CN101589157A - 用于连续快速热循环系统的方法 - Google Patents

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Abstract

用于高分子量有机物质诸如DNA的有效、高速、大规模合成法，所述方法需要多个温度环境。在聚合酶链式反应操作中，在存在足量表面吸附聚合物的条件下，将基本上均质的反应物液体通过管道输送通过最少两个温度带，所述足量表面吸附聚合物条件化管道并保护催化酶以提高产量和效率，并将进一步使用所需再生系统的间歇期降到最低。特别地，使用氧化乙烯和环氧丙烷的嵌段共聚物。

Description

用于连续快速热循环系统的方法
本申请要求享有2006年10月6日提交的、标题为“Use of PluronicF-127block copolymer surfactant，Pluronic F-68，and Pluronic F-108NF in anon-static DNA amplification solution(普朗尼克F-127嵌段聚合物表面活性剂、普朗尼克F-68和普朗尼克F-108NF在非静态DNA扩增溶液中的用途)”的美国临时专利申请号60/850,103的优先权。
简介
聚合酶链式反应(PCR)是一种三步方法，通常被设计用于诊断、鉴定或法医目的。第一步，DNA或类似分子在约94-96摄氏度(C)的温度下被变性，也被称为裂解、分离或解开。第二步，第一步中产生的链在约55-60℃的温度下与聚合酶起始子即引物反应物退火，也被称为引发或杂交。第三步，在大约70-73℃下，随着单个核苷酸碱基的添加，使上述引发的单链DNA通过引物延伸来合成复制本DNA。更新的PCR方法也可以使用两个温度带的操作。
PCR装置通常通过批量方法工作，其中将含有单独等分量的反应物的多孔板从一个温度环境物理转移到另一个温度环境以完成循环。可选择地，一组盒、微瓶、管或其他容器通过固定的一系列恒温箱。可选择地，将管置于一个模块中，该模块可以被加热和冷却以改变所述模块内的盒、微瓶、管或其他容器包含的液体反应物的温度。
更详细地来说，在世界范围内专业研究人员广泛使用PCR作为扩增小链DNA的手段，所扩增的量足以用于检测和鉴定。通常，PCR是利用自动热循环仪实施的，所述自动热循环仪交替加热和冷却众多包含PCR反应混合物的小管。这类过程利用具有不连续的受限空间的静态反应器，在该空间中当按照重复顺序暴露于不同的温度时，反应发生。所述过程是时间密集型、劳动密集型和低效的，因为必须分别给管子填装反应物，密闭，通过自动循环仪处理，打开，并最终倒出含有所需扩增DNA的反应产物。
因此，开发出连续的热循环仪，通过利用动态反应器以避免需要利用许多小管通过PCR扩增DNA。连续的热循环仪不是利用小管，而是利用恒量或连续流的流体，所述液体重复通过不同的温度带以扩增DNA。连续热循环仪的一个实例公开于1993年12月14日授权的Corbett等的美国专利号5,270,183。Corbett等人公开了用于DNA扩增的装置和方法，其中将PCR反应混合物注入载液(PCR反应混合物与其不混溶)，然后载液穿过多个温度带以促进PCR反应混合物内的DNA扩增。因此，各个反应混合物被大量载液分离。该装置的功能是加速处理不连续的槽或塞中含有的多种不同DNA链，因此需要与PCR反应混合物不混溶的载液，其可以用作分离不同的DNA链。该装置未被设计用于产生大量DNA。
此外，Corbett等的装置未被设计成容易和快速地适应不同的PCR反应要求。例如，载液穿过温度带的优选布置是将传输载液的管道缠绕在单独的圆柱(维持在不同温度)周围。因此，将该装置改造用于不同的反应条件需要将管道围绕一个或多个圆柱不同的次数，解开围绕一个或多个圆柱的管道，从而用不同的圆柱替换一个或多个圆柱，按照不同的顺序重新设置围绕圆柱的管道的路径，或另一种这样的劳动密集型过程。此外，当反应混合物槽从一个圆柱穿到下一个圆柱时效率和精细的温度控制被减弱，并且在这类“缺口”中热能被无意丢失或获得。
