이, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 바코드 비드 라이브러리로부터의 바코딩된 비드는 추가적인 기능성 서열, 예를 들어, 부착/프라이머 서열(606), 예컨대 P5 부착 서열과 함께 바코드 세그먼트(604)뿐만 아니라 제1의 공지된 서열 세그먼트, 예를 들어, 공지된 프라이머 서열 608, 예컨대 판독1 프라이머 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드(602)를 함유하는 바코드가 제공된다. 추가적인 기능성 서열은 선택적으로 본 명세서의 다른 곳에서 논의되는 바와 같이, 예를 들어, 더 보편적인 바코드 비드 라이브러리가 다수의 상이한 적용 또는 공정에 대해 사용될 때, 예를 들어, 무작위 프라이머 서열 등이 포함될 수 있다. 추가적인 표적화된 프라이머 올리고뉴클레오타이드(610)는 또한 바코드 올리고뉴클레오타이드(602)와 함께 공동 분할된다. 표적화된 프라이머 올리고뉴클레오타이드(610)는 표적화된 프라이머 서열, 예를 들어, 관심 대상의 서열 영역(표적화된 프라이머로서 지칭됨)에 대해 샘플 서열에서 근접한 알려진 서열을 프라이밍하기 위한 서열에 대한 상보체 서열을 제공하는 제1 부분(612)을 포함한다. 나타낸 바와 같이, 표적화된 프라이머 올리고뉴클레오타이드(610)는 또한 바코드 세그먼트(604)의 3'인 바코드 올리고뉴클레오타이드(602)의 일부, 예컨대 판독1 프라이머 세그먼트(608)의 일부에 대해 상보성인, 세그먼트(608c)로서 나타낸 부분을 포함한다.
나타낸 바와 같이, 바코드 올리고뉴클레오타이드(602)의 일부에 대한 표적화된 프라이머 올리고뉴클레오타이드(610)의 어닐링 및 후속적 연장은, 예를 들어, 파티션 내에서 중합효소 반응을 이용하여, 그 다음에, 완료된 올리고뉴클레오타이드(614)로서 나타난 표적화된 프라이머 서열(612)이 부착된 다양한 세그먼트(예를 들어, 604c, 606c 및 608c)의 상보체를 이용하여 바코드 올리고뉴클레오타이드의 역 상보체(614로서 나타냄)를 생성한다. 예를 들어, 세그먼트(606)에 대해 동일하고, 세그먼트(606c)에 대해 상보성인 올리고뉴클레오타이드(614)의 복제를 프라이밍하기 위해, 예를 들어, P5 프라이머 서열(616)을 이용하는 올리고뉴클레오타이드(614)의 추가 복제는 바코드 세그먼트(620)(상보체의 상보체로서 바코드 세그먼트(604)와 동일함), 기능성 세그먼트, 예를 들어, P5 세그먼트(622)(세그먼트(606)와 동일) 및 판독1 프라이머 세그먼트(624)(세그먼트(608)와 동일), 및 표적화된 프라이머 서열(626)(표적화된 세그먼트(612)에 대해 상보성)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드(618)의 생성을 초래한다. 이어서, 표적화된 프라이머 서열(626)은 또한 바코딩된 라이브러리를 생성하기 위한 무작위 n-량체 프라이머의 사용에 대해 상기 기재한 것과 동일한 방식으로 바코드 올리고뉴클레오타이드(602) 및 표적화된 프라이머 올리고뉴클레오타이드(610)와 함께 공동 분할되는, 샘플 핵산의 표적화된 부분(628)에 대해 프라이밍할 수 있다.
그 결과, 표적화된 서열에 대해 특이적으로 선택되고, 본래의 분자 내용을 표시하는 바코드와 하나 이상의 목적으로 하는 기능성 서열, 예를 들어, 프라이머, 예컨대 P5, 판독1 등을 둘 다 포함하는 시퀀싱 라이브러리가 생성될 수 있다.
인식될 바와 같이, 표적화된 프라이머 올리고뉴클레오타이드는 벌크 용액 중에서 이러한 올리고뉴클레오타이드를 제공함으로써, 예를 들어, 다른 시약, 예를 들어, 중합효소, dNTP 등과 함께 공동 분할함으로써 바코드 올리고뉴클레오타이드와 함께 공동 분할될 수 있다. 대안적으로, 상이한 표적화된 올리고뉴클레오타이드 또는 표적화된 올리고뉴클레오타이드의 그룹은 본 명세서에 기재된 바코드 비드 라이브러리에서의 그것과 유사한 비드에 대한 성향을 가질 수 있으며, 여기서 바코드 비드 및 표적화된 프라이머 비드는 단일 파티션, 예를 들어, 액적으로 함께 공동 분할될 수 있다.
또한 추가의 대안적 공정에서, 바코딩된 라이브러리는 상기 기재한 공정과 유사한 방식으로, 그러나 분할된 단편 핵산에 대한 바코드 올리고뉴클레오타이드의 결찰을 통해 제조될 수 있다. 일반적으로 말해서, 단편 라이브러리는 분자 내용물을 보존하기 위해 해당 파티션 내에 포함된 긴 단편으로부터 파티션 내에서 생성될 수 있다. 단편 라이브러리는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 비드 기반 전달 시스템을 통해 해당 단편과 함께 공동 분할된 바코딩된 올리고뉴클레오타이드에 의한 결찰을 위해 이용 가능한 단편을 남기는 방식으로 제조될 수 있다. 특정 경우에, 결찰 기반 공정은 잠재적으로 연장 기반 접근과 관련될 수 있는 증폭 기반 변칙, 예컨대 프라이밍 편향의 가능성을 회피할 수 있다.
이러한 접근의 일예는 도 25에서 개략적으로 도시된다. 나타낸 바와 같이, 샘플 핵산 단편(702)은 액적 또는 다른 파티션으로 분할된다. 긴 단편(702)은 파티션 내에서 더 짧은 단편으로 단편화된다. 도시한 바와 같이, 이 단편화 단계는 고충실도 중합효소, 예를 들어, phi29 DNA 중합효소를 이용하여 긴 단편을 처음 복제함으로써 수행된다. 복제 단계는, 예를 들어, 사전 분할 샘플 분취 단계 동안 본래의 단편에 결찰된 어댑터 서열로서 제공될 수 있는 알려진 말단 서열 세그먼트를 프라이밍함으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 도시한 바와 같이, 어댑터 서열, 예를 들어, 어댑터 서열(704)은 각각의 가닥 내에서 알려진 틈 부위(706)를 제공하는 본래의 이중 가닥 단편 상에 제공될 수 있다. 적절한 틈내기 효소에 의한 처리 후에, 틈이 생긴 가닥을 프라이밍 할 수 있는 DNA 중합효소, 예를 들어, phi29 중합효소는 하나의 가닥을 복제하는 한편 다른 가닥을 전위시키기 위해 사용될 수 있다. 이 복제는 서열 전체적으로 분산된 무작위 분산 유라실 함유 염기(708)를 지니는 복제를 생성하기 위해 제거 가능한 뉴클레오타이드, 예를 들어, UTP의 저수준 농도로 수행될 수 있다. 유라실 염기에서 절단하기 위한 효소, 예를 들어, 유라실 DNA 글리코실라제(UDG)를 이용함으로써, 예를 들어, 유라실 특정 절단 시약, 또는 USER(뉴잉글랜드 바이오랩스사(New England Biolabs)로부터 입수 가능), 또는 다른 시약에서 발견되는 바와 같이, 복제 단편 세트, 예를 들어, 단편(710, 712, 714, 716 및 718)을 생성할 수 있다.
