ES2856074T3 - Preparación de muestras de ácido nucleico - Google Patents

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Robert Turner
Kai Yang
Irina Dobrovolskaya
David Liu
Rajaram Krishnan
David Charlot
Eugene Tu
James Mccanna
Lucas Kumosa
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Abstract

Un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, comprendiendo el método: a. aplicar el fluido a un dispositivo, comprendiendo el dispositivo una matriz de electrodos capaz de generar un campo electrocinético de CA con una corriente alterna; b. controlar la temperatura del dispositivo con un elemento térmico; c. concentrar una pluralidad de células en una primera región de campo electrocinético de CA, en la que la primera región electrocinética de CA es una región de campo bajo dielectroforético; d. aislar el ácido nucleico en una segunda región de campo electrocinético de CA, en la que la segunda región de campo electrocinético de CA es una región de campo alto dielectroforético; y e. enjuagar las células concentradas y/u otro material en partículas desde la matriz; en el que el fluido tiene una conductividad de al menos 100 mS/m.

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación de muestras de ácido nucleico
Antecedentes de la invención
En los últimos años se ha logrado un progreso exponencialmente rápido en el campo de la secuenciación de ADN. Los métodos tales como pirosecuenciación, secuenciación de semiconductores de iones y secuenciación polony tienen como objetivo reducir los costes hasta un punto en el que la secuenciación de un genoma completo se convierta en una rutina. Se espera que esto transforme campos tan diversos como la medicina, las energías renovables, la bioseguridad y la agricultura, por nombrar algunos. Sin embargo, las técnicas para aislar ADN adecuadas para la secuenciación no se han mantenido a la par y existe la amenaza de que esto se convierta en una limitación.
La publicación de patente US 2011/108422 A1 describe dispositivos y técnicas que involucran una combinación de fuerzas y efectos electrocinéticos, dielectroforéticos, electroforéticos y fluídicos multidimensionales para separar células, nanovesículas, nanopartículas y biomarcadores (ADN, ARN, anticuerpos, proteínas) en muestras y tampones biológicos de alta resistencia en conductancia (iónica). En las realizaciones divulgadas, se utiliza una combinación de fuerzas dielectroforéticas continuas y/o pulsadas (DEP), fuerzas electroforéticas de CC de campo continuo y/o pulsado, microelectroforesis y fluidos controlados con matrices de electrodos. En particular, el uso de dispositivos DEP con cámara y de dispositivos de matriz de electrodos relativamente más grandes debidamente escalados que combinan fuerzas de fluidos, electroforéticos y DEP permiten que volúmenes de sangre, suero, plasma u otras muestras más grandes y/o clínicamente relevantes sean analizadas más directamente, de forma rápida y eficaz.
Resumen de la invención
La invención se define en la reivindicación 1. Otros aspectos y realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones adjuntas. Los aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente divulgación que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proponen solo con fines ilustrativos. En algunos casos, la presente invención satisface la necesidad de métodos mejorados de aislamiento de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas. Los atributos particulares de ciertos aspectos proporcionados en este documento incluyen un tiempo total de preparación de la muestra de menos de aproximadamente una hora, con un tiempo de práctica de menos de aproximadamente un minuto. En algunas realizaciones, la presente invención se puede utilizar para aislar ADN de fluidos diluidos y/o complejos, tales como sangre o muestras ambientales. En otros aspectos, la presente invención puede utilizar pequeñas cantidades de material de partida, lograr ácidos nucleicos altamente purificados y es susceptible de operación multiplexada y de alto rendimiento.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, el método comprende: a. aplicar el fluido a un dispositivo, el dispositivo comprende una matriz de electrodos capaz de generar un campo electrocinético de CA; b. concentrar una pluralidad de células en una primera región de campo electrocinético de CA; c. lisar las células en la primera región de campo electrocinético de CA; y d. aislar el ácido nucleico en una segunda región de campo electrocinético de CA, en la que el fluido tiene una conductividad capaz de concentrar una pluralidad de células en la primera región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, la primera región electrocinética de CA es una región de campo dielectroforético, en la que la segunda región de campo electrocinético de CA es una región de campo dielectroforético, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CAes una primera región de campo bajo dielectroforético y la segunda región de campo electrocinético de CA es una segunda región de campo alto dielectroforético, en la que la conductividad del fluido es mayor que 300 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CA es una primera región de campo alto dielectroforético y la segunda región de campo electrocinético de CA es una segunda región de campo alto dielectroforético, en la que la conductividad del fluido es menor de 300 mS/m. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se concentra en la segunda región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente enjuagar el material residual desde la matriz y el ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente la degradación de una proteína residual. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente enjuagar las proteínas degradadas desde la matriz y el ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente recolectar el ácido nucleico. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CA se produce por una corriente alterna. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CA se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 voltio a 40 voltios pico-pico; y/o una frecuencia de 5 Hz a 5,000,000 Hz, y ciclos de trabajo desde 5 % hasta 50 %. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA es una región diferente de la matriz de electrodos como la primera región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA es la misma región de la matriz de electrodos como la primera región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA se produce por una corriente alterna. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 voltio a 50 voltios pico-pico; y/o una frecuencia de 5 Hz a 5,000,000 Hz, y ciclos de trabajo desde 5 % hasta 50 %. En algunas realizaciones, los electrodos se energizan selectivamente para proporcionar la primera región de campo electrocinético de CA y se energizan selectivamente subsiguiente o continuamente para proporcionar la segunda región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, las células se lisan al aplicar una corriente directa a las células. En algunas realizaciones, la corriente directa utilizada para lisar las células tiene un voltaje de 1 - 500 voltios; y una duración de .01 a 10 segundos aplicada una vez o como múltiples pulsos. En algunas realizaciones, la corriente directa utilizada para lisar las células es un pulso de corriente directa o una pluralidad de pulsos de corriente directa aplicados a una frecuencia adecuada para lisar las células. En algunas realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de 0.2 a 200 Hz con ciclos de trabajo desde 10-50 %. En algunas realizaciones, las células se lisan sobre el dispositivo utilizando una corriente directa, un agente de lisis químico, un agente de lisis enzimático, calor, presión osmótica, energía sónica, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el material residual comprende material celular lisado. En algunas realizaciones, el material celular lisado comprende proteína residual liberada de la pluralidad de células luego de lisis. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos se recubre con un hidrogel. En algunas realizaciones, el hidrogel comprende dos o más capas de un polímero sintético. En algunas realizaciones, el hidrogel se recubre por centrifugación sobre los electrodos. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una viscosidad entre aproximadamente 0.5 cP a aproximadamente 5 cP antes del recubrimiento por centrifugación. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.1 micrómetros y 1 micrómetro. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad entre aproximadamente 0.1 S/m a aproximadamente 1.0 S/m. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de puntos. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 25° hasta aproximadamente 60°. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en la que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos comprende una capa de pasivación con una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.0. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente amplificar el ácido nucleico aislado mediante reacción en cadena de polimerasa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende ADN, ARN, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende menos de aproximadamente 80 %, menos de aproximadamente 70 %, menos de aproximadamente 60 %, menos de aproximadamente 50 %, menos de aproximadamente 40 %, menos de aproximadamente 30 %, menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 5 %, o menos de aproximadamente 2 % material celular sin ácido nucleico y/o proteína en masa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende más de aproximadamente 99 %, más de aproximadamente 98 %, más de aproximadamente 95 %, más de aproximadamente 90 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 20 %, o más de aproximadamente 10 % de ácido nucleico en masa. En algunas realizaciones, el método se completa en menos de aproximadamente una hora. En algunas realizaciones, no se utiliza centrifugación. En algunas realizaciones, las proteínas residuales se degradan mediante una o más de degradación química y degradación enzimática. En algunas realizaciones, las proteínas residuales se degradan mediante Proteinasa K. En algunas realizaciones, las proteínas residuales se degradan mediante una enzima, el método comprende adicionalmente inactivar la enzima luego de la degradación de las proteínas. En algunas realizaciones, la enzima se inactiva mediante calor (por ejemplo, 50 a 95°C durante 5 - 15 minutos). En algunas realizaciones, el material residual y las proteínas degradadas se enjuagan en etapas separadas o concurrentes. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado se recolecta al (i) apagar la segunda región de campo electrocinético de CA; y (ii) eluir el ácido nucleico desde la matriz en un eluyente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla en una forma adecuada para secuenciación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla en una forma fragmentada adecuada para secuenciación aleatoria. En algunas realizaciones, el fluido que comprende las células tiene una baja conductividad o una alta conductividad. En algunas realizaciones, el fluido comprende un fluido corporal, sangre, suero, plasma, orina, saliva, un alimento, una bebida, un medio de crecimiento, una muestra ambiental, un líquido, agua, células clonales, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las células comprenden células clonales, células patógenas, células bacterianas, virus, células vegetales, células animales, células de insectos, y/o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente secuenciar el ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se secuencia mediante secuenciación de Sanger, pirosecuenciación, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación polony, secuenciación por ligación, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación por ligación, o secuenciación de una sola molécula. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente realizar una reacción sobre el ADN (por ejemplo, fragmentación, digestión de restricción, ligación). En algunas realizaciones, la reacción ocurre sobre o cerca a la matriz o en el dispositivo. En algunas realizaciones, el fluido que comprende las células no comprende más de 10,000 células.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, el método comprende: a. aplicar el fluido a un dispositivo, el dispositivo comprende una matriz de electrodos capaz de generar un campo electrocinético de CA; b. concentrar una pluralidad de células en una primera región de campo electrocinético de CA (por ejemplo, dielectroforético); c. aislar el ácido nucleico en una segunda región de campo electrocinético de CA (por ejemplo, dielectroforético); y d. enjuagar las células, en el que el fluido tiene una conductividad capaz de concentrar una pluralidad de células en la primera región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CA es una región de campo dielectroforético. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CA es una región de campo bajo dielectroforético, y en la que la conductividad del fluido es mayor que 300 mS/m. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA es una región de campo dielectroforético. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente la degradación de proteínas residuales después de la etapa (e). En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente enjuagar las proteínas degradadas del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente recolectar el ácido nucleico. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CA se produce por una corriente alterna. En algunas realizaciones, la primera región de campo electrocinético de CA se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 voltio a 40 voltios pico-pico; y/o una frecuencia de 5 Hz a 5,000,000 Hz, y ciclos de trabajo desde 5 % hasta 50 %. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA es una región diferente de la matriz de electrodos como la primera región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA es la misma región de la matriz de electrodos como la primera región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA se produce por una corriente alterna. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA es una región de campo alto dielectroforético. En algunas realizaciones, la segunda región de campo electrocinético de CA se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 voltio a 50 voltios pico-pico; y/o una frecuencia de 5 Hz a 5,000,000 Hz, y ciclos de trabajo desde 5 % hasta 50 %. En algunas realizaciones, los electrodos se energizan selectivamente para proporcionar la primera región de campo electrocinético de CA y se energizan selectivamente subsiguiente o continuamente para proporcionar la segunda región de campo electrocinético de CA. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos se recubre con un hidrogel. En algunas realizaciones, el hidrogel comprende dos o más capas de un polímero sintético. En algunas realizaciones, el hidrogel se recubre por centrifugación sobre los electrodos. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una viscosidad entre aproximadamente 0.5 cP a aproximadamente 5 cP antes del recubrimiento por centrifugación. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.1 micrómetros y 1 micrómetro. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad entre aproximadamente 0.1 S/m a aproximadamente 1.0 S/m. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de puntos. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 25° hasta aproximadamente 60°. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en la que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos comprende una capa de pasivación con una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.0. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente amplificar el ácido nucleico aislado mediante reacción en cadena de polimerasa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende ADN, ARN, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende menos de aproximadamente 80 %, menos de aproximadamente 70 %, menos de aproximadamente 60 %, menos de aproximadamente 50 %, menos de aproximadamente 40 %, menos de aproximadamente 30 %, menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 5 %, o menos de aproximadamente 2 % material celular sin ácido nucleico y/o proteína en masa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende más de aproximadamente 99 %, más de aproximadamente 98 %, más de aproximadamente 95 %, más de aproximadamente 90 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 20 %, o más de aproximadamente 10 % de ácido nucleico en masa. En algunas realizaciones, el método se completa en menos de aproximadamente una hora. En algunas realizaciones, no se utiliza centrifugación. En algunas realizaciones, las proteínas residuales se degradan mediante una o más de degradación química y degradación enzimática. En algunas realizaciones, las proteínas residuales se degradan mediante Proteinasa K. En algunas realizaciones, las proteínas residuales se degradan mediante una enzima, el método comprende adicionalmente inactivar la enzima luego de la degradación de las proteínas. En algunas realizaciones, la enzima se inactiva mediante calor (por ejemplo, 50 a 95°C durante 5 - 15 minutos). En algunas realizaciones, el material residual y las proteínas degradadas se enjuagan en etapas separadas o concurrentes. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado se recolecta al (i) apagar la segunda región de campo electrocinético de CA; y (ii) eluir el ácido nucleico desde la matriz en un eluyente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla en una forma adecuada para secuenciación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla en una forma fragmentada adecuada para secuenciación aleatoria. En algunas realizaciones, el fluido que comprende las células tiene una baja conductividad o una alta conductividad. En algunas realizaciones, el fluido comprende un fluido corporal, sangre, suero, plasma, orina, saliva, un alimento, una bebida, un medio de crecimiento, una muestra ambiental, un líquido, agua, células clonales, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las células comprenden células clonales, células patógenas, células bacterianas, virus, células vegetales, células animales, células de insectos, y/o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente secuenciar el ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se secuencia mediante secuenciación de Sanger, pirosecuenciación, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación polony, secuenciación por ligación, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación por ligación, o secuenciación de una sola molécula. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente realizar una reacción sobre el ADN (por ejemplo, fragmentación, digestión de restricción, ligación). En algunas realizaciones, la reacción ocurre sobre o cerca a la matriz o en el dispositivo. En algunas realizaciones, el fluido que comprende las células no comprende más de 10,000 células.
En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento un dispositivo para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, el dispositivo comprende: a. una carcasa; b. un calentador y/o un depósito que comprende un agente de degradación de proteína; y c. una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA) dentro de la carcasa, los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones de campo alto electrocinético de CAy de campo bajo electrocinético de CA, por lo cual los efectos electrocinéticos de CA proporcionan la concentración de células en las regiones de campo bajo del dispositivo. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos se configura para ser energizada selectivamente para establecer regiones de campo alto dielectroforético y campo bajo dielectroforético. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos se recubre con un hidrogel. En algunas realizaciones, el hidrogel comprende dos o más capas de un polímero sintético. En algunas realizaciones, el hidrogel se recubre por centrifugación sobre los electrodos. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una viscosidad entre aproximadamente 0.5 cP a aproximadamente 5 cP antes del recubrimiento por centrifugación. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.1 micrómetros y 1 micrómetro. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad entre aproximadamente 0.1 S/m a aproximadamente 1.0 S/m. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de puntos. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 25° hasta aproximadamente 60°. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en la que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos comprende una capa de pasivación con una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.0. En algunas realizaciones, el agente de degradación de proteína es Proteinasa K. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende adicionalmente un segundo depósito que comprende un eluyente.
En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento un sistema para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, el sistema comprende: a. un dispositivo que comprende una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA), los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones de campo alto electrocinético de CA y de campo bajo electrocinético de CA, por lo cual los efectos electrocinéticos de CA proporcionan la concentración de células en las regiones de campo alto del dispositivo, en el que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante; y b. un módulo capaz de secuenciar ADN mediante métodos de secuenciación de Sanger o secuenciación de próxima generación; c. un programa de software capaz de controlar el dispositivo que comprende una pluralidad de electrodos de CA, el módulo capaz de secuenciar ADN o una combinación de los mismos; y d. un fluido que comprende células. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos se configura para ser energizada selectivamente para establecer regiones de campo alto dielectroforético y campo bajo dielectroforético.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un dispositivo comprende: a. una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA), los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones de campo alto electrocinético de CA y de campo bajo electrocinético de CA, en el que la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en la que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante; y b. un módulo capaz de termociclar y amplificar ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos se configura para ser energizada selectivamente para establecer regiones de campo alto dielectroforético y campo bajo dielectroforético. En algunas realizaciones, el dispositivo es capaz de aislar los ácidos nucleicos desde un fluido que comprende células y realizar la amplificación de los ácidos nucleicos aislados. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado es ADN o ARNm. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla y se realiza la amplificación en una única cámara. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla y se realiza la amplificación en múltiples regiones de una única cámara. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende adicionalmente utilizar al menos uno de un tubo de elución, una cámara y un depósito para realizar la amplificación. En algunas realizaciones, la amplificación del ácido nucleico se basa en la reacción en cadena de polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, la amplificación del ácido nucleico se realiza en un microcanal serpentino que comprende una pluralidad de zonas de temperatura. En algunas realizaciones, se realiza la amplificación en gotitas acuosas atrapadas en fluidos inmiscibles (es decir, PCR digital). En algunas realizaciones, el termociclado comprende convección. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una superficie en contacto o próxima a los electrodos, en el que la superficie se funcionaliza con ligandos biológicos que son capaces de capturar selectivamente biomoléculas. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos se recubre con un hidrogel. En algunas realizaciones, el hidrogel comprende dos o más capas de un polímero sintético. En algunas realizaciones, el hidrogel se recubre por centrifugación sobre los electrodos. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una viscosidad entre aproximadamente 0.5 cP a aproximadamente 5 cP antes de recubrimiento por centrifugación. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.1 micrómetros y 1 micrómetro. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad entre aproximadamente 0.1 S/m a aproximadamente 1.0 S/m. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos comprende una capa de pasivación con una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.0. En algunas realizaciones, la superficie captura selectivamente biomoléculas mediante: a. hibridación del ácido nucleico; b. interacciones anticuerpo-antígeno; c. interacciones biotina-avidina; d. interacciones iónicas o electrostáticas; o e. cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la superficie se funcionaliza para minimizar y/o inhibir interacciones de unión no específicas mediante: a. polímeros (por ejemplo, polietilenglicol PEG); b. interacciones iónicas o electrostáticas; c. tensioactivos; o d. cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una pluralidad de dispositivos de microelectrodos orientados (a) planos lado a lado, (b) que se orientan verticalmente, o (c) que se orientan horizontalmente. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende un módulo capaz de realizar secuenciación de Sanger. En algunas realizaciones, el módulo capaz de realizar secuenciación de Sanger comprende un módulo capaz de electroforesis capilar, un módulo capaz de detección de fluorescencia multicolor, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un dispositivo comprende: a. una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA), los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones de campo alto electrocinético de CA y de campo bajo electrocinético de CA, en los que la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en la que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante; y b. un módulo capaz de realizar secuenciación. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos se configura para ser energizada selectivamente para establecer regiones de campo alto dielectroforético y campo bajo dielectroforético. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una superficie en contacto o próxima a los electrodos, en el que la superficie se funcionaliza con ligandos biológicos que son capaces de capturar selectivamente biomoléculas. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos se recubre con un hidrogel. En algunas realizaciones, el hidrogel comprende dos o más capas de un polímero sintético. En algunas realizaciones, el hidrogel se recubre por centrifugación sobre los electrodos. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una viscosidad entre aproximadamente 0.5 cP a aproximadamente 5 cP antes del recubrimiento por centrifugación. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.1 micrómetros y 1 micrómetro. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad entre aproximadamente 0.1 S/m a aproximadamente 1.0 S/m. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos comprende una capa de pasivación con una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 4.0. En algunas realizaciones, la superficie captura selectivamente biomoléculas mediante: a. hibridación del ácido nucleico; b. interacciones anticuerpo-antígeno; c. interacciones biotina-avidina; d. interacciones iónicas o electrostáticas; o e. cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la superficie se funcionaliza para minimizar y/o inhibir interacciones de unión no específicas mediante: a. polímeros (por ejemplo, polietilenglicol PEG); b. interacciones iónicas o electrostáticas; c. tensioactivos; o d. cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una pluralidad de dispositivos de microelectrodos orientados (a) planos lado a lado, (b) que se orientan verticalmente, o (c) que se orientan horizontalmente. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende un módulo capaz de realizar secuenciación de próxima generación. En algunas realizaciones, el módulo capaz de realizar secuenciación de próxima generación es capaz de realizar pirosecuenciación, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación polony, secuenciación por ligación, secuenciación de nanobolas de ADN, o secuenciación de una sola molécula.
