JP2022120133A - デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 - Google Patents
デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022120133A JP2022120133A JP2022096041A JP2022096041A JP2022120133A JP 2022120133 A JP2022120133 A JP 2022120133A JP 2022096041 A JP2022096041 A JP 2022096041A JP 2022096041 A JP2022096041 A JP 2022096041A JP 2022120133 A JP2022120133 A JP 2022120133A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- microdroplets
- microdroplet
- fluorescence
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 476
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 475
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 475
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 426
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 134
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 125
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title abstract description 49
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 175
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 174
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 164
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 164
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 125
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 124
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 108
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 claims description 99
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 53
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims description 51
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 claims description 48
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 45
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 44
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 44
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 43
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 39
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 37
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 27
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 25
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 18
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 18
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- 238000007599 discharging Methods 0.000 claims description 13
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 11
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 6
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 125000004386 diacrylate group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 abstract description 161
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 51
- 238000005253 cladding Methods 0.000 abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 163
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 126
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 126
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 77
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 66
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 52
- 230000008569 process Effects 0.000 description 49
- 230000008859 change Effects 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 36
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 35
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 34
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 31
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 27
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 26
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 23
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 23
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 22
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 18
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 17
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 17
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 17
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 17
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 description 16
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 16
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 15
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 12
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 11
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 8
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 8
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- BGHCVCJVXZWKCC-UHFFFAOYSA-N tetradecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC BGHCVCJVXZWKCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010406 interfacial reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 7
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 6
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 238000003491 array Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 5
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 Manufacturing Method Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 3
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 3
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 3
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 3
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 3
- LEJBBGNFPAFPKQ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-prop-2-enoyloxyethoxy)ethyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCCOCCOC(=O)C=C LEJBBGNFPAFPKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 230000005679 Peltier effect Effects 0.000 description 2
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Chemical compound [O-2].[Ca+2] BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 description 2
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Inorganic materials [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 2
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003779 heat-resistant material Substances 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000005676 thermoelectric effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N (fluoren-9-ylideneamino) n-naphthalen-1-ylcarbamate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1=NOC(=O)NC1=CC=CC2=CC=CC=C12 PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000838 Al alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 229910021532 Calcite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000000342 Monte Carlo simulation Methods 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004734 Polyphenylene sulfide Substances 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000013398 bayesian method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000011889 copper foil Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000003066 decision tree Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920006267 polyester film Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000069 polyphenylene sulfide Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2/00—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic
- B01J2/02—Processes or devices for granulating materials, e.g. fertilisers in general; Rendering particulate materials free flowing in general, e.g. making them hydrophobic by dividing the liquid material into drops, e.g. by spraying, and solidifying the drops
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
