CN113789259A - 机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置及检测方法。所述微滴数字核酸检测装置包括液滴生成芯片、核酸扩增装置、荧光检测芯片三个部分。本发明利用微流控技术和机器学习辅助的图形处理，针对现有的恒温扩增或非恒温扩增核酸检测操作复杂、难以实现POCT、检测难以绝对定量的核酸检测问题，提出一种新的基于微流控的高通量微液滴数字核酸检测低成本系统，可以满足高生物安全性、便携性、高效性的检测设备需求。
Description
技术领域
本发明属于现场定性检测领域，具体涉及一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置及检测方法。
背景技术
传染病毒具有很强的传播性且易于变异，防控难度大，对人民的健康和生活产生了极为严重的影响。在传染性病毒传播时，最好的解决方案是快速准确地检测出传染原并分离出载体以防止进一步传播。现有核酸检测操作复杂且耗时长，需要在生物安全实验室实施，难以实现现场应用。
目前核酸检测技术在临床医学领域上已经被较大范围地应用，但在抗疫一线的公共场合区域，例如火车站、飞机场、临检场所等，人流量巨大，现有核酸检测手段对实验环境要求较高且耗时较长，不能做到即时现场检测(point-of-care testing,POCT)，POCT检测仍然面临着如何有效地克服对周围环境的污染、如何减少实验所需的费用、如何降低仪器的复杂程度、怎样将检测操作最大程度上进行简化、如何实现绝对定量等一系列的问题。
发明内容
本发明提供一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置及检测方法，针对现有的恒温扩增或非恒温扩增核酸检测操作复杂、难以实现POCT、检测难以绝对定量的核酸检测问题。
本发明通过以下技术方案实现：
一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，所述微滴数字核酸检测装置包括液滴生成芯片、核酸扩增装置和荧光检测芯片；所述液滴生成芯片通过核酸扩增装置和荧光检测芯片相连接，所述微滴数字核酸检测装置在不低于大气压的压力下使用。
所述液滴生成芯片包括米字形、十字形或T形液滴生成通道1、进口2、过滤段3、稳流段4及一个出口5，每个所述进口2均连通一个过滤段3，每个所述过滤段3均连通一个稳流段4，多个所述稳流段4均连通一个米字形、十字形或T形液滴生成通道1的一端，所述米字形、十字形或T形液滴生成通道1连通出口5。
进一步的，每个所述过滤段3包括多组过滤柱3-1，每组过滤柱3-1为多个过滤柱交错设置。
进一步的，所述进口2包括分散相进口和连续相进口，所述米字形液滴生成通道1包括分散相进口和连续相进口，所述米字形液滴生成通道1的连续相位于分散相外侧，连续相流体从两侧对称给分散相流体施加剪切力；
所述十字形液滴生成通道1包括分散相进口和连续相进口，所述十字形液滴生成通道1的连续相流体分为两路流动，同样从两端对称挤压分散相；
所述T形液滴生成通道1包括分散相进口和连续相进口，所述T形液滴生成通道1的连续相流体从单侧挤压分散相；
进一步的，所述核酸扩增装置包括圆柱形核酸扩增装置和平面形核酸扩增装置；所述圆柱形核酸扩增装置包括导热块Ⅰ11和导热块Ⅱ12以及其上所缠绕的管路，所述导热块Ⅰ11上设置加热孔Ⅰ13，所述加热孔Ⅰ13的辐射范围内设置多个温控孔Ⅰ14，所述导热块Ⅱ12的一端设置加热孔Ⅱ15，所述加热孔Ⅱ15的辐射范围内设置温控孔Ⅱ16，所述导热块Ⅰ11和导热块Ⅱ12之间通过绝热材料相连接，所述导热块Ⅰ11、导热块Ⅱ12与绝热材料形成类似圆柱形的结构。
进一步的，所述平面形核酸扩增装置包括导热板25以及其上所刻蚀的微通道28，对导热板25上不同位置加热，并通过温控使不同区域温度不同。