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulga un método de aislamiento de un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, que comprende a) realizar un método divulgado en el presente documento; b) realizar ampliación por PCR sobre el ácido nucleico, o una versión de ADNc del ácido nucleico, para producir un producto de PCR; c) aislar el producto de PCR en una tercera región electrocinética de CA; d) realizar reacciones de terminación de cadena de Sanger sobre el producto de PCR para producir un producto de secuenciación del ácido nucleico; y e) realizar separación electroforética del producto de secuenciación del ácido nucleico. En algunas realizaciones, la tercera región electrocinética de CA es una región de campo dielectroforético. En algunas realizaciones, la tercera región electrocinética de CA es una región de campo alto dielectroforético. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en la que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante. En algunas realizaciones, la separación electroforética del producto de secuenciación del ácido nucleico es electroforesis capilar. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente el uso de detección de fluorescencia multicolor para analizar el producto de secuenciación del ácido nucleico. En algunas realizaciones, se realizan todas las etapas sobre un único chip. En algunas realizaciones, el fluido que comprende las células no comprende más de 10,000 células.
Breve descripción de los dibujos
Las características novedosas de la invención se establecen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que establece realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos acompañantes de los cuales:
La FIG. 1 muestra una vista superior (A), una vista inferior (B) y una vista en sección transversal (C) de un dispositivo ejemplar.
La FIG. 2 muestra los electrodos asociados con diversas cantidades de ADN genómico.
La FIG. 3 muestra el aislamiento de E. coli verde fluorescente en una matriz. El panel (A) muestra una vista de campo brillante. El panel (B) muestra una vista fluorescente verde de los electrodos antes de la activación de DEP. El panel (C) muestra E. coli sobre los electrodos después de un minuto a 10 kHz, 20 Vp-p en tampón 1xTBE. El panel (D) muestra E. coli sobre los electrodos después de un minuto a 1 MHz, 20 Vp-p en tampón 1xTBE.
La FIG. 4 muestra una comparación entre los métodos de la presente invención (panel superior derecho) y el procedimiento de purificación de ADN Epicenter™ WaterMaster™ (panel superior izquierdo). Los gráficos circulares son la distribución de 10,000 lecturas de secuenciación Illumina™ BLASt buscadas contra la base de datos MEGAN™. Como se muestra, un porcentaje similar de lecturas de secuenciación se originó de secuencias de E. coli para ambos métodos. La tabla en el panel inferior muestra la cobertura de Secuenciación y la calidad de la serie de E. Coli a través del chip y se compara con una serie de control fuera del chip de acuerdo con el protocolo del fabricante.
La FIG. 5 muestra un método de ejemplo para aislar ácidos nucleicos a partir de las células.
La FIG. 6 muestra un método de ejemplo para aislar ácidos nucleicos extracelulares a partir de un fluido que comprende células.
La FIG. 7 ejemplifica las fuerzas ACEK (Electrocinética de CA) que resultan de los métodos y dispositivos descritos en el presente documento. Utilizando la relación entre las fuerzas sobre las partículas debido a la Dielectroforesis (DEP), el flujo Electrotérmico de CA (ACET) y la Electroósmosis de CA (ACEO), en algunas realizaciones, se utilizan cortes de tamaño para el aislamiento y purificación de ácidos nucleicos. El aislamiento se basa en vórtices de flujo que acercará los ácidos nucleicos al borde de un electrodo debido a ACET y ACEO dependiendo de la conductividad del fluido. Una trampa DEP retiene las partículas una vez que están en el sitio de la trampa, dependiendo del radio de Stokes efectivo.
La FIG. 8 ejemplifica una configuración de electrodo ondulado, como se divulga en el presente documento. La distancia de borde a borde entre electrodos es generalmente equidistante en todas partes. Una configuración de electrodo ondulado maximiza el área de superficie del electrodo mientras mantiene un campo eléctrico alterno no uniforme para inducir un gradiente de ACEK para habilitar las fuerzas DEP, ACEO, ACET y otras fuerzas ACEK.
La FIG. 9 ejemplifica cómo el gradiente del campo E en una esquina de la capa dieléctrica se basa en el grosor de nitruro de silicio. Un K menor y un grosor menor dieron como resultado un mayor gradiente de campo E (flexión) en una esquina de la capa dieléctrica.
La FIG. 10 ejemplifica la captura de ADN sobre un electrodo con una capa de hidrogel depositada en forma de vapor. Los recubrimientos en fase vapor de monómeros activados forman recubrimientos de película delgada uniforme sobre una variedad de sustratos. Los hidrogeles tales como pHEMA se depositaron en varios grosores (100, 200, 300, 400 nm) y densidades de entrecruzamiento (5, 25, 40 %) en chips de electrodos por GVD Corporation (Cambridge, MA). Las películas de hidrogel se probaron utilizando un protocolo ACE estándar (sin pretratamiento, 7 Vp-p, 10 kHz, 2 minutos, 0.5XPBS, 500 ng/ml de ADNg marcado con Sybr Green 1). La fluorescencia de los electrodos se capturó mediante formación de imágenes. Se encontró que el dispositivo de gel de entrecruzamiento al 5 % de 100 nm de grosor tenía una fuerte captura de ADN. Opcionalmente, el proceso se podría optimizar al cambiar la velocidad de deposición o al anclar el crecimiento a la superficie de la matriz de microelectrodos (es decir, a la capa de pasivación y los electrodos expuestos), utilizando un promotor de adhesión tal como un derivado de silano.
Descripción detallada de la invención
En el presente documento se describen métodos, dispositivos y sistemas adecuados para aislar o separar partículas o moléculas de una composición fluida. En realizaciones específicas, se proporcionan en el presente documento métodos, dispositivos y sistemas para aislar o separar un ácido nucleico de un fluido que comprende células u otro material en partículas. En algunos aspectos, los métodos, dispositivos y sistemas pueden permitir la separación rápida de partículas y moléculas en una composición fluida. En otros aspectos, los métodos, dispositivos y sistemas pueden permitir un rápido aislamiento de moléculas de partículas en una composición fluida. En varios aspectos, los métodos, dispositivos y sistemas pueden permitir un procedimiento rápido que requiere una cantidad mínima de material y/o da como resultado ADN de alta pureza aislado de fluidos complejos tales como sangre o muestras ambientales.
En ciertas realizaciones del presente documento se proporcionan métodos, dispositivos y sistemas para aislar o separar partículas o moléculas de una composición fluida, los métodos, dispositivos y sistemas comprenden aplicar el fluido a un dispositivo que comprende una matriz de electrodos y que es capaz de generar fuerzas electrocinéticas de CA (por ejemplo, cuando se energiza la matriz de electrodos). En algunas realizaciones, el campo dielectroforético es un componente de los efectos de la fuerza electrocinética de CA. En otras realizaciones, el componente de los efectos de la fuerza electrocinética de CA es la electroósmosis de CA o los efectos electrotérmicos de CA. En algunas realizaciones, la fuerza electrocinética de CA, que incluye los campos dielectroforéticos, comprende regiones de campo alto (DEP positivo, es decir, área donde hay una fuerte concentración de líneas de campo eléctrico debido a un campo eléctrico no uniforme) y/o regiones de campo bajo (DEP negativo, es decir, área donde hay una concentración débil de líneas de campo eléctrico debido a un campo eléctrico no uniforme).
En casos específicos, las partículas o moléculas (por ejemplo, ácido nucleico) se aíslan (por ejemplo, se aíslan o separan de células) en una región de campo (por ejemplo, una región de campo alto) del campo dielectroforético. En algunas realizaciones, el método, dispositivo, o sistema incluye adicionalmente una o más de las siguientes etapas: concentrar células de interés en una primera región de campo dielectroforético (por ejemplo, una región DEP de campo alto), lisar células en la primera región de campo dielectroforético, y/o concentrar ácido nucleico en una primera o segunda región de campo dielectroforético. En otras realizaciones, el método, dispositivo, o sistema incluye una o más de las siguientes etapas: concentrar células en una primera región de campo dielectroforético (por ejemplo, una región DEP de campo bajo), concentrar ácido nucleico en una segunda región de campo dielectroforético (por ejemplo, una región DEP de campo alto), y lavar las células y material residual. El método también incluye opcionalmente dispositivos y/o sistemas capaces de realizar una o más de las siguientes etapas: lavar o eliminar de otra forma el material residual (por ejemplo, celular) del ácido nucleico (por ejemplo, enjuagar la matriz con agua o tampón mientras que se concentra el ácido nucleico y se mantiene dentro de una región DEP de campo alto de la matriz), degradar las proteínas residuales (por ejemplo, proteínas residuales de las células lisadas y/u otras fuentes, dicha degradación ocurre de acuerdo con cualquier mecanismo adecuado, tal como con calor, una proteasa, o un producto químico), enjuagar las proteínas degradadas del ácido nucleico, y recolectar el ácido nucleico. En algunas realizaciones, el resultado de los métodos, operación de los dispositivos, y operación de los sistemas descritos en el presente documento es un ácido nucleico aislado, opcionalmente de cantidad y pureza adecuada para secuenciación de ADN.
En algunos casos, es ventajoso que los métodos descritos en el presente documento se realicen en un corto período de tiempo, los dispositivos se operen en un corto período de tiempo y los sistemas en un corto período de tiempo. En algunas realizaciones, el período de tiempo es corto con referencia al “tiempo de procedimiento” medido desde el tiempo entre la adición del fluido al dispositivo y la obtención del ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el tiempo de procedimiento es menor que 3 horas, menor que 2 horas, menor que 1 hora, menor que 30 minutos, menor que 20 minutos, menor que 10 minutos, o menor que 5 minutos.
En otro aspecto, el período de tiempo es corto con referencia al “tiempo de práctica” medido como la cantidad acumulada de tiempo que una persona debe atender al procedimiento desde el momento entre la adición del fluido al dispositivo y la obtención del ácido nucleico aislado. En algunas realizaciones, el tiempo de práctica es menor que 20 minutos, menor que 10 minutos, menor que 5 minuto, menor que 1 minuto, o menor que 30 segundos.
En algunos casos, es ventajoso que los dispositivos descritos en el presente documento comprendan un solo recipiente, los sistemas descritos en el presente documento comprendan un dispositivo que comprende un solo recipiente y los métodos descritos en el presente documento se puedan realizar en un solo recipiente, por ejemplo, en un dispositivo dielectroforético como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, dicha realización de un solo recipiente minimiza el número de etapas de manipulación de fluidos y/o se realiza en un corto período de tiempo. En algunos casos, los presentes métodos, dispositivos y sistemas se contrastan con métodos, dispositivos y sistemas que utilizan una o más etapas de centrifugación y/o intercambios de medio. En algunos casos, la centrifugación aumenta la cantidad de tiempo de práctica necesario para aislar los ácidos nucleicos. En otro aspecto, el procedimiento o dispositivo de un solo recipiente aísla los ácidos nucleicos utilizando una cantidad mínima de reactivos consumibles.
Dispositivos y sistemas
En algunas realizaciones, en el presente documento se divulgan dispositivos para recolectar un ácido nucleico desde un fluido. En un aspecto, se describen en el presente documento dispositivos para recolectar un ácido nucleico desde un fluido que comprende células u otro material en partículas. En otros aspectos, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de recolectar y/o aislar el ácido nucleico desde un fluido que comprende material celular o proteico. En otros casos, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de recolectar y/o aislar el ácido nucleico desde material celular.
En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento un dispositivo para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células u otro material en partículas, el dispositivo comprende: a. una carcasa; b. un calentador o fuente térmica y/o un depósito que comprende un agente de degradación de proteína; y c. una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA) dentro de la carcasa, los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones de campo alto electrocinético de CA y de campo bajo electrocinético de CA, por lo cual los efectos electrocinéticos de CA proporcionan la concentración de células en las regiones de campo bajo del dispositivo. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos se configura para ser energizada selectivamente para establecer regiones de campo alto dielectroforético y campo bajo dielectroforético. En algunas realizaciones, el agente de degradación de proteína es una proteasa. En algunas realizaciones, el agente de degradación de proteína es Proteinasa K. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende adicionalmente un segundo depósito que comprende un eluyente.
En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento un dispositivo comprende: a. una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA), los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones de campo alto electrocinético de CAy de campo bajo electrocinético de CA; y b. un módulo capaz de termociclar y realizar PCR u otras reacciones enzimáticas. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos se configura para ser energizada selectivamente para establecer regiones de campo alto dielectroforético y campo bajo dielectroforético. En algunas realizaciones, el dispositivo es capaz de aislar ADN desde un fluido que comprende células y realizar ampliación por PCR u otras reacciones enzimáticas. En algunas realizaciones, el ADN se aísla y se realiza PCR u otra reacción enzimática en una única cámara. En algunas realizaciones, el ADN se aísla y se realiza PCR u otra reacción enzimática en múltiples regiones de una única cámara. En algunas realizaciones, el ADN se aísla y se realiza PCR u otra reacción enzimática en múltiples cámaras.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende adicionalmente al menos uno de un tubo de elución, una cámara y un depósito para realizar ampliación por PCR u otra reacción enzimática. En algunas realizaciones, se realiza ampliación por PCR u otra reacción enzimática en un microcanal serpentino que comprende una pluralidad de zonas de temperatura. En algunas realizaciones, se realiza ampliación por PCR u otra reacción enzimática en gotitas acuosas atrapadas en fluidos inmiscibles (es decir, PCR digital). En algunas realizaciones, el termociclado comprende convección. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una superficie en contacto o próxima a los electrodos, en el que la superficie se funcionaliza con ligandos biológicos que son capaces de capturar selectivamente biomoléculas.
En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento un sistema para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células u otro material en partículas, el sistema comprende: a. un dispositivo que comprende una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA), los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones de campo alto electrocinético de CA y de campo bajo electrocinético de CA, por lo cual los efectos electrocinéticos de CA proporcionan la concentración de células en las regiones de campo alto del dispositivo; y b. un secuenciador, termociclador u otro dispositivo para realizar reacciones enzimáticas sobre nucleico aislado o recolectado. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos se configura para ser energizada selectivamente para establecer regiones de campo alto dielectroforético y campo bajo dielectroforético.
En varias realizaciones, los campos DEP se crean o pueden ser creados al energizar selectivamente una matriz de electrodos como se describe en el presente documento. Los electrodos están hechos opcionalmente de cualquier material adecuado resistente a la corrosión, que incluyen metales, tales como metales nobles (por ejemplo, platino, aleación de platino-iridio, paladio, oro y similares). En varias realizaciones, los electrodos son de cualquier tamaño adecuado, de cualquier orientación adecuada, de cualquier espaciado adecuado, energizados o capaces de energizarse de cualquier manera adecuada, y similares, de modo que se produzcan DEP adecuados y/u otros campos electrocinéticos.
En algunas realizaciones se describen en el presente documento métodos, dispositivos y sistemas en los que los electrodos se colocan en cámaras separadas y se crean regiones DEP positivas y regiones DEP negativas dentro de una cámara interna mediante el pasaje del campo de DEP de CA a través de estructuras de poros o agujeros. Se utilizan diversas geometrías para formar las regiones DEP positivas (campo alto) deseadas y regiones negativas (campo bajo) de DEP para transportar separaciones celulares, de micropartículas, nanopartículas y de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, las estructuras de poros u agujeros contienen (o están llenas de) material poroso (hidrogeles) o están cubiertas con estructuras de membranas porosas. En algunas realizaciones, al segregar los electrodos en cámaras separadas, dichos dispositivos DEP con estructura de poros/agujeros reducen los efectos electroquímicos, el calentamiento o el movimiento fluídico caótico que se produce en la cámara de separación interna durante el proceso DEP.