- G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q3/00—Condition responsive control processes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Databases & Information Systems (AREA)
- Evolutionary Computation (AREA)
- Bioethics (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- Signal Processing (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Artificial Intelligence (AREA)
- Public Health (AREA)
- Software Systems (AREA)
Abstract
Description
出口端112を有し、第一の液体を貯留している液体吐出ピペットチップ110を提供し、開口を有し第二の液体を貯留している微小液滴容器を提供し、そのうち、第一の液体と第二の液体は、互いに非相溶を持ち、又は、界面反応を有する任意の二つの液体とされるステップS201と、
液体吐出ピペットチップ110の出口端112を、微小液滴容器の開口より、第二の液体の液面下に挿入するステップS202と、
液体吐出ピペットチップ110の出口端112が第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を含む運動を行いながら、第一の液体を液体吐出ピペットチップ110の出口端112から排出し、液体吐出ピペットチップ110の出口端112から排出された第一の液体により、液体吐出ピペットチップ110の出口端112に付着される液滴195を形成し、液体吐出ピペットチップ110の出口端112が瞬間加速度運動をしている過程において、液滴195を液体吐出ピペットチップ110の出口端112から脱離して第二の液体の液面下に、微小液滴を形成するステップS203と、を含む。
各リアルタイムの蛍光画像に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光強度値を取得するステップS4111と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光強度値に基づいて、核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線を取得するステップS4113と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光曲線に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てのリアルタイムの蛍光曲線を取得するステップS4115と、を含む。
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出し、前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きを取得するステップS4121と、
前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きに基づいて、前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きのうち、数値が変化しない傾きを取得するステップS4123と、
前記傾きが変化しない数値に基づいて、その対応する初期巡回数を核酸増幅された各微小液滴のCt値として取得する、ステップS4125と、
前記核酸増幅された各微小液滴のCt値に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てのCt値を取得するステップS4127と、を含む。
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値を取得するステップS4122と、
核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値に基づいて、その対応する巡回数を、核酸増幅された各微小液滴のCt値として取得するステップS4124と、
前記核酸増幅された各微小液滴のCt値に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てのCt値を取得するステップS4126と、をさらに含む。
として示される。
そのうち、x0は、初期の鋳型(DNA)量であり、Exが増幅の効率であり、Nが、蛍光増幅信号が、閾値の強度になるまで増幅産物の量である。
そのうち、λは、前記微小液滴に平均して含まれる初期DNAコピー数である。各液滴に含まれる平均初期コピー数は、CPD(copies per droplet)により表される。
微小液滴の全てについて、複数のリアルタイムの蛍光画像を取得し、前記複数のリアルタイムの蛍光画像に基づいて、核酸増幅された微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線を取得するステップS4210と、
前記リアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てのCt値を取得するステップS4220と、
前記Ct値と核酸増幅された微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数を取得するステップS4230と、
前記核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数に基づいて、一部の核酸初期コピー数を選択するステップS4240と、
前記一部の核酸初期コピー数に基づいて、前記一部の核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップS4250と、
前記一部の核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布について点推定を行い、ポアソン分布のパラメータλを取得するステップS4260と、を含む。
そのうち、各微小液滴に含まれるDNA初期コピー数は、確率変数xであり、一部の微小液滴のDNA初期コピー数と対応する度数値がnkであり、Nが前記複数の微小液滴の総数である。
微小液滴の全ての体積v1、v2、...vmを取得し、ただし、前記体積v1、v2、...vmと順次に対応する微小液滴の数量をn1、n2、…、nmとし、前記体積v1、v2、...vmと順次に対応する微小液滴における核酸増幅された陰性の微小液滴の数量をb1、b2、…、bmとする、ステップS4310と、
微小液滴の全てについて核酸増幅された関連のパラメータv1、v2、...vm、n1、n2、…、nm、b1、b2、…、bmに基づいて、核酸増幅反応液の濃度cについての結合二項分布関数f(c)を構築するステップS4320と、
結合二項分布関数f(c)に基づいて、前記結合二項分布関数f(c)に極値点を取った時のcの値を求めるステップS4330と、
前記結合二項分布関数f(c)をln(c)についての結合二項分布関数F(Λ)に転換して、ln(c)についての標準偏差及び信頼区間を取得するステップS4340と、
ln(c)についての標準偏差及び信頼区間に基づいて、前記核酸増幅反応液の濃度cの標準偏差及び信頼区間を取得するステップS4350を含む。
従って、前記ポアソン分布モデルの期待値μと分散σ2により、期待値μがλであり、分散σ2がλであると分かる。従って、デジタルPCRにおける各微小液滴に含まれる標的DNA分子のコピー数がλであるので、求められるλ値により、核酸を定量で検出することが実現される。
故に、λの値を求めると、DNAを定量で検出することが実現される。
標的核酸を含んでいる試料溶液を微滴化し、複数の異なる体積v1、v2、...vmの微小液滴を取得し、ただし、前記微小液滴体積v1、v2、...vmと順次に対応する微小液滴の数量をn1、n2、…、nmとするステップS4311と、
微小液滴の全てについて核酸増幅を行い、撮影により検出し、前記微小液滴の全てに蛍光画像を取得するステップS4313と、