进一步的，将导热块Ⅰ11和导热块Ⅱ12或导热板25分成几个区域，每个区域对应核酸扩增过程的不同温度需求，以液流速度和路程来控制液滴内反应试剂的加热时间，从而在加热的微小管道内实现扩增。
进一步的，所述荧光检测芯片包括进口21、出口22和支路23，所述进口 21和出口22通过支路23相连接，所述支路23上为笔直通路或在笔直通路上设置蛇形弯曲段，所述支路23允许多个液滴并排流动。
进一步的，所述荧光检测芯片为透光结构的微通道，能被特定波长激光透射。
一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置的检验方法，所述绝对定量核酸检验方法包括以下步骤：
步骤1：将待检测液体通过进口2进入过滤段3，通过过滤段3滤掉大尺寸的异物；
步骤2：经过步骤1过滤后的待检测液体经过稳流段4进入液滴生成段1在液滴生成通道1的通道交汇处对待检测液体生成的液滴直径进行直观的比较；
步骤3：将经过步骤2液滴生成通道1的待检测液体通过出口5流向核酸扩增装置，
步骤4：经过核酸扩增器的待检测液体进入荧光检测芯片，由成像设备获得荧光图像，对图像进行处理，得到该图像是否有荧光流涕的检测结果，检测结果由通过训练后的机器学习算法进行阴阳性结果判读；
步骤5：荧光检测后的废液通过排泄管排出。
进一步的，所述步骤4的机器学习具体为，以有限的手动注释来训练分类器并且自动分割剩余的数据，自定义适用液滴的图像特征和分类器；将表现出荧光的液滴当作前景，其余部分包括未发出荧光的液滴、液滴之间的连续相油、PDMS 通道材料当作背景，通过训练分类器，对图像中的像素点进行判断，预测像素点属于荧光液滴的概率。
本发明的有益效果是：
1、本发明可实现液滴的绝对定量检测；通过对荧光液滴个数的识别，得到病毒核酸的准确浓度。
2、相比于PCR仪通过仪器的升降温变化达到扩增温度要求，本发明利用液体在多个温度区域流动来满足温度需求，可省去升降温过程缩短扩增时间。
3、本发明使用机器学习或其它算法在单一图像上可同时对几百个液滴进行高通量处理和识别，能够有效提高检测速度，减少检测段实验所需的时间。
4、本发明结合微流控技术，达到设备小型化、便携化，同时具有较高生物安全性。
附图说明
图1本发明的液滴生成芯片通道示意图，其中(a)米字形通道示意图，(b) 十字形通道示意图，(c)T字形通道示意图，(d)过滤段示意图，(e)稳流 段示意图，(f)米字形通道局部放大示意图，(g)十字形通道局部放大示意图, (h)T字形通道局部放大示意图。
图2本发明的液滴生成通道芯片成品示意图。
图3本发明的圆柱加热器结构示意图，其中(a)铜块截面示意图，(b)铜块三维示意图。
图4本发明的圆柱形加热器实物示意图。
图5本发明的检测芯片通道示意图。
图6本发明的检测芯片内液滴排布示意图。
图7本发明的分类器处理紧密荧光液滴结果示意图。
图8本发明的实施例流程示意图。
图9本发明平面形加热器示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以常见非恒温扩增PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应过程为例，一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其中检测过程由成像设备或光电转换设备拍摄获得荧光液滴图像，并对其进行图像处理，其方法由机器学习或其它算法辅助实现，所述微滴数字核酸检测装置包括液滴生成芯片、核酸扩增装置和荧光检测芯片；所述液滴生成芯片通过核酸扩增装置和荧光检测芯片相连接，所述微滴数字核酸检测装置在不低于大气压的压力下使用；
针对常见的PCR扩增过程，以圆柱形加热装置为例，图8为其一流程示意图。其中图像处理方法由机器学习或其它算法辅助实施。