En un aspecto, se describe en el presente documento un dispositivo que comprende electrodos, en el que los electrodos se colocan en cámaras separadas y los campos DEP se crean dentro de una cámara interna mediante el pasaje a través de estructuras de poros. El dispositivo ejemplar incluye una pluralidad de electrodos y cámaras que contienen electrodos dentro de una carcasa. Un controlador del dispositivo controla de forma independiente los electrodos, como se describe adicionalmente en la publicación de patente PCT WO 2009/146143 A2.
En algunas realizaciones, los dispositivos con cámara se crean con una variedad de estructuras de poros y/o agujeros (nanoescala, microescala e incluso macroescala) y contienen membranas, geles o materiales filtrantes que controlan, confinan o impiden que las células, nanopartículas u otras entidades se difundan o transporten a las cámaras internas mientras los campos eléctricos de CA/CC, las moléculas de soluto, el tampón y otras moléculas pequeñas pueden pasar a través de las cámaras.
En varias realizaciones, es posible una variedad de configuraciones para los dispositivos. Por ejemplo, un dispositivo que comprende una matriz más grande de electrodos, por ejemplo en un patrón cuadrado o rectangular configurado para crear un campo eléctrico no uniforme repetido para permitir la electrocinética de CA. Solo con fines ilustrativos, una matriz de electrodos adecuada puede incluir, pero no se limita a, una configuración de electrodos de 10x10, una configuración de electrodos de 50x50, una configuración de electrodos de 10x100, una configuración de electrodos de 20x100 o una configuración de electrodos de 20x80.
Dichos dispositivos incluyen, pero no se limitan a, electrodos multiplexados y dispositivos de cámara, dispositivos que permiten crear patrones de campo eléctrico reconfigurables, dispositivos que combinan procesos electroforéticos y fluídicos de CC; dispositivos de preparación de muestras, preparación de muestras, manipulación enzimática de moléculas de ácido nucleico aisladas y dispositivos de diagnóstico que incluyen detección y análisis posteriores, dispositivos de laboratorio en chip, puntos de atención y otros sistemas o versiones de diagnóstico clínico.
En algunas realizaciones, un dispositivo de matriz de electrodos de platino plano comprende una carcasa a través del cual fluye una muestra de fluido. En algunas realizaciones, el fluido fluye desde un extremo de entrada hasta un extremo de salida, que comprende opcionalmente una salida de analito lateral. El dispositivo ejemplar incluye múltiples electrodos de CA. En algunas realizaciones, la muestra consiste en una combinación de entidades o células del tamaño de un micrómetro, nanopartículas más grandes y nanopartículas o biomoléculas más pequeñas. En algunos casos, las nanopartículas más grandes son desechos celulares dispersos en la muestra. En algunas realizaciones, las nanopartículas más pequeñas son proteínas, ADN, ARN y fragmentos celulares más pequeños. En algunas realizaciones, el dispositivo de matriz de electrodos plano es una matriz de electrodos de 60 x 20 que opcionalmente está seccionado en tres matrices de 20 x 20 que se pueden controlar por separado pero operar simultáneamente. Los electrodos de CC auxiliares opcionales se pueden encender a carga positiva, mientras que los electrodos de CC opcionales se encienden a carga negativa con fines electroforéticos. En algunos casos, cada uno de los sistemas de CA y CC controlados se utilizan tanto de forma continua como pulsada (por ejemplo, cada uno se puede encender y apagar mediante pulsos a intervalos de tiempo relativamente cortos) en varias realizaciones. Las matrices de electrodos planos opcionales a lo largo de los lados del flujo de muestra, cuando se superponen con material nanoporoso (por ejemplo, un hidrogel de polímero sintético), se utilizan opcionalmente para generar fuerzas electroforéticas de CC así como DEP de CA. Además, los procesos de separación microelectroforética se llevan a cabo opcionalmente dentro de las capas de nanoporos utilizando electrodos planos en la matriz y/o electrodos auxiliares en las dimensiones x-y-z.
En varias realizaciones estos métodos, dispositivos y sistemas se operan en el rango de frecuencia de CA desde 1,000 Hz hasta 100 MHz, en voltajes que pueden variar desde aproximadamente 1 voltio hasta 2000 voltios pk-pk; en voltajes de CC desde 1 voltio hasta 1000 voltios, en índices de fluidez desde 10 microlitros por minuto hasta 10 mililitro por minuto, y en rangos de temperatura desde 1°C hasta 120°C. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de frecuencia de CA desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 15 kHz. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en voltajes desde 5 - 25 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 voltios/cm. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes de CC desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 voltios. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en un índice de fluidez desde aproximadamente 10 microlitros hasta aproximadamente 500 microlitros por minuto. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de temperatura desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 60°C. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de frecuencia de CA desde 1,000 Hz hasta 10 MHz. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de frecuencia de CA desde 1,000 Hz hasta 1 MHz. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de frecuencia de CA desde 1,000 Hz hasta 100 kHz. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de frecuencia de CA desde 1,000 Hz hasta 10 kHz. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de frecuencia de CA desde 10 kHz hasta 100 kHz. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en rangos de frecuencia de CA desde 100 kHz hasta 1 MHz. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 voltio hasta 1500 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 voltio hasta 1500 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 voltio hasta 1000 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 voltio hasta 500 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 voltio hasta 250 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 voltio hasta 100 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes desde aproximadamente 1 voltio hasta 50 voltios pk-pk. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes de CC desde 1 voltio hasta 1000 voltios. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes de CC desde 1 voltio hasta 500 voltios. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes de CC desde 1 voltio hasta 250 voltios. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes de CC desde 1 voltio hasta 100 voltios. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas se operan en voltajes de CC desde 1 voltio hasta 50 voltios. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en índices de fluidez desde 10 microlitros por minuto hasta 1 ml por minuto. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en índices de fluidez desde 10 microlitros por minuto hasta 500 microlitros por minuto. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en índices de fluidez desde 10 microlitros por minuto hasta 250 microlitros por minuto. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en índices de fluidez desde 10 microlitros por minuto hasta 100 microlitros por minuto. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en rangos de temperatura desde 1°C hasta 100°C. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en rangos de temperatura desde 20°C hasta 95°C. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan en rangos de temperatura desde 25°C hasta 100°C. En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos, y sistemas se operan una temperatura ambiente.
En algunas realizaciones, el controlador controla independientemente cada uno de los electrodos. En algunas realizaciones, el controlador está conectado externamente al dispositivo, tal como mediante una conexión de enchufe y clavija, o está integrado con la carcasa del dispositivo.
También se describen en el presente documento matrices seccionadas a escala (dimensión x-y) de electrodos robustos y disposiciones estratégicamente colocadas (dimensión x-y-z) de electrodos auxiliares que combinan DEP, fuerzas electroforéticas y fluídicas, y uso de los mismos. En algunas realizaciones, los volúmenes clínicamente relevantes de sangre, suero, plasma u otras muestras se analizan más directamente bajo condiciones de mayor fuerza iónica y/o conductancia. En el presente documento se describe la superposición de estructuras de electrodos robustos (por ejemplo, platino, paladio, oro, etc.) con una o más capas porosas de materiales (hidrogeles porosos naturales o sintéticos, membranas, materiales nanoporosos controlados y materiales en capas dieléctricas delgadas) para reducir los efectos de cualesquier reacciones electroquímica (electrólisis), calentamiento y movimiento caótico de fluidos que pueden ocurrir sobre o cerca de los electrodos, y aún así permitir que se lleve a cabo la separación efectiva de células, bacterias, virus, nanopartículas, ADN y otras biomoléculas. En algunas realizaciones, además de utilizar puntos de cruce de frecuencia de CA para lograr separaciones de mayor resolución, se utiliza microelectroforesis de CC sobre el dispositivo (en matriz) para separaciones secundarias. Por ejemplo, la separación de nanopartículas de ADN (20 -50 kb), fragmentos de ADN de alto peso molecular (5 - 20 kb), ADN de peso molecular intermedio ( 1 - 5 kb) y ADN de bajo peso molecular (0.1-1 kb) se puede lograr a través de microelectroforesis de CC sobre la matriz. En algunas realizaciones, el dispositivo se subdivide, opcionalmente con el propósito de separaciones concurrentes de diferentes células sanguíneas, bacterias y virus, y ADN llevadas a cabo simultáneamente sobre dicho dispositivo.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una carcasa y un calentador o fuente térmica y/o un depósito que comprende un agente de degradación de proteína. En algunas realizaciones, el calentador o fuente térmica es capaz de incrementar la temperatura del fluido a una temperatura deseada (por ejemplo, a una temperatura adecuada para degradar proteínas, aproximadamente 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, o similares). En algunas realizaciones, el calentador o fuente térmica es adecuado para operación como un termociclador de PCR. En otras realizaciones, el calentador o fuente térmica se utiliza para mantener una temperatura constante (condiciones isotérmicas). En algunas realizaciones, el agente de degradación de proteína es una proteasa. En otras realizaciones, el agente de degradación de proteína es Proteinasa K y el calentador o fuente térmica se utiliza para inactivar el agente de degradación de proteína.
En algunas realizaciones, el dispositivo también comprende una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA) dentro de la carcasa, los electrodos de CA capaces de ser configurados para ser energizados selectivamente para establecer regiones dielectroforéticas (DEP) de campo alto y dielectroforéticas (DEP) de campo bajo, por lo cual los efectos electrocinéticos de CA proporcionan la concentración de células en las regiones de campo bajo del dispositivo. En algunas realizaciones, los electrodos se energizan selectivamente para proporcionar la primera región de campo electrocinético de CA y se energizan selectivamente subsiguiente o continuamente para proporcionar la segunda región de campo electrocinético de CA. Por ejemplo, la descripción adicional de los electrodos y la concentración de células en los campos DEP se encuentra en la publicación de patente PCT WO 2009/146143 a 2.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende un segundo depósito que comprende un eluyente. El eluyente es cualquier fluido adecuado para eluir el ácido nucleico aislado desde el dispositivo. En algunos casos el eluyente es agua o un tampón. En algunos casos, el eluyente comprende los reactivos requeridos para un método de secuenciación de ADN.
También se proporcionan en el presente documento sistemas y dispositivos que comprenden una pluralidad de electrodos de corriente alterna (CA), los electrodos de CA se configuran para ser energizados selectivamente para establecer regiones dielectroforéticas (DEP) de campo alto y dielectroforéticas (DEP) de campo bajo. En algunos casos, los efectos electrocinéticos de CA proporcionan la concentración de células en las regiones de campo bajo y/o concentración (o recolección o aislamiento) de moléculas (por ejemplo, macromoléculas, tales como ácido nucleico) en las regiones de campo alto del campo de DEP.
También se proporcionan en el presente documento sistemas y dispositivos que comprenden una pluralidad de corriente directa (DC) electrodos. En algunas realizaciones, la pluralidad de electrodos de CC comprende al menos dos electrodos rectangulares, extendidos a través de la matriz. En algunas realizaciones, los electrodos se ubican en los bordes de la matriz. En algunas realizaciones, los electrodos de CC se intercalan entre electrodos de CA.
En algunas realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento comprende un medio para manipular ácido nucleico. En algunas realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento incluye un medio para realizar reacciones enzimáticas. En otras realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento incluye un medio para realizar reacción en cadena de polimerasa, amplificación isotérmica, reacciones de ligación, análisis de restricción, clonación de ácido nucleico, ensayos de transcripción o traducción, u otro ensayo de biología molecular de base enzimática.
En algunas realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento comprende un ácido nucleico secuenciador. El secuenciador es opcionalmente cualquier dispositivo secuenciador de a Dn adecuado que incluye pero no se limita a un secuenciador de Sanger, pirosecuenciado, secuenciador semiconductor polony, secuenciador polony, dispositivo de secuenciación por ligación, dispositivo de secuenciación de nanobolas de ADN, dispositivo de secuenciación por ligación, o dispositivo de secuenciación de una sola molécula.
En algunas realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento es capaz de mantener una temperatura constante. En algunas realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento es capaz de enfriar la matriz o cámara. En algunas realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento es capaz de calentar la matriz o cámara. En algunas realizaciones, un sistema o dispositivo descrito en el presente documento comprende a termociclador. En algunas realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento comprenden un elemento de control de temperatura localizado. En algunas realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de tanto detectar como controlar la temperatura.
En algunas realizaciones, los dispositivos comprenden adicionalmente elementos de calentamiento o térmicos. En algunas realizaciones, un elemento de calentamiento o térmico se ubica debajo de un electrodo. En algunas realizaciones, los elementos de calentamiento o térmicos comprenden un metal. En algunas realizaciones, los elementos de calentamiento o térmicos comprenden tantalio, aluminio, tungsteno, o una combinación de los mismos. En general, la temperatura alcanzada por un elemento de calentamiento o térmico es proporcional a la corriente que lo atraviesa. En algunas realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento comprenden elementos de enfriamiento localizados. En algunas realizaciones, los elementos resistentes al calor se colocan directamente bajo la matriz de electrodos expuesta. En algunas realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de alcanzar y mantener una temperatura entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 120°C. En algunas realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de alcanzar y mantener una temperatura entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 100°C. En otras realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de alcanzar y mantener una temperatura entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 95°C. En algunas realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de alcanzar y mantener una temperatura entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 90°C, entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 85°C, entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 75°C, entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 65°C o entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 55°C. En algunas realizaciones, los dispositivos divulgados en el presente documento son capaces de alcanzar y mantener una temperatura de aproximadamente 20°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 70°C, aproximadamente 80°C, aproximadamente 90°C, aproximadamente 100°C, aproximadamente 110°C o aproximadamente 120°C.
Electrodos
La pluralidad de electrodos de corriente alterna se configura opcionalmente en cualquier manera adecuada para los procesos de separación descritos en el presente documento. Por ejemplo, la descripción adicional del sistema o dispositivo que incluye electrodos y/o concentración de células en los campos DEP se encuentra en publicación de patente PCT WO 2009/146143.
En algunas realizaciones, los electrodos divulgados en el presente documento pueden comprender cualquier metal. En algunas realizaciones, los electrodos pueden incluir, pero no se limitan a: aluminio, cobre, carbono, hierro, plata, oro, paladio, platino, iridio, aleación de platino e iridio, rutenio, rodio, osmio, tántalo, titanio, tungsteno, polisilicio, y óxido de indio y estaño, o combinaciones de los mismos, así como materiales de siliciuro tales como siliciuro de platino, siliciuro de titanio, siliciuro de oro o siliciuro de tungsteno. En algunas realizaciones, los electrodos pueden comprender una tinta conductora capaz de ser serigrafiada.
En algunas realizaciones, la relación borde a borde (E2E) a diámetro de un electrodo es aproximadamente 0.5 mm a aproximadamente 5 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 4 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 3 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 2 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 5 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 1 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 2 mm En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 3 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 4 mm. En algunas realizaciones, la relación E2E a diámetro es de aproximadamente 5 mm
En algunas realizaciones, los electrodos divulgados en el presente documento se graban en seco. En algunas realizaciones, los electrodos se graban en húmedo. En algunas realizaciones, los electrodos experimentan una combinación de grabado en seco y grabado en húmedo.
En algunas realizaciones, cada electrodo se controla individualmente en el sitio.
En algunas realizaciones, una matriz de electrodos se controla como una unidad.
En algunas realizaciones, se emplea una capa de pasivación. En algunas realizaciones, una capa de pasivación se puede formar de cualquier material adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la capa de pasivación comprende nitruro de silicio. En algunas realizaciones, la capa de pasivación comprende dióxido de silicio. En algunas realizaciones, la capa de pasivación tiene una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 8.0. En algunas realizaciones, la capa de pasivación tiene una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 3.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 4.0 a aproximadamente 8.0 o aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. En algunas realizaciones, la capa de pasivación tiene una permisividad eléctrica relativa de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 4.0. En algunas realizaciones, la capa de pasivación tiene una permisividad eléctrica relativa desde aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 3.0. En algunas realizaciones, la capa de pasivación tiene una permisividad eléctrica relativa de aproximadamente 2.0, aproximadamente 2.5, aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.5 o aproximadamente 4.0.
En algunas realizaciones, la capa de pasivación está entre aproximadamente 0.1 micrómetros y aproximadamente 10 micrómetros en grosor. En algunas realizaciones, la capa de pasivación está entre aproximadamente 0.5 micrómetros y 8 micrómetros en grosor. En algunas realizaciones, la capa de pasivación está entre aproximadamente 1.0 micrómetro y 5 micrómetros en grosor. En algunas realizaciones, la capa de pasivación está entre aproximadamente 1.0 micrómetro y 4 micrómetros en grosor. En algunas realizaciones, la capa de pasivación está entre aproximadamente 1.0 micrómetro y 3 micrómetros en grosor. En algunas realizaciones, la capa de pasivación está entre aproximadamente 0.25 micrómetros y 2 micrómetros en grosor. En algunas realizaciones, la capa de pasivación está entre aproximadamente 0.25 micrómetros y 1 micrómetro en grosor.
En algunas realizaciones, la capa de pasivación está compuesta de cualquier material dieléctrico aislante de bajo k adecuado, que incluye pero no se limita a nitruro de silicio o dióxido de silicio. En algunas realizaciones, la capa de pasivación se selecciona del grupo que consiste en poliamidas, carbón, nitruro de silicio dopado, dióxido de silicio dopado con carbón, nitruro de silicio dopado con flúor, dióxido de silicio dopado con flúor, dióxido de silicio poroso, o cualesquier combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la capa de pasivación puede comprende una tinta dieléctrica capaz de ser serigrafiada.
Geometría de electrodo
En algunas realizaciones, se pueden disponer los electrodos divulgados en el presente documento en cualquier manera adecuada para practicar los métodos divulgados en el presente documento.