连续热循环仪的另一个实例公开于Curico，M.和Roeraade，J.(2003，于2002年网络公开)Continuous Segmented Flow Polymerase ChainReaction for High-Throughput Miniaturized DNA Amplification(用于高通量小型化DNA扩增的连续分段流动聚合酶链式反应)，Anal.Chem.75，1-7。该装置类似地被设计用于多种被不混溶流体分离的小样品混合物。但是，该装置使用分离的热控水浴作为温度带；而不是如Corbett等的装置利用分离的圆柱作为不同的温度带。该装置未被设计成容易改造用于提供大量不同的反应条件，因为对于这种改造必须准备和添加额外的水浴。该装置的使用还需要周期性的为水浴添水、检查和排水，以及清理水浴容器。
Hansen的于1996年4月16日出版的美国专利5,508,197教导了一种PCR装置，其具有96、192和384孔形式的多孔板及板夹台。
Hayes的于1998年12月15日出版的美国专利5,849,208描述多种反应室和多种分析室，其中使用盒来保存用于PCR和后续分析的生物材料。
Astle的于2003年10月14日出版的美国专利6,632,653教导了一种PCR装置，其用指标化步骤在连续基础上以独特的温度变化顺利指示试剂多孔板的模式。
Sudor的于2004年3月23日出版的美国专利6,709,692描述了一种利用表面处理聚合物对表面的处理，以及在这类表面上进行流体操作(包括PCR)的方法。表面包括诸如试管、多孔板、移液管和毛细管的装置的表面。
Atwood的于2006年11月7日出版的美国专利7,133,726教导了一种装置(其将样品循环通过一系列温度偏移)、盖子和控制该过程的计算机。
发明概述
进行聚合酶链式反应的方法，包括将含有聚合酶链式反应的反应物的液体运输通过聚合管道，所述聚合管道被设置为通过第一反应循环区域和至少第二反应循环区域，所述每个区域包括第一和第二，或第一、第二和第三温度带，所述第二区域中每个带的温度与所述第一区域中相应带的温度基本相同，其中所述液体是含有聚合酶链式反应的反应物和表面吸附聚合物的水溶液。
需要连续热循环仪，其被设计成能大量产生DNA链，能容易地适应不同的PCR反应要求，并且能够有效运转。
本发明提供用于能够批量产生DNA链的连续热循环系统的方法，所述热循环系统是有效的、可扩展的、容易适应不同的PCR反应要求并且相对便宜的产生。本发明的实施方案在温度控制体内具有多种温度控制扇区，从而产生多种温度带。流体优选的通过路径流过装置或沿着装置流动，从而流过不同的温度带或沿着不同的温度带流动。
本发明的优选实施方案特别地适合于快速、容易和大量地扩增DNA片段。因此利用本发明可以有效使大量产生DNA的速率大大高于常规的DNA产生率。本发明的低制造成本和增强的可扩展性允许大量DNA的相对廉价的连续扩增。特别地，本发明的优选实施方案包括具有12个饼状或楔形扇区的单个圆柱状温度控制体，每个扇区具有用于获得所需温度的装置，并且每个扇区与其他扇区通过热障分隔。具沟通道沿着所述温度控制体的外表面环绕或盘旋，并且置于所述通道内或所述通道上的一段的管道将DNA扩增反应物循环地从一个扇区输送到后续扇区。因此反应物以循环方式暴露于不同的温度带，最终引起DNA的扩增。用于移动反应物的装置确定反应物通过一段管道的流速，从而基于特定反应物的特性优化经由PCR的扩增。可以将任意数目的扇区并入温度控制体，这只需简单的将其分成增加的扇区或减少所述扇区的数目。此外，通过添加分层扇区和/或利用具有非圆柱形(诸如具有椭圆形横截面)的温度控制体，可以在温度控制体中并入进一步的适应性。
附图简述
