JP2003153692A - 核酸増幅方法 - Google Patents
核酸増幅方法Info
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- JP2003153692A JP2003153692A JP2002127623A JP2002127623A JP2003153692A JP 2003153692 A JP2003153692 A JP 2003153692A JP 2002127623 A JP2002127623 A JP 2002127623A JP 2002127623 A JP2002127623 A JP 2002127623A JP 2003153692 A JP2003153692 A JP 2003153692A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 １分子〜数分子の極微量の鋳型核酸を対象
とした核酸増幅反応を実現するために、これまでに様々
な手法が試みられている。しかしながら、これまでに行
われてきた手法は装置等にコストがかかったり、確実性
に欠けたり、十分な増幅が行われなかったりといった問
題があった。 【解決手段】本発明は、油中に形成された反応溶液の微
小液滴中で核酸増幅を行う第一のステップと、その後前
記微小液滴を集合させて再び増幅を行う第二のステップ
とを含む核酸増幅方法を提供する。
とした核酸増幅反応を実現するために、これまでに様々
な手法が試みられている。しかしながら、これまでに行
われてきた手法は装置等にコストがかかったり、確実性
に欠けたり、十分な増幅が行われなかったりといった問
題があった。 【解決手段】本発明は、油中に形成された反応溶液の微
小液滴中で核酸増幅を行う第一のステップと、その後前
記微小液滴を集合させて再び増幅を行う第二のステップ
とを含む核酸増幅方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、極微量核酸試料を
増幅する方法に関する。
増幅する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、生化学反応を行う際に、試料の微
量化、反応の効率化を実現することが重要な課題となっ
ている。
量化、反応の効率化を実現することが重要な課題となっ
ている。
【０００３】特に、核酸増幅法による、ＤＮＡ、ＲＮＡ
等核酸の分析は診断医療、医薬品開発、法医学、感染症
検査などの分野に利用されており、これらの分野では試
料の核酸が極微量しか手に入らない状況があること、分
析コストの面から試料や反応溶液の微量化が求められて
いることなどから、極微量の核酸を対象とした核酸増幅
法の開発が望まれる。
等核酸の分析は診断医療、医薬品開発、法医学、感染症
検査などの分野に利用されており、これらの分野では試
料の核酸が極微量しか手に入らない状況があること、分
析コストの面から試料や反応溶液の微量化が求められて
いることなどから、極微量の核酸を対象とした核酸増幅
法の開発が望まれる。
【０００４】極微量の核酸試料から増幅反応を行わせる
手段としては、マイクロデバイスを用いる方法が数多く
試みられているが、この方法では、容器表面へ核酸分子
が付着する可能性が増加し、１分子レベルの極微量核酸
試料を取り扱う場合には大きな問題となるとともに、反
応生成物の検出に特別な性能を持つ検出・解析装置が必
要になるため、初期コストが高価になる場合が多い。
手段としては、マイクロデバイスを用いる方法が数多く
試みられているが、この方法では、容器表面へ核酸分子
が付着する可能性が増加し、１分子レベルの極微量核酸
試料を取り扱う場合には大きな問題となるとともに、反
応生成物の検出に特別な性能を持つ検出・解析装置が必
要になるため、初期コストが高価になる場合が多い。
【０００５】一方で、より簡便に、より確実に一分子レ
ベルの極微量核酸試料を増幅する手段として、微小液滴
を反応場とした方法がいくつか提供されている。
ベルの極微量核酸試料を増幅する手段として、微小液滴
を反応場とした方法がいくつか提供されている。
【０００６】特許第３１２０４５３号では、基板表面に
被覆された油層中にインクジェット法を用いて微小反応
液滴を形成し、ＰＣＲ等の反応を行う方法が記載されて
いる。このような方法では、局所的な核酸試料濃度が非
常に高くなるために反応効率は上がり、また、核酸試料
の反応容器壁への付着を抑制することが可能になった。
被覆された油層中にインクジェット法を用いて微小反応
液滴を形成し、ＰＣＲ等の反応を行う方法が記載されて
いる。このような方法では、局所的な核酸試料濃度が非
常に高くなるために反応効率は上がり、また、核酸試料
の反応容器壁への付着を抑制することが可能になった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら上記のよ
うな方法では、微小液滴中に含まれる反応材料（例えば
ＰＣＲ反応の場合プライマー等を指す）の量が少ないこ
とが問題となる。具体的に例を挙げると、微小反応液滴
中でＰＣＲを行った場合、反応溶液には試料の核酸とプ
ライマー等の反応材料が含まれるが、熱サイクルを繰り
返すうちに反応液滴中のプライマー等が消費され尽くし
て反応がそれ以上進まず、十分な量まで核酸増幅が行わ
れないという不具合が生じる。
うな方法では、微小液滴中に含まれる反応材料（例えば
ＰＣＲ反応の場合プライマー等を指す）の量が少ないこ