제1 단편 세트를 전위시키고, 무작위로 분산된 간격에서 유라실 함유 염기를 혼입하고, 이어서, 상기와 같이 단편화될 수 있는 추가적인 복제물을 생성하는 틈내기 지점으로부터 phi29 중합효소가 이들 단편을 연장도록 허용함으로써 추가적인 단편이 생성될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 무작위 n-량체 프라이머, 예를 들어, 6량체, 7-량체, 8-량체, 9-량체, 10-량체 또는 이상을 이용하는 무작위 프라이밍 및 연장 공정은 본래의 단편에 대한 무작위 위치를 어닐링하고, 존재하는 중합효소, 예를 들어, phi29 등에 의해 연장함으로써 본래의 단편으로부터 무작위 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이들 대안의 프라이밍 메커니즘이 사용될 수 있지만, 예를 들어, 상기 기재한 바와 같이 무작위 틈내기 부위를 프라이밍함으로써, 외인성으로 도입된 프라이머로부터 유래될 수 있는 프라이밍 편향을 감소시킬 수 있고, 따라서 본래의 단편으로부터 덜 편향된 단편 라이브러리의 생성을 허용한다.
일단 이들 단편 라이브러리가 생성되면, 그들은 또한 단편과 함께 공동 분할되는, 예를 들어 무작위 6량체 프라이머(720)를 이용하여 추가로 복제될 수 있다. 짧은 프라이머 서열(720)을 이용하는 이들 단편의 복제는 다양한 길이로 이중 가닥, 평활 말단 단편(722)의 생성을 초래할 수 있다. 일단 평활 말단 단편(722)이 생성되면, 그들은 단편, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 비드 기반 전달 시스템을 통해 단편과 함께 공동 분할되는 이중 가닥 바코드 올리고뉴클레오타이드를 부착하기 위해 가공될 수 있다. 예를 들어, 나타낸 바와 같이, 평활 말단 단편(722)은, 예를 들어, 클레노브 중합효소를 이용하여 처음에 a-꼬리가 된다. 이어서, A-꼬리 단편(724)은 표준 결찰 효소 시스템, 예를 들어, T4 리가제를 이용하여 결찰 지점에서 상보성 T 염기(734)와 함께, 예를 들어, 바코드 세그먼트(728)뿐만 아니라 기능성 서열, 예컨대 P5 서열(730) 및 R1 세그먼트(732)를 포함하는 이중 가닥 바코드 올리고뉴클레오타이드(726)에 결찰된다. 그 결과, 바코딩된, 이중 가닥 단편이 생성된다. 이어서, 바코딩된 단편에, 예를 들어, 다른 말단에서 어댑터 서열을 증폭시키고 부착시키기 위해 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 추가적인 가공이 실시될 수 있다.
바코딩된 라이브러리의 추가적인 가공
라이브러리 제조의 개선은 추가적으로 또는 대안적으로 상기 기재한 초기 바코딩 단계 후에 가공 단계를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재한 바와 같은, 예를 들어, 주형 핵산의 바코딩된 복제 단편의 생성 후에, 추가적인 바코딩된 단편, 예를 들어, 해당 단편을 추가로 증폭시키고/시키거나 해당 단편 또는 이의 복제물에 대한 추가적인 기능성 서열, 예를 들어, 추가적인 시퀀싱 프라이머, 샘플 지표 서열 등을 제공하기 위해 바코딩된 단편에 의해 추가적인 가공이 수행될 수 있다.
다수의 경우에, 바코딩된 복제 단편은 시퀀싱을 위해 더 다량의 바코딩된 핵산을 제공하고 또한 시퀀싱 시스템 상에서 라이브러리를 효율적으로 가공하기 위해 라이브러리에 추가적인 기능성 핵산 서열 세그먼트를 부착하도록 추가로 가공될 수 있다. 이 추가적인 가공이, 예를 들어, 통상적인 포함된 바코드 서열때문에 주어진 파티션 내에서 주어진 핵산 분자로부터 생성된 단편의 결합 정보를 보존하여, 단편에 대한 바코드 서열의 부착 후에 일어나기 때문에, 후속적 가공은 풀링된 반응으로서, 예를 들어, 다양한 파티션의 내용물이 대량 가공을 위해 함께 풀링되는 경우 수행될 수 있다.
예로서, 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 특허 제14/316,383호에 기재되고 본 명세서에 이미 포함된 바와 같이, 바코딩된 단편 핵산, 예를 들어, 도 19의 단편(126)에 해당 단편의 존재를 증폭시킬 뿐만 아니라 시퀀싱 공정에서 사용하기 위한 추가적인 기능성 서열을 부착하기 위한 추가적인 가공이 실시될 수 있다. 예를 들어, 일단 바코딩된 단편(126)이 개개 파티션 내에서 제조된다면, 다양한 별개의 파티션이 파괴되어(예를 들어, 오일 에멀전 중에서 수성을 파괴함으로써), 상이한 파티션으로부터 유래되고 상이한 바코드 서열을 보유하는 모든 바코딩된 단편의 풀링을 초래할 수 있다. 이어서, 바코딩된 단편(126)의 증폭은 복제된 기능성 서열, 예를 들어, R1 상보성 서열(114')에 대한 프라이밍에 의해 수행될 수 있고, 여기서 이 증폭을 위한 프라이머는 또한 추가적인 기능성 서열, 예를 들어, P7 및 R2 서열, 또는 그들의 상보체를 포함한다. 그 결과, 생성된 서열은 각각의 말단 상에서 필수적인 기능성 서열 또는 그들의 상보체를 포함할 수 있다. 추가로, 역평행 증폭, 예를 들어, PCR을 개시하기 위해 프라이머 어닐링 서열로서 본래의 기능성 서열(110)에 대해 프라이머를 또한 이용함으로써 역평행 프라이밍에 의해 증폭시킬 수 있다.
하나의 예시적인 공정을 도 22에 도시하며, 도 19를 참고한다. 특히, 도 19에 나타낸 바와 같은 바코딩 공정이라면, 샘플 단편 또는 삽입물(422)에 부착된 다른 기능성 서열, 예를 들어 부착 서열(410) 및 시퀀싱 프라이머(414)와 함께 바코드 서열(들)(412)을 포함하는 부착 바코드 올리고뉴클레오타이드(408) 상에서, 예를 들어, 다수의 위치로부터의 그리고 다수의 상이한 바코드 서열을 보유하는 풀링된 단편 세트인, 도 22의 핵산 단편의 바코딩된 세트(402)를 얻을 수 있다.
이어서, 프라이머 서열의 제2 세트(450)가 반응 혼합물 내로 도입된다. 나타낸 바와 같이, 프라이머 서열의 제2 세트(450)는, 예를 들어, 시퀀서 유세포, 예를 들어, P7 서열(452)에 대한 부착을 위해, 그리고 시퀀서, 예를 들어, R2 프라이밍 서열(454)에 대한 제2 판독 단계의 프라이밍을 위해 서열 라이브러리에서 사용되는 추가적인 기능성 서열을 포함한다. 또한 이들 프라이머 서열에서 임의의 주어진 샘플에 대해 통상적인 무작위 프라이밍 서열의 세트, 예를 들어, 무작위 n-량체(456)뿐만 아니라 선택적 샘플 지표 서열(나타내지 않음)가 포함될 수 있다. 무작위 n-량체(456c)는 반응 혼합물에서 바코딩된 단편(402)에 대해 무작위로 프라이밍하고, 이들 프라이머의 연장은 바코드 올리고뉴클레오타이드(408)의 상보성 복제물을 포함하는, 예를 들어, 바코드 서열에 대한 상보체(412)(세그먼트(412c)로서 나타냄) 및 해당 바코딩된 단편에 포함된 임의의 기능성 서열에 대한 상보체, 예를 들어, P5 부착 서열(410)(상보성 서열(410c)로서 나타냄) 및 R1 프라이머 서열(414)(상보성 서열(414c)로서 나타냄)을 포함하는, 바코딩된 단편(402)의 복제물(458)을 생성한다.