En algunas realizaciones, los electrodos están en una configuración de puntos, por ejemplo los electrodos comprenden una configuración generalmente circular o redonda. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 25° hasta aproximadamente 60°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 30° a aproximadamente 55°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 30° a aproximadamente 50°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 35° a aproximadamente 45°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 25°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 30°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 35°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 40°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 45°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 50°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 55°. En algunas realizaciones, el ángulo de orientación entre puntos es aproximadamente 60°.
En algunas realizaciones, los electrodos están en una configuración sustancialmente alargada.
En algunas realizaciones, los electrodos están en una configuración que se asemeja a líneas onduladas o no lineales. En algunas realizaciones, la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en la que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en la que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en la que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en la que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante. En algunas realizaciones, los electrodos son tiras que se asemejan a líneas onduladas, como se representa en la FIG. 8. En algunas realizaciones, la distancia de borde a borde entre los electrodos es equidistante, o más o menos equidistante en toda la configuración de la línea ondulada. En algunas realizaciones, el uso de electrodos de línea ondulada, como se divulga en el presente documento, conduce a un gradiente de DEP de campo mejorado.
En algunas realizaciones, los electrodos divulgados en el presente documento están en una configuración plana. En algunas realizaciones, los electrodos divulgados en el presente documento están en una configuración no plana.
En algunas realizaciones, la superficie de los dispositivos divulgados en el presente documento captura selectivamente biomoléculas sobre su superficie. Por ejemplo, los dispositivos divulgados en el presente documento pueden capturar biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, mediante, por ejemplo, a. hibridación del ácido nucleico; b. interacciones anticuerpo-antígeno; c. interacciones biotina-avidina; d. interacciones iónicas o electrostáticas; o e. cualquier combinación de las mismas. Por lo tanto, los dispositivos divulgados en el presente documento, , pueden incorporar una superficie funcionalizada que incluye la captura de moléculas, tales como sondas de ácido nucleico complementarias, anticuerpos o otras capturas de proteína capaces de capturar biomoléculas (tales como ácidos nucleicos), biotina u otras capturas de anclaje capaces de capturar moléculas diana complementarias tales como avidina, moléculas de captura capaces de capturar biomoléculas (tales como ácidos nucleicos) mediante interacciones iónicas o electrostáticas, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la superficie se funcionaliza para minimizar y/o inhibir interacciones de unión no específicas by: a. polímeros (por ejemplo, polietilenglicol PEG); b. interacciones iónicas o electrostáticas; c. tensioactivos; o d. cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento incluyen el uso de aditivos que reducen las interacciones de unión no específicas al interferir en dichas interacciones, tales como Tween 20 y similares, albúmina de suero bovino, inmunoglobulinas no específicas, etc.
En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una pluralidad de dispositivos de microelectrodos orientados (a) planos lado a lado, (b) que se orientan verticalmente, o (c) que se orientan horizontalmente. En otras realizaciones, los electrodos están en una configuración intercalada, por ejemplo apilados uno encima del otro en un formato vertical.
Hidrogeles
La superposición de estructuras de electrodos con una o más capas de materiales puede reducir los efectos electroquímicos perjudiciales, que incluyen, entre otros, reacciones de electrólisis, calentamiento y movimiento de fluidos caótico que pueden ocurrir sobre o cerca de los electrodos, y aún así permitir la separación efectiva de células, bacterias, virus, nanopartículas, ADN y otras biomoléculas que se va a lavar a cabo. En algunas realizaciones, los materiales en capas sobre las estructuras de los electrodos pueden ser una o más capas porosas. En otras realizaciones, la una o más capas porosas es una capa de polímero. En otras realizaciones, la una o más capas porosas es un hidrogel.
En general, el hidrogel debe tener suficiente resistencia mecánica y ser relativamente inerte químicamente de modo que pueda se capaz de soportar los efectos electroquímicos en la superficie del electrodo sin desconfiguración o descomposición. En general, el hidrogel es suficientemente permeable a pequeños iones acuosos, pero mantiene las biomoléculas alejadas de la superficie del electrodo.
En algunas realizaciones, el hidrogel es una capa única o recubrimiento.
En algunas realizaciones, el hidrogel comprende un gradiente de porosidad, en el que la parte inferior de la capa de hidrogel tiene mayor porosidad que la parte superior de la capa de hidrogel.
En algunas realizaciones, el hidrogel comprende múltiples capas o recubrimientos. En algunas realizaciones, el hidrogel comprende dos revestimientos. En algunas realizaciones, el hidrogel comprende tres revestimientos. En algunas realizaciones, el (primer) recubrimiento inferior tiene una mayor porosidad que los recubrimientos posteriores. En algunas realizaciones, el revestimiento superior tiene menos porosidad que el primer recubrimiento. En algunas realizaciones, el revestimiento superior tiene un diámetro de poro medio que funciona como un corte de tamaño para partículas de más de 100 picómetros de diámetro.
En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.001 S/m hasta aproximadamente 10 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.01 S/m hasta aproximadamente 10 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.1 S/m hasta aproximadamente 10 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 1.0 S/m hasta aproximadamente 10 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.01 S/m hasta aproximadamente 5 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.01 S/m hasta aproximadamente 4 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.01 S/m hasta aproximadamente 3 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.01 S/m hasta aproximadamente 2 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.1 S/m hasta aproximadamente 5 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.1 S/m hasta aproximadamente 4 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.1 S/m hasta aproximadamente 3 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.1 S/m hasta aproximadamente 2 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.1 S/m hasta aproximadamente 1.5 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad desde aproximadamente 0.1 S/m hasta aproximadamente 1.0 S/m.
En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.1 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.2 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.3 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.4 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.5 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.6 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.7 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.8 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 0.9 S/m. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene una conductividad de aproximadamente 1.0 S/m.
En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 0.1 micrómetros hasta aproximadamente 10 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 0.1 micrómetros hasta aproximadamente 5 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 0.1 micrómetros hasta aproximadamente 4 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 0.1 micrómetros hasta aproximadamente 3 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 0.1 micrómetros hasta aproximadamente 2 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 1 micrómetro hasta aproximadamente 5 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 1 micrómetro hasta aproximadamente 4 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 1 micrómetro hasta aproximadamente 3 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 1 micrómetro hasta aproximadamente 2 micrómetros. En algunas realizaciones, el hidrogel tiene un grosor desde aproximadamente 0.5 micrómetros hasta aproximadamente 1 micrómetro.
En algunas realizaciones, la viscosidad de una solución de hidrogel antes del recubrimiento por centrifugación varía desde aproximadamente 0.5 cP hasta aproximadamente 5 cP. En algunas realizaciones, un único recubrimiento de solución de hidrogel tiene una viscosidad de entre aproximadamente 0.75 cP y 5 cP antes del recubrimiento por centrifugación. En algunas realizaciones, en un hidrogel de múltiples revestimientos, la primera solución de hidrogel tiene una viscosidad desde aproximadamente 0.5 cP hasta aproximadamente 1.5 cP antes del recubrimiento por centrifugación. En algunas realizaciones, la segunda solución de hidrogel tiene una viscosidad desde aproximadamente 1 cP hasta aproximadamente 3 cP. La viscosidad de la solución de hidrogel se basa en la concentración de polímeros (0.1 % - 10 %) y el peso molecular de los polímeros (10,000 a 300,000) en el solvente y la viscosidad inicial del solvente.
En algunas realizaciones, el primer recubrimiento de hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.5 micrómetros y 1 micrómetro. En algunas realizaciones, el primer recubrimiento de hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.5 micrómetros y 0.75 micrómetros. En algunas realizaciones, el primer recubrimiento de hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.75 y 1 micrómetro. En algunas realizaciones, el segundo recubrimiento de hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.2 micrómetros y 0.5 micrómetros. En algunas realizaciones, el segundo recubrimiento de hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.2 y 0.4 micrómetros. En algunas realizaciones, el segundo recubrimiento de hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.2 y 0.3 micrómetros. En algunas realizaciones, el segundo recubrimiento de hidrogel tiene un grosor entre aproximadamente 0.3 y 0.4 micrómetros.
En algunas realizaciones, el hidrogel comprende cualquier polímero sintético adecuado que forme un hidrogel. En general, se puede utilizar cualquier molécula suficientemente hidrófila y polimerizable en la producción de un hidrogel de polímero sintético para uso como se divulga en el presente documento. Las fracciones polimerizables en los monómeros pueden incluir restos alquenilo que incluyen, entre otros, carbonilos insaturados a,p sustituidos o no sustituidos, en los que el doble enlace está directamente unido a un carbono que tiene un enlace doble a un oxígeno y un enlace sencillo a otro oxígeno, nitrógeno, azufre., halógeno o carbono; vinilo, en el que el doble enlace está unido de forma sencilla a oxígeno, nitrógeno, halógeno, fósforo o azufre; alilo, en el que el doble enlace está unido de forma sencilla a un carbono que está unido a oxígeno, nitrógeno, halógeno, fósforo o azufre; homoalilo, en el que el doble enlace está unido de forma sencilla a un carbono que está unido de forma sencilla a otro carbono que luego está unido de forma sencilla a un oxígeno, nitrógeno, halógeno, fósforo o azufre; fracciones de alquinilo en las que existe un triple enlace entre dos átomos de carbono. En algunas realizaciones, los monómeros de acriloílo o acrilamido tales como acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, etc., son útiles para la formación de hidrogeles como se divulga en el presente documento. Los monómeros de acrilamido más preferidos incluyen acrilamidas, acrilamidas N-sustituidas, metacrilamidas N-sustituidas y metacrilamidas. En algunas realizaciones, un hidrogel comprende polímeros tales como polímeros a base de epóxido, polímeros a base de vinilo, polímeros a base de alilo, polímeros a base de homoalilo, polímeros a base de anhídrido cíclico, polímeros a base de éster, polímeros a base de éter, polímeros a base de alquilenglicol (por ejemplo, polipropilenglicol) y similares.
En algunas realizaciones, el hidrogel comprende polihidroxietilmetacrilato (pHEMA), acetato de celulosa, acetato ftalato de celulosa, acetato butirato de celulosa, o cualquier polímero a base de vinilo o acrilamida apropiado, o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, el hidrogel se aplica mediante deposición de vapor.
En algunas realizaciones, el hidrogel se polimeriza mediante vía de polimerización de radicales por transferencia de átomos (ATRP).
En algunas realizaciones, el hidrogel se polimeriza mediante polimerización por adición-fragmentación-transferencia de cadena reversible (RAFT).
En algunas realizaciones, se agregan aditivos a un hidrogel para aumentar la conductividad del gel. En algunas realizaciones, los aditivos de hidrogel son polímeros conductores (por ejemplo, PEDOT: PSS), sales (por ejemplo, cloruro de cobre), metales (por ejemplo, oro), plastificantes (por ejemplo, PEG200, PEG 400 o PEG 600) o cosolventes.
En algunas realizaciones, el hidrogel también comprende compuestos o materiales que ayudan a mantener la estabilidad de los híbridos de ADN, que incluyen, pero no se limitan a, histidina, péptidos de histidina, polihistidina, lisina, péptidos de lisina y otros compuestos o sustancias catiónicas.
Campos dielectroforéticos
En algunas realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas descritos en el presente documento proporcionan un mecanismo para recolectar, separar, o aislar células, partículas, y/o moléculas (tales como ácido nucleico) desde un material fluido (que opcionalmente contiene otros materiales, tales como contaminantes, material celular residual, o similares).
En algunas realizaciones, se genera un campo electrocinético de CA para recolectar, separar o aislar biomoléculas, tales como ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el campo electrocinético de CA es un campo dielectroforético. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones se utiliza dielectroforesis (DEP) en varias etapas de los métodos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de generar campos DEP, y similares. En realizaciones específicas, se utiliza DEP para concentrar células y/o ácidos nucleicos (por ejemplo, al mismo tiempo o en diferentes tiempos). En ciertas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento comprenden adicionalmente energizar la matriz de electrodos con el fin de producir el primer, segundo, y cualesquier campos DEP opcionales adicionales. En algunas realizaciones, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de ser energizados con el fin de producir el primer, segundo, y cualesquier campos DEP opcionales adicionales.
La DEP es un fenómeno en el que se ejerce una fuerza sobre una partícula dieléctrica cuando se somete a un campo eléctrico no uniforme. Dependiendo de la etapa de los métodos descritos en el presente documento, aspectos de los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento, y similares, la partícula dieléctrica en varias realizaciones del presente documento es una célula biológica y/o una molécula, tal como una molécula de ácido nucleico. Se pueden utilizar diferentes etapas de los métodos descritos en el presente documento o aspectos de los dispositivos o sistemas descritos en el presente documento para aislar y separar diferentes componentes, tales como células intactas u otro material particular; adicionalmente, se pueden utilizar diferentes regiones de campo del campo de DEP en diferentes etapas de los métodos o aspectos de los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento. Esta fuerza dielectroforética no requiere que se cargue la partícula. En algunos casos, la resistencia de la fuerza depende del medio y de las propiedades eléctricas de las partículas específicas, de la forma y tamaño de las partículas, así como de la frecuencia del campo eléctrico. En algunos casos, los campos de una selectividad de frecuencia particular manipulan partículas. En ciertos aspectos descritos en el presente documento, estos procesos permiten la separación de células y/o partículas más pequeñas (tales como moléculas, que incluyen moléculas de ácido nucleico) de otros componentes (por ejemplo, en un medio fluido) o entre sí.
En varias realizaciones proporcionadas en el presente documento, un método descrito en el presente documento comprende producir una primera región de campo de DEP y una segunda región de campo de DEP con la matriz. En varias realizaciones proporcionadas en el presente documento, un dispositivo o sistema descrito en el presente documento es capaz de producir una primera región de campo de DEP y una segunda región de campo de DEP con la matriz. En algunos casos, la primera y segunda regiones de campo son parte de un campo único (por ejemplo, la primera y segunda regiones están presentes al mismo tiempo, pero se encuentran en diferentes ubicaciones dentro del dispositivo y/o sobre la matriz). En algunas realizaciones, la primera y segunda regiones de campo son diferentes campos (por ejemplo la primera región se crea al energizar los electrodos en un primer tiempo, y la segunda región se crea al energizar los electrodos en un segundo tiempo). En aspectos específicos, la primera región de campo de DEP es adecuada para concentrar o aislar células (por ejemplo, en una región DEP de campo bajo). En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP es adecuada para concentrar partículas más pequeñas, tales como moléculas (por ejemplo, ácido nucleico), por ejemplo en una región DEP de campo alto. En algunos casos, un método descrito en el presente documento opcionalmente excluye el uso de cualquiera de la primera o segunda región de campo de DEP.
En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP está en la misma cámara de un dispositivo como se divulga en el presente documento como la segunda región de campo de DEP. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP y la segunda región de campo de DEP ocupan la misma área de la matriz de electrodos.
En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP está en una cámara separada de un dispositivo como se divulga en el presente documento, o un dispositivo completamente separado, desde la segunda región de campo de DEP.
Primera región de campo de DEP
En algunos aspectos, por ejemplo, tampones de alta conductancia (> 100 mS/m), el método descrito en el presente documento comprende aplicar un fluido que comprende células u otro material en partículas a un dispositivo que comprende una matriz de electrodos, y, de este modo, concentrar las células en una primera región de campo de d Ep . En algunos aspectos, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de aplicar un fluido que comprende células u otro material en partículas al dispositivo que comprende una matriz de electrodos, y, de este modo, concentrar las células en una primera región de campo de DEP. La segunda subsiguiente o concurrente o tercera y cuarta regiones de DEP opcionales, pueden recolectar o aislar otros componentes fluidos, que incluyen biomoléculas, tales como ácidos nucleicos.
La primera región de campo de DEP puede ser cualquier región de campo adecuada para concentrar células desde un fluido. Para esta solicitud, las células generalmente se concentran cerca de la matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo bajo dielectroforético. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo alto dielectroforético. En algunos aspectos, por ejemplo tampones de baja conductancia (< 100 mS/m), el método descrito en el presente documento comprende aplicar un fluido que comprende células a un dispositivo que comprende una matriz de electrodos, y, de este modo, concentrar las células u otro material en partículas en una primera región de campo de DEP.
En algunos aspectos, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de aplicar un fluido que comprende células u otro material en partículas al dispositivo que comprende una matriz de electrodos, y concentrar las células en una primera región de campo de DEP. En varias realizaciones, la primera región de campo de DEP puede ser cualquier región de campo adecuada para concentrar células desde un fluido. En algunas realizaciones, las células se concentran sobre la matriz de electrodos. En algunas realizaciones, las células se capturan en una región de campo alto dielectroforético. En algunas realizaciones, las células se capturan en una región de campo bajo dielectroforético. La captura de campo alto versus bajo generalmente depende de la conductividad del fluido, en el que en general, el punto de cruce está entre aproximadamente 300 - 500 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo bajo dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de más de aproximadamente 300 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo bajo dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de menos de aproximadamente 300 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo alto dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de más de aproximadamente 300 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo alto dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de menos de aproximadamente 300 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo bajo dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de más de aproximadamente 500 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo bajo dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de menos de aproximadamente 500 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo alto dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de más de aproximadamente 500 mS/m. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP es una región de campo alto dielectroforético realizada en una conductividad de fluido de menos de aproximadamente 500 mS/m.
En algunas realizaciones, la primera región de campo dielectroforético se produce por una corriente alterna. La corriente alterna tiene cualquier amperaje, voltaje, frecuencia, y similares adecuados para concentrar células. En algunas realizaciones, la primera región de campo dielectroforético se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 0.1 micro Amperio -10 Amperios; un voltaje de 1 - 50 Voltios pico a pico; y/o una frecuencia de 1 - 10,000,000 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 5 - 25 voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene una frecuencia desde 3 - 15 kHz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 1 miliamperio a 1 amp. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 0.1 micro Amperios - 1 Amperio. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 1 micro Amperios -1 Amperio. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 100 micro Amperios - 1 Amperio. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 500 micro Amperios - 500 mili Amperios. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 - 25 Voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 - 10 Voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 25 - 50 Voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 10 -1,000,000 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 100 - 100,000 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 100 - 10,000 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 10,000 - 100,000 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 100,000 - 1,000,000 Hz.