とが問題となる。具体的に例を挙げると、微小反応液滴
中でＰＣＲを行った場合、反応溶液には試料の核酸とプ
ライマー等の反応材料が含まれるが、熱サイクルを繰り
返すうちに反応液滴中のプライマー等が消費され尽くし
て反応がそれ以上進まず、十分な量まで核酸増幅が行わ
れないという不具合が生じる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明に想到した。
即ち、本発明は以下のような構成からなる。 （１）核酸試料を核酸増幅する方法であって、油中に形
成された反応溶液の微小液滴中で前記核酸増幅を行う第
一のステップと、その後前記微小液滴を集合させて再び
増幅を行う第二のステップとを含む核酸増幅方法。 （２）前記第一のステップにおいて、油中に反応溶液を
導入し撹拌してＷａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｗ／Ｏ）エ
マルジョン化することにより微小反応液滴を形成する
（１）に記載の方法。 （３）前記核酸試料はＤＮＡであり、前記核酸増幅反応
はＰＣＲ反応であることを特徴とする（１）または
（２）に記載の方法。 （４）前記核酸試料はＲＮＡであり、前記核酸増幅反応
はＲＴ−ＰＣＲである、（１）または（２）に記載の方
法。 （５）核酸試料を核酸増幅する装置であって、油中に形
成された反応溶液の微小液滴中で前記核酸増幅を行う手
段と、前記微小液滴を集合させる手段と、集合された微
小液滴中で増幅を行う手段とを備えてなる核酸増幅装
置。
解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明に想到した。
即ち、本発明は以下のような構成からなる。 （１）核酸試料を核酸増幅する方法であって、油中に形
成された反応溶液の微小液滴中で前記核酸増幅を行う第
一のステップと、その後前記微小液滴を集合させて再び
増幅を行う第二のステップとを含む核酸増幅方法。 （２）前記第一のステップにおいて、油中に反応溶液を
導入し撹拌してＷａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｗ／Ｏ）エ
マルジョン化することにより微小反応液滴を形成する
（１）に記載の方法。 （３）前記核酸試料はＤＮＡであり、前記核酸増幅反応
はＰＣＲ反応であることを特徴とする（１）または
（２）に記載の方法。 （４）前記核酸試料はＲＮＡであり、前記核酸増幅反応
はＲＴ−ＰＣＲである、（１）または（２）に記載の方
法。 （５）核酸試料を核酸増幅する装置であって、油中に形
成された反応溶液の微小液滴中で前記核酸増幅を行う手
段と、前記微小液滴を集合させる手段と、集合された微
小液滴中で増幅を行う手段とを備えてなる核酸増幅装
置。
【０００９】本発明の方法では、第一段階において油中
に形成した微小反応液滴中である程度増幅反応を行う
と、核酸が導入されて反応が進行した液滴中では反応材
料が欠乏し、その一方で反応が行われなかった液滴中で
は反応材料は消費されずに残っている。そこで、この状
態から、第二段階として液滴を集合させることにより、
残った材料を用いてさらに反応を進めることが可能にな
る。
に形成した微小反応液滴中である程度増幅反応を行う
と、核酸が導入されて反応が進行した液滴中では反応材
料が欠乏し、その一方で反応が行われなかった液滴中で
は反応材料は消費されずに残っている。そこで、この状
態から、第二段階として液滴を集合させることにより、
残った材料を用いてさらに反応を進めることが可能にな
る。
【００１０】例えば該反応がＰＣＲの場合、第一段階で
は微小液滴を反応場とすることで１〜数分子の極微量Ｄ
ＮＡ試料でも効率的にＰＣＲ増幅を行うことができる。
ここで、ＤＮＡが導入された液滴内ではＰＣＲ増幅が進
んだ結果プライマー等のＰＣＲ基質が欠乏し、ＤＮＡが
導入されなかった液滴内では反応が起こらないためＰＣ
Ｒ基質が残る。そこで、液滴を集合させることにより、
第一段階である程度増幅したＤＮＡに対して、残ったＰ
ＣＲ基質を利用して、さらに第二段階の反応が進むこと
になる（図１）。
は微小液滴を反応場とすることで１〜数分子の極微量Ｄ
ＮＡ試料でも効率的にＰＣＲ増幅を行うことができる。
ここで、ＤＮＡが導入された液滴内ではＰＣＲ増幅が進
んだ結果プライマー等のＰＣＲ基質が欠乏し、ＤＮＡが
導入されなかった液滴内では反応が起こらないためＰＣ
Ｒ基質が残る。そこで、液滴を集合させることにより、
第一段階である程度増幅したＤＮＡに対して、残ったＰ
ＣＲ基質を利用して、さらに第二段階の反応が進むこと
になる（図１）。
【００１１】本発明の方法は、様々な化学・生化学反応
に広く利用可能である。具体的には、ＰＣＲ法、ＲＴ−
ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ
法、ＣＰＣＲ法などの各種核酸増幅法に適用することで
より効果を発揮する。しかしながら、核酸増幅反応以外
にも、タンパク質合成反応、種々の酵素反応等に利用で
きる。
に広く利用可能である。具体的には、ＰＣＲ法、ＲＴ−
ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ
法、ＣＰＣＲ法などの各種核酸増幅法に適用することで
より効果を発揮する。しかしながら、核酸増幅反応以外
にも、タンパク質合成反応、種々の酵素反応等に利用で
きる。
【００１２】本発明の方法は、ＤＮＡを対象としたＰＣ