参照附图描述本发明。在附图中，类似的附图标号表示相同或功能类似的元件。
图1是本发明热循环系统的一个实施方案的正视图。
图2是图1的热循环系统的平面图。
图3A是本发明热循环系统的可选择实施方案的正视图。
图3B是图3A的热循环系统的外表面一部分的展开图。
图3C是图3A的热循环系统的通道一部分的展开图。
图4是图1的热循环系统的正视图，显示绝缘层基本上环绕温度控制体。
图5是图1的热循环系统的俯视图。
图6是图1的热循环系统的温度控制体的透视图，显示绝缘层的一部分。
图7是图1的热循环系统的温度控制体的俯视图。
图8是图1的热循环系统的温度控制体的底视图。
图9是本发明热循环系统的可选择实施方案的正视图。
图10是图9的热循环系统的俯视图。
图11是图9的热循环系统的底视图。
图12是图9的热循环系统的顶盖的平面图。
图13是图9的热循环系统的底盖的平面图。
图14是电泳凝胶照片，显示与常规系统的效率进行比较的本发明热循环系统的一个实施方案的效率。
图15是冷却组件的分解透视图。
图16是冷却组件的近摄透视图(closed perspective view)。
图17是与热循环仪连接的冷却组件的透视图。
发明详述
用于本发明的聚合管特别地包括合成的树脂含氟聚合物管，诸如柔性聚四氟乙烯(PTFE)或TEFLON牌管。对于圆横截面来说，合适的大小可以是外径为约1/8英寸，以便适合通道104，如果该通道宽大约1/8英寸。管道壁可以是约5/1000英寸，内径为约1/32英寸或更大。对于任选的热传导，内径应当低于约1/8英寸。管道的横截面还可以是椭圆、正方形或矩形的。供应商包括Orangeburg，SC的Zeus Industrial Products和FallRiver MA的Oxidation Systems Inc。
用于本发明的表面吸附聚合物包括美国专利6,709,692中描述的那些，特别地，氧化乙烯和环氧丙烷的嵌段共聚物，诸如Florham Park，NJ的BASF用PLURONIC(普朗尼克)商标提供的那些。实例包括
Figure A20078004528100081
F108、F108NF、F68和F127。
表面吸附聚合物(诸如聚环氧乙烷/聚环氧丙烯嵌段共聚物)的量可以在约1.5毫克每毫升到100毫克每毫升的范围。普遍认为相对于未经处理的管道，所述聚合物使管道表面对反应物更加惰性，并且防止Taq酶失活。该结论基于以下观察，在无表面吸附聚合物的情况下PCR试剂流过20英寸或更厚的PFTE管道后扩增被有效抑制。但是，当从该管道收集PCR试剂时，通过向试剂回添新的Taq聚合酶，所述试剂可以被再活化用于常规模块热循环仪中的DNA扩增。这表明因为接触管道而损失或失活的单一关键组分是Taq DNA聚合酶。当混合物中包含表面吸附聚合物时，DNA扩增进行的水平与传统模块热循环仪相同或比其更高。此外，通过用含有约1.5-3.5％(w/v)的表面嵌段聚合物(诸如普朗尼克F108)的水溶液预冲洗管道，可以使用不含表面嵌段聚合物作为试剂的扩增混合物进行成功扩增，这样的话最后对纯化的要求更低，但是这不如包含所述聚合物作为PCR试剂之一时那么有效。本发明的另一部分是进行聚合酶链式反应的方法，其包括以下步骤：(a)将含有表面吸附聚合物的水溶液输送通过聚合管道，继之以；(b)在足以引起所述聚合酶链式反应的温度将含有聚合酶链反应物的第二水溶液运输通过所述管道。在所述装置从产生一种特定DNA转换为产生另一种之前，通常用10％漂白剂清洗再用去离子水充分洗涤来清洁本发明方法中使用的管道。在所述装置用于进一步的DNA合成之前，可以用表面吸附聚合物(诸如普朗尼克)洗涤来预处理清洁的管道，本发明的一个优点是在反应合成操作期间对管道的连续处理和条件化，从而减少了关闭模式下耗费的时间。因此，添加的聚合物的量是足以维持管道条件化并防止DNA合成期间反应酶诸如Taq失活的量。这可以通过观察添加到反应物溶液中的聚合物的量(使溶液稍微浑浊)来确定。认为这是在Taq周围产生微胶粒(即聚合物的外层)的点。这与使用油类和油/水乳液反应物系统完全不同。