前記微小液滴の全ての蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の全ての体積v1、v2、...vmと順次に対応する核酸増幅された陰性微小液滴数量b1、b2、…、bmを取得するステップS4315と、を含む。
標的核酸を含んでいる試料溶液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップS4312と、
前記複数の微小液滴に核酸を増幅し、撮影により検出し、核酸増幅された微小液滴の全ての蛍光画像を取得するステップS4314と、
前記蛍光画像に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全ての体積を取得し、ただし、前記体積をそれぞれv1、v2、...vmとして、前記体積v1、v2、...vmと順次に対応する核酸増幅された微小液滴の数量をn1、n2、…、nmとして、前記体積v1、v2、...vmと順次に対応する核酸増幅された陰性微小液滴数量をb1、b2、…、bmとするステップS4316をさらに含む。
単一体積デジタルPCRの解析工程に基づいて、各微小液滴の体積のそれぞれをv1、v2、...vmとすると、各微小液滴の体積とそれぞれ対応する数量が順次にn1、n2、…、nmである。cについての結合二項分布関数を構築すると
前記結合二項分布関数f(c)に導関数を導出し、前記結合二項分布関数f(c)の導関数を取得するステップS4331と、
前記結合二項分布関数f(c)の導関数を0にし、前記結合二項分布関数f(c)に極値点を取った時の核酸増幅反応液濃度cの値を取得するステップS4332と、を含む。
前記関数F(Λ)に対数を取り、関数L(Λ)を取得するステップS4341と、
前記関数L(Λ)に一次導関数を導出し、関数L(Λ)の一次導関数を0にするステップS4342と、
ln(c)に対応する標準偏差σを取得するステップS4343と、
ln(c)に対応する標準偏差σに基づいて、ln(c)の信頼区間を取得するステップS4344と、を含む。
となり、
前記関数F(Λ)に自然対数を取ることにより、対応する乗法関係を、独立する加法関係に変更して、対応する導関数をより容易に処理することができる。
検出すべき核酸増幅反応液を製造するステップS10と、
前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、微小液滴のマトリックスを形成するステップS20と、
前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線及び各微小液滴の溶解曲線を取得するステップS30と、
前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線及び各微小液滴の溶解曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスを解析し、前記検出すべき核酸情報を取得するステップS40と、を含む。
ポリメラーゼ連鎖反応の温度パラメータ、時間パラメータ及び循環回数を配置するステップS310と、
前記温度パラメータ及び前記時間パラメータに基づいて、前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、順次に前記循環回数だけ循環を行い、循環工程ごとに各前記微小液滴に蛍光曲線を取得するステップS320と、
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された前記微小液滴のマトリックスを降温させ、一定の温度間隔で昇温し、各前記微小液滴の溶解曲線を取得するステップS330と、を含む。
前記温度パラメータ及び前記時間パラメータに基づいて、前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、前記微小液滴にマトリックスの蛍光画像を取得するステップS321と
前記循環回数だけ順次に循環を行い、ポリメラーゼ連鎖反応の工程における前記微小液滴についてマトリックスの蛍光画像の全てを取得するステップS322と、
前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像の全てに基づいて、循環工程毎に各前記微小液滴の蛍光情報を取得するステップS323と、
毎次循環工程毎に各前記微小液滴の蛍光情報に基づいて、各前記微小液滴の蛍光曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線を取得するステップS324と、を含む。
まず、前記微小液滴のマトリックスの酵素がホットスタートするように、前記微小液滴のマトリックスを95℃まで加熱し、4分だけ加熱し、前記微小液滴のマトリックスの酵素がホットスタートされた後に、1分だけ前記微小液滴のマトリックスを変性させること、
次に、前記微小液滴のマトリックスが変性した後に、プライマーとDNA鋳型とが結合して一部の二本鎖を形成するように、55℃まで降温し、1分だけアニーリング(annealing)すると、前記蛍光信号検出装置30により、前記微小液滴のマトリックスを撮影し、一回目の循環の前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を取得すること、
さらに次に、前記微小液滴のマトリックスを70℃まで昇温し、7分だけ伸長すること、
最後に、前記循環回数に従って、順次に上記の変性-アニーリング(annealing)-伸長という三つのステップを、45回だけ循環し、45回だけ循環が完了すると、4℃まで降温し、前記複数の微液を保存することを含む。
そのうち、各前記微小液滴を追跡する時に、各前記微小液滴の画像を追跡するステップは、
まず、温度循環工程ごとに撮影された写真を識別し、各微小液滴の円心位置を取得すること、
次に、現在に識別される各微小液滴の円心位置と、前回循環工程における各微小液滴の円心位置と、を比較すること、
最後に、現在に識別される各微小液滴の円心位置と前回循環工程中の各微小液滴の円心位置の円心との距離が一つの微小液滴直径よりも小さい場合に、同一の微小液滴と示されること、を含む。
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された前記微小液滴のマトリックスを40℃以下まで降温させるステップS33と、
40℃以下まで降温された前記微小液滴のマトリックスを一定の温度間隔で昇温させ、前記温度間隔に対応する前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を取得するステップS332と、
前記温度間隔に対応する前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像に基づいて、前記温度間隔に対応する各前記微小液滴の蛍光情報を取得するステップS333と、
前記温度間隔に対応する各前記微小液滴の蛍光情報に基づいて、各前記微小液滴の溶解曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線を取得するステップS334と、を含む。
前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を取得するステップS410と、
前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸情報を取得するステップS420と、を含む。
前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線に基づいて、各前記微小液滴の前記蛍光曲線と対応するCt値を取得するステップS411と、
各前記微小液滴の前記蛍光曲線のCt値をクラスタリングすることにより、順次に大きい順で、x1、x2、…、xnの類別を取得するステップS412と、
前記x1、x2、…、xnの類別に基づいて、類別毎に対応する前記微小液滴の数y1、y2、…、ynを取得するステップS413と、
各類別に対応する前記微小液滴の数y1、y2、…、ynに基づいて、前記x1、x2、…、xnの類別毎に対応する前記微小液滴の数y1、y2、…、ynの度数分布を取得するステップS414と、