이 복제 후에, 얻어진 단편(458)은 이제 말단 둘 다, 예를 들어, 삽입 서열 세그먼트(460)의 P5 서열과 P7 서열(각각 세그먼트(410 및 452))에서 기능성 서열을 포함한다. 이어서, 이들 완료된 단편에 역평행 증폭을 위한 프라이밍 영역으로서 단편의 알려진 말단 세그먼트, 예를 들어, P5 및 P7 서열 또는 그들의 각각의 상보체, 예컨대 세그먼트(410c 및 452)를 이용하여 추가적인 증폭 단계, 예를 들어, PCR이 실시될 수 있다.
인식될 바와 같이, 일부 경우에 바코딩된 단편의 초기 생성 후에, 예를 들어, SPRI 비드 등을 이용하여 그들을 생성하기 위해 사용한 반응 혼합물로부터 떨어진 바코딩된 단편을 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 도 19를 참조하여 상기 기재한 바와 같이, 예를 들어, 유라실 함유 염기를 통해 가공할 수 없는 중합효소를 이용할 때, 단편을 추가로 가공하기 위해 사용될 상이한 중합효소에 대해 해당 중합효소를 교환하여, 도 22에 나타낸 바와 같은 바코드 올리고뉴클레오타이드의 유라실 함유 부분의 복제를 허용하는 것이 유용할 수 있다. 다양한 상이한 고도로 진행성이고, 예를 들어, 열적으로 안정한 중합효소, 예를 들어, 태그, 북위 9°, 딥 벤트 중합효소뿐만 아니라 비-열적으로 안정한 중합효소, 예를 들어, Bst, 클레노브, phi29 등을 포함하는 고도로 정확한 중합효소가 본 공정에서 사용될 수 있다. 일부 경우에, 예를 들어, 헤어핀 또는 부분적 헤어핀 구조에 대해 상기 기재한 바와 같이, 또한 가닥 전위 활성, 유라실 내성, 예를 들어, 엑소뉴클레아제 활성 등을 포함하는 교정 능력 중 하나 이상을 갖는 후속적 증폭 단계에서 중합효소를 이용하는 것이 바람직할 수 있다.
마찬가지로, 예를 들어, 도 22에 도시한 바와 같은 제2 복제 단계 후에, 얻어진 단편(458)의 선택된 증폭에 참여하는 것으로부터 관련 없는 프라이머 서열, 예를 들어, 프라이머(450)를 제거하기 위해 추가적인 PCR 또는 다른 증폭을 실시하기 전에 복제 단편(458)을 정제하는 것이 바람직할 수 있다.
프라이머 세트(450)에서 기능성 서열 세그먼트를 포함하는 것으로 도시하지만, 일부 이들 서열은 후속적 공정 단계에서 혼입될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 프라이머 세트(450)는 P7 서열, 예를 들어, 세그먼트(452)와 같은 기능성 서열을 포함하지 않을 수 있다. 바코딩된 단편의 복제 후에, 단편, 예를 들어, 단편(458)의 얻어진 라이브러리에 추가적인 기능성 서열을 첨가할 수 있다. 또한, 다른 서열의 첨가는 결찰 단계를 통해, 예를 들어, 도 23을 참고로 하여 이하에 기재하는 바와 같이 달성될 수 있거나, 또는 대안적으로, 얻어진 단편(458)의 후속적 증폭에서 사용되는 프라이머 서열의 성분으로서 도입될 수 있다. 특히, 단편의 일부, 예를 들어, 세그먼트(454)(단편(452)이 없다고 가정하면)에 대해 프라이밍될 수 있는 프라이머 서열에 부착되는 추가적인 서열이 제공될 수 있었다. 이어서, 단편(458)의 증폭은 그것을 프라이머를 통해 첨가된 서열 세그먼트에 운반할 수 있다.
다른 예시적인 공정에서, 초기 바코딩된 단편, 예를 들어, 각각 도 19 또는 도 22로부터의 단편(118 또는 402)의 후속 가공은 필요한 기능성 서열을 보유하는 마무리된 단편을 제공하기 위해 전단 및 결찰 공정을 통해 달성될 수 있다. 본 공정은 도 23에서 개략적으로 도시된다. 나타낸 바와 같이, 바코딩된, 이중 가닥 핵산 단편(502)의 수집은, 예를 들어, 임의의 도 19 및 도 20에 나타내는 바와 같이 초기 바코딩 단계로부터 생성된다. 단편 및 그들의 회합된 상보성 가닥(504), 예를 들어, 그들로부터 복제된 주형에, 이어서, 예를 들어, 효소, 기계 및/또는 음향 전단 공정, 예를 들어, 코바리스(Covaris) AFA 전단 공정을 이용하는 전단 공정이 실시되어, 전단된 이중 가닥 단편(506)을 생성한다.
이어서, 전단된 이중 가닥 단편(506)은, 예를 들어, 하나 이상의 충전(fill-in) 반응을 이용하여, 예를 들어, 클레노브 및/또는 뉴클레아제 처리를 이용하여 평활 말단으로 된다. 평활화 후에, dATP의 존재하에, 예를 들어, 태그 또는 다른 비교정 중합효소를 이용하여, A 염기가 3' 말단에 첨가되어 A-꼬리, 평활 말단 이중 가닥 단편(508)을 수득한다. 3' 말단에서 T-염기를 포함하는 어댑터(550)는, 이어서, 적절한 결찰 혼합물, 예를 들어, T-4 리가제 및 관련된 시약의 존재하에 혼합물에 첨가된다. 나타낸 바와 같이, 어댑터(550)는 선택 시퀀서의 적용에 필요한 추가적인 기능성 서열, 예를 들어, 판독2 프라이머(상보체)(552) 및 P7(상보체)(554) 서열을 포함한다. 또한 바코딩된 단편과의 효율적인 결찰을 허용하기 위해 3' T-염기 돌출부(부분적 R2 세그먼트(556)로서 나타냄)를 갖는 부분적 상보성 서열이 포함된다.
결찰 후에, 얻어진 라이브러리 요소(558)는, 예를 들어, 본래의 샘플 주형 서열, 기능성 서열의 제1 세트, 예를 들어, P5(510) 및 R1(514) 서열, 바코드 서열(512), 및 기능성 서열의 제2 세트, 예를 들어, R2 및 P7 서열 또는 그들의 상보체(각각 세그먼트(552 및 554))로부터 유래된, 삽입 서열(560)을 포함한다. 또한 바코딩 올리고뉴클레오타이드로부터 유래된 본래의 프라이머 서열(516)이 포함된다.
상기 기재한 바와 같이, 이어서, 얻어진 바코딩된 단편은 프라이밍 표적으로서 알려진 말단 서열 세그먼트, 예를 들어, P5 서열(510) 및 P7 서열(554)을 이용하여, 프라이밍 증폭, 예를 들어, PCR과 같은 역평행 증폭에 의해 추가로 증폭될 수 있다.