当根据本发明实施时，用于PCR三个步骤的温度分别为大约95℃、57℃和72℃。但是，为了增加反应的特异性和产量，温度可以变化。
本发明涉及用于在单个物理结构内同时维持多个温度区域的方法和组成。因此本发明特别地适合于在物质的自动热循环中使用，诸如用于核酸序列的扩增。参照附图，特别地参照图1-13，本发明的热循环系统100优选的包括具有至少两个扇区118和路径104的温度控制体102，所述路径104循环地从一个起始扇区118依次通到每个后续的扇区118，然后返回所述的起始扇区118，并按照需要的次数循环重复从一个扇区118通到下一个扇区118。路径104跨过扇区118，其沿着温度控制体102的外表面132从一个扇区118通到各后续扇区118，通过内部地钻过扇区118从一个扇区118到各后续的扇区118，或通过这类外部或内部行进的组合。
每个扇区118都包含至少一个改变或获得温度的装置120。所述变温装置120能够实现并维持特定的所需温度。因此变温装置120优选的是加热器，冷却器，Peltier装置，热泵，恒温箱，火室，热反应室，或类似装置。每个扇区118优选的基本上由铝、铝合金、金属、金属合金、热导体、不对称热导体或其组合制成。变温装置120从而加热、冷却或维持扇区118的温度，以致位于每一扇区118内或扇区118上的路径104部分被类似地加热、冷却或维持在该扇区118的特定温度。
各个扇区118还优选的与其他扇区118被位于所述扇区118之间的热障122分隔。热障122可以是被动的，可以包括热绝缘体、空气、气体、液体、固体和/或其组合。可选择地或此外，热障122可以是主动装置或物质(诸如Peltier装置)，其能够维持明显的温度差异。因此每个扇区118作为独立的温度槽，其中该扇区118的变温装置120实现并维持整个扇区118的所需温度，而热障122将每个扇区118与其他扇区118热分离。从而有效地在单体内实现并维持多个温度区域。绝缘层124可以任选的基本上环绕温度控制体102，从而将扇区118和周围环境之间的热转移降到最低。
温度控制体102可以具有任何需要的形状，诸如圆柱形，圆锥形，三角形，矩形，金字塔形，多角形，块形或立方形。扇区118可以具有任何符合温度控制体102的剖面、部分或小块的所需形状。例如，扇区118可以是楔形、弧形或扇形，或具有圆柱形、圆锥形、三角形、矩形、金字塔形、多角形、块形或立方形的扇形部分的形状。扇区118也可以是分层的，一个在另一个的顶上。所需扇区118可以以任意数目存在。所有扇区118可以是相同大小，或一个或多个扇区118可以是不同大小。
热循环系统100还优选的包括多个温度传感器130。每个扇区118优选的具有一个或多个温度传感器130，其位于该扇区118内或附近，以测量该扇区118或扇区118的一部分的温度。每个温度传感器130产生温度输出值，其直接或间接代表该扇区118的温度。这类温度传感器130可以是任意测定温度的常规装置。可以任选的将这类温度传感器130置于绝缘层124内或绝缘层124上。
热循环系统100还优选的包括调温装置134。调温装置134调节各个变温装置120，以致在各个扇区118内实现所需温度。可以使用任意数目的调温装置134来调节变温装置120。调温装置134优选的包括恒温器。在一个实施方案中，执行软件程序的计算机系统与变温装置120和温度传感器130联通，其中所述软件使用为每个扇区118预设的目标温度来控制和调节变温装置120。所述目标温度由预期应用和使用的热循环系统100确定，在一个优选的实施方案中该系统是PCR。所述软件接收来自温度传感器130的温度值输出。每个所述温度值直接或间接代表扇区118的温度。所述软件将各扇区118的温度值输出与该扇区118预设的目标温度进行比较。然后，如果从温度传感器130接收的温度输出值超过或低于最小预定值，所述软件将启动该扇区118的一个或多个变温装置120以增加或减少该扇区118或该扇区118适当部分的热量。也就是说，根据温度传感器130的值和位置，该系统可以启动扇区118中变温装置的全部或一部分。可选的，可以使用调温装置134，诸如任何常规恒温系统。