Ｒ法、ＲＮＡを対象としたＲＴ−ＰＣＲ法、または種々
の酵素反応など、熱サイクルを必要とする反応にも利用
可能である。
Ｒ法、ＲＮＡを対象としたＲＴ−ＰＣＲ法、または種々
の酵素反応など、熱サイクルを必要とする反応にも利用
可能である。
【００１３】油中に微小液滴を形成する方法としては、
Ｗ／Ｏエマルジョンを利用する方法が挙げられる。Ｗ／
Ｏエマルジョンは油成分に水溶液成分を混合撹拌するこ
とで形成される乳化状態のことである。エマルジョン状
態とは、油成分中に水溶液成分が微小な水滴となって分
散している状態をいう（図２）。Ｗ／Ｏエマルジョンを
利用することにより、特殊な装置を必要とすることな
く、微小反応液滴を簡単に形成することができる。しか
しながら、これ以外に細いノズルなどから油中に反応溶
液を注入して液滴を作ってもよい。
Ｗ／Ｏエマルジョンを利用する方法が挙げられる。Ｗ／
Ｏエマルジョンは油成分に水溶液成分を混合撹拌するこ
とで形成される乳化状態のことである。エマルジョン状
態とは、油成分中に水溶液成分が微小な水滴となって分
散している状態をいう（図２）。Ｗ／Ｏエマルジョンを
利用することにより、特殊な装置を必要とすることな
く、微小反応液滴を簡単に形成することができる。しか
しながら、これ以外に細いノズルなどから油中に反応溶
液を注入して液滴を作ってもよい。
【００１４】油中に分散した液滴を集合させる方法とし
て遠心分離が好適に利用される。汎用の機器を利用で
き、簡易であるからである。遠心分離操作を行った結
果、油−水の２層が形成されることとなる。液滴を集合
する方法は遠心分離に限られるものではなく、振とうな
ど他の方法を採用することができる。
て遠心分離が好適に利用される。汎用の機器を利用で
き、簡易であるからである。遠心分離操作を行った結
果、油−水の２層が形成されることとなる。液滴を集合
する方法は遠心分離に限られるものではなく、振とうな
ど他の方法を採用することができる。
【００１５】本発明に使用する油としては、水の溶解度
が小さい、撥水性がある、化学的、熱的に不活性であ
る、等の性質を満たすものが使用される。一般的には、
ミネラルオイル、シリコーンオイル、イマ−ジョンオイ
ル、ナタネ油が使用できるが、より小さく安定した液滴
を保持し、耐熱性が優れている点で、シリコーンオイル
が望ましい。
が小さい、撥水性がある、化学的、熱的に不活性であ
る、等の性質を満たすものが使用される。一般的には、
ミネラルオイル、シリコーンオイル、イマ−ジョンオイ
ル、ナタネ油が使用できるが、より小さく安定した液滴
を保持し、耐熱性が優れている点で、シリコーンオイル
が望ましい。
【００１６】水溶液成分に界面活性剤（例えばＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００ ０．０１％〜１％程度）を添加しても
よい。
ｏｎＸ−１００ ０．０１％〜１％程度）を添加しても
よい。
【００１７】
【発明の実施の形態】次に本発明の実施の形態について
説明する。Ｗ／Ｏエマルジョンを利用することで汎用機
器を用いて簡便に行える１分子ＰＣＲ法に関して、以下
に本発明の実施例を説明する。
説明する。Ｗ／Ｏエマルジョンを利用することで汎用機
器を用いて簡便に行える１分子ＰＣＲ法に関して、以下
に本発明の実施例を説明する。
【００１８】通常のＰＣＲの手順に従ってＰＣＲ溶液を
調製する。この時、ＰＣＲ溶液中に界面活性剤を添加し
てもよい。
調製する。この時、ＰＣＲ溶液中に界面活性剤を添加し
てもよい。
【００１９】次に、例えば図４のように設置した容器
に、ＰＣＲ溶液４を混合する。この時、マグネチックス
ターラーバー５を回転させ、油を撹拌しながらＰＣＲ溶
液４を混合する。
に、ＰＣＲ溶液４を混合する。この時、マグネチックス
ターラーバー５を回転させ、油を撹拌しながらＰＣＲ溶
液４を混合する。
【００２０】Ｗ／Ｏエマルジョン状態になった溶液をＰ
ＣＲ熱サイクル実施のための反応装置に導入できる大き
さのプラスチックチューブに分注する。
ＣＲ熱サイクル実施のための反応装置に導入できる大き
さのプラスチックチューブに分注する。
【００２１】ＰＣＲ熱サイクルを行う。ここでのサイク
ル数は１０〜１５回でよい。この時、Ｗ／Ｏエマルジョ
ンによる液滴のうち鋳型ＤＮＡが導入されたものは微小
な反応場となり１分子からの増幅がされる。
ル数は１０〜１５回でよい。この時、Ｗ／Ｏエマルジョ
ンによる液滴のうち鋳型ＤＮＡが導入されたものは微小
な反応場となり１分子からの増幅がされる。
【００２２】最初の熱サイクルが終わったら、遠心操作
を行うことにより、油−水の２層に分離し、再びＰＣＲ
熱サイクルを行う。このサイクル数は２５〜３０回でよ
い。最初のＷ／Ｏエマルジョン状態時に鋳型ＤＮＡが入
らなかった液滴中のプライマー等のＰＣＲ反応基質は熱
サイクルによる消費が無いためそのまま残り、遠心操作
後の反応にＰＣＲの基質を提供する。
を行うことにより、油−水の２層に分離し、再びＰＣＲ
熱サイクルを行う。このサイクル数は２５〜３０回でよ
い。最初のＷ／Ｏエマルジョン状態時に鋳型ＤＮＡが入
らなかった液滴中のプライマー等のＰＣＲ反応基質は熱
サイクルによる消費が無いためそのまま残り、遠心操作
後の反応にＰＣＲの基質を提供する。
【００２３】以下、本発明の実施例を挙げてさらに詳細
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００２４】
【実施例１】ＰＣＲを用いて実際に行った実験を実施例