En algunas realizaciones, la primera región de campo dielectroforético se produce por una corriente directa. La corriente directa tiene cualquier amperaje, voltaje, frecuencia, y similares adecuados para concentrar células. En algunas realizaciones, la primera región de campo dielectroforético se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 0.1 micro Amperios -1 Amperio; un voltaje de 10 mili Voltios -10 Voltios; y/o un ancho de pulso de 1 milisegundos -1000 segundos y una frecuencia de pulso de 0.001 - 1000 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 1 micro Amperios -1 Amperios. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 100 micro Amperios - 500 mili Amperios. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 1 mili Amperio - 1 Amperio. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 1 micro Amperios - 1 mili Amperios. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 500 milisegundos - 500 segundos. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 500 milisegundos -100 segundos. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 1 segundo - 1000 segundos. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 500 milisegundos - 1 segundo. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 0.01 - 1000 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 0.1 -100 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 1 - 100 Hz. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 100 - 1000 Hz.
En algunas realizaciones, el fluido comprende una mezcla de tipos de células. Por ejemplo, la sangre se compone de glóbulos rojos y glóbulos blancos. Las muestras ambientales comprenden muchos tipos de células y otro material en partículas en un amplio rango de concentraciones. En algunas realizaciones, un tipo de célula (o cualquier número de tipos de células menor que el número total de tipos de células que comprenden la muestra) se concentra preferentemente en el primer campo de DEP. Sin limitación, esta realización es beneficiosa para enfocar el procedimiento de aislamiento de ácido nucleico sobre un contaminante ambiental particular, tal como una bacteria coliforme fecal, por lo que la secuenciación de ADN se puede utilizar para identificar la fuente del contaminante. En otro ejemplo no limitante, el primer campo de DEP se opera de una manera que concentra específicamente virus y no células (por ejemplo, En un fluido con conductividad superior a 300 mS/m, los virus se concentran en una región de campo alto de DEP, mientras que más grande las células se concentrarán en una región de campo bajo de DEP).
En algunas realizaciones, un método, dispositivo o sistema descrito en el presente documento es adecuado para aislar o separar tipos de células específicos. En algunas realizaciones, el campo de DEP del método, dispositivo o sistema se ajusta específicamente para permitir la separación o concentración de un tipo específico de célula en una región de campo del campo de DEP. En algunas realizaciones, un método, dispositivo o sistema descrito en el presente documento proporciona más de una región de campo en la que se aísla o concentra más de un tipo de célula. En algunas realizaciones, un método, dispositivo o sistema descrito en el presente documento se puede ajustar para permitir el aislamiento o la concentración de diferentes tipos de células dentro de las regiones del campo de DEP de las mismas. En algunas realizaciones, un método proporcionado en el presente documento comprende adicionalmente ajustar el campo de DEP. En algunas realizaciones, un dispositivo o sistema proporcionado en el presente documento es capaz de tener ajustado el campo de DEP. En algunos casos, dicho ajuste puede ser para proporcionar un DEP particularmente adecuado para el propósito deseado. Por ejemplo, las modificaciones en la matriz, la energía u otro parámetro se utilizan opcionalmente para ajustar el campo de DEP. Los parámetros de ajuste para una resolución más fina incluyen el diámetro del electrodo, la distancia de borde a borde entre los electrodos, voltaje, frecuencia, conductividad del fluido y composición de hidrogel.
En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP comprende la totalidad de una matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP comprende una porción de una matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP comprende aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 20 %, o aproximadamente 10 % de una matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la primera región de campo de DEP comprende aproximadamente una tercera parte de una matriz de electrodos.
Segunda región de campo de DEP
En un aspecto, luego de la lisis de las células (como se indica a continuación), los métodos descritos en el presente documento involucran concentrar el ácido nucleico en una segunda región de campo de DEP. En otro aspecto, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de concentrar el ácido nucleico en una segunda región de campo de DEP. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP es cualquier región de campo adecuada para concentrar ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se concentran sobre la matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP es una región de campo alto dielectroforético. La segunda región de campo de DEP es, opcionalmente, la misma como la primera región de campo de DEP.
En algunas realizaciones, la segunda región de campo dielectroforético se produce por una corriente alterna. En algunas realizaciones, la corriente alterna tiene cualquier amperaje, voltaje, frecuencia, y similares adecuados para concentrar ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo dielectroforético se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 0.1 micro Amperios -10 Amperios; un voltaje de 1 - 50 Voltios pico a pico; y/o una frecuencia de 1 - 10,000,000 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 0.1 micro Amperios - 1 Amperio. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 1 micro Amperios - 1 Amperio. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 100 micro Amperios -1 Amperio. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 500 micro Amperios -500 mili Amperios. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 - 25 Voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 - 10 Voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 25 - 50 Voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 10 - 1,000,000 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 100 - 100,000 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 100- 10,000 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 10,000 - 100,000 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de desde 100,000 - 1,000,000 Hz.
En algunas realizaciones, la segunda región de campo dielectroforético se produce por una corriente directa. En algunas realizaciones, la corriente directa tiene cualquier amperaje, voltaje, frecuencia, y similares adecuados para concentrar ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo dielectroforético se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 0.1 micro Amperios -1 Amperios; un voltaje de 10 mili Voltios -10 Voltios; y/o un ancho de pulso de 1 milisegundos - 1000 segundos y una frecuencia de pulso de 0.001 - 1000 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 5 - 25 voltios pico a pico. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene una frecuencia desde 3- 15 kHz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente alterna que tiene un amperaje de 1 miliamperio a 1 amp. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 1 micro Amperios - 1 Amperios. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 100 micro Amperios - 500 mili Amperios. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 1 mili Amperios -1 Amperios. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un amperaje de 1 micro Amperios - 1 mili Amperios. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 500 milisegundos - 500 segundos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 500 milisegundos- 100 segundos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 1 segundo - 1000 segundos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una corriente directa que tiene un ancho de pulso de 500 milisegundos -1 segundo. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 0.01 - 1000 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 0.1 - 100 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 1 -100 Hz. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP se produce utilizando una frecuencia de pulso de 100 -1000 Hz.
En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP comprende la totalidad de una matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP comprende una porción de una matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP comprende aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 20 %, o aproximadamente 10 % de una matriz de electrodos. En algunas realizaciones, la segunda región de campo de DEP comprende aproximadamente una tercera parte de una matriz de electrodos.
Aislamiento de ácidos nucleicos
En un aspecto, se describe en el presente documento un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos están inicialmente dentro de las células. Como se ve en la FIG. 5, el método comprende concentrar las células cerca de una región de campo alto en algunos casos. En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, el método comprende: a. aplicar el fluido a un dispositivo, el dispositivo comprende una matriz de electrodos; b. concentrar una pluralidad de células en una primera región de campo electrocinético de CA (por ejemplo, dielectroforético); c. aislar el ácido nucleico en una segunda región de campo electrocinético de CA (por ejemplo, dielectroforético); y d. enjuagar las células. En algunos casos, las células se lisan en la región de campo alto. Luego de lisis, los ácidos nucleicos permanecen en la región de campo alto y/o se concentran en la región de campo alto. En algunos casos, el material celular residual se concentra cerca a la región de campo bajo. En algunas realizaciones, el material residual se lava del dispositivo y/o se lava de los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se concentra en la segunda región de campo electrocinético de CA.
En un aspecto, se describe en el presente documento un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células u otro material en partículas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos no están dentro de las células (por ejemplo, ADN libre de células en fluido). En algunas realizaciones, se divulga en el presente documento un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células u otro material en partículas, el método comprende: a. aplicar el fluido a un dispositivo, el dispositivo comprende una matriz de electrodos; b. concentrar una pluralidad de células en una primera región de campo electrocinético de CA (por ejemplo, dielectroforético); c. aislar el ácido nucleico en una segunda región de campo electrocinético de CA (por ejemplo, dielectroforético); y d. enjuagar las células. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente degradar proteínas residuales después de enjuagar las células. La FIG. 6 muestra un método de ejemplo para aislar ácidos nucleicos extracelulares desde un fluido que comprende células. En algunas realizaciones, las células se concentran sobre o cerca a una región de campo bajo y los ácidos nucleicos se concentran sobre o cerca a una región de campo alto. En algunos casos, las células se lavan del dispositivo y/o se lavan de los ácidos nucleicos.
En un aspecto, los métodos, sistemas y dispositivos descritos en el presente documento aíslan el ácido nucleico desde un fluido que comprende células u otro material en partículas. En un aspecto, se utiliza dielectroforesis para concentrar células. En algunas realizaciones, el fluido es un líquido, opcionalmente agua o una solución o dispersión acuosa. En algunas realizaciones, el fluido es cualquier fluido adecuado que incluye un fluido corporal. Los fluidos corporales ejemplares incluyen sangre, suero, plasma, bilis, leche, fluido cerebrospinal, jugo gástrico, eyaculación, moco, fluido peritoneal, saliva, sudor, lágrimas, orina, y similares. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se aíslan de los fluidos corporales utilizando los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento como parte de un procedimiento médico terapéutico o de diagnóstico, dispositivo o sistema. En algunas realizaciones, el fluido es tejidos y/o células solubilizadas y/o dispersas en un fluido. Por ejemplo, el tejido puede ser un tumor canceroso del cual se puede aislar ácido nucleico utilizando los métodos, dispositivos o sistemas descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, el fluido es una muestra ambiental. En algunas realizaciones, la muestra ambiental se ensaya o se monitoriza para detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos particular indicativa de una cierta contaminación, incidencia de infestación o similares. La muestra ambiental también se puede utilizar para determinar la fuente de cierta contaminación, incidencia de infestación o similares utilizando los métodos, dispositivos o sistemas descritos en el presente documento. Las muestras ambientales ejemplares incluyen aguas residuales municipales, aguas residuales industriales, agua o fluidos utilizados o producidos como resultado de diversos procesos de fabricación, lagos, ríos, océanos, acuíferos, aguas subterráneas, aguas pluviales, plantas o porciones de plantas, animales o porciones de animales., insectos, suministros municipales de agua y similares.
En algunas realizaciones, el fluido es un alimento o bebida. El alimento o la bebida se puede ensayar o monitorizar para determinar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos particular indicativa de una cierta contaminación, incidencia de infestación o similares. El alimento o bebida también se puede utilizar para determinar la fuente de una cierta contaminación, incidencia de infestación o similar utilizando los métodos, dispositivos o sistemas descritos en el presente documento. En varias realizaciones, los métodos, dispositivos y sistemas descritos en el presente documento se pueden utilizar con uno o más de los fluidos corporales, muestras ambientales y alimentos y bebidas para monitorizar la salud pública o responder a incidentes adversos de salud pública.
En algunas realizaciones, el fluido es un medio de crecimiento. El medio de crecimiento puede ser cualquier medio adecuado para cultivar células, por ejemplo, caldo de lisogenia (LB) para cultivar E. coli, medio de cultivo de tejidos
de Ham para cultivar células de mamíferos y similares. El medio puede ser un medio rico, medio mínimo, medio selectivo y similares. En algunas realizaciones, el medio comprende o consiste esencialmente en una pluralidad de
células clonales. En algunas realizaciones, el medio comprende una mezcla de al menos dos especies.
En algunas realizaciones, el fluido es agua.
Las células son cualquier célula adecuada para aislar ácidos nucleicos como se describe en el presente documento.
En varias realizaciones, las células son eucariotas o procariotas. En varias realizaciones, las células consisten esencialmente en una pluralidad de células clonales o pueden comprender al menos dos especies y/o al menos dos
cepas.
En varias realizaciones, las células son células patógenas, células bacterianas, células vegetales, células animales, células de insectos, células de algas, células cianobacterianas, orgánulos y/o combinaciones de las mismas. Como se
utiliza en el presente documento, “células” incluye virus y otros microorganismos patógenos intactos. Las células
pueden ser microorganismos o células de organismos multicelulares. En algunos casos, las células se originan a partir de una muestra de tejido solubilizada.
En varias realizaciones, las células son de tipo silvestre o genéticamente modificadas. En algunos casos, las células comprenden una biblioteca de células mutantes. En algunas realizaciones, las células se mutagenizan aleatoriamente, tal como al haber experimentado mutagénesis química, mutagénesis por radiación (por ejemplo, radiación UV) o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las células se han transformado con una biblioteca de moléculas de ácido nucleico mutantes.
En algunas realizaciones, el fluido también puede comprender otro material en partículas. Dicho material en partículas
puede ser, por ejemplo, cuerpos de inclusión (por ejemplo, Ceroides o cuerpos de Mallory), cilindros celulares (por ejemplo, cilindros granulares, cilindros hialinos, cilindros celulares, cilindros cerosos y pseudocilindros), cuerpos de
Pick, Cuerpos de Lewy, ovillos fibrilares, formaciones de fibrillas, restos celulares y otro material en partículas. En algunas realizaciones, el material en partículas es una proteína agregada (por ejemplo, beta-amiloide).
El fluido puede tener cualquier conductividad que incluye una alta o baja conductividad. En algunas realizaciones, la conductividad está entre aproximadamente 1 pS/m a aproximadamente 10 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividad está entre aproximadamente 10 pS/m a aproximadamente 10 mS/m. En otras realizaciones, la conductividad está entre aproximadamente 50 pS/m a aproximadamente 10 mS/m. En aún otras realizaciones, la conductividad está entre aproximadamente 100 pS/m a aproximadamente 10 mS/m, entre aproximadamente 100 pS/m
a aproximadamente 8 mS/m, entre aproximadamente 100 pS/m a aproximadamente 6 mS/m, entre aproximadamente
100 pS/m a aproximadamente 5 mS/m, entre aproximadamente 100 pS/m a aproximadamente 4 mS/m, entre aproximadamente 100 pS/m a aproximadamente 3 mS/m, entre aproximadamente 100 pS/m a aproximadamente 2
mS/m, o entre aproximadamente 100 pS/m a aproximadamente 1 mS/m.
En algunas realizaciones, la conductividad es aproximadamente 1 pS/m. En algunas realizaciones, la conductividad
es aproximadamente 10 pS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es aproximadamente 100 pS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es aproximadamente 1 mS/m. En otras realizaciones, la conductividad es aproximadamente 2 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es aproximadamente 3 mS/m. En aún otras realizaciones, la conductividad es aproximadamente 4 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es aproximadamente 5 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es aproximadamente 10 mS/m. En todavía
otras realizaciones, la conductividad es aproximadamente 100 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es aproximadamente 1 S/m. En otras realizaciones, la conductividad es aproximadamente 10 S/m.
En algunas realizaciones, la conductividades al menos 1 pS/m. En aún otras realizaciones, la conductividad es al menos 10 pS/m. En algunas realizaciones, la conductividades al menos 100 pS/m. En algunas realizaciones, la conductividades al menos 1 mS/m. En realizaciones adicionales, la conductividades al menos 10 mS/m. En aún otras realizaciones, la conductividades al menos 100 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividades al menos 1 S/m.
En algunas realizaciones, la conductividades al menos 10 S/m. En algunas realizaciones, la conductividad es a lo
sumo 1 pS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es a lo sumo 10 pS/m. En otras realizaciones, la conductividad es a lo sumo 100 pS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es a lo sumo 1 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es a lo sumo 10 mS/m. En algunas realizaciones, la conductividad es a lo sumo 100
mS/m. En aún otras realizaciones, la conductividad es a lo sumo 1 S/m. En algunas realizaciones, la conductividad es
a lo sumo 10 S/m.
En algunas realizaciones, el fluido es un volumen pequeño de líquido que incluye menos de 10 ml. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 8 ml. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 5 ml. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 2 ml. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 1 ml. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 500 pl. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 200 pl. En al realizaciones, el fluido es menor de 100 pl. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 50 realizaciones, el fluido es menor de 10 pl. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 5 pl. En algunas realizaciones, el fluido es menor de 1 pl.
En algunas realizaciones, la cantidad de fluido aplicada al dispositivo o utilizada en el método comprende menos de aproximadamente 100,000,000 células. En algunas realizaciones, el fluido comprende menos de aproximadamente 10,000,000 células. En algunas realizaciones, el fluido comprende menos de aproximadamente 1,000,000 células. En algunas realizaciones, el fluido comprende menos de aproximadamente 100,000 células. En algunas realizaciones, el fluido comprende menos de aproximadamente 10,000 células. En algunas realizaciones, el fluido comprende menos de aproximadamente 1,000 células.
En algunas realizaciones, el aislamiento del ácido nucleico desde un fluido que comprende células u otro material en partículas con los dispositivos, sistemas y métodos descritos en el presente documento toma menos de aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente 20 minutos, menos de aproximadamente 15 minutos, menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos o menos de aproximadamente 1 minuto. En otras realizaciones, el aislamiento del ácido nucleico desde un fluido que comprende células u otro material en partículas con los dispositivos, sistemas y métodos descritos en el presente documento no toma más de 30 minutos, no más de aproximadamente 20 minutos, no más de aproximadamente 15 minutos, no más de aproximadamente 10 minutos, no más de aproximadamente 5 minutos, no más de aproximadamente 2 minutos o no más de aproximadamente 1 minuto. En realizaciones adicionales, el aislamiento del ácido nucleico desde un fluido que comprende células u otro material en partículas con los dispositivos, sistemas y métodos descritos en el presente documento toma menos de aproximadamente 15 minutos, preferiblemente menos de aproximadamente 10 minutos o menos de aproximadamente 5 minutos.
En algunos casos, el ADN extracelular u otro ácido nucleico (fuera de las células) se aísla desde un fluido que comprende células de otro material en partículas. En algunas realizaciones, el fluido comprende células. En algunas realizaciones, el fluido no comprende células.