热循环系统100还优选的包括使流体128沿着路径104移动的装置106。因此流体128循环地从一个扇区118流到另一个扇区118，并且流体128的温度与其穿过或于其上流动的扇区118的温度平衡。因此当流体128沿着路径104流动时，其温度循环变化。流体128优选的包括任何热依赖性反应混合物、反应物或试剂。流体移动装置106优选的包括泵，诸如蠕动泵、压缩气体系统或类似装置。例如，可以使用加压氦气系统沿着路径104推动流体128。
用于移动反应混合物通过所述系统的泵包括以下类型的泵：蠕动泵、腔式泵、离心泵、活塞泵、罗茨增压泵、旋转叶片泵、隔膜泵、注射泵和齿轮泵。注射泵由Holliston，Massachusetts的KD Scientific提供，其通常被设置提供从供应管通过管道而进入反应区的脉动性连续液流，其不接触推动液体运动的注射器，该注射器只接触作为液压流体的水。例如，2个注射器可以是180异相，以致当一个充满水时，另一个倾空其水以推动反应物液体进入并通过DNA合成装置。可以接触反应物液体的可选择泵是旋转活塞泵，其使用对反应物没有影响的陶瓷活塞和圆柱。实例包括由North Springfield，Vermont的IVEK Corporation供应的那些。
在热循环系统100的特定实施方案中，温度控制体102是单个基本上为圆柱的体，其具有多个基本上扇形或楔形的扇区118。路径104包括在温度控制体102的外表面132周围环绕或盘旋的具沟通道。在该具沟通道内或沿着该具沟通道放置一段管道126。根据特定热依赖性反应的特性和要求确定各扇区118的所需温度。调温装置134和变温装置120被激发，以致达到各扇区118的所需温度。
温度传感器130测量各扇区118的实际温度，酌情激发或关闭各变温装置120以达到并维持各扇区118的所需温度。流体移动装置106移动或推动流体128通过一段管道126。因此流体128在循环基础上经历一系列不同的温度区域，最终导致流体128向一个或多个产物的转化或反应。任选的温度控制体102可以附着于支持基质上。用于转动温度控制体102的装置也可以任选的用于便于将一段管道126置于具沟通道内或沿着具沟通道放置。这类转动装置可以包括具有轮子和齿轮部件的电动机或类似替代性装置。
热循环系统100特别地适合于通过PCR的DNA大规模扩增。因此，热循环系统100的特定实施方案含有具沟通道路径104，其环绕单个圆柱状温度控制体102的外表面132。因此，该通道具有邻近温度控制体102的顶部边缘110的第一末端114和邻近温度控制体102的底部边缘112的第二末端116。沟的深度是任意的，并且可以取决于一段管道126(可以置于沟内或沿着沟放置)的直径和/或可以取决于热循环系统的特定应用。圆柱状温度控制体具有12个相同大小的弧形扇区118，每个扇区118都具有一个变温装置120。每个扇区118都具有一个温度传感器130(具体来说是K型热电偶)，内置于扇区118中。流体移动装置106(优选的是加压氦气系统)使流体128流过一段管道126。流体128优选的包括待扩增的DNA链，两条引物和热稳定的Taq聚合酶。此外，流体128中还包含有利于通过PCR扩增DNA的物质。优选的单个调温装置134调节每个变温装置120。流体移动装置106使流体128从扇区118移到扇区118，以致通过PCR的DNA扩增被优化。