前記度数分布に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を計算するステップS415と、を含む。
そのうち、λは、前記微小液滴に平均して含まれる初期DNAコピー数である。各液滴に含まれる平均初期コピー数は、CPD(copies per droplet)により示される。
従って、λの値を求めたと、DNAの定量検出も実現される。
前記x2、…、xn個の類別毎に対応する前記微小液滴の数y2、…、ynの一部の度数分布に基づいて、順次に前記x2の類別と対応する前記核酸初期コピー数として、ポアソン分布で当てはめ、各ポアソン分布の対応するパラメータλj(j=0、1、2….)を取得するステップS4151と、
度数値の残差平方和errが最小になり、λoptimalを最適に取得するように、一つの空間[λmin, λmax]にλjを照会する、ステップS4152と、
前記最適λoptimalに基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を計算するステップS4153と、を含む。
複数の核小体730及びプライマー溶液を提供するステップS110と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップS120と、
ゲル溶解温度で、前記複数の核小体730、前記プライマー溶液及び前記被覆層の製造液を混合し、核酸検出微小球の製造溶液を取得するステップS130と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球の製造溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップS140と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球700を取得するステップS150と、を含む。
出口端を有し前記核酸検出微小球の製造溶液を貯留している液体吐出ピペットチップを提供し、疎水性油を貯留している開口容器を提供するステップS141と、
前記ゲル溶解温度で、前記液体吐出ピペットチップの出口端を前記疎水性油の液面下に挿入するステップS142と、
前記液体吐出ピペットチップの出口端が前記疎水性油の液面下に瞬間加速度運動を行い、又は、周期的に変化する速度で運動を行い、前記核酸検出微小球の製造溶液を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記疎水性油の液面下に前記複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップS143と、を含む。
プライマー溶液、プローブ溶液、及び、複数の核小体730を提供するステップS210と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップS220と、
ゲル溶解温度で、将前記複数の核小体730と、前記プライマー溶液と、前記プローブ溶液とを、前記被覆層の製造液に混合し、核酸検出微小球の製造溶液を取得するステップS230と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球を製造する溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップS240と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球ステップを選択するS250と、を含む。
核酸増幅反応液と多種類の異なる種類の核酸検出微小球700を提供し、前記核酸検出微小球700は、核小体730及び被覆層710を含み、前記核小体730は、コード情報を有し、前記被覆層710は、前記核小体730を被覆し、前記被覆層710は、基体711及び前記基体711に分散されるプライマー712を含み、前記プライマー712が前記核小体730と一意に対応し、前記核小体730は、蛍光染料を含んでいるソリッド球体であるステップS310と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球700と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップS320と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴800を形成するステップS330と、
前記複数の微小液滴800に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴800を取得するステップS340と、
増幅された前記複数の微小液滴800に基づいて、各前記微小液滴800における前記核小体730を検出し、一つの前記核小体730しかを含まない前記微小液滴800をスクリーニングし、第一の効果的な微小液滴810を取得するステップS350と、
前記第一の効果的な微小液滴810に基づいて、前記第一の効果的な微小液滴810における前記核小体730の蛍光信号を検出し、前記核小体730と対応する前記プライマー712を取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第一の効果的な微小液滴810に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップS360と、を含む。
コード蛍光チャネル及び蛍光染料検出チャネルを含み、コード蛍光チャネルに基づいて、前記効果的な微小液滴における前記核小体730の蛍光信号を識別する蛍光信号検出装置を提供する、ステップS361と、
前記核小体730の蛍光信号に基づいて、前記730と対応する前記プライマー712を取得するステップS362と、
前記蛍光染料検出チャネルに基づいて、前記第一の効果的な微小液滴810における核酸増幅反応された報告蛍光信号を検出し、前記第一の効果的な微小液滴810に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップS363と、を含む。
核酸増幅の反応液及び多種類の異なる種類の核酸検出微小球700を提供し、ただし、前記核酸検出微小球700は、核小体730及び被覆層710を含み、前記核小体730は、コード情報を有し、前記被覆層710は、前記核小体730を被覆し、前記被覆層710は、基体711、及び、前記基体711に分散されるプライマー712及びプローブ713を含み、前記プライマー712と前記プローブ713とが前記核小体730と一意に対応し、前記核小体730は、蛍光コード情報を有するソリッド球体であるステップS410と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球700と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップS420と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴800を形成するステップS430と、
前記複数の微小液滴800に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴800を取得するステップS440と、
増幅された前記複数の微小液滴800に基づいて、各前記微小液滴800における前記核小体730を検出し、一つの前記核小体730しかを含まない前記微小液滴800をスクリーニングし、第二の効果的な微小液滴820を取得するステップS450と、
前記第二の効果的な微小液滴820に基づいて、前記第二の効果的な微小液滴820における前記核小体730の蛍光信号を検出し、前記核小体730と対応する前記プライマー712及び前記プローブ713を取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第二の効果的な微小液滴820に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップS460、とを含む。
Claims (17)
- 蛍光コード情報を有する核小体と、被覆層と、を含み、