所述液滴生成芯片包括米字形、十字形或T形液滴生成通道1、进口2、过滤段3、稳流段4及出口5，每个所述进口2均连通一个过滤段3，每个所述过滤段3均连通一个稳流段4，多个所述稳流段4均连通一个米字形、十字形或T 形液滴生成通道1的一端，所述米字形、十字形或T形液滴生成通道1连通出口5。
由于核酸检测过程容易发生交叉污染，而微流控芯片体积小且实验全程处于密闭状态，可以有效地解决检测的可靠性、假阳性等问题，芯片仅有几平方厘米，易于携带，这种微型化也使得检测更加方便。
本发明利用微流控技术，设计制作出集成样本处理和检测的微流控芯片，并结合机器学习技术对检测图像进行处理得到绝对定量的检测结果，为体外定量检测特别是核酸即时现场检测提供新的解决方案。
进一步的，多个所述过滤段(3)包括多组过滤柱，每个所述过滤段3包括多组过滤柱3-1，每组过滤柱3-1为多个过滤柱交错设置。
过滤结构由约50μm直径的圆形柱子错位排列而成，如图1(d)所示。由于反应体系的复杂性和在芯片通道制作过程及打孔过程中可能产生的微小组织，为防止其在通道细小结构处形成堆积和阻塞，影响通道内部流体的流动状态，造成两侧对称通道液体分配不均、流动状态不同等情况，在每一通道进口处均设计过滤结构。综合考虑PDMS的加工精度以及在本实验中分散相需要包裹病毒和蛋白质等一些微米结构颗粒，合理设置入口通道中的微圆柱距离，以阻隔较大尺寸的异物，提高芯片的耐用性。
进一步的，所述稳流段4为重复的曲折管道。如图1(e)所示。微芯片及其实验装置常常具有机械结构的不稳定性：当微量注射泵发生振动、流体密度不均匀时，会导致流量振荡；同时，PDMS材料具有较大的弹性，因而在高流体压力条件下会产生变形，最终造成流体流速的波动。为减少微通道中流体的振荡程度，芯片中需要增加流体阻力结构，该结构在连续相和分散相微通道中均有设计。
进一步的，所述进口2包括分散相进口和连续相进口，所述米字形液滴生成通道1包括分散相进口和连续相进口，所述米字形液滴生成通道1的连续相位于分散相外侧，连续相流体从两侧对称给分散相流体施加剪切力；
所述十字形液滴生成通道1包括分散相进口和连续相进口，所述十字形液滴生成通道1的连续相流体分为两路流动，同样从两端对称挤压分散相；
所述T形液滴生成通道1包括分散相进口和连续相进口，所述T形液滴生成通道1的连续相流体从单侧挤压分散相；
进一步的，图1(f)、(g)、(h)为两相流体交汇即生成液滴处的通道细节图，四个进口均为渐缩形，并配有缓冲区，出口为渐扩形。所述米字形、十字形或T形液滴生成通道1的通道交汇处设置有20μm～60μm标度尺，方便直观比较生成液滴的直径。
进一步的，所述核酸扩增装置包括圆柱形核酸扩增装置和平面形核酸扩增装置；所述圆柱形核酸扩增装置包括导热块Ⅰ11和导热块Ⅱ12以及其上所缠绕的管路，所述导热块Ⅰ11上设置加热孔Ⅰ13，所述加热孔Ⅰ13的辐射范围内设置多个温控孔Ⅰ14，所述导热块Ⅱ12的一端设置加热孔Ⅱ15，所述加热孔Ⅱ15的辐射范围内设置温控孔Ⅱ16，所述导热块Ⅰ11和导热块Ⅱ12之间通过绝热材料相连接，所述导热块Ⅰ11、导热块Ⅱ12与绝热材料形成类似圆柱形的结构。
将导热块Ⅰ11分成几个区域，每个区域对应PCR变性、退火、延伸的温度，以液流速度和路程来控制加热时间，将液体通过包裹在圆柱体表面的微通道实现扩增。
圆柱形加热器四周缠绕毛细管，为使加热更均匀，圆柱选用导热系数最高的紫铜材料，铜块设计加热孔和温控孔。中间通孔为加热孔，放置加热棒；靠近边缘的通孔为温控孔，部分放置热电偶另一部分用于风冷或水冷，其测量值可表示铜块表面温度并用于温度反馈。铜块厚度和弧长根据流量和试剂使用要求时间设计。中间使用3D打印的绝热材料模型做支撑将两部分铜块合并呈完整的圆形，可以避免尖锐的弯角使毛细管出现明显的折痕，且3D打印支架略短于铜块长度以预留出单独加热区域。
进一步的，所述核酸扩增装置各部分，均保持温度恒定，通过控制器实现不同温度模块较小的温度波动。
进一步的，所述核酸扩增装置两导热块大小不同，小尺寸的为高温加热，大尺寸的为低温加热，分别需要根据所使用的核酸检测试剂扩增标准进行设计。两导热块需要配备相应的加热和温度控制设备，部分情况下需要通过通风、加水等方法控制其达到扩增的目标温度。