在热循环系统100的一个实施方案中，圆柱状温度控制体102被分成3个相等的扇形扇区118，围绕该圆柱的通道有约30到约40个“圈(turns)”，特定数目为约33个圈。通道的每个“圈”是流体128围绕圆柱的外表面132圆周流动的一个“循环”。此外，该通道内的管道126(诸如PTFE管道或TEFLON管道或合成树脂含氟聚合物管道)被3个绝缘层124(每个扇区118一个)围绕，其中每个绝缘层124具有8个温度传感器130。蠕动泵106被置于距离管道126延伸离开圆柱的底112的点约6到约7英寸处。利用装置的这种布置，使用本装置的优选方法以45秒每部分118(温度带)的速率推动流体128通过管道126，导致约135秒每循环的流速(管道126围绕圆柱1“圈”)。
扇区/温度带118施加在试剂上的温度和循环次数优选的符合公知的和现有的PCR方法。用于连续热循环系统的本装置和方法的优选用途是扩增DNA，但本发明的该用途只是为了方便的目的。在需要连续加热或冷却流体128通过多个温度带的不同应用中使用本发明的装置和方法，这对于相关领域的普通技术人员来说是显而易见的。
可以在将流体128引入一段管道126之前，大批量混合或产生流体128，或在即将将其引入一段管道126前，及时或快速地产生流体128。流体128优选的是基本上均质的温度依赖性反应混合物，并且优选的存在通过一段管道126的连续供应这类流体128。可以使用控制流体128引入的装置，诸如计算机系统和软件程序。所述软件程序优选的使用用于确定正确混合(通过比例)、相继次序和向一段管道126内输入流体128和/或流体组分的时间的预定实验步骤。在一个实施方案中，根据特定的PCR要求确定引入流体128组分的实验步骤。可以使用引入流体128的任意装置，诸如本领域技术人员已知的泵阀管线或网络。
通过常规方法收集从管道末端获得的流体128输出物。在一个优选实施方案中，所获流体包含扩增的DNA。此外，显而易见本发明的装置和方法将提供扩增DNA的连续供应，只要泵按照本文所述通过所述装置补充流体组分。然后可以从反应混合物中分离DNA，诸如去除表面吸附聚合物，诸如其中的嵌段共聚物。
本发明的方法用于促进需要周期性温度变化的化学反应，因此包括激发热循环系统100上的变温装置120，所述热循环系统100具有输送流体的装置诸如沿着路径104延伸的一段管道126，将基本上同质的温度依赖性反应混合物引入输送装置，激发移动装置106，以致反应混合物穿过输送装置并且反应混合物发生反应形成产物，以及在输送装置的末端收集产物。所述化学反应优选的是聚合酶链式反应。该方法任选的还包括在输送装置的一个末端连续补充流体。
用于连续调节流体温度的装置，包括：含有至少两个扇区、外表面、顶部边缘、底部边缘、每个所述扇区内的至少一个温度控制装置和所述外表面中的通道的圆柱，其中所述通道具有第一末端和第二末端，并且其中所述通道围绕所述外表面盘旋；一部分管道具有第一末端、第二末端和一段长度，所述管道置于所述通道内，其中所述管道的所述第一末端自所述通道的所述第一末端延伸，并且所述管道的所述第二末端自所述通道的所述第二末端延伸；用于将流体分配入所述管道的所述第二末端的装置；与所述管道联通的移动装置，其中所述移动装置使所述流体通过所述管道从所述管道的所述第二末端移动到所述管道的所述第一末端；当所述流体流过所述管道穿过所述圆柱的每个所述扇区时，测定所述管道温度的装置；和用于调节所述一个或多个温度控制装置的装置，其中所述调节装置与所述测定装置联通。
在该装置中，所述通道的所述第一末端在邻近所述圆柱的所述顶部边缘终止，所述通道的所述第二末端在邻近所述圆柱的所述底部边缘终止。
用于促进需要周期性温度变化的化学反应的方法，所述方法包括以下步骤：(a)激发热循环系统上的变温装置，其中所述热循环系统包括：包括至少两个扇区、外表面和循环地穿过所述扇区的路径的温度控制体，其中每个所述扇区包括至少一个所述变温装置；输送流体的装置，其中所述输送装置沿着所述路径延伸；以及与所述输送装置联通的移动装置，其中所述移动装置适宜使所述流体移动通过所述输送装置；(b)将基本上均质的温度依赖性反应混合物引入所述输送装置；(c)激发所述移动装置，以致所述反应混合物穿过所述输送装置，并且以致所述反应混合物反应形成产物；和(d)在所述输送装置的第一末端收集所述产物。