前記被覆層は、前記核小体を被覆し、基体とプライマーとを含み、
前記プライマーは、前記基体に分散され、前記核小体と一意に対応する、核酸検出微小球。 - 前記被覆層は、プローブをさらに含み、
前記プローブ及び前記プライマーは、前記基体に分散され、前記核小体と一意に対応する、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸検出微小球。 - 前記基体は、アガロースのゲルである、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸検出微小球。
- 前記核小体は、蛍光染料を含むソリッド球体である、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸検出微小球。
- 前記核小体は、その直径が10ミクロン~100ミクロンである、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸検出微小球。
- 前記被覆層は、その厚さが10ミクロン~100ミクロンである、ことを特徴とする請求項1に記載の核酸検出微小球。
- 複数の核小体及びプライマー溶液を提供するステップS110と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップS120と、
ゲル溶解温度で、前記複数の核小体、前記プライマー溶液及び前記被覆層の製造液を混合し、核酸検出の微小球の製造溶液を取得するステップS130と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球の製造溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップS140と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球を取得するステップS150と、を含む、核酸検出微小球の製造方法。 - 前記ステップS150には、前記核酸検出微小球は、単一の前記核小体を含む核酸検出微小球である、ことを特徴とする請求項7に記載の核酸検出微小球の製造方法。
- 前記ステップS120には、前記ゲル粉末がカンテン末、又は、ポリエチレングリコールジアクリレートなどである、ことを特徴とする請求項7に記載の核酸検出微小球の製造方法。
- 前記ステップS140には、
出口端を有し、前記核酸検出微小球の製造溶液を貯留している液体吐出ピペットチップを提供し、疎水性油を貯留している開口容器を提供するステップS141と、
前記ゲル溶解温度で、前記液体吐出ピペットチップの出口端を前記疎水性油の液面に挿入するステップS142と、
前記液体吐出ピペットチップの出口端が前記疎水性油の液面下に瞬間加速度運動を行い、又は、周期的に変化する速度で運動を行い、前記核酸検出微小球の製造溶液を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記疎水性油の液面下に前記複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップS143と、を含む、ことを特徴とする請求項7に記載の核酸検出微小球の製造方法。 - プライマー溶液、プローブ溶液、及び、複数の核小体を提供するステップS210と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップS220と、
ゲル溶解温度で、前記複数の核小体と、前記プライマーとプローブ溶液とを前記被覆層の製造液に混合し、核酸検出微小球の製造溶液を取得するステップS230と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球の製造溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップS240と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球を取得するステップS250と、を含む、核酸検出微小球の製造方法。 - 前記ステップS250には、前記核酸検出微小球は、単一の前記核小体を含む核酸検出微小球である、ことを特徴とする請求項11に記載の核酸検出微小球の製造方法。
- ハイスループットで核酸への検出と解析に用いられる試薬キットであって、請求項1から6のいずれか一つに記載の核酸検出微小球与核酸反応液を含む、ことを特徴とする、試薬キット。
- 核酸増幅反応液、及び、多種類の異なる種類の核酸検出微小球を提供し、前記核酸検出微小球は、核小体及び被覆層を含み、前記核小体は、コード情報を有し、前記被覆層は、前記核小体を被覆し、前記被覆層は、基体と前記基体に分散されるプライマーとを含み、前記プライマーが前記核小体に一意に対応し、前記核小体は、蛍光染料を含むソリッド球体である、ステップS310と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップS320と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップS330と、
前記複数の微小液滴に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴を取得するステップS340と、
増幅された前記複数の微小液滴に基づいて、各前記微小液滴中の前記核小体を検出し、一つの前記核小体しかを含まない前記微小液滴をスクリーニングし、第一の効果的な微小液滴を取得するステップS350と、
前記第一の効果的な微小液滴に基づいて、前記第一の効果的な微小液滴における前記核小体の蛍光コード信号を検出し、前記核小体と対応する前記プライマーを取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第一の効果的な微小液滴に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップS360と、を含む、ハイスループット核酸検出方法。 - 前記ステップS310には、前記核酸増幅反応液は、デオキシリボ核酸を鋳型とする核酸増幅反応液、リボ核酸を鋳型とする逆転写核酸増幅反応液、又は、ループ介在等温増幅反応液であり、前記核酸増幅反応液に蛍光染料を含む、ことを特徴とする請求項14に記載のハイスループット核酸検出方法。
- 前記ステップS360は、
コード蛍光チャネル及び蛍光染料検出チャネルを含み、コード蛍光チャネルに基づいて、前記効果的な微小液滴における前記核小体の蛍光コード信号を識別する蛍光信号検出装置を提供するステップS361と、
前記核小体の蛍光コード信号に基づいて、前記核小体と対応する前記プライマーを取得するステップS362と、
前記蛍光染料検出チャネルに基づいて、前記第一の効果的な微小液滴における核酸増幅反応された報告蛍光信号を検出し、前記第一の効果的な微小液滴に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップS363と、を含む、ことを特徴とする請求項14に記載のハイスループット核酸検出方法。 - 核酸増幅反応液及び多種類の異なる種類の核酸検出微小球を提供し、前記核酸検出微小球は、核小体及び被覆層を含み、前記核小体は、コード情報を有し、前記被覆層は、前記核小体を被覆し、前記被覆層は、基体、及び、前記基体に分散されるプライマーとプローブとを含み、前記プライマーと前記プローブとが前記核小体に一意に対応し、前記核小体は、蛍光コード情報を有するソリッド球体であるステップS410と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップS420と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップS430と、
前記複数の微小液滴に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴を取得するステップS440と、
増幅された前記複数の微小液滴に基づいて、各前記微小液滴における前記核小体を検出し、一つの前記核小体しかを含まない前記微小液滴をスクリーニングし、第二の効果的な微小液滴を取得するステップS450と、