인식될 바와 같이, 일부 경우에, 상기 기재한 전단 단계는 본래의 바코딩된 서열이 전단되는 단편을 생성할 수 있거나, 또는 바코드 단편을 포함하지 않는 전단 단편으로부터 초개된 단편을 생성할 수 있다.
이들 단편이 기능성 서열의 완전한 세트, 예를 들어, P5와 P7 둘 다, 또는 후속적 증폭 단계를 프라이밍하기 위해 사용되는 임의의 다른 기능성 서열을 결여하기 때문에, 기능성 서열, 예를 들어, 어댑터(550)를 통한 기능성 서열의 제2 세트의 결찰 후 조차, 그들은 성공적인 증폭을 위해, 서열의 세트 둘 다, 예를 들어, P5 및 P7 서열의 존재에 의존하여 후속 단계에서 증폭되지 않는다. 다시 말해서, 부정확하게 결찰된 단편이 처음에 생성될 수 있지만, 그들은 후속적으로 증폭되지 않을 수도 있고, 그 결과, 시퀀싱 시 시스템의 노이즈 수준 미만으로 떨어질 수 있다.
다수의 추가적인 또는 대안의 공정이 바코드 라이브러리 요소를 추가로 가공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 바코딩된 핵산 단편, 예를 들어, 도 19의 단편(126), 또는 다른 유사한 바코딩된 단편에 의해 시작할 때, 다수의 방법을 통해 단편의 말단, 예를 들어, 비-바코딩된 말단에 추가적인 기능성 서열을 부착할 수 있다. 예를 들어, 상기 언급한 바와 같이, 이는 이러한 프라이머의 연장 산물이 바코딩된 단편(126)의 복제물뿐만 아니라 프라이머에 부착된 기능성 서열을 포함하도록, 추가적인 기능성 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 비바코딩 말단으로부터 총 서열의 증폭을 통해 달성될 수 있다. 마찬가지로, 추가적인 서열은 기능성 서열을 첨가하기 위해 서열의 말단에 단순히 결찰될 수 있다.
다수의 다른 공정 단계는 본 명세서에 기재된 바코딩된 단편에 추가적인 서열을 추가로 가공, 증폭 및/또는 현수하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 완전한 복제를 차단하기 위해, 예를 들어, 바코드 올리고뉴클레오타이드 내 유라실 함유 염기를 이용하여, 부분적 헤어핀을 생성하기보다는, 완전한 헤어핀 분자의 형성을 허용하기 위해 비유라실 함유 바코드 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 3' 말단의 일부를 선택적으로 제거함으로써, 다양한 단편에 대한 추가적인 기능성 서열에 대해 결찰 부위를 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 기재한 바코드 올리고뉴클레오타이드의 통상적인 알려진 부분에서, 예를 들어, R1 프라이머 세그먼트에서 틈내기 효소 인식 부위에 상보체를 혼입함으로써, 헤어핀 이중가닥의 하류 부분에서 틈내기 부위를 간접적으로 생성할 수 있었다. 필수 틈내기 효소에 의한 헤어핀의 처리는 공지된 단일 가닥 DNA의 일부를 갖는 부분적 헤어핀 구조를 수득할 수 있으며, 공지된 서열 부분은 부분적 헤어핀, 예를 들어, 판독2, P7, 샘플 지표 등의 3' 말단에 대한 추가적인 기능성 서열(들)의 결찰을 위한 랜딩 지점으로서 사용될 수 있다.
대안으로서, 관련된 접근에서, 유라실 함유 염기를 통해 가공할 수 있는 중합효소를 사용하는 것을 제외하고 도 19에 약술한 접근을 이용하여 완전한 헤어핀 구조를 생성할 수 있다. 이러한 경우에, 완전한 복제가 하나의 말단에서 바코드 올리고뉴클레오타이드(108b)(유라실 염기를 포함), 다른 말단에서 바코드 세그먼트에 대한 상보체(112), 및 기능성 서열, 예를 들어, (110 및 114)를 포함하는 본래의바코드 올리고뉴클레오타이드의 상보체(108)(유라실 함유 염기가 없음)를 포함하도록, 바코드 함유 프라이머 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 유라실 함유 올리고뉴클레오타이드(108)의 초기 연장으로부터 초래된 단편은 프라이머 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드(108b)를 함유하는 제2 바코드의 연장을 통해 완전히 복제된다. 이어서, 예를 들어, UDG 효소 등을 이용하여 유라실 함유 염기에서 얻어진 복제 단편을 절단하여, 단편, 예를 들어, 세그먼트(114)의 말단에서 바코드 올리고뉴클레오타이드(108b)의 일부를 남길 수 있다. 한편으로 다른 말단은 바코드 서열 및 기능성 서열에 대한 상보체를 포함하는, 본래의 바코드 올리고뉴클레오타이드에 대한 상보체를 보유할 수 있다. 분해된 말단에 부착된 알려진 세그먼트를 남김으로써, 제2 측면 어댑터 서열을 결찰하기 위해, 예를 들어, 다른 기능성 서열, 예를 들어, 시퀀서 특이적 부착 및 프라이머 서열, 샘플 지표 서열 등을 포함하는, 핸들이 제공된다.
또 다른 양상에서, 바코딩 공정에서 생성된 바코딩된 단편의 헤어핀 구조를 이용할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 상기 언급한 바와 같은 완전한 헤어핀 구조로 형성되는 바코딩된 단편을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 기재하고 도 19에 나타내는 공정을 참고로 하여, 예를 들어, 포함된 추가적인 기능성 서열에 의해 또는 기능성 서열 없이 바코드/프라이머 서열의 완전한 복제를 허용함으로써 완전한 바코딩된 헤어핀 구조를 제공할 수 있었다. 이어서, 헤어핀의 이중가닥 부분의 말단은 헤어핀에 추가적인 기능성 서열을 부착하기 위해 이중가닥 어댑터 부착 공정에서 표준 이중가닥의 말단으로서 처리될 수 있다(예를 들어, 일루미나 트루세크 샘플 제조 가이드(Illumina Truseq Sample Preparation Guide)(일루미나 인코포레이티드(Illumina, Inc.) 부분 #15026486 Rev C), 및 미국 특허 제8,053,192호 참조), 이의 전체 개시내용은 본 명세서에 모든 목적을 위하여 전문이 참고로 포함됨). 특히, 트루세크 어댑터는 판독1과 판독2 프라이머 서열 사이의 적어도 부분적인 상보성에 기반하여 부분적 혼성 구조에서 P5-판독2 서열을 P7-판독2 서열과 함께 포함한다. 그 결과, 어댑터의 이중가닥 부분은 헤어핀 분자의 5' 말단에 P5-판독 1 서열, 및 헤어핀의 3' 말단에 P7-R2를 부착하기 위해 헤어핀 구조의 이중가닥 말단에 부착, 예를 들어 결찰될 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, 일단 이중가닥 어댑터가 헤어핀의 이중가닥 말단에 부착되면, 예를 들어, P5 및 P7 서열에 대해 프라이밍함으로써 역평행, PCR 증폭 공정을 이용하여 증폭될 수 있다. 인식될 바와 같이, 이 접근을 이용하여 헤어핀에 결찰되는 부분적 또는 완전히 상보성 그리고 이중 가닥 구조를 이용하여 헤어핀 구조의 말단에 다양한 상이한 추가적인 기능성 및 다른 서열을 부착할 수 있었다.
대안의 공정은 마찬가지로 바코드 올리고뉴클레오타이드 구조를 포함하는 완전한 헤어핀을 변형하는 데 사용될 수 있다. 특히, 부분적 헤어핀 구조를 생성하기 보다는, 분해될 때, 부분적 헤어핀 구조를 수득할 수 있고, 이어서 상기 논의한 바와 같이 가공될 수 있는 이중가닥의 5' 부분의 틈을 허용하는 상보성 이중가닥 구조로 선택적 틈 부위를 혼입할 수 있다.