として挙げる。通常のＰＣＲの手順に従って５０μｌの
ＰＣＲ溶液を氷上にて調製する。このときＰＣＲ溶液に
は０．１％の界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）が
含まれている。また、鋳型ＤＮＡはｐＵＣ１９ＤＮＡ
（宝酒造）である。反応溶液構成物はＰｆｕＴｕｒｂｏ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）と同酵素に添付されたＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭＫＣ
ｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（宝酒造）、
プライマーは５１７Ｆ ＰＲＩＭＥＲ１、５１７Ｆ Ｐ
ＲＩＭＥＲ２（フナコシ）（配列番号１〜２）をそれぞ
れ０．３μＭである。このプライマーによって増幅され
るのはｐＵＣ１９ＤＮＡのうちの５２２ｂｐである。プ
ライマーの配列番号は、配列番号１：５１７Ｆ ＰＲＩ
ＭＥＲ ５’ＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡ
Ｇ３’、配列番号２：５１７Ｆ ＰＲＩＭＥＲ ５’Ｇ
ＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧ３’である。
として挙げる。通常のＰＣＲの手順に従って５０μｌの
ＰＣＲ溶液を氷上にて調製する。このときＰＣＲ溶液に
は０．１％の界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）が
含まれている。また、鋳型ＤＮＡはｐＵＣ１９ＤＮＡ
（宝酒造）である。反応溶液構成物はＰｆｕＴｕｒｂｏ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）と同酵素に添付されたＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭＫＣ
ｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（宝酒造）、
プライマーは５１７Ｆ ＰＲＩＭＥＲ１、５１７Ｆ Ｐ
ＲＩＭＥＲ２（フナコシ）（配列番号１〜２）をそれぞ
れ０．３μＭである。このプライマーによって増幅され
るのはｐＵＣ１９ＤＮＡのうちの５２２ｂｐである。プ
ライマーの配列番号は、配列番号１：５１７Ｆ ＰＲＩ
ＭＥＲ ５’ＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡ
Ｇ３’、配列番号２：５１７Ｆ ＰＲＩＭＥＲ ５’Ｇ
ＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧ３’である。
【００２５】５ｍｌの容器に０．９５ｍｌのシリコーン
オイルとマグネチックスターラーバーを入れて、図４の
状態にする。図４の状態でシリコーンオイルを撹拌しな
がら、先に調製したＰＣＲ溶液を３０秒ごとに１０μｌ
ずつシリコーンオイルに混合していく。全て混合した
ら、そのまま９０秒間撹拌し続ける。この時できる液滴
の大きさは直径５〜１０μｍである。０．５ｍｌのマイ
クロチューブ２本にエマルジョン溶液を分注し、サーマ
ルサイクラーに導入しＰＣＲを実行する。その条件は、
９５℃−５分の後、９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、
７２℃−１分を１３サイクルである。
オイルとマグネチックスターラーバーを入れて、図４の
状態にする。図４の状態でシリコーンオイルを撹拌しな
がら、先に調製したＰＣＲ溶液を３０秒ごとに１０μｌ
ずつシリコーンオイルに混合していく。全て混合した
ら、そのまま９０秒間撹拌し続ける。この時できる液滴
の大きさは直径５〜１０μｍである。０．５ｍｌのマイ
クロチューブ２本にエマルジョン溶液を分注し、サーマ
ルサイクラーに導入しＰＣＲを実行する。その条件は、
９５℃−５分の後、９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、
７２℃−１分を１３サイクルである。
【００２６】最初のＰＣＲが終わったらチューブをサー
マルサイクラーから取り出し、３０００ｇで５分間遠心
する。その後、再びＰＣＲを行う。その条件は、９５℃
−３分の後、９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃
−１分を２５サイクルし、最後に７２℃−７分である。
産物の確認は各チューブから９μｌずつ取り、１．２％
アガロースゲル電気泳動で行った。
マルサイクラーから取り出し、３０００ｇで５分間遠心
する。その後、再びＰＣＲを行う。その条件は、９５℃
−３分の後、９５℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃
−１分を２５サイクルし、最後に７２℃−７分である。
産物の確認は各チューブから９μｌずつ取り、１．２％
アガロースゲル電気泳動で行った。
【００２７】上記実験の結果を図５に示す。ＰＣＲ増幅
の産物はλ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩマーカーの５６４ベース
ペア付近に見られる。この実験を行う際、鋳型ＤＮＡの
数を１０、１、０．１、０分子となるように、反応溶液