前記第二の効果的な微小液滴に基づいて、前記第二の効果的な微小液滴における前記核小体の蛍光コード信号を検出し、前記核小体と対応する前記プライマーと前記プローブとを取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第二の効果的な微小液滴に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップS460とを含む、ハイスループット核酸検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023042563A JP2023075307A (ja) | 2018-01-24 | 2023-03-17 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810070377.2 | 2018-01-24 | ||
CN201810070377.2A CN110066857B (zh) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 数字pcr定量检测方法 |
CN201810932950.6 | 2018-08-16 | ||
CN201810932950.6A CN110835645B (zh) | 2018-08-16 | 2018-08-16 | 数字pcr检测方法 |
CN201811392278.2 | 2018-11-21 | ||
CN201811392278.2A CN111206081B (zh) | 2018-11-21 | 2018-11-21 | 核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法 |
PCT/CN2019/072974 WO2019144907A1 (zh) | 2018-01-24 | 2019-01-24 | 数字pcr检测仪、数字pcr定量检测方法、不同体积数字pcr的定量分析方法、数字pcr检测方法、核酸检测微球、核酸检测微球制备方法、核酸检测微球试剂盒以及高通量核酸检测方法 |
JP2020560539A JP7094524B2 (ja) | 2018-01-24 | 2019-01-24 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020560539A Division JP7094524B2 (ja) | 2018-01-24 | 2019-01-24 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023042563A Division JP2023075307A (ja) | 2018-01-24 | 2023-03-17 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022120133A true JP2022120133A (ja) | 2022-08-17 |
Family
ID=67395202
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020560539A Active JP7094524B2 (ja) | 2018-01-24 | 2019-01-24 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
JP2022096041A Pending JP2022120133A (ja) | 2018-01-24 | 2022-06-14 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
JP2023042563A Pending JP2023075307A (ja) | 2018-01-24 | 2023-03-17 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020560539A Active JP7094524B2 (ja) | 2018-01-24 | 2019-01-24 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023042563A Pending JP2023075307A (ja) | 2018-01-24 | 2023-03-17 | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210032680A1 (ja) |
EP (2) | EP3739059B1 (ja) |
JP (3) | JP7094524B2 (ja) |
CA (2) | CA3188153A1 (ja) |
ES (1) | ES2967012T3 (ja) |
WO (1) | WO2019144907A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111206081B (zh) * | 2018-11-21 | 2023-06-30 | 思纳福(苏州)生命科技有限公司 | 核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法 |
EP3805406B1 (en) * | 2019-10-09 | 2022-04-20 | Quark Biosciences Taiwan, Inc. | Digital and quantitative pcr measuring method for nucleic acid sample |
US20220411858A1 (en) * | 2019-11-29 | 2022-12-29 | Mgi Tech Co., Ltd. | Random emulsification digital absolute quantitative analysis method and device |
CN111197003B (zh) * | 2019-12-26 | 2023-08-25 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种基于智能手机的集成核酸提取扩增检测的分析装置及方法 |
CN112950571B (zh) * | 2021-02-25 | 2024-02-13 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 阴阳性分类模型建立方法、装置、设备及计算机存储介质 |
CN112813152B (zh) * | 2021-04-02 | 2021-10-15 | 深圳市博瑞生物科技有限公司 | 一种基于图像识别的数字pcr液滴荧光检测方法 |
CN113699033A (zh) * | 2021-08-10 | 2021-11-26 | 上海交通大学 | 一种基于熔解曲线的多重数字核酸分析装置和分析方法 |
CN113670877B (zh) * | 2021-08-25 | 2022-05-10 | 华中科技大学 | 用于高通量数字pcr检测的斜置上顶式高斯光片成像系统 |
CN113789259A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-14 | 哈尔滨工业大学 | 机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置及检测方法 |
CN113755563B (zh) * | 2021-10-20 | 2023-11-28 | 西安天隆科技有限公司 | 一种使用微液滴进行核酸分子定量的方法及定量化系统 |
TWI797820B (zh) * | 2021-11-08 | 2023-04-01 | 財團法人工業技術研究院 | Pcr快速檢測裝置及其方法 |