进一步的，所述平面形核酸扩增装置包括导热板25以及其上所刻蚀的微通道28，对导热板25上不同位置加热，并通过温控使不同区域温度不同。
进一步的，将导热块Ⅰ11和导热块Ⅱ12或导热板25分成几个区域，每个区域对应核酸扩增过程的不同温度需求，以液流速度和路程来控制液滴内反应试剂的加热时间，从而在加热的微小管道内实现扩增。
进一步的，所述荧光检测芯片满足高通量检测，所述荧光检测芯片包括进口 21、出口22和支路23，所述进口21和出口22通过支路23相连接，所述支路 23上为笔直通路或在笔直通路上可以设置蛇形弯曲段，所述支路23允许多个液滴并排流动。
进一步的，所述荧光检测芯片为透光结构的微通道，能被特定波长激光透射。
该部分检测通道的目标是使液滴紧密排列，在这种情况下，液滴之间的相对位置更加固定，可在同一张图片中容纳更多的液滴。如图5所示为两个检测通道光掩模的设计，直通道长度可保证进入拍摄画面的液滴已经保持相对稳定的流动状态。蛇形弯曲段处有助于帮助液滴稳定，每个直通道支路的宽度允许多个液滴并排流动。所设计通道整体尺寸较小，全长分别为15mm和19mm。如图6所示，在此通道中，液滴可以紧密稳定排布。
进一步的，在荧光检测芯片中，使用相应波长激发光照射激发扩增后试剂的荧光，检测过程由成像设备或光电转换设备拍摄获得荧光液滴的二维图像，并对其进行图像处理，其方法由机器学习或其它算法辅助实现。
一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置的检验方法，所述绝对定量核酸检验方法包括以下步骤：
步骤1：步骤1：将待检测液体通过进口2进入过滤段3，通过过滤段3滤掉大尺寸的异物，所述大尺寸为交错设置的过滤圆柱不能通过为准；
步骤2：经过步骤1过滤后的待检测液体经过稳流段4进入液滴生成段1在液滴生成通道1的通道交汇处对待检测液体生成的液滴直径进行直观的比较；
步骤3：将经过步骤2液滴生成通道1的待检测液体通过出口5流向核酸扩增装置；
步骤4：经过核酸扩增器的待检测液体进入荧光检测芯片，由成像设备获得荧光图像，对图像进行处理，得到该图像是否有荧光流涕的检测结果，检测结果由通过训练后的机器学习算法进行阴阳性结果判读；
步骤5：荧光检测后的废液通过排泄管排出。
所述步骤4的机器学习具体为，以有限的手动注释来训练分类器并且自动分割剩余的数据，选择适用液滴的图像特征和分类器；将表现出荧光的液滴当作前景，其余部分包括未发出荧光的液滴、液滴之间的连续相油、PDMS通道材料当作背景，通过训练分类器，对图像中的像素点进行判断，预测像素点属于需要识别的前景也就是荧光液滴的概率。
Claims (10)
1.一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，所述微滴数字核酸检测装置包括液滴生成芯片、核酸扩增装置和荧光检测芯片；所述液滴生成芯片通过核酸扩增装置和荧光检测芯片相连接，所述微滴数字核酸检测装置在不低于大气压的压力下使用；
所述液滴生成芯片包括米字形、十字形或T形液滴生成通道(1)、进口(2)、过滤段(3)、稳流段(4)及出口(5)，每个所述进口(2)均连通一个过滤段(3)，每个所述过滤段(3)均连通一个稳流段(4)，多个所述稳流段(4)均连通一个米字形、十字形或T形液滴生成通道(1)的一端，所述米字形、十字形或T形液滴生成通道(1)连通出口(5)。
2.根据权利要求1所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，每个所述过滤段(3)包括多组过滤柱(3-1)，每组过滤柱(3-1)为多个过滤柱交错设置。