を調製している。このように鋳型ＤＮＡの希釈を行った
場合、マイクロチューブ中の鋳型ＤＮＡの数の確率分布
はポアソン分布に従う。その確率分布を表１に示す。
の産物はλ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩマーカーの５６４ベース
ペア付近に見られる。この実験を行う際、鋳型ＤＮＡの
数を１０、１、０．１、０分子となるように、反応溶液
を調製している。このように鋳型ＤＮＡの希釈を行った
場合、マイクロチューブ中の鋳型ＤＮＡの数の確率分布
はポアソン分布に従う。その確率分布を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】ＰＣＲ増幅では理想的には１分子の鋳型Ｄ
ＮＡが存在すれば、増幅可能であることに留意して、図
５の結果を解析すると、増幅された試料の数はポアソン
分布による確率分布にほぼ忠実である。このことは、本
反応系により、１分子からの増幅が行われていることを
示している。
ＮＡが存在すれば、増幅可能であることに留意して、図
５の結果を解析すると、増幅された試料の数はポアソン
分布による確率分布にほぼ忠実である。このことは、本
反応系により、１分子からの増幅が行われていることを
示している。
【００３０】また、同反応条件でＷ／Ｏエマルジョンを
用いないでＰＣＲ増幅を行った結果を図６に示す。ここ
では鋳型ＤＮＡが１０００、１００、１０分子となるよ
うに試料を調製した。これらの試料において、熱サイク
ル数を増加させてもこれらの分子数からの産物は得られ
なかった。
用いないでＰＣＲ増幅を行った結果を図６に示す。ここ
では鋳型ＤＮＡが１０００、１００、１０分子となるよ
うに試料を調製した。これらの試料において、熱サイク
ル数を増加させてもこれらの分子数からの産物は得られ
なかった。
【００３１】これにより、本発明はＷ／Ｏエマルジョン
を反応時に適用することによって１分子からの増幅が可
能になることが示された。
を反応時に適用することによって１分子からの増幅が可
能になることが示された。
【００３２】
【実施例２】次に実際にＲＴ−ＰＣＲを用いて行った実
験を実施例として記載する。
験を実施例として記載する。
【００３３】これは，一段階式のＲＴ−ＰＣＲ法に適用
される。例えば，ＴａＫａＲａ社製のＴａＫａＲａ Ｏ
ｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）を
用いる。以下に同社同製品を用いてＲＴ−ＰＣＲを本件
におけるＷ／Ｏエマルジョンを用いた方法で行なった実
験を記載する。
される。例えば，ＴａＫａＲａ社製のＴａＫａＲａ Ｏ
ｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）を
用いる。以下に同社同製品を用いてＲＴ−ＰＣＲを本件
におけるＷ／Ｏエマルジョンを用いた方法で行なった実
験を記載する。
【００３４】ＲＴ−ＰＣＲを行なうための試薬はＴａＫ
ａＲａ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡＰＣＲ ｋｉｔ（Ａ
ＭＶ）に同梱されているものを用いた。ここで用いたプ
ライマーの配列は各々，Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆ−１ｐｒｉ
ｍｅｒ：ｄ（ＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＧＣＴＡＣＴＴＧ
ＧＡ），Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒ−１ ｐｒｉｍｅｒ：ｄ
（ＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＧＡＧＴＴＧ）であ
る。また，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ
は，ＳＰ６Ｐｒｏｍｏｔｅｒ流域下流にｐＢＲ３２２由
来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約１．４ｋｂｐ
の断片を挿入したプラスミドｐＳＰＴｅｔ３を鋳型とし
て，ＳＰ６ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎにより合
成を行なったものである（同製品説明書より抜粋）。反
応溶液の組成は以下のとおりである（同製品説明書記載
事項に従う）。
ａＲａ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡＰＣＲ ｋｉｔ（Ａ
ＭＶ）に同梱されているものを用いた。ここで用いたプ
ライマーの配列は各々，Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆ−１ｐｒｉ
ｍｅｒ：ｄ（ＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＧＣＴＡＣＴＴＧ
ＧＡ），Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒ−１ ｐｒｉｍｅｒ：ｄ
（ＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＧＡＧＴＴＧ）であ
る。また，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ
は，ＳＰ６Ｐｒｏｍｏｔｅｒ流域下流にｐＢＲ３２２由
来のテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約１．４ｋｂｐ
の断片を挿入したプラスミドｐＳＰＴｅｔ３を鋳型とし
て，ＳＰ６ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎにより合
成を行なったものである（同製品説明書より抜粋）。反
応溶液の組成は以下のとおりである（同製品説明書記載
事項に従う）。
【００３５】５ｍｌの容器に０．９５ｍｌのシリコーン
オイルとマグネチックスターラーバーを入れて、図４の
状態にする。図４の状態でシリコーンオイルを撹拌しな
がら、先に調製したＰＣＲ溶液を３０秒ごとに１０μｌ
ずつシリコーンオイルに混合していく。全て混合した
ら、そのまま９０秒間撹拌し続ける。０．２ｍｌのマイ
クロチューブ８本にエマルジョン溶液を分注し、サーマ
ルサイクラーに導入しＲＴ−ＰＣＲを実行する。その条
件は、５０℃−１５分，９４℃−３分の後、９４℃−３
０秒、６０℃−３０秒、７２℃−１．５分を１３サイク
ルである。ここで，最初の５０℃−１５分の過程は最初
のＤＮＡ一本鎖合成（Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ）行程である。
オイルとマグネチックスターラーバーを入れて、図４の
状態にする。図４の状態でシリコーンオイルを撹拌しな
がら、先に調製したＰＣＲ溶液を３０秒ごとに１０μｌ
ずつシリコーンオイルに混合していく。全て混合した
ら、そのまま９０秒間撹拌し続ける。０．２ｍｌのマイ
クロチューブ８本にエマルジョン溶液を分注し、サーマ
ルサイクラーに導入しＲＴ−ＰＣＲを実行する。その条
件は、５０℃−１５分，９４℃−３分の後、９４℃−３
０秒、６０℃−３０秒、７２℃−１．５分を１３サイク
ルである。ここで，最初の５０℃−１５分の過程は最初
のＤＮＡ一本鎖合成（Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ）行程である。
【００３６】最初のＰＣＲが終わったらチューブをサー
マルサイクラーから取り出し、３０００ｇで３分間遠心
する。その後、再びＰＣＲを行う。その条件は、９４℃
−３分の後、９４℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃
−１．５分を２８サイクルし、最後に７２℃−７分であ
る。産物の確認は各チューブから４μｌずつ取り、１．
２％アガロースゲル電気泳動で行った。
マルサイクラーから取り出し、３０００ｇで３分間遠心
する。その後、再びＰＣＲを行う。その条件は、９４℃
−３分の後、９４℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃
−１．５分を２８サイクルし、最後に７２℃−７分であ
る。産物の確認は各チューブから４μｌずつ取り、１．
２％アガロースゲル電気泳動で行った。
【００３７】まず，Ｗ／Ｏエマルジョンを使った場合と
使わなかった場合の比較実験の結果を図７に示す。Ｃｏ
ｎｔｒｏｌはＷ／Ｏエマルジョンを導入しなかったもの
である。この図７よりＷ／Ｏエマルジョンを導入したこ
とによる反応の阻害が見られず，逆にＣｏｎｔｒｏｌに
比べてスメアのバンドが小さいことから反応の特異性の
向上が確認される。
使わなかった場合の比較実験の結果を図７に示す。Ｃｏ
ｎｔｒｏｌはＷ／Ｏエマルジョンを導入しなかったもの
である。この図７よりＷ／Ｏエマルジョンを導入したこ
とによる反応の阻害が見られず，逆にＣｏｎｔｒｏｌに
比べてスメアのバンドが小さいことから反応の特異性の
向上が確認される。
【００３８】また，鋳型ＲＮＡ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ）の量を１反応あたり５分子にな
るように反応を行なった結果が図８である。図８の結果
に産物が示されていることから，このＷ／Ｏエマルジョ
ンを用いたＰＣＲは１段階ＲＴ−ＰＣＲに有効であるこ
とが示された。
ｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ）の量を１反応あたり５分子にな
るように反応を行なった結果が図８である。図８の結果
に産物が示されていることから，このＷ／Ｏエマルジョ
ンを用いたＰＣＲは１段階ＲＴ−ＰＣＲに有効であるこ
とが示された。
【００３９】一般に１段階のＲＴ−ＰＣＲは２段階のＲ
Ｔ−ＰＣＲに比べて簡便である代わりに感度が比較的悪
いと言われている。しかしながら，Ｗ／Ｏエマルジョン
を用いた場合，こういった欠点が解消されていると考え
られる。
Ｔ−ＰＣＲに比べて簡便である代わりに感度が比較的悪
いと言われている。しかしながら，Ｗ／Ｏエマルジョン
を用いた場合，こういった欠点が解消されていると考え
られる。
【００４０】ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写もＷ／Ｏエマ
ルジョンが与える微小液滴中で行なうことで，確実かつ
特異的にＲＮＡの逆転写が実行されていることがその理
由だと考えられる。
ルジョンが与える微小液滴中で行なうことで，確実かつ
特異的にＲＮＡの逆転写が実行されていることがその理
由だと考えられる。
【００４１】このように簡便な１段階ＲＴ−ＰＣＲにＷ
／Ｏエマルジョンを適用することで，その欠点が改善で
きることが示された。この手法はＨＩＶウィルスなどの