CN116747917A (zh) * | 2023-04-26 | 2023-09-15 | 上海科技大学 | 一种微流控芯片及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105925572A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-09-07 | 厦门大学 | 一种dna编码微球及其合成方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10201604446PA (en) | 2011-09-30 | 2016-07-28 | Life Technologies Corp | Methods and systems for visualizing and evaluating data |
BR112014011818A2 (pt) | 2011-11-17 | 2017-05-02 | Curiosity Diagnostics Sp Z O O | método para realizar ensaios de quantificação |
WO2013130857A1 (en) * | 2012-02-29 | 2013-09-06 | Bio Dx, Inc. | Defining diagnostic and therapeutic targets of conserved fetal dna in maternal circulating blood |
CN104388307B (zh) * | 2014-11-24 | 2016-05-25 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种液滴式样品荧光检测系统和方法 |
US11085074B2 (en) * | 2015-09-29 | 2021-08-10 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for performing digital PCR |
CN106596489B (zh) * | 2016-12-19 | 2019-06-28 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 用于荧光液滴检测中荧光强度数据的处理方法 |
CN106520524A (zh) | 2016-12-30 | 2017-03-22 | 中国科学技术大学 | 一体式刚性流道液滴数字pcr系统及方法 |
CN107513495B (zh) * | 2017-09-01 | 2020-07-31 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 用于核酸检测的多通道微滴检测芯片 |
CN107478629A (zh) * | 2017-09-04 | 2017-12-15 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种大面积数字pcr微滴荧光高通量检测装置和方法 |
CN107622185B (zh) | 2017-10-27 | 2020-08-21 | 领航基因科技(杭州)有限公司 | 一种数字pcr浓度计算方法 |
-
2019
- 2019-01-24 WO PCT/CN2019/072974 patent/WO2019144907A1/zh unknown
- 2019-01-24 CA CA3188153A patent/CA3188153A1/en active Pending
- 2019-01-24 CA CA3089411A patent/CA3089411C/en active Active
- 2019-01-24 EP EP19743502.7A patent/EP3739059B1/en active Active
- 2019-01-24 EP EP23206494.9A patent/EP4293673A3/en active Pending
- 2019-01-24 ES ES19743502T patent/ES2967012T3/es active Active
- 2019-01-24 US US16/964,183 patent/US20210032680A1/en active Pending
- 2019-01-24 JP JP2020560539A patent/JP7094524B2/ja active Active
-
2022
- 2022-06-14 JP JP2022096041A patent/JP2022120133A/ja active Pending
-
2023
- 2023-03-17 JP JP2023042563A patent/JP2023075307A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105925572A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-09-07 | 厦门大学 | 一种dna编码微球及其合成方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3188153A1 (en) | 2019-08-01 |
EP4293673A3 (en) | 2024-03-27 |
EP3739059A4 (en) | 2021-03-31 |
JP7094524B2 (ja) | 2022-07-04 |
EP4293673A2 (en) | 2023-12-20 |
ES2967012T3 (es) | 2024-04-25 |
EP3739059B1 (en) | 2023-12-06 |
JP2023075307A (ja) | 2023-05-30 |
US20210032680A1 (en) | 2021-02-04 |
CA3089411C (en) | 2024-01-09 |
WO2019144907A1 (zh) | 2019-08-01 |
EP3739059C0 (en) | 2023-12-06 |
CA3089411A1 (en) | 2019-08-01 |
EP3739059A1 (en) | 2020-11-18 |
JP2021511074A (ja) | 2021-05-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2022120133A (ja) | デジタルpcr検出器、デジタルpcr定量検出方法、異なる体積のデジタルpcrの定量解析方法、デジタルpcr検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法 | |
US11633739B2 (en) | Droplet-based assay system | |
CN110066857B (zh) | 数字pcr定量检测方法 | |
CA2738578C (en) | Droplet-based assay system | |
US20200086312A1 (en) | Detection method for a target nucleic acid | |
CN112029653A (zh) | 基于CRISPR和Cas的数字化核酸扩增检测方法和集成化检测系统 | |
CN111206081B (zh) | 核酸检测微球、制备方法、试剂盒及高通量核酸检测方法 | |
US20230372935A1 (en) | Partition-based method of analysis |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220614 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20221227 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230725 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231012 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231226 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240321 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20240326 |