Lisis celular
En un aspecto, luego de concentrar las células en una primera región de campo dielectroforético, el método involucra liberar ácidos nucleicos desde las células. En otro aspecto, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de liberar ácidos nucleicos desde las células. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se liberan de las células en la primera región de campo de DEP.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento liberan ácidos nucleicos desde una pluralidad de células al lisar las células. En algunas realizaciones, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de liberar ácidos nucleicos desde una pluralidad de células al lisar las células. Un método de lisis celular involucra aplicar una corriente directa a las células después del aislamiento de las células sobre la matriz. La corriente directa tiene cualquier amperaje, voltaje adecuado, y similares adecuados para lisar células. En algunas realizaciones, la corriente tiene un voltaje de aproximadamente 1 voltio a aproximadamente 500 Voltios. En algunas realizaciones, la corriente tiene un voltaje de aproximadamente 10 Voltios a aproximadamente 500 Voltios. En otras realizaciones, la corriente tiene un voltaje de aproximadamente 10 Voltios a aproximadamente 250 Voltios. En todavía otras realizaciones, la corriente tiene un voltaje de aproximadamente 50 Voltios a aproximadamente 150 Voltios. El voltaje es generalmente el impulsor de la lisis celular, ya que los campos eléctricos altos dan como resultado la integridad fallida de la membrana.
En algunas realizaciones, la corriente directa utilizada para la lisis comprende uno o más pulsos que tienen cualquier duración, frecuencia, y similares adecuados para lisar células. En algunas realizaciones, un voltaje de aproximadamente 100 voltios se aplica durante aproximadamente 1 milisegundo para lisar células. En algunas realizaciones, el voltaje de aproximadamente 100 voltios se aplica 2 o 3 veces sobre la fuente de un segundo.
En algunas realizaciones, la frecuencia de la corriente directa depende de voltios/cm, del ancho de pulso, y la conductividad del fluido. En algunas realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1000 Hz. En algunas realizaciones, el pulso tiene una frecuencia desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 Hz. En otras realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de aproximadamente .01 Hz - 1000 Hz. En todavía otras realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de aproximadamente 0.1 Hz - 1000 Hz, aproximadamente 1 Hz - 1000 Hz, aproximadamente 1 Hz - 500 Hz, aproximadamente 1 Hz - 400 Hz, aproximadamente 1 Hz - 300 Hz, o aproximadamente 1 Hz - aproximadamente 250 Hz. En algunas realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de aproximadamente 0.1 Hz. En otras realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de aproximadamente 1 Hz. En todavía otras realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de aproximadamente 5 Hz, aproximadamente 10 Hz, aproximadamente 50 Hz, aproximadamente 100 Hz, aproximadamente 200 Hz, aproximadamente 300 Hz, aproximadamente 400 Hz, aproximadamente 500 Hz, aproximadamente 600 Hz, aproximadamente 700 Hz, aproximadamente 800 Hz, aproximadamente 900 Hz o aproximadamente 1000 Hz.
En otras realizaciones, el pulso tiene una duración de aproximadamente 1 milisegundo (ms) - 1000 segundos (s). En algunas realizaciones, el pulso tiene una duración de aproximadamente 10 ms -1000 s. En todavía otras realizaciones, el pulso tiene una duración de aproximadamente 100 ms - 1000 s, aproximadamente 1 s - 1000 s, aproximadamente 1 s - 500 s, aproximadamente 1 s - 250 s o aproximadamente 1 s -150 s. En algunas realizaciones, el pulso tiene una duración de aproximadamente 1 ms, aproximadamente 10 ms, aproximadamente 100 ms, aproximadamente 1 s, aproximadamente 2 s, aproximadamente 3 s, aproximadamente 4 s, aproximadamente 5 s, aproximadamente 6 s, aproximadamente 7 s, aproximadamente 8 s, aproximadamente 9 s, aproximadamente 10 s, aproximadamente 20 s, aproximadamente 50 s, aproximadamente 100 s, aproximadamente 200 s, aproximadamente 300 s, aproximadamente 500 s o aproximadamente 1000 s. En algunas realizaciones, el pulso tiene una frecuencia de 0.2 a 200 Hz con ciclos de trabajo desde 10-50 %.
En algunas realizaciones, la corriente directa se aplica una vez, o como múltiples pulsos. Se puede aplicar cualquier número de pulsos adecuado que incluye aproximadamente 1 - 20 pulsos. Hay una cantidad adecuada de tiempo entre pulsos que incluye aproximadamente 1 milisegundo - 1000 segundos. En algunas realizaciones, la duración del pulso es .01 a 10 segundos.
En algunas realizaciones, las células se lisan utilizando otros métodos en combinación con una corriente directa aplicada a las células aisladas. En aún otras realizaciones, las células se lisan sin el uso de corriente directa. En varios aspectos, los dispositivos y sistemas son capaces de lisar células con corriente directa en combinación con otros medios o pueden ser capaces de lisar células sin el uso de corriente directa. Cualquier método de lisis celular conocido por aquellos expertos en la técnica puede ser adecuado, que incluye, pero no se limita a, la aplicación de un agente de lisis químico (por ejemplo, un ácido), un agente de lisis enzimático, calor, presión, fuerza de corte, energía sónica, choque osmótico, o combinaciones de los mismos. La lisozima es un ejemplo de un agente de lisis enzimático.
Eliminación de material residual
En algunas realizaciones, luego de la concentración de los ácidos nucleicos en la segunda región de campo de DEP, el método incluye opcionalmente enjuagar el material residual del ácido nucleico. En algunas realizaciones, los dispositivos o sistemas descritos en el presente documento opcionalmente son capaces de y/o comprender un depósito que comprende un fluido adecuado para enjuagar el material residual del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se mantiene cerca a la matriz de electrodos, tal como en la segunda región de campo de DEP, al continuar energizando los electrodos. “Material residual” es cualquier cosa presente originalmente en el fluido, originalmente presente en las células, agregada durante el procedimiento, creada a través de cualquier etapa del proceso, que incluye pero no se limita a la lisis de las células (es decir, material celular residual) y similares. Por ejemplo, el material residual incluye células no lisadas, fragmentos de pared celular, proteínas, lípidos, carbohidratos, minerales, sales, tampones, plasma y ácidos nucleicos no deseados. En algunas realizaciones, el material celular lisado comprende proteína residual liberada de la pluralidad de células luego de lisis. Es posible que no todo el ácido nucleico se concentre en el segundo campo de DEP. En algunas realizaciones, se enjuague una cierta cantidad de ácido nucleico con el material residual.
En algunas realizaciones, el material residual se enjuaga en cualquier fluido adecuado, por ejemplo en agua, tampón TBE o similares. En algunas realizaciones, el material residual se enjuaga con cualquier volumen adecuado de fluido, se enjuaga durante cualquier período de tiempo adecuado, se enjuaga con más de un fluido o con cualquier otra variación. En algunas realizaciones, el método de enjuagar el material residual está relacionado con el nivel deseado de aislamiento del ácido nucleico, con ácido nucleico de mayor pureza, lo que requiere un enjuague y/o lavado más riguroso. En otras realizaciones, el método de enjuagar el material residual está relacionado con el material de partida particular y su composición. En algunos casos, un material de partida con alto contenido de lípidos requiere un procedimiento de enjuague que implica un fluido hidrófobo adecuado para solubilizar lípidos.
En algunas realizaciones, el método incluye degradar material residual que incluye proteína residual. En algunas realizaciones, los dispositivos o sistemas son capaces de degradar material residual que incluye proteína residual. Por ejemplo, las proteínas se degradan mediante una o más de degradación química (por ejemplo hidrólisis ácida) y degradación enzimática. En algunas realizaciones, el agente de degradación enzimática es una proteasa. En otras realizaciones, el agente de degradación de proteína es Proteinasa K. Se realiza la etapa opcional de degradación de material residual durante cualquier momento adecuado, temperatura, y similares. En algunas realizaciones, el material residual degradado (que incluye proteínas degradadas) se enjuaga desde el ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el agente utilizado para degradar el material residual se inactiva o degrada. En algunas realizaciones, los dispositivos o sistemas son capaces de degradar o inactivar el agente utilizado para degradar el material residual. En algunas realizaciones, una enzima utilizada para degradar el material residual se inactiva mediante calor (por ejemplo, 50 a 95°C durante 5 - 15 minutos). Por ejemplo, las enzimas que incluyen proteasas, (por ejemplo, Proteinasa K) se degradan y/o inactivan utilizando calor (normalmente, 15 minutos, 70°C). En algunas realizaciones en las que las proteínas residuales se degradan mediante una enzima, el método comprende adicionalmente inactivar la enzima de degradación (por ejemplo, Proteinasa K) luego de la degradación de las proteínas. En algunas realizaciones, se proporciona calor mediante un módulo de calentamiento en el dispositivo (rango de temperatura, por ejemplo, desde 30 hasta 95°C).
Se puede variar el orden y/o combinación de ciertas etapas del método. En algunas realizaciones, los dispositivos o métodos son capaces de realizar ciertas etapas en cualquier orden o combinación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el material residual y las proteínas degradadas se enjuagan en etapas separadas o concurrentes. Es decir, el material residual se enjuaga, seguido por la degradación de proteínas residuales, seguido por el enjuague de las proteínas degradadas del ácido nucleico. En algunas realizaciones, primero se degradan las proteínas residuales, y luego se enjuaga tanto el material residual como las proteínas degradadas del ácido nucleico en una etapa combinada.
En algunas realizaciones, se retiene el ácido nucleico en el dispositivo y opcionalmente se utiliza en procedimientos adicionales tales como PCR o u otros procedimientos que manipulan o amplifican el ácido nucleico. En algunas realizaciones, los dispositivos y sistemas son capaces de realizar PCR u otros procedimientos opcionales. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos se recolectan y/o eluyen desde el dispositivo. En algunas realizaciones, los dispositivos y sistemas son capaces de permitir la recolección y/o elución de ácido nucleico desde el dispositivo o sistema. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado se recolecta al (i) apagar la segunda región de campo dielectroforético; y (ii) eluir el ácido nucleico desde la matriz en un eluyente. Eluyentes de ejemplo incluyen agua, TE, TBE y tampón de L-Histidina.
Ácidos nucleicos y rendimientos de los mismos
En algunas realizaciones, el método, dispositivo, o sistema descrito en el presente documento se utiliza opcionalmente para obtener, aislar o separar cualquier ácido nucleico deseado que se pueda obtener a partir de dicho método, dispositivo o sistema. Los ácidos nucleicos aislados mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos en el presente documento incluyen ADN (ácido desoxirribonucleico), ARN (ácido ribonucleico), y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla en una forma adecuada para secuenciación o manipulación adiciona del ácido nucleico, que incluye amplificación, ligación o clonación.
En varias realizaciones, un ácido nucleico aislado o separado es una composición que comprende ácido nucleico que está libre de al menos 99 % en masa de otros materiales, libre de al menos 99 % en masa de material celular residual (por ejemplo, de células lisadas de las que se obtiene el ácido nucleico), libre de al menos 98 % en masa de otros materiales, libre de al menos 98 % en masa de material celular residual, libre de al menos 95 % en masa de otros materiales, libre de al menos 95 % en masa de material celular residual, libre de al menos 90 % en masa de otros materiales, libre de al menos 90 % en masa de material celular residual, libre de al menos 80 % en masa de otros materiales, libre de al menos 80 % en masa de material celular residual, libre de al menos 70 % en masa de otros materiales, libre de al menos 70 % en masa de material celular residual, libre de al menos 60 % en masa de otros materiales, libre de al menos 60 % en masa de material celular residual, libre de al menos 50 % en masa de otros materiales, libre de al menos 50 % en masa de material celular residual, libre de al menos 30 % en masa de otros materiales, libre de al menos 30 % en masa de material celular residual, libre de al menos 10 % en masa de otros materiales, libre de al menos 10 % en masa de material celular residual, libre de al menos 5 % en masa de otros materiales, o libre de al menos 5 % en masa de material celular residual.
En varias realizaciones, el ácido nucleico tiene cualquier pureza adecuada. Por ejemplo, si se puede trabajar un procedimiento de secuenciación de ADN con muestras de ácido nucleico que tienen aproximadamente 20 % material celular residual, entonces es adecuado el aislamiento del ácido nucleico a 80 %. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende menos de aproximadamente 80 %, menos de aproximadamente 70 %, menos de aproximadamente 60 %, menos de aproximadamente 50 %, menos de aproximadamente 40 %, menos de aproximadamente 30 %, menos de aproximadamente 20 %, menos de aproximadamente 10 %, menos de aproximadamente 5 %, o menos de aproximadamente 2 % material celular sin ácido nucleico y/o proteína en masa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado comprende más de aproximadamente 99 %, más de aproximadamente 98 %, más de aproximadamente 95 %, más de aproximadamente 90 %, más de aproximadamente 80 %, más de aproximadamente 70 %, más de aproximadamente 60 %, más de aproximadamente 50 %, más de aproximadamente 40 %, más de aproximadamente 30 %, más de aproximadamente 20 %, o más de aproximadamente 10 % de ácido nucleico en masa.
Los ácidos nucleicos se aíslan en cualquier forma adecuada, que incluye no modificada, derivatizada, fragmentada, no fragmentada, y similares. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se recolecta en una forma adecuada para secuenciación. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se recolecta en una forma fragmentada adecuada para secuenciación aleatoria, amplificación u otra manipulación. El ácido nucleico se puede recolectar a partir del dispositivo en una solución que comprende los reactivos utilizados en, por ejemplo, un procedimiento de secuenciación de ADN, tal como nucleótidos como se utiliza en la secuenciación mediante métodos de síntesis.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento resultan en una muestra de ácido nucleico aislado que es aproximadamente representativa del ácido nucleico de la muestra partida. En algunas realizaciones, los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento son capaces de aislar el ácido nucleico desde una muestra que es aproximadamente representativa del ácido nucleico de la muestra partida. Es decir, la población de ácidos nucleicos recolectados por el método, o que pueden ser recolectados por el dispositivo o sistema, es sustancialmente proporcional a la población de ácidos nucleicos presentes en las células en el fluido. En algunas realizaciones, este aspecto es ventajoso en aplicaciones en las que el fluido es una mezcla compleja de muchos tipos de células y el médico desea un procedimiento basado en ácido nucleico para determinar las poblaciones relativas de los diversos tipos de células.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado utilizando los métodos descritos en el presente documento o capaz de ser aislado mediante los dispositivos se describe en el presente documento es de alta calidad y/o adecuado para utilizar directamente en procedimientos en dirección descendente tales como secuenciación de ADN, el ácido nucleico amplificación, tal como PCR, u otra manipulación de ácido nucleico, tal como ligación, clonación o ensayos de traducción o transformación adicionales. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 0.01 % de proteína. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 0.5 % de proteína. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 0.1 % de proteína. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 1 % de proteína. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 2 % de proteína. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 3 % de proteína. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 4 % de proteína. En algunas realizaciones, el ácido nucleico recolectado comprende a lo sumo 5 % de proteína.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado por los métodos descritos en el presente documento o capaz de ser aislado por los dispositivos descritos en el presente documento tiene una concentración de al menos 0.5 ng/mL. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado mediante los métodos descritos en el presente documento o capaz de ser aislado mediante los dispositivos descritos en el presente documento tiene una concentración de al menos 1 ng/mL. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado mediante los métodos descritos en el presente documento o capaz de ser aislado mediante los dispositivos descritos en el presente documento tiene una concentración de al menos 5 ng/mL. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado mediante los métodos descritos en el presente documento o capaz de ser aislado mediante los dispositivos descritos en el presente documento tiene una concentración de al menos 10 ng/ml.
En algunas realizaciones, aproximadamente 50 picogramos de ácido nucleico se aíslan desde aproximadamente 5,000 células utilizando los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 10 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 20 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5.000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 50 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 75 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 100 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5.000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 200 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 300 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 400 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 500 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 1.000 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células. En algunas realizaciones, los métodos, sistemas o dispositivos descritos en el presente documento producen al menos 10,000 picogramos de ácido nucleico desde aproximadamente 5,000 células.
Ensayos y aplicaciones
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento adicionalmente comprenden opcionalmente amplificar el ácido nucleico aislado mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, la reacción de PCR se realiza sobre o cerca a la matriz de electrodos o en el dispositivo. En algunas realizaciones, el dispositivo o sistema comprende mecanismos de control de calentador y/o temperatura adecuados para termociclado.
La PCR se realiza opcionalmente utilizando termociclado tradicional al colocar los analitos de la química de reacción entre dos elementos termoconductores eficientes (por ejemplo, aluminio o plata) y regulando las temperaturas de reacción utilizando TEC. Los diseños adicionales utilizan opcionalmente calentamiento por infrarrojos a través de material ópticamente transparente como vidrio o termopolímeros. En algunos casos, los diseños utilizan polímeros inteligentes o vidrio inteligente que comprenden cableado conductor conectado en red a través del sustrato. Este cableado conductor permite una conductividad térmica rápida de los materiales y (mediante la aplicación de voltaje de CC apropiado) proporciona los cambios de temperatura y los gradientes necesarios para mantener reacciones de PCR eficientes. En ciertos casos, el calentamiento se aplica utilizando calentadores de chip resistivos y otros elementos resistivos que cambiarán la temperatura de forma rápida y proporcional a la cantidad de corriente que los atraviesa.
En algunas realizaciones, utilizadas junto con la fluorometría tradicional (ccd, pmt, otro detector óptico y filtros ópticos), la amplificación de pliegues se monitoriza en tiempo real o en un intervalo cronometrado. En ciertos casos, la cuantificación de la amplificación del pliegue final se informa mediante detección óptica convertida a AFU (unidades de fluorescencia arbitrarias correlacionadas para analizar la duplicación) o traducida a señal eléctrica mediante medición de impedancia u otra detección electroquímica.
Dado el pequeño tamaño de la matriz de microelectrodos, estos elementos se agregan opcionalmente alrededor de la matriz de microelectrodos y la reacción de PCR se realizará en la cámara principal de procesamiento de muestras (sobre la matriz DEP) o los analitos que se amplificarán opcionalmente transportado a través de fluidos a otra cámara dentro del cartucho de fluidos para permitir el procesamiento de Laboratorio en Chip sobre el cartucho.