3.根据权利要求1所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，所述米字形液滴生成通道(1)包括分散相进口和连续相进口，所述米字形液滴生成通道(1)的连续相位于分散相外侧，连续相流体从两侧对称给分散相流体施加剪切力；
所述十字形液滴生成通道(1)包括分散相进口和连续相进口，所述十字形液滴生成通道(1)的连续相流体分为两路流动，同样从两端对称挤压分散相；
所述T形液滴生成通道(1)包括分散相进口和连续相进口，所述T形液滴生成通道(1)的连续相流体从单侧挤压分散相。
4.根据权利要求1所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，所述核酸扩增装置包括圆柱形核酸扩增装置和平面形核酸扩增装置；所述圆柱形核酸扩增装置包括导热块Ⅰ(11)和导热块Ⅱ(12)以及其上所缠绕的管路，所述导热块Ⅰ(11)上设置加热孔Ⅰ(13)，所述加热孔Ⅰ(13)的辐射范围内设置多个温控孔Ⅰ(14)，所述导热块Ⅱ(12)的一端设置加热孔Ⅱ(15)，所述加热孔Ⅱ(15)的辐射范围内设置温控孔Ⅱ(16)，所述导热块Ⅰ(11)和导热块Ⅱ(12)之间通过绝热材料相连接，所述导热块Ⅰ(11)、导热块Ⅱ(12)与绝热材料形成类似圆柱结构。
5.根据权利要求4所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，所述平面形核酸扩增装置包括导热板(25)以及其上所刻蚀的微通道(28)，对导热板(25)上不同位置加热，并通过温控使不同区域温度不同。
6.根据权利要求4或5所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，将导热块Ⅰ(11)和导热块Ⅱ(12)或导热板(25)分成几个区域，每个区域对应核酸扩增过程的不同温度需求，以液流速度和路程来控制液滴内反应试剂的加热时间，从而在加热的微小管道内实现扩增。
7.根据权利要求1所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，所述荧光检测芯片包括进口(21)、出口(22)和支路(23)，所述进口(21)和出口(22)通过支路(23)相连接，所述支路(23)上为笔直通路或在笔直通路上设置蛇形弯曲段，所述支路(23)允许多个液滴并排流动。
8.根据权利要求1所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置，其特征在于，所述荧光检测芯片为透光结构的微通道，能被特定波长激光透射。
9.根据权利要求1-7任一所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置的检验方法，其特征在于，所述绝对定量核酸检验方法包括以下步骤：
步骤1：将待检测液体通过进口(2)进入过滤段(3)，通过过滤段(3)滤掉大尺寸的异物；
步骤2：经过步骤1过滤后的待检测液体经过稳流段(4)进入液滴生成段(1)在液滴生成通道(1)的通道交汇处将待检测液体制备成液滴；
步骤3：将经过步骤2液滴生成通道(1)的待检测液体通过出口(5)流向核酸扩增装置，
步骤4：经过核酸扩增器的待检测液体进入荧光检测芯片，由成像设备获得荧光图像，对图像进行处理，得到该图像是否有荧光流涕的检测结果，检测结果由通过训练后的机器学习算法进行阴阳性结果判读；
步骤5：荧光检测后的废液通过排泄管排出。
10.根据权利要求8所述一种机器学习辅助的微滴数字核酸检测装置的检验方法，其特征在于，所述步骤4的机器学习具体为，以有限的手动注释来训练分类器并且自动分割剩余的数据，选择适用液滴的图像特征和分类器；将表现出荧光的液滴当作前景，其余部分包括未发出荧光的液滴、液滴之间的连续相油、PDMS通道材料当作背景，通过训练分类器，对图像中的像素点进行判断，预测像素点属于荧光液滴的概率。
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