추가적인 시스템 및 키트
라이브러리 생성 및 제조 공정에 관해 주로 기재되었지만, 상기 기재한 공정을 수행하기 위해 사용되는 공정, 시스템, 시약, 소모품 및 시약 및 소모 가능한 키트가 또한 본 명세서에 제공된다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 전반적인 시스템은, 예를 들어, 본 명세서에서 모든 목적을 위해 전문이 참고로 포함된, 예를 들어, 공동 계류 중인 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제14/316,383호, 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/017,808호, 2014년 10월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/072,214호, 2014년 10월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/072호 및 2014년 6월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/017,558호에서 상세하기 기재하는 바와 같이, 예를 들어, 바코딩 시약, 예컨대 분할 가능한 비드에 배치된 바코드 올리고뉴클레오타이드 라이브러리를 포함하는, 상기 기재한 반응 공정을 수행하는데 필수적인 시약을 포함할 수 있다. 또한 이러한 시스템에 공정에서 사용되는 다른 시약, 예컨대 분할 유체, 예를 들어, 플루오린화된 오일, 뉴클레오사이드 삼인산염 등뿐만 아니라 파티션이 생성되는 미세유체 소모성 성분뿐만 아니라 미세유체 장치의 작동을 구동 및 제어하기 위해 사용되는 기기를 포함하는 바코드 시약과 함께 샘플 핵산을 공동 분할하는 데 사용되는 분할 시스템이 포함될 수 있다.
언급한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 반응 공정을 수행하는데 필요한 시약을 포함하는 키트가 또한 본 명세서에서 제공된다. 전형적으로 이러한 키트는 목적으로 하는 반응을 수행하기 위해 필수 바코드 올리고뉴클레오타이드 보유 비드 라이브러리, 및 적절한 효소 반응 시약, 예를 들어, 적절한 중합효소, 단량체 및 다른 시약, 예를 들어, UDG, USER 등을 포함하는 바코딩 시약을 포함할 수 있다. 키트는 마찬가지로 또한 필수 분할 시약, 예컨대 비수성 분할 유체, 예를 들어, 플루오린화된 오일 등을 함유할 수 있다. 최종적으로, 키트는 또한 전형적으로 사용자가 상기 상세하게 기재한 바와 같은 목적으로 하는 반응 공정을 수행하도록 지시하기 위한 사용자 설명서를 포함할 수 있다.
앞서 언급한 발명이 명확함 및 이해의 목적을 위해 일부 상세하게 기재되었지만, 형태 및 상세한 설명에서의 다양한 변화가 본 발명의 진정한 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다는 것은 본 개시내용을 읽는 당업자에게 명확하게 될 것이다. 예를 들어, 상기 기재한 모든 기법 및 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 입자 전달은 기재한 바와 같은 어레이 웰 사이징(sizing) 방법에 의해 실행될 수 있다. 본 출원에서 인용하는 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 다른 문헌은 각각의 개개 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위하여 그의 전문이 참고로 포함된다.
X. 실시예
실시예 1: 무 프라이밍 증폭 주형의 분자 바코딩
다수의 접근이 시퀀싱을 위한 무 프라이밍 증폭으로부터 초래된 분자 바코딩 주형에 대해 효과적이라는 것이 상정된다. 분자 바코딩을 달성하기 위한 반응 및 시약은 동일한 반응의 부분일 수 있으며, 주형의 무 프라이밍 증폭과 동시에 실행된다. 상기 접근은 어댑터도 포함할 수 있다. 예를 들어 어댑터 설계는 일루미나사의 프라이머 설계로부터의 부분적 R1 서열, 다음에 바람직한 바코드 서열 다음에 무작위 N량체(서열 크기는 2 내지 20개의 염기로 변함)를 포함할 수 있다. 이들 어댑터는 이중가닥일 수 있고, 3' 돌출부로서 배열되는 N량체를 지니는 바코드 및 R1 서열을 포함한다.
제1 접근에서, 도 2a에서 나타내는 바와 같이, 주형의 바코딩은 연장 바코딩 접근을 이용하여 달성될 수 있다. phi29 DNA 중합효소의 가닥 전위 및 고진행도는 증폭된 단편을 방출함으로써, 추가적인 증폭을 위한 주형의 재순환을 가능하게 한다. 동일한 중합효소에 의한 어댑터의 6량체 또는 N량체를 제외하고, 가닥 전위 동안 생성되는 단일 가닥 단편은 dsDNA로 전환될 수 있다.
분자 바코딩에 대한 다른 접근은 도 2b에 나타낸다. 도 1에 기재된 바와 같이 생성된 증폭된 주형은 바코드 결찰 접근에 대해 선택적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 주형에 의해 분자 바코딩된다. 나타낸 바와 같이, 주형 DNA 분자는 단일 가닥(온도/효소를 이용; 도면의 좌측 절반을 참조) 또는 이중 가닥(효소를 이용; 도면의 우측 절반을 참조)으로 전환된다. 분자 바코드, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 ssDNA 리가제(타원) 또는 dsDNA 리가제(타원) 또는 다른 핵산 변형 효소를 이용하여 결찰 공정을 통해 부착된다. 분자 핸들로서 작용하는 추가적인 올리고뉴클레오타이드는 후속적 결찰에서 제1 바코드 태그에 첨가될 수 있다.
주형을 바코딩하는 분자에 대한 추가적인 접근은 도 2c에 나타낸다. 이 도식에서, 단일 가닥 DNA 분자(바코드/프라이머 서열을 지님)는 3' 말단으로부터 비드에 부착된다. 올리고의 5' 말단은 (화학적으로 또는 효소적으로) 사전 아데닐화된다. 올리고는 원한다면 열을 이용하여 방출될 수 있는 핫스타트(Hotstart)-IT 결합 단백질을 이용하여 격리될 수 있다. 단일 가닥 라이브러리 분자(열 처리 또는 헬리카제에 의해 생성된 단일 가닥)의 바코딩을 위해, APP DNA/RNA 리가제는 라이브러리 분자의 3' 말단에 의해 5' 사전 아데닐화된 올리고를 결찰할 수 있다. 이 공정은 매우 특이적인데, 올리고-올리고 결찰이 3' 말단을 차단함으로써 회피될 수 있고, 라이브러리 분자는 그들이 아데닐화되지 않기 때문에 자기 결찰될 수 없기 때문이다.
APP DNA/RNA 리가제는 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)으로부터의 RNA 리가제의 촉매적 라이신의 점 돌연변이를 포함하는 내열성 5' App DNA/RNA 리가제일 수 있다. 이 효소는 ATP 독립적이다. 이는 RNA 또는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 중 하나의 3'-OH 말단에 결찰을 위해 5' 사전 아데닐화된 링커를 필요로 한다.
주형을 바코딩하는 분자에 대한 추가적인 접근은 토포아이소머라제 효소를 이용한다. 예를 들어, 우두 바이러스로부터의 토포아이소머라제 I은 특정 부위에서 이중가닥 DNA에 결합하고, 하나의 가닥에서 5'-CCCTT 다음에 포스포다이에스터 골격을 절단한다. 여기서 분자 바코딩은 어댑터 서열(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)이 토포아이소머라제 효소에 사전 결합하는 경우에 달성될 수 있다. 증폭된 주형은, 예를 들어, DNA 중합효소의 클레노브 단편을 이용하여 평활 말단 결찰을 위해 제조될 수 있다.