图15、图16和图17显示可以用于本发明的液体冷却组件。所述冷却组件是连续PCR热循环仪的附加装置，其增加热负荷，可以被置于热循环仪的热反应圆柱上，从而增加其中所含流体的流速或者体积以更快的产生特定DNA结构。通过对该装置实施方案进行的实验，已经观察到多至60℃的降温。这使热循环仪的流体体积增加4倍，等于产生速度增加4倍。
液体冷却组件134由铝组件组成，该铝组件由两块板136和138制成，这两块板用螺钉140拧接在一起并用垫圈142密封。提供输入和输出口144和146，以便冷却液流过组件134。在操作期间，所述组件被附着到加热的圆柱温度控制体102的侧面，所述温度控制体102在其外表面围绕有螺纹，并按照环状排列被分成24个部分150。每个部分的温度可以被独立设置。组件134中每个部分具有相同的宽度和高度。管道沿着置入表面的螺纹环绕圆柱，而所述组件被附着到必须发生明显降温的部分。用于PCR的DNA试剂流过管道(该管道沿着围绕圆柱外周的螺旋路径)，当它们穿过每个部分时被加热或冷却。当所述试剂达到组件时，它们在组件134的圆柱部分和外表面进行加热。当所述试剂进入下一个部分时，它们非常接近于该部分的温度。为了从圆柱散热，所述组件具有贯穿其的盘旋通道148，所述通道148载有高流速的流体冷却剂。这些盘旋设计在冷却剂内产生涡流，从而增加组件与冷却剂间的热转移。一旦冷却剂穿过组件，其通过端口146从系统排出。可以将冷却剂收集到冷却器中进行冷却并再次穿过系统，或被永久排出。
实施例1
制备样品，其包含：12％MgCl2(25mM)，0.33％Taq DNA聚合酶(5单位/μl)，2.0％dNTPs(三磷酸脱氧腺苷(dATP)，三磷酸脱氧胞苷(dCTP)，三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)和三磷酸脱氧胸苷(dTTP))，8.0％模板(2μg/ml)，61.66％普朗尼克F108溶液(1.5％溶液)，4％正向引物，4％反向引物，8％反应缓冲液(10×浓度)。利用这些数字可以将溶液扩充至恰当的体积。圆柱状温度控制体102的12个垂直扇区118被加热到3种不同温度，4个相邻扇区118被加热到95℃，另一4个相邻扇区118被加热到59℃，和最后4个相邻扇区118被加热到72℃。内径(ID)1/32″、外径(OD)1/16″的TEFLON PTFE管道环绕温度控制体102共30次，使一段管道126和反应混合物连续经历3种不同温度共30次。然后利用20PSI的增压容器推动该反应混合物通过该管道126。在将反应混合物提供给温度控制体102后，使用矿物油推动样品通过管道126的全长。用流量阀将反应混合物的流速控制为0.25ml/分钟。当特定DNA序列循环通过所述温度带时，样品中存在的特定DNA序列(其界限由寡核苷酸引物确定)被扩增。第30个循环后，管道126退出圆柱102，收集内容物。样品在Cambrex ReliantPrecast 2％琼脂糖凝胶上进行分析并用溴化乙锭染色。
利用BIORad Geldoc EQ系统获得凝胶图像，显示于图14。各泳道的内容物如下：泳道1，空；泳道2，分子量梯度物(ladder)；泳道3，无模板阴性对照(样品A)；泳道4，空；泳道5，在热系统100的实施方案中扩增的样品(样品B)；泳道6，空；泳道7，在热循环系统100的实施方案中扩增继之以在常规Perkin Elmer 480装置中扩增的样品(样品C)；泳道8，空；泳道9，用常规Perkin Elmer 480装置运行的阳性对照样品(样品D)；泳道10，分