ＲＮＡウィルスの検出限界（ウィンド・ピリオド）を飛
躍的に短縮することが期待される。
／Ｏエマルジョンを適用することで，その欠点が改善で
きることが示された。この手法はＨＩＶウィルスなどの
ＲＮＡウィルスの検出限界（ウィンド・ピリオド）を飛
躍的に短縮することが期待される。
【００４２】
【発明の効果】本発明の方法を用いることで、極微量核
酸試料を対象として容易に核酸増幅反応を進行させるこ
とが可能である。反応を二段階で行うことにより、微小
反応液滴中の反応材料の欠乏に起因する不具合を解決
し、十分な量の増幅反応産物を得ることができる。
酸試料を対象として容易に核酸増幅反応を進行させるこ
とが可能である。反応を二段階で行うことにより、微小
反応液滴中の反応材料の欠乏に起因する不具合を解決
し、十分な量の増幅反応産物を得ることができる。
【００４３】本発明の方法でＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲを行
うと、その産物は、ゲル電気泳動ではっきりと確認でき
るほどの高増幅率を示している。本発明の方法は効率的
かつ確実に核酸増幅を行えることから、希少ＤＮＡのシ
ーケンシングの前段階などの少ない分子のＰＣＲ増幅、
感染初期のウイルス検査などに汎用的に応用されること
が期待される。
うと、その産物は、ゲル電気泳動ではっきりと確認でき
るほどの高増幅率を示している。本発明の方法は効率的
かつ確実に核酸増幅を行えることから、希少ＤＮＡのシ
ーケンシングの前段階などの少ない分子のＰＣＲ増幅、
感染初期のウイルス検査などに汎用的に応用されること
が期待される。
【図１】図１はＷａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｗ／Ｏ）エ
マルジョンの概略を示す図である。
マルジョンの概略を示す図である。
【図２】図２は本発明による方法の実施の形態の概略を
示す図である。
示す図である。
【図３】図３は、極微小反応液を微小な液滴に分散する
ことで、高濃度の反応液を作ることができることを示す
図である。
ことで、高濃度の反応液を作ることができることを示す
図である。
【図４】図４は本発明による方法の実施の形態の例を示
す図である。
す図である。
【図５】（Ａ）（Ｂ）図５（Ａ）は本発明の方法を用い
て行った１分子ＰＣＲの電気泳動の結果を示す図であ
る。（Ｂ）は個々のレーンの説明図である。
て行った１分子ＰＣＲの電気泳動の結果を示す図であ
る。（Ｂ）は個々のレーンの説明図である。
【図６】（Ａ）（Ｂ）図６（Ａ）は本発明の方法を用い
ずに本発明と比較するために行った通序のＰＣＲ法の産
物を電気泳動で解析した結果を示す図である。（Ｂ）は
個々のレーンの説明図である。
ずに本発明と比較するために行った通序のＰＣＲ法の産
物を電気泳動で解析した結果を示す図である。（Ｂ）は
個々のレーンの説明図である。
【図７】図７は本発明の方法を用いたＲＴ−ＰＣＲ法の
産物を通序のＰＣＲ法の産物と比較した電気泳動の結果
を示す図である。
産物を通序のＰＣＲ法の産物と比較した電気泳動の結果
を示す図である。
【図８】図８は本発明の方法を用いて行ったＲＴ−ＰＣ
Ｒの電気泳動の結果を示す図である。
Ｒの電気泳動の結果を示す図である。
１は油相 ２は水相 ３はマグネチックスターラー
バー ４はマグネチックスターラー ５は氷と水
バー ４はマグネチックスターラー ５は氷と水
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 中野 道彦
愛知県豊橋市弥生町字東豊和65（彩季館
428号)
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA11 HA20
4B029 AA23 BB20 DA10 DB19 DF10
Claims (5)
- 【請求項１】 核酸試料を核酸増幅する方法であって、
油中に形成された反応溶液の微小液滴中で前記核酸増幅
を行う第一のステップと、その後前記微小液滴を集合さ
せて再び増幅を行う第二のステップとを含む核酸増幅方
法。 - 【請求項２】 前記第一のステップにおいて、油中に反
応溶液を導入し撹拌してＷａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｉｌ（Ｗ
／Ｏ）エマルジョン化することにより微小反応液滴を形
成する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記核酸試料はＤＮＡであり、前記核酸
増幅反応はＰＣＲ反応であることを特徴とする請求項１
または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記核酸試料はＲＮＡであり、前記核酸
増幅反応はＲＴ−ＰＣＲである、請求項１または２に記
載の方法。 - 【請求項５】 核酸試料を核酸増幅する装置であって、
油中に形成された反応溶液の微小液滴中で前記核酸増幅
を行う手段と、前記微小液滴を集合させる手段と、前記
微小液滴を集合して得た反応溶液層中で増幅を行う手段
とを備えてなる核酸増幅装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002127623A JP2003153692A (ja) | 2001-09-07 | 2002-03-25 | 核酸増幅方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001317473 | 2001-09-07 | ||