실시예 2: 틈 부위에서 중합에 의한 무 프라이밍 증폭은 티미딘 (T) 염기 편향을 초래한다
(A) 프라이머가 있는 또는 (B)프라이머가 없는 증폭 프로토콜을 이용하여 실험을 수행하였다.
(A) 프라이머 제형에 의한 증폭 프로토콜:
1X 써모폴(Thermopol) 완충제(NEB), 0.2mM dNTP 혼합물(각각 10mM), 0.3uM 프라이머*, 0.07%(v/v) 글리세롤, 0.5%(w/v) 신페로닉(Synperonic)-F108, 1mM DTT, 0.1ng/㎕ gDNA 주형, 0.4U/㎕ 9°N 중합효소.
*프라이머 서열: TAGAUCGCACACUCUUUCCCUACACGACGCUCTTCCGATCTNNNNNNNNNN
열순환 프로토콜:
1.) 4℃/ ∞
2.) 98℃/5:00분 - 증가 2℃/S
3.) 4℃/0:30초 - 증가 2℃/S
4.) 45℃/0:01초 - 증가 0.1℃/s
5.) 70℃/0:20초 - 증가 2℃/S
6.) 98℃/0:30초 - 증가 2℃/S
7.) 단계 2로 진행, 14X
8.) 4℃/∞
(B) 프라이머(중합에 의한 무 프라이밍 증폭) 제형이 없는 증폭 프로토콜:
50mM 트리스, pH 7.5, 10mM(NH4)2SO4, 0.50% 심페로닉, 1mM dNTP, 0.03mM dUTP, 7% 글리세롤, 25uM 6량체, 17mM DTT, 1ng gDNA, 10ug/㎖ BSA, 0.01% 트리톤 X, 0.006 U/㎕ UDG, 30U/㎕ EndoIV, 0.2uM Phi29 DNA Pol
열순환 프로토콜:
1.) 30℃/3 시간
2.) 65℃/10:00 분
3.) 4℃/∞
중합 반응에 의해 무 프라이밍 증폭을 이용하여, dUTP(U)를 주형에 혼입시켰다. 중합효소에 대한 개시 부위를 생성하는 주형 내 틈을 생성하는 리가제 효소를 이용하여 "U"의 절단을 달성하였다. U 절단의 결과로서 개시가 발생되었지만, 관찰한 서열에서 반영된 염기 티미딘(T)에 대한 편향이 있다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 전체 게놈 시퀀싱 데이터에 기반한 T 염기 편향에 대한 시험은 T 염기에 대한 편향을 나타내었다. T 염기 편향은 시험한 dUTP 농도에 비례해서 확대되었는데, 이는 대부분의 개시가 U 혼입/절제에 의해 유발된다는 것을 강하게 지지한다. 서열이 기준 서열에 대해 정렬될 때 T 염기 편향이 나타났다.
도 3에 나타낸 결과는 프라이머 기반 연장보다는 생성된 틈 부위로부터의 중합효소 개시의 개념을 입증하였다.
실시예 3: GC 범위 : 프라이밍된 증폭 대 무 프라이밍 증폭
도 4A 및 도 4B에서 2개의 플롯은 인간 게놈의 GC 함량을 저장한 1000bp에 걸쳐 범위 균일성을 나타낸다. 플롯으로부터 알 수 있는 바와 같이, 프라이밍된 증폭 반응(도 4A)은 균일한 범위를 갖지 않으며, 따라서 GC 함량이 0.35 내지 0.5인 영역에 비교하여 낮은 GC 및 높은 GC 게놈 영역이 불량하게 나타난다. 비교에서, 무 프라이머 증폭 방법(도 4B)은 넓은 범위의 GC 함량에 걸쳐 균일한 범위를 나타낸다.
실시예 4: GC 범위에 대한 효과를 위한 dUTP의 적정
도 5A 내지 도 5E에 도시하는 GC 범위 플롯은 그들의 GC 함량에 의해 저장된 게놈의 상이한 부분에 걸쳐 시퀀싱을 이용하여 범위 균일성을 나타낸다. 데이터는 GC 범위가 존재하는 dUTP가 없을 때 높은 GC쪽으로 더 편향되고(도 5A), dUTP가 더 높을수록 더 균일하게 된다는 것을 나타낸다(1%). dUTP 없음, 0.5%, 1%, 2% 및 3% dUTP에 대한 결과를 도 5A, 도 5B, 도 5C, 도 5D 및 도 5E에 각각 나타낸다. 종합하면, 1% 초과의 dUTP의 사용을, dUTP 없음(도 5A) 또는 0.5% dUTP(도 5B)에 비교할 때, 다양한 GC 저장의 균일한 범위를 유리하게 초래한다는 것을 관찰하였다.
실시예 5: 키메라 감소를 위한 dUTP의 적정
중합 반응에 의한 무 프라이밍 증폭에서, 증폭 동안 dUTP 농도를 적정하고, 동일한 방향에서 판독으로부터 키메라 비율에 대한 효과, 1000개 염기에 대한 전체 범위로부터의 신뢰 영역 및 증폭(amp) 비율에 대해 중복제거한 깊이 위치 변동 계수(Depth Positional Coefficient of Variation: DPCV)를 연구하였다. 도 6에 나타내는 바와 같이, 약 3.5% 내지 약 5.5% dUTP의 범위에서, 키메라 비율의 상당한 감소가 관찰된 반면, DPCV와 amp 비율은 둘 다 상대적으로 강하고 안정하게 남아있었다.
실시예 6: DTT의 첨가는 DPCV를 감소시킨다
DTT 첨가를 중합 반응에 의해 무 프라이밍 증폭에서 DPCV 및 증폭에 대한 효과에 대해 시험하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, DTT의 첨가를 1.0mM 내지 10mM의 농도 범위에 걸쳐 시험하였다. 유리하게는, 시험한 DTT 농도 범위에 걸쳐, 증폭률에 대해 인식 가능한 효과 없이 DPCV의 유리한 감소를 관찰하였다. 더 고농도의 DTT는 DPCV에서 훨씬 더 큰 감소를 초래하였다. 그렇게 해서 증폭률에 유해하게 영향을 미치는 일 없이 DTT의 첨가에 따라 DPCV가 개선되었다.
실시예 7: 전체 게놈 분석을 위한 중합 조건 최적화
전체 게놈 주형 샘플을 위한 최적화된 중합을 결정하기 위해 다수의 조합에서 중합 반응에 의한 무 프라이밍 증폭을 위한 다양한 반응 성분을 시험하였다. 도 8a에 나타내는 바와 같이, SSB, DTT 또는 둘 다의 첨가를 포함하는 표준 조건은 더 높은 dUTP (5%) 농도를 지니는 유사한 조건에 비해 DPCV가 더 낮았다. 도 8b에 나타내는 바와 같이, 데이터는 SSB의 첨가가 증폭률을 감소시켰는데, 이는 5% dUTP의 존재 하에 훨씬 더 감소되었다는 것을 시사하였다. 도 8c에 나타내는 바와 같이, SSB가 생략되는 조건에 비해 SSB는 키메라를 감소시킨다. DTT는 또한 비율을 감소시켰다.