En algunos casos, se utilizan esquemas de suministro de luz para proporcionar la excitación óptica y/o emisión y/o detección de amplificación de pliegues. En ciertas realizaciones, esto incluye utilizar materiales de celda de flujo (polímeros térmicos como polímero de acrílico (PMMA) polímero de olefina cíclica (COP), copolímero de olefina cíclica, (COC), etc.) como guías de ondas ópticas para eliminar la necesidad de utilizar componentes externos. Además, en algunos casos, las fuentes de luz - diodos emisores de luz - LED, láseres emisores de superficie de cavidad vertical -VCSEL y otros esquemas de iluminación se integran directamente dentro de la celda de flujo o se construyen directamente sobre la superficie de la matriz de microelectrodos para tener control interno y fuentes de luz potenciadas. También se pueden incorporar detectores PMT, CCD o CMOS en miniatura en la celda de flujo. Esta minimización y miniaturización permite dispositivos compactos capaces de entregar y detectar señales rápidamente mientras se reduce la huella de dispositivos tradicionales similares (es decir, un PCR/QPCR/fluorómetro de sobremesa estándar).
Amplificación sobre chip
En algunos casos, las matrices de microelectrodos de silicio pueden soportar los ciclos térmicos necesarios para la PCR. En algunas aplicaciones, la PCR sobre chip es ventajosa porque se pueden perder pequeñas cantidades de ácidos nucleicos diana durante las etapas de transferencia. En ciertas realizaciones de dispositivos, sistemas o procesos descritos en el presente documento, se utiliza opcionalmente cualquiera o más de múltiples técnicas de PCR, que incluyen opcionalmente tales técnicas uno o más de los siguientes: ciclado térmico en la celda de flujo directamente; movimiento del material a través de microcanales con diferentes zonas de temperatura; y movimiento del volumen a un tubo de PCR que se puede amplificar en el sistema o transferir a una máquina de PCR. En algunos casos, la PCR de gotitas se realiza si la salida contiene una unión en T que contiene un fluido inmiscible y estabilizadores interfaciales (tensioactivos, etc.). En ciertas realizaciones, las gotitas se someten a un ciclo térmico mediante cualquier método adecuado.
En algunas realizaciones, la amplificación se realiza utilizando una reacción isotérmica, por ejemplo, amplificación mediada por transcripción, amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos, amplificación mediada por señales de tecnología de ARN, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación por círculo rodante, amplificación isotérmica mediada por bucle de ADN, amplificación isotérmica de desplazamiento múltiple, amplificación dependiente de helicasa, amplificación isotérmica de cebador único o amplificación circular dependiente de helicasa.
En varias realizaciones, la amplificación se realiza en una solución homogénea o como un sistema heterogéneo con cebador o cebadores anclados. En algunas realizaciones de este último, los amplicones resultantes se unen directamente a la superficie para un mayor grado de multiplexación. En algunas realizaciones, el amplicón se desnaturaliza para producir productos de cadena sencilla sobre o cerca de los electrodos. Las reacciones de hibridación se realizan opcionalmente para interrogar la información genética, tal como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), repeticiones cortas en tándem (STR), mutaciones, inserciones/deleciones, metilación, etc. La metilación se determina opcionalmente mediante análisis en paralelo donde una muestra de ADN es tratada con bisulfito y una no. El bisulfito depurina el C no modificado y se convierte en U. El C metilado no se ve afectado en algunos casos. En algunas realizaciones, la extensión de la base específica del alelo se utiliza para informar la base de interés.
En lugar de interacciones específicas, la superficie se modifica opcionalmente con fracciones no específicas para la captura. Por ejemplo, la superficie podría modificarse con policationes, es decir, polilisina, para capturar moléculas de a Dn que se pueden liberar mediante polarización inversa (-V). En algunas realizaciones, las modificaciones de la superficie son uniformes sobre la superficie o están diseñadas específicamente para funcionalizar los electrodos o las regiones sin electrodos. En ciertas realizaciones, esto se logra con fotolitografía, activación electroquímica, detección y similares.
En algunas aplicaciones, donde se emplean múltiples diseños de chips, es ventajoso tener un intercalado de chips en el que los dos dispositivos estén uno frente al otro, separados por un separador, para formar la celda de flujo. En varias realizaciones, los dispositivos se ejecutan secuencialmente o en paralelo. Para la secuenciación y la secuenciación de próxima generación (NGS), la fragmentación y selección del tamaño tiene ramificaciones sobre la eficiencia y calidad de la secuenciación. En algunas realizaciones, se utilizan múltiples diseños de chips para reducir el rango de tamaño del material recolectado creando un filtro de paso de banda. En algunos casos, la geometría actual del chip (por ejemplo, electrodos de 80 um de diámetro en un paso de centro a centro de 200 um (80/200) actúa como un filtro de corte de 500 bp (por ejemplo, utilizando condiciones de voltaje y frecuencia de alrededor de 10 Vpp y 10 kHz). En algunos casos, se captura un ácido nucleico de más de 500 bp y no se captura un ácido nucleico de menos de 500 bp. El diámetro de electrodo alternativo y las geometrías de paso tienen diferentes tamaños de corte, de modo que una combinación de chips debería proporcionar un tamaño de fragmento deseado. En algunos casos, un electrodo de 40 um de diámetro en un paso de centro a centro de 100 um (40/100) tiene un umbral de corte más bajo, mientras que un electrodo de 160 um de diámetro en un paso de centro a centro de 400 um (160/400) tiene un umbral de corte más alto en relación con la geometría 80/200, bajo condiciones similares. En varias realizaciones, las geometrías sobre un solo chip o múltiples chips se combinan para seleccionar fragmentos o partículas de un tamaño específico. Por ejemplo, un chip de corte de 600 bp dejaría un ácido nucleico de menos de 600 bp en solución, luego ese material se vuelve a capturar opcionalmente con un chip de corte de 500 bp (que se opone al chip de 600 bp). Esto deja una población de ácidos nucleicos que comprende 500 - 600 bp en solución. Esta población se amplifica entonces opcionalmente en la misma cámara, una cámara lateral o cualquier otra configuración. En algunas realizaciones, la selección del tamaño se logra utilizando una geometría de electrodo único, en la que se aísla ácido nucleico de> 500 bp sobre los electrodos, seguido de lavado, seguido de reducción de la alta intensidad de campo ACEK (cambio de voltaje, frecuencia, conductividad) para liberar ácidos nucleicos de < 600 bp, lo que da como resultado una población de ácido nucleico sobrenadante entre 500 - 600 bp.
En algunas realizaciones, el dispositivo de chip está orientado verticalmente con un calentador en el borde inferior que crea una columna de gradiente de temperatura. En ciertos casos, la parte inferior está a la temperatura de desnaturalización, la parte media a la temperatura de recocido y la parte superior a la temperatura de extensión. En algunos casos, la convección impulsa continuamente el proceso. En algunas realizaciones, se proporcionan en el presente documento métodos o sistemas que comprenden un diseño de electrodo que proporciona específicamente flujos electrotérmicos y aceleración del proceso. En algunas realizaciones, dicho diseño está opcionalmente sobre el mismo dispositivo o sobre un dispositivo separado colocado apropiadamente. En algunos casos, enfriamiento activo o pasivo en la parte superior, mediante aletas o ventiladores, o similares, proporciona un gradiente de temperatura pronunciado. En algunos casos, el dispositivo o sistema descrito en el presente documento comprende, o un método descrito en el presente documento utiliza, sensores de temperatura sobre el dispositivo o en la cámara de reacción para monitorizar la temperatura y dichos sensores se utilizan opcionalmente para ajustar la temperatura sobre una base de retroalimentación. En algunos casos, dichos sensores se acoplan con materiales que poseen diferentes propiedades de transferencia térmica para crear perfiles de gradiente continuos y/o discontinuos.
En algunas realizaciones, la amplificación procede a una temperatura constante (por ejemplo, amplificación isotérmica).
En algunas realizaciones, los métodos divulgados en el presente documento comprenden adicionalmente secuenciar el ácido nucleico aislado como se divulga en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se secuencia mediante secuenciación de Sanger o secuenciación de próxima generación (NGS). En algunas realizaciones, los métodos de secuenciación de próxima generación incluyen, pero no se limitan a, pirosecuenciación, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación polony, secuenciación por ligación, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación por ligación, o secuenciación de una sola molécula.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento se utilizan en la secuenciación de Sanger. En algunas realizaciones, la secuenciación de Sanger se realiza dentro del mismo dispositivo como el aislamiento de ácido nucleico (Laboratorio-en-un-Chip). El flujo de trabajo de Laboratorio-en-un-Chip para la preparación de muestras y los resultados de la secuenciación de Sanger incorporarían las siguientes etapas: a) extracción de muestras utilizando chips ACE; b) realización de la amplificación de las secuencias diana sobre un chip; c) captura de productos de PCR por ACE; d) realización de secuenciación cíclica para enriquecer la cadena diana; e) captura de cadenas diana enriquecidas; f) realización de reacciones de terminación de cadena de Sanger; realización de la separación electroforética de las secuencias diana mediante electroforesis capilar con detección de fluorescencia multicolor sobre chip. El lavado de ácidos nucleicos, adición de reactivo y apagado del voltaje se realizan según sea necesario. Las reacciones se pueden realizar en un solo chip con una pluralidad de zonas de captura o en chips y/o cámaras de reacción independientes.
En algunas realizaciones, el método divulgado en el presente documento comprende adicionalmente realizar una reacción sobre los ácidos nucleicos (por ejemplo, fragmentación, digestión de restricción, ligación de ADN o ARN). En algunas realizaciones, la reacción ocurre sobre o cerca a la matriz o en un dispositivo, como se divulga en el presente documento.
Otros ensayos
Los ácidos nucleicos aislados divulgados en el presente documento se pueden utilizar adicionalmente en una variedad de formatos de ensayo. Por ejemplo, los dispositivos que se direccionan con sondas de ácido nucleico o amplicones se pueden utilizar en análisis de transferencia de punto o transferencia de punto inversa, análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de apilamiento de bases, análisis de SNP con rigurosidad electrónica o en análisis STR. Además, dichos dispositivos divulgados en el presente documento se pueden utilizaren formatos para la modificación enzimática del ácido nucleico o la interacción proteína-ácido nucleico, tal como, por ejemplo, análisis de expresión génica con notificación enzimática, amplificación de ácido nucleico anclado u otras modificaciones de ácido nucleico adecuadas para formatos en fase sólida, incluida la escisión de endonucleasas de restricción, escisión de endo o exonucleasas, ensayos de proteínas de unión a ranuras menores, reacciones de transferasas terminales, reacciones de polinucleótido quinasa o fosfatasa, reacciones de ligasa, reacciones de topoisomerasa y otras reacciones de unión o modificación de proteínas de ácidos nucleicos.
Además, los dispositivos divulgados en el presente documento pueden ser útiles en inmunoensayos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las ubicaciones de los dispositivos se pueden ligar con antígenos (por ejemplo, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, proteoglicanos, glicoproteínas, etc.) para ensayar anticuerpos en una muestra de fluido corporal mediante ensayo intercalado, ensayo competitivo u otros formatos. Alternativamente, las ubicaciones del dispositivo se pueden abordar con anticuerpos, con el fin de detectar antígenos en una muestra mediante ensayo intercalado, ensayo competitivo u otros formatos de ensayo. Como el punto isoeléctrico de anticuerpos y proteínas se puede determinar con bastante facilidad mediante experimentación o cálculos de pH/carga, las ventajas de direccionamiento electrónico y concentración electrónica de los dispositivos se pueden utilizar sencillamente al ajustar el pH del tampón para que sea cargada la especie analizada o de analito.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos aislados son útiles para su uso en matrices de tipo inmunoensayo o matrices de ácidos nucleicos.
Comparación de ejemplo
Se necesitan aproximadamente 100 ng del genoma de E. coli de entrada para los métodos manuales convencionales (por ejemplo, se requieren 50 ng de ADN de entrada para Nextera, asumiendo un 50 % de recuperación (el kit Epicenter WaterMaster reivindica una recuperación de aproximadamente 30 - 60 %) de la purificación de extracción de ADN). Esto equivale a unos 20 millones de bacterias. En algunas realizaciones de la presente invención, es suficiente una entrada de menos de 10,000 bacterias (por ejemplo, dado que el chip es autónomo e implica menos transferencias, la eficiencia es mayor). En algunas realizaciones, esto es una reducción de al menos 100 veces en la entrada, que puede ser importante para aplicaciones donde la muestra es limitada, tales como biopsias de tumores.
La Tabla 1 a continuación describe las etapas de ejemplo implicadas para pasar de E. coli a un ADN adecuado para la secuenciación. En algunos casos, los métodos convencionales requieren centrifugación, varias temperaturas, etapas de lavado y numerosas etapas de transferencia que son ineficaces. Por el contrario, como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones se permite que se lleven a cabo las mismas etapas mediante un dispositivo que minimiza las transferencias de pipetas y la exposición a grandes superficies vírgenes con grados variables de propiedades de unión no específicas. En algunos casos, la temperatura del dispositivo se controla para proporcionar las condiciones de reacción adecuadas. En algunos casos, la PCR, la PCR de ciclo para la secuenciación previa al amplificador o la PCR completa (criterio de valoración, en tiempo real o digital) se realiza fuera del dispositivo o en el dispositivo. Fuera del dispositivo no incluye en el dispositivo, sino en las mismas conexiones de montaje de cartucho, a través de canales o conductos fluídicos. Adicionalmente, en algunos casos, la amplificación por PCR se logra en la cámara de la celda de flujo del dispositivo, en un tubo de PCR que está sobre el cartucho, o a través de canales fluídicos que poseen zonas de calor para ciclos de temperatura. En algunos casos, el eluido de la cámara del dispositivo se combina con canales laterales cebados con fluido miscible no acuoso, por ejemplo, aceite y otros estabilizadores de gotitas para realizar la amplificación en gotitas. En algunas realizaciones, la mecánica del ciclo de temperatura es como se describió anteriormente.
En la Tabla 1, la cantidad de material de partida para el procesamiento convencional fue de 2 - 5 x 107 células de E. Coli en aproximadamente 1 ml de agua y la cantidad total se concentró sobre los filtros. Utilizando el chip, como se divulga en el presente documento, solo se aplicó a la celda de flujo 1 x 104 células de E. Coli en aproximadamente 50 microlitros. Esto fue 3 órdenes de magnitud menos que el material de partida.
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En varias realizaciones (es decir, dependiendo de los parámetros electrocinéticos de CA), las células u otras partículas de escala micrométrica se concentran en las regiones de campo bajo o alto. En algunos casos, la frecuencia de cruce que determina si una partícula se mueve dentro o fuera de la región de campo alto se puede ajustar al variar la frecuencia de CA, voltaje, conductividad media, polarización de partículas adulterantes (tal como la adhesión o unión de materiales con diferentes características d Ep ) o geometría del electrodo. En algunos casos, las partículas a nanoescala se limitan a la concentración en la región de campo alto. En algunos casos, el movimiento browniano y otras fuerzas hidrodinámicas limitan la capacidad de concentración en regiones de campo bajo.
Definiciones y abreviaturas
Los artículos “un”, “una” y “el” no son limitantes. Por ejemplo, “el método” incluye la definición más amplia del significado de la frase, que puede ser más de un método.
“Vp-p” es el voltaje pico a pico.
“TBE” es una solución tampón que contiene una mezcla de base Tris, ácido bórico y EDTA.
“TE” es una solución tampón que contiene una mezcla de base Tris y EDTA.
El “tampón de L-histidina” es una solución que contiene L-histidina.
“DEP” es una abreviatura de dielectroforesis.
Ejemplos
Ejemplo 1: Formación de hidrogel mediante recubrimiento por centrifugación (dos revestimientos)]
Para una capa de hidrogel, se utilizan aproximadamente 70 microlitros de hidrogel para recubrir un chip de 10 x 12 mm.
Una baja concentración (< 1 % de sólidos en volumen) de solución de acetato de celulosa se disuelve en un solvente tal como acetona, o una mezcla de acetona y etanol y se aplica a un chip de matriz de electrodos como se divulga en el presente documento. El chip se hace girar a una velocidad baja de rpm (1000 - 3000). La velocidad baja de rpm asegura que la altura del gel está en el rango de 500 nm o más.
El primer recubrimiento (inferior) de acetato de celulosa se seca una temperatura ambiente, en un horno de convección, o un horno de vacío. Opcionalmente, se agrega inmediatamente la segunda capa de revestimiento por centrifugación de acetato de celulosa.
La segunda capa de acetato de celulosa comprende una alta concentración (> 2 %) de acetato de celulosa disuelto en un solvente tal como acetona, o una mezcla de acetona y etanol. Después de que se agrega una segunda capa de acetato de celulosa, el chip se hace girar a una velocidad alta de rpm (9000 - 12000). La velocidad alta de rpm asegurará que la altura del gel está en el rango de 300 nm o menos.
El chip con dos capas de acetato de celulosa luego se seca a temperatura ambiente, en un horno de convección, o en un horno de vacío.
Ejemplo 2: Formación de hidrogel con aditivos mediante recubrimiento por centrifugación (Dos Revestimientos)
Para una capa de hidrogel, se utilizan aproximadamente 70 microlitros de hidrogel para recubrir un chip de 10 x 12 mm.
Una baja concentración (< 1 % de sólidos en volumen) de solución de acetato de celulosa se disuelve en un solvente tal como acetona, o una mezcla de acetona y etanol y se aplica a un chip de matriz de electrodos como se divulga en el presente documento. El chip se hace girar a una velocidad baja de rpm (1000 - 3000). La velocidad baja de rpm asegura que la altura del gel está en el rango de 500 nm o más.
El primer recubrimiento (inferior) de acetato de celulosa se seca una temperatura ambiente, en un horno de convección, o un horno de vacío. Opcionalmente, la segunda capa de revestimiento por centrifugación de acetato de celulosa se agrega inmediatamente.