| JP2001-317473 | 2001-09-07 | ||
| JP2002127623A JP2003153692A (ja) | 2001-09-07 | 2002-03-25 | 核酸増幅方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003153692A true JP2003153692A (ja) | 2003-05-27 |
Family
ID=26623908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002127623A Pending JP2003153692A (ja) | 2001-09-07 | 2002-03-25 | 核酸増幅方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003153692A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003106678A1 (en) * | 2002-06-13 | 2003-12-24 | Nucleics Pty Ltd | Dna amplification and sequencing in collapsible emulsions |
| JP2006211984A (ja) * | 2005-02-04 | 2006-08-17 | Univ Nagoya | エマルジョンを利用した核酸増幅方法、及び核酸増幅反応用キット |
| JP2006326419A (ja) * | 2005-05-24 | 2006-12-07 | Ms Kiki Kk | エマルジョンの自動分離方法 |
| JP2008245612A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-16 | Hitachi Ltd | 試料調製法および装置 |
| JP2012105580A (ja) * | 2010-11-17 | 2012-06-07 | Seiko Epson Corp | 熱サイクル装置及び熱サイクル方法 |
| JP2013507108A (ja) * | 2009-10-09 | 2013-03-04 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | エマルジョン破壊および生物学的要素の回収のためのシステムおよび方法 |
| US20140227709A1 (en) * | 2002-12-20 | 2014-08-14 | Caliper Life Sciences, Inc. | Methods of detecting low copy nucleic acids |
| EP3090063A4 (en) * | 2013-12-31 | 2017-06-07 | Raindance Technologies Inc. | System and method for detection of rna species |
| US10632465B2 (en) | 2015-04-22 | 2020-04-28 | Stilla Technologies | Contact-less priming method for loading a solution in a microfluidic device and associated system |
| US11066699B2 (en) | 2012-10-08 | 2021-07-20 | Ecole Polytechnique | Microfluidic process for treating and analysing a solution containing a biological material and corresponding microfluidic circuit |
| US11174509B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-11-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
-
2002
- 2002-03-25 JP JP2002127623A patent/JP2003153692A/ja active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US10632465B2 (en) | 2015-04-22 | 2020-04-28 | Stilla Technologies | Contact-less priming method for loading a solution in a microfluidic device and associated system |
| US11577242B2 (en) | 2015-04-22 | 2023-02-14 | Stilla Technologies | Contact-less priming method for loading a solution in a microfluidic device and associated system |
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