실시예 8: 중합 반응 시간 과정
phi29 중합효소를 32nM에서 이용하는 중합 반응에 의한 대량 무 프라이밍 증폭에서, DPCV와 증폭률을 둘 다 8시간까지 시간에 걸쳐 측정하였다. 도 9에 나타내는 바와 같이, DPCV 는 1 내지 4시간에 약간 개선(감소)되며(0.22에서 0.20으로) 본질적으로 남은 4시간에 걸쳐 안정 상태를 유지하였다. 증폭률(BAC-인식 Amp으로서 나타냄)은 시험한 전체 시계열에 걸쳐 상대적으로 편평하게 남아있었다. 80nM에서 시험하는 추가적인 phi29는 상기 결과에 상당하게 영향을 미치지 않았다(데이터 미제시).
실시예 9: DPCV 및 증폭률에 대한 주형 변성의 효과
중합 반응에 의한 무 프라이밍 증폭에서 DPCV 및 증폭률에 대한 주형 변성 효과를 시험하기 위해, 3가지 조건을 블랭크 GEM으로 시험하였다: i) 변성 없음(열 없음), ii) NaOH 변성 및 iii) 열 변성. 실험을 2회 중복해서 수행하였다. 도 10에 나타내는 바와 같이, 실험 결과는 DPCV가 시험한 모든 조건에서 상당히 안정하지만, 주형이 변성되지 않을 때 증폭은 실질적으로 더 낮다는 것을 나타내었다. 시험한 바와 같이, 성공적인 중합을 위해 NaOH 또는 열 변성을 효과적으로 사용할 수 있다. 그러나, 열 변성을 위한 약간의 이점을 관찰하였다.
실시예 10: 어댑터 농도의 적정
분자 바코딩을 위한 어댑터 농도에 대한 적합한 범위를 어댑터의 적정 및 DPCV 및 중복 비율을 측정함으로써 시험하였다. 시험한 조건은 0.4U/uL Phi29 DNA 중합효소, 54nM 내지 500nM 어댑터 12(이중가닥 pR1 인라인 BC 어댑터)였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 비맵핑 분획의 증가가 증가된 어댑터 농도로서 관찰되었지만, DPCV와 중복 비율은 둘 다 시험 범위 54nM 내지 500nM 어댑터에서 안정하였다.
이들 결과로부터 비맵핑 분획을 감소시키기 위해 SSB(단일 가닥 결합 단백질) 또는 다른 첨가제를 포함함으로써 적합한 범위의 어댑터 농도가 1nM 내지 10uM로 연장 가능할 수 있다는 것이 예상된다.
도 11의 표는 중복 비율에 대한 어댑터 농도의 효과(라이브러리 복잡성의 측정), 및 DPCV(범위 균일성의 측정)를 도시한 도면. 제1 열은 'LL 대조군' 샘플과 함께 사용한 어댑터 농도가 어댑터가 없다는 것을 나타낸다. 제3 열은 시퀀싱 깊이를 나타낸다(중복제거- 중복은 이 숫자를 계산하기 전에 제거됨). 제4 열은 모든 샘플을 0.25X 범위로 다운 샘플링 후 중복 비율을 나타내며, 이 숫자는 또한 바코드 정보를 이용하여 계산한다. 제5 칼럼은 범위 균일성의 측정인 DPCV를 나타낸다. 나타낸 결과는 넓은 범위의 어댑터 농도에 걸쳐, 중복 비율 및 DPCV가 상대적으로 편평하게 남아있는데, 이것이 넓은 범위의 어댑터 농도에 대한 반응 공차를 시사한다는 것을 나타내었다.
실시예 11: 바코딩 결찰 반응 시간의 효과
본 실험은 상이한 시퀀싱 기질에 대한 반응 지속시간의 효과를 연구하도록 설계하였다. 두 상이한 어댑터(adptr) 농도, 0.2uM 및 2uM에서 연구를 수행하였다.
도 12 패널 A는 반응 시간이 더 짧아짐에 따라 DPCV는 감소된다는 것을 나타내며; 패널 B는 반응 시간이 더 짧아짐에 따라 삽입 크기가 증가된다는 것을 나타내고; 패널 C는 반응 시간이 더 짧아짐에 따라 키메라가 감소된다는 것을 나타내며; 패널 D는 시간의 함수로서 비맵핑 분획이 영향받지 않음을 나타내고; 패널 E는 더 낮은 어댑터 농도에서, 증폭(Amp) 비율이 편평하고, 더 높은 어댑터 농도가 4시간 후에 증폭의 증가를 나타낸다는 것을 나타낸다. 이들 결과에 기반하여, 반응 시간 3시간은 대부분의 기질에서 최고가 되는 것으로 해석될 수 있다.
실시예 12: 무 프라이밍 증폭 산물의 T4 리가제 분자 바코딩
도 13은 T4 리가제 기반 바코딩의 특이성을 시험하기 위한 대조군 실험 결과를 도시한다. 판독은 P5/P7 퀀트(quant)이다. 5 초과의 P5/P7 퀀트는 양으로 고려된다. 결과는 바코딩된 주형의 유용한 세트(예를 들어, 시퀀싱을 위한 주형의 라이브러리)를 만들기 위해 제공되는 리가제, 주형 및 어댑터를 가질 필요가 있다는 것을 나타낸다. 임의의 3가지 성분의 부재는, 예를 들어 시퀀싱을 위해 증폭된 주형의 라이브러리로서 사용하기 위한 바코딩된 주형의 부적절한 세트를 초래한다.
실시예 13: 시퀀싱 범위 균일성 - 프라이밍된 증폭 대 무 프라이밍 증폭
도 14A 및 도 14B는 프라이밍된 증폭(도 14A)과 무 프라이밍 증폭(도 14B) 사이의 범위 균일성을 비교하기 위한 히스토그램이다. 도면 둘 다에서 y-축은 게놈 위치의 수이다. x-축은 좌측(0)에서 우측으로 증가되는 범위를 플롯팅한다. 데이터는 프라이밍된 증폭에 대한 분포에 비교할 때 더 많은 푸아송 분포를 갖는 무 프라이밍 증폭 프로토콜에서 관찰된 개선된 범위 균일성 이점을 명확하게 나타낸다.
실시예 14: DPCV에 대한 n량체 농도( uM ) 효과
n량체 농도(uM) 효과를 상기 기재한 바와 같이 제조한 5가지 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대해 시험하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 30uM 초과의 더 고농도의 n량체에서, 5개 샘플 중 4개에서 유리하게 감소된 DPCV가 관찰되었다. 40uM 및 50uM에서, 모든 샘플은 감소된 DPCV를 나타내었는데, 가장 큰 감소가 50uM n량체 농도에서 관찰되었다. 결과는 더 낮은 농도의 n량체보다는 더 높은 농도가 개선된 DPCV 감소에 필요하다는 것을 나타내었다.
실시예 15: DPCV에 대한 SPRI 엄격성 절단 효과
SPRI(고체상 가역적 고정) 엄격성 절단의 효과를 상기 기재한 바와 같이 6가지 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대해 시험하였다. 도 16에 나타내는 바와 같이, 더 엄격한 SPRI 절단은 유리하게 감소된 DPCV를 초래하였다.
실시예 16: DPCV에 대한 총 반응 시간 효과
DPCV에 대한 총 반응의 효과를 상기 기재한 바와 같이 5가지 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대해 시험하였다. 도 17에 나타내는 바와 같이, 현재의 시험 조건 하에서, DPCV는 시간에 의해 상대적으로 영향을 받지 않는다. 시험한 시점은 2시간으로부터 10시간 초과의 범위에 있다.