La segunda capa de acetato de celulosa comprende una alta concentración (> 2 %) de acetato de celulosa disuelto en un solvente tal como acetona, o una mezcla de acetona y etanol. Una baja concentración ( 1 - 15 %) de polímero condutor(PEDOT:PSS o similar) se agrega en la segunda solución de acetato de celulosa. Después de que se agrega una segunda capa de acetato de celulosa, el chip se hace girar a una velocidad alta de rpm (9000 - 12000). La velocidad alta de rpm asegurará que la altura del gel está en el rango de 300 nm o menos.
El chip con dos capas de acetato de celulosa luego se agrega a temperatura ambiente, en un horno de convección, o en un horno de vacío.
Ejemplo 3: Formación de hidrogel con aditivos mediante recubrimiento por centrifugación (Tres Revestimientos)
Para una capa de hidrogel, aproximadamente se utilizan 70 microlitros de hidrogel para recubrir un chip de 10 x 12 mm.
Una baja concentración (< 1 % de sólidos en volumen) solución de acetato de celulosa se disuelve en un solvente tal como acetona, o una mezcla de acetona y etanol y se aplica a un chip de matriz de electrodos como se divulga en el presente documento. El chip se hace girar a una velocidad alta de rpm (9000 - 12000). La velocidad baja de rpm asegura que la altura del gel está en el rango de 300 nm o menos.
El primer recubrimiento (inferior) de acetato de celulosa se seca una temperatura ambiente, en un horno de convección, o un horno de vacío. Opcionalmente, se agrega inmediatamente la segunda capa de revestimiento por centrifugación de acetato de celulosa.
La segunda capa de acetato de celulosa comprende una alta concentración (> 2 %) de acetato de celulosa disuelto en un solvente tal como acetona, o una mezcla de acetona y etanol. Una baja concentración ( 1 - 15 %) de polímero conductor (PEDOT:PSS o similar) se agrega en la segunda solución de acetato de celulosa. Después de que se agrega una segunda capa de acetato de celulosa, el chip se hace girar a una velocidad baja de rpm (1000 - 3000). La velocidad baja de rpm asegurará que la altura del gel está en el rango de 500 nm o más.
El segundo recubrimiento de acetato de celulosa se seca una temperatura ambiente, en un horno de convección, o un horno de vacío. Opcionalmente, se agrega inmediatamente la tercera capa de revestimiento por centrifugación de acetato de celulosa.
La tercera capa de acetato de celulosa comprende una alta concentración (> 2 %) de acetato de celulosa disuelto en un solvente tal como Acetona, o una mezcla de Acetona Etanol. El chip se hace girar a una velocidad alta de rpm (9000 - 12000). La velocidad baja de rpm asegura que la altura del gel está en el rango de 300 nm o menos.
El chip con tres capas de acetato de celulosa luego se agrega a temperatura ambiente, en un horno de convección, o en un horno de vacío.
Ejemplo 4: Construcción de chips
Para la FIG. 2 y 3: Se fabricó una matriz de microelectrodos de platino circular de 45 x 20 de 80 pm de diámetro a medida en un paso de centro a centro de 200 um basándose en resultados anteriores (véase referencias 1-3, a continuación). Los 900 microelectrodos se activan juntos y se polarizan en CA para formar una geometría de campo de tablero de ajedrez. Las regiones DEP positivas se producen directamente sobre microelectrodos y las regiones de campo bajo negativas se producen entre microelectrodos. La matriz se recubre con una capa de hidrogel de poli-Hema poroso de 200 nm a 500 nm de grosor (procedimiento: pHema al 12 % en solución madre de etanol, comprada a PolySciences Inc., que se diluye al 5 % utilizando etanol. 70 ul de la solución al 5 % se hace girar sobre el chip mencionado anteriormente a una velocidad de centrifugado de 6K RPM utilizando un recubridor de centrifugado. La capa de chip hidrogel se coloca en un horno a 60°C durante 45 minutos) y se encierra en un cartucho de microfluidos, formando una cámara de muestra de 50 pL cubierta con una ventana acrílica (FIG. 1). Se accede a las conexiones eléctricas a los microelectrodos desde conectores Molex desde la placa PCB en la celda de flujo. Un generador de funciones (HP 3245A) proporcionó una señal eléctrica sinusoidal a 10 KHz y 10 a 14 V pico a pico, dependiendo de la conductividad de la solución. Las imágenes se capturaron con un microscopio fluorescente (Leica) y un cubo EGFP (filtros de paso de banda de emisión de 485 nm y de excitación de 525 nm). La fuente de excitación fue una lámpara de arco PhotoFluor II de 200 W Hg.
[1] R. Krishnan, B.D. Sullivan, R.L. Mifflin, S.C. Esener, and M.J. Heller, “Alternating current electrokinetic separation and detection of DNA nanoparticles in high-conductance solutions.” Electrophoresis, vol. 29, pages 1765-1774, 2008.
[2] R. Krishnan and M.J. Heller, “An AC electrokinetic method for enhanced detection of DNA nanoparticles.” J. Biophotonics, vol. 2, pages 253-261, 2009.
[3] R. Krishnan, D.A. Dehlinger, G.J. Gemmen, R.L. Mifflin, S.C. Esener, and M.J. Heller, “ Interaction of nanoparticles at the DEP microelectrode interface under high conductance conditions” Electrochem. Comm., vol. 11, pages 1661­ 1666, 2009.
Ejemplo 5: Aislamiento de ADN genómico humano
Se adquirió ADN genómico humano (ADNg) de Promega (Promega, Madison, WI) y se dimensionó a 20 - 40 kpb. (no se muestra el dimensionamiento del gel). El ADNg se diluyó en agua DI a las siguientes concentraciones: 50 nanogramos, 5 nanogramos, 1 nanogramo y 50 picogramos. El ADNg se tiñó utilizando 1x colorante de ADN de doble cadena fluorescente verde SYBR Green I adquirido de Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA). A continuación, esta mezcla se insertó en las matrices de microelectrodos y se corrió a 14 voltios de pico a pico (Vp-p), a una onda sinusoidal de 10 kHz durante 1 minuto. Al final de 1 minuto, se tomó una fotografía de las almohadillas de microelectrodos utilizando una cámara CCD con un objetivo de 10x sobre un microscopio utilizando filtros de fluorescencia verde (FITC) para que se pudiera visualizar el ADNg (FIG. 2) El chip pudo identificar hasta 50 pg de ADNg en 50 pl de agua, es decir, concentración de Ing/mL. Adicionalmente, a 50 picogramos, cada microelectrodo tenía un promedio de ~60 femtogramos de ADN ya que hay 900 microelectrodos sobre la matriz. La capacidad de concentración de bajo nivel del dispositivo ACE está dentro del rango de 1 - 10 ng/ml necesario para identificar los biomarcadores de Cfc-ADN en plasma y suero (véase las referencias 4-6 a continuación).
[4] T.L. Wu et al, “Cell-free DNA: measurement in various carcinomas and establishment of normal reference range.” Clin Chim Acta., vol. 21, pages 77-87, 2002.
[5] R. E. Board et al, “DNA Methylation in Circulating Tumour DNA as a Biomarker for Cancer”, Biomarker Insights, vol.
2, pages 307-319, 2007.
[6] O. Gautschi et al, “Circulating deoxyribonucleic Acid as prognostic marker in non-small-cell lung cancer patients undergoing chemotherapy.” J Clin Oncol., vol. 22, pages 4157-4164, 2004.
Ejemplo 6: Aislamiento de ADN de E. Coli
Utilizando el Chip y los métodos descritos en los Ejemplos 4 y 5, se insertaron aproximadamente 5000 células de E. coli fluorescentes verdes en 50 ul de fluido en un chip y se corrieron utilizando el protocolo descrito en el título de la FIG. 3. El panel (A) muestra una vista de campo brillante. El panel (B) muestra una vista fluorescente verde de los electrodos antes de la activación de DEP. El panel (C) muestra E. coli sobre los electrodos después de un minuto a 10 kHz, 20 Vp-p en tampón 1xTBE. El panel (D) muestra E. coli sobre los electrodos después de un minuto a 1 MHz, 20 Vp-p en tampón 1xTBE.
La E. coli representada en la FIG. 3 se lisó utilizando un pulso de CC de 100 V de 100 milisegundos utilizando el generador de funciones HP 3245A. Las partículas lisadas se reunieron luego sobre la superficie del electrodo utilizando 10 kHz, 10 Vp-p y se utilizó el Protocolo Illumina Nextera para la preparación de la biblioteca para la secuenciación mientras el ADN estaba en el chip (al insertar los tampones apropiados en los momentos apropiados en el chip) para etiquetar el ADN para la Secuenciación. A continuación, el ADN se eluyó en 50 ul de tampón TBE 1x y luego se amplificó por PCR durante 9 - 12 ciclos (utilizando el protocolo Nextera) sobre una máquina de PCR Bio-Rad. El ADN amplificado se corrió luego en un secuenciador Illumina GA II. El ADN de E. Coli también se aisló de tampón TBE 1x (10 millones de células) utilizando el procedimiento de purificación de ADN Epicenter™ WaterMaster™, para servir como un estándar de oro para la comparación. Los resultados se representan en la FIG. 4.
Ejemplo 7: Formación de hidrogel con GVD
El hidrogel, tal como polihidroxietilmetacrilato (pHEMA) también se puede colocar sobre la superficie del chip mediante deposición de vapor utilizando ensayos patentados desarrollados por GVD Corporation (Cambridge, Ma ) (véase www.gvdcorp.com). Los hidrogeles tales como pHEMA se depositaron en varios grosores (100, 200, 300, 400 nm) y se realizó un entrecruzamiento (5, 25, 40 %) de densidad sobre chips de electrodos utilizando tecnología desarrollada por GVD Corporation. Las películas de hidrogel se probaron utilizando un protocolo ACE estándar (sin pretratamiento, 7 Vp-p, 10 KHz, 2 minutos, 0.5X PBS, 500 ng/ml de ADNg marcado con Sybr Green 1). La fluorescencia de los electrodos se capturó mediante formación de imágenes. La FIG. 10 muestra que se encontró que el dispositivo de gel de entrecruzamiento al 5 % de 100 nm de grosor tenía una fuerte captura de ADN. El proceso también se podría optimizar al cambiar la tasa de deposición o al anclar el crecimiento a la superficie de la matriz de microelectrodos (es decir, a la capa de pasivación y los electrodos expuestos), utilizando un promotor de adhesión como un derivado de silano.
Ejemplo 8: Rendimiento del dispositivo y método divulgados frente al método convencional
Se utilizó el kit de purificación de ácido nucleico circulante QIAGEN® (cat#55114) para purificar 1 ml de plasma de pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se realizó la incubación de 1 ml de plasma con solución de proteinasa K durante 30 minutos a 60 °C. La reacción se inactivó sobre hielo y todo el volumen se aplicó a una columna QlAamp Mini conectada a vacío. El líquido se extrajo a través de la columna y se lavó con 3 tampones diferentes (600 - 750 ul cada uno). La columna se centrifugó a 20,000 x g, 3 minutos y se horneó a 56 °C durante 10 minutos para eliminar el exceso de líquido. La muestra se eluyó en 55 pl de tampón de elución con 20.000 x g, centrifugación de 1 minuto. El tiempo total de procesamiento fue de ~2.5 horas.
El tamaño de la matriz del chip fue de 10 x 12 mm, con electrodos de Pt de 60 - 80 pm de diámetro en un paso de centro a centro de 180 - 200 pm, respectivamente. La matriz se recubrió con una capa de hidrogel pHEMA al 5 % (se hace girar el cilindro a 6000 rpm de una solución de etanol, 12 % de solución madre de pHEMA de Polysciences). El chip se pretrató utilizando 0.5xPBS, 2 V rms, 5 Hz, 15 segundos. Se eliminó el tampón y se agregaron 25 pl de plasma de pacientes con CLL. El ADN se aisló durante 3 minutos a 11 V p-p, 10 Khz, luego se lavó con 500 pl de tampón TE a un índice de fluidez de 100 pl/min, con la potencia ENCENDIDA. Se apagó el voltaje y el volumen de la celda de flujo se eluyó en un tubo de microcentrífuga. El tiempo total de procesamiento fue ~10 minutos.
El mismo proceso se puede aplicar a sangre completa fresca sin modificación. La capacidad de extraer y purificar ADN de sangre completa sin diluir está habilitada de forma única por la tecnología de chip divulgada en el presente documento.
La cuantificación del ADN se realizó en el Qiagen y el chip se eluye utilizando PicoGreen de acuerdo con el protocolo del fabricante (Life Tech) (Tabla 2).
Las reacciones de electroforesis en gel, PCR y secuenciación de Sanger posteriores mostraron un rendimiento similar para ambas técnicas de extracción, el chip es capaz de procesar sangre completa así como plasma. También se realizó una prueba estadística no paramétrica de Mann-Whitney U entre cantidades de ADN aisladas del plasma utilizando las técnicas de chip y Qiagen. No hubo diferencia estadística (p < 0.05 de dos colas) utilizando cualquier método de purificación de ADN.
Tabla 2: Purificación de ADN, chip v. Qiagen
Los valores están en ng/ml y se normalizan al volumen de la muestra de plasma original para propósitos de comparación.
Paciente Chip - plasma Qiagen - plasma Chip - sangre normal A 139 39 274 normal B 206 80 114 normal C 133 32 97
TJK 528 320 547 167
TJK851 218 393 307
T J K 1044 285 424 794
TJK 334 261 1387 666
TJK 613 179 53 257
TJK 762 145 367 314
TJK 847 886 1432 811
TJK 248 84 119 448
T J K 1024 302 169 332
T J K 1206 584 396 1435
T J K 1217 496 146 584
T J K 1262 87 84 1592
T J K 1311 119 257 1825
Aunque se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas de la presente invención, será obvio para aquellos expertos en la técnica que dichas realizaciones se proporcionan solo a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les ocurrirán ahora a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Se debe entender que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento al poner en práctica la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones queden cubiertos por ellas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para aislar un ácido nucleico a partir de un fluido que comprende células, comprendiendo el método:
a. aplicar el fluido a un dispositivo, comprendiendo el dispositivo una matriz de electrodos capaz de generar un campo electrocinético de CA con una corriente alterna;
b. controlar la temperatura del dispositivo con un elemento térmico;
c. concentrar una pluralidad de células en una primera región de campo electrocinético de CA, en la que la primera región electrocinética de CA es una región de campo bajo dielectroforético;
d. aislar el ácido nucleico en una segunda región de campo electrocinético de CA, en la que la segunda región de campo electrocinético de CA es una región de campo alto dielectroforético; y
e. enjuagar las células concentradas y/u otro material en partículas desde la matriz;
en el que el fluido tiene una conductividad de al menos 100 mS/m.
2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el elemento térmico comprende tantalio, aluminio, tungsteno, o una combinación de los mismos.
3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el método comprende adicionalmente la degradación de una proteína residual y el enjuague de proteínas degradadas desde la matriz y el ácido nucleico aislado.
4. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que el método comprende adicionalmente recolectar el ácido nucleico al (i) apagar la segunda región de campo electrocinético de CA; y (ii) eluir el ácido nucleico desde la matriz en un eluyente.
5. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que la primera región de campo electrocinético de CA se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 voltio a 40 voltios pico-pico; y/o una frecuencia de 5 Hz a 5,000,000 Hz, y ciclos de trabajo desde 5 % hasta 50 %.
6. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que la segunda región de campo electrocinético de CA es una región diferente de la matriz de electrodos como la primera región de campo electrocinético de CA.
7. Un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la segunda región de campo electrocinético de CA es la misma región de la matriz de electrodos como la primera región de campo electrocinético de CA.
8. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que la segunda región de campo electrocinético de CA se produce utilizando una corriente alterna que tiene un voltaje de 1 voltio a 50 voltios pico-pico; y/o una frecuencia de 5 Hz a 5,000,000 Hz, y ciclos de trabajo desde 5 % hasta 50 %.
9. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que los electrodos se energizan selectivamente para proporcionar la primera región de campo electrocinético de CA y se energizan selectivamente subsiguiente o continuamente para proporcionar la segunda región de campo electrocinético de CA.
10. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que las células se lisan sobre el dispositivo utilizando una corriente directa, un agente de lisis químico, un agente de lisis enzimático, calor, presión osmótica, energía sónica, o una combinación de los mismos.
11. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que las células se lisan al aplicar una corriente directa a las células, en el que la corriente directa utilizada para lisar las células tiene un voltaje de 1 - 500 voltios y una duración de .01 a 10 segundos aplicada una vez o como múltiples pulsos, en el que el pulso tiene una frecuencia de 0.2 a 200 Hz con ciclos de trabajo desde 10-50 %.
12. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que la matriz de electrodos está en una configuración de puntos y el ángulo de orientación entre puntos es desde aproximadamente 25° hasta aproximadamente 60°.
13. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que la matriz de electrodos está en una configuración de línea ondulada o no lineal, en el que la configuración comprende una unidad de repetición que comprende la conformación de un par de puntos conectados por un ligador, en el que los puntos y el ligador definen los límites del electrodo, en el que el ligador se estrecha hacia adentro hacia o en el punto medio entre el par de puntos, en el que los diámetros de los puntos son los puntos más anchos a lo largo de la unidad de repetición, en el que la distancia de borde a borde entre un conjunto paralelo de unidades de repetición es equidistante, o más o menos equidistante.
14. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente amplificar el ácido nucleico aislado mediante reacción en cadena de polimerasa.
15. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que el fluido comprende un fluido corporal, sangre, suero, plasma, orina, saliva, un alimento, una bebida, un medio de crecimiento, una muestra ambiental, un líquido, agua, células clonales, o una combinación de los mismos.
16. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente secuenciar el ácido nucleico aislado mediante secuenciación de Sanger, pirosecuenciación, secuenciación de semiconductores de iones, secuenciación polony, secuenciación por ligación, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación por ligación, o secuenciación de una sola molécula.
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