실시예 17: DPCV에 대한 USER 농도 효과
DPCV에 대한 USER(상표명)(유라실-특이적 절단 시약; 매사추세츠주 입스위치에 소재한 뉴잉글랜드 바이오랩스(등록상표) 인코포레이티드(NEB)) 농도 효과를 상기 기재한 바와 같이 6가지 상이한 바코딩된 주형 라이브러리 샘플에 대해 시험하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 실험적 시험 조건 하에서, 평균적으로 DPCV는 상대적으로 USER 농도에 의해 영향을 받지 않는다.
특정 실행이 도시되고 기재되지만, 그에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 본 명세서에서 상정된다는 것이 앞의 언급으로부터 이해되어야 한다. 또한 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 특정 실시예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 앞서 언급한 명세서에 대해 기재하였지만, 본 명세서의 바람직한 실시형태의 설명 및 예시는 제한적 의미로 해석되는 것을 의미하지 않는다. 더 나아가, 본 발명의 모든 양상은 다양한 조건 및 변수에 따라서 본 명세서에 제시된 특정 도시, 입체배치 또는 상대적 비율로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 실시형태의 형태 및 상세한 설명의 다양한 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 임의의 이러한 변형, 변화 및 동등물을 아우른다는 것이 상정된다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범주를 정하며, 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그들의 동등물이 이에 의해 포함된다는 것이 의도된다.

Claims (43)

  1. 하기 단계들을 포함하는 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법:
    (a) 주형 핵산 서열, dNTP, dUTP, 프라이머, 중합효소, dUTP 절단 효소, 및 올리고뉴클레오타이드 어댑터 서열 세그먼트를 포함하는 복수의 비드를 제공하는 단계;
    (b) 상기 중합효소, dNTP, dUTP 및 무작위 6량체를 이용하여 주형 핵산을 증폭시켜 임시적(occasional) dUTP를 포함하는 상보성 핵산 서열을 제공하는 단계; 및
    (c) 시퀀싱 라이브러리를 제공하기 위해 dUTP 절단 효소를 이용하여 혼입된 dUTP를 절단하여 상기 상보성 핵산 서열에서 틈을 제공하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 틈이 있는 상보성 핵산 서열을 증폭시키는 단계 (d), 및 핵산 연장 수단을 이용하여 상기 증폭된 핵산 서열의 상기 서열을 연장시키는 단계 (e)를 더 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계는 단일 반응으로 수행되는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 비드는 풀링된 비드 집단인, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 풀링된 비드 집단의 상기 비드는 단계 (a)에서 열거된 성분 중 하나 이상과 함께 공동 분할되고, 상기 파티션은 선택적으로 에멀전에서 액적을 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드는 화학적으로 분해 가능한 비드, 광 분해성 비드 및 열 분해성 비드로부터 선택되는 분해 가능한 비드를 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드는 화학적으로 환원 가능한 가교제를 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 화학적으로 환원 가능한 가교제는 이황화 결합을 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 상기 증폭은 등온성인, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소는 phi29 DNA 중합효소인, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 핵산 연장 수단은 결찰효소, 핵산 연장 효소 및 트랜스포사제로 이루어진 군으로부터 선택된, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 증폭된 핵산 서열의 라이브러리는 단일 가닥 DNA를 포함하고, 상기 결찰 효소는 ATP 독립적 효소를 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 ATP 독립적 효소는 내열성 5' App DNA/RNA 리가제를 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 결찰 효소는 토포아이소머라제를 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 토포아이소머라제는 토포아이소머라제 I인, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 결찰 효소는 T4 DNA 리가제를 포함하는, 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  17. 하기 단계들을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법:
    (a) 주형 핵산 서열, dNTP, dUTP, 프라이머, 중합효소, dUTP 절단 효소, 핵산 연장 수단, 및 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열 세그먼트를 포함하는 복수의 비드를 제공하는 단계;
    (b) 상기 중합효소, dNTP, dUTP 및 무작위 6량체를 이용하여 주형 핵산을 증폭시켜 임시적 dUTP를 포함하는 상보성 핵산 서열을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 상보성 핵산 서열에서 틈을 제공하기 위해 dUTP 절단 효소를 이용하여 혼입된 dUTP를 절단하는 단계;
    (d) 틈이 생긴 상보성 핵산 서열을 증폭시켜 증폭된 핵산 서열의 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (e) 풀링된 비드 집단으로부터 상기 바코드 서열 세그먼트를 방출하는 단계; 및
    (f) 상기 바코드 서열 세그먼트 및 상기 핵산 연장 수단을 이용하여 상기 증폭된 핵산 서열의 상기 서열을 연장시켜 바코드 라이브러리를 제공하거나 또는 대안적으로, 핵산 결찰 효소를 이용하여 상기 바코드 서열 세그먼트를 상기 증폭된 핵산 서열의 라이브러리에 연결하여 바코드 라이브러리를 제공하는 단계.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단계는 단일 반응으로 수행되는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 복수의 비드는 풀링된 비드 집단인, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 풀링된 비드 집단의 상기 비드는 단계 (a)에서 열거된 성분 중 하나 이상과 함께 공동 분할되고, 상기 파티션은 선택적으로 에멀전에서 액적을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드는 화학적으로 분해 가능한 비드, 광 분해성 비드 및 열 분해성 비드로부터 선택되는 분해 가능한 비드를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드는 화학적으로 환원 가능한 가교제를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 화학적으로 환원 가능한 가교제는 이황화 결합을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 증폭은 등온성인, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소는 phi29 DNA 중합효소인, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 연장 수단은 결찰효소, 핵산 연장 효소 및 트랜스포사제로 이루어진 군으로부터 선택된, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 증폭된 핵산 서열의 라이브러리는 단일 가닥 DNA를 포함하고, 상기 결찰 효소는 ATP 독립적 효소를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 ATP 독립적 효소는 내열성 5' App DNA/RNA 리가제를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  29. 제26항에 있어서, 상기 결찰 효소는 토포아이소머라제를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 토포아이소머라제는 토포아이소머라제 I인, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  31. 제26항에 있어서, 상기 결찰 효소는 T4 DNA 리가제를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  32. 제17항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코드 서열 세그먼트는 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 10개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  33. 제17항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코드 서열 세그먼트는 적어도 1000개의 상이한 바코드 서열 세그먼트를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  34. 제17항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1,000,000개의 올리고뉴클레오타이드 분자가 각각의 비드에 부착되는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  35. 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 풀링된 비드 집단은 적어도 10개의 상이한 비드 집단을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  36. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 풀링된 비드 집단은 적어도 100개의 상이한 비드 집단을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  37. 제19항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 풀링된 비드 집단은 적어도 500개의 상이한 비드 집단을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  38. 제17항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열 세그먼트는 적어도 하나의 기능성 서열을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 기능성 서열은 어댑터, 프라이머 서열, 프라이머 어닐링 서열, 부착 서열, 및 시퀀싱 프라이머 서열로부터 선택되는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 기능성 서열은 열 증가 및 화학적 절단으로 이루어진 목록으로부터 선택된 자극을 포함하는 방출 단계에서 격리 및 방출 가능한, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 방출 단계는 올리고뉴클레오타이드 바코드 서열 세그먼트를 포함하는 상기 비드 집단의 상기 비드의 적어도 일부를 분해하는 단계를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 비드를 분해하는 단계는 상기 바코드 서열 세그먼트와 상기 비드 사이의 이황화 브릿지 결합을 포함하는 화학적 결합을 절단하는 것을 포함하고, 상기 방출하는 단계는 상기 비드를 환원제에 노출시키는 것을 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 환원제는 DTT 및 TCEP로 이루어진 군으로부터 선택되는 환원제를 포함하는, 바코드 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법.
KR1020177022368A 2015-01-12 2016-01-07 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리 KR102321863B1 (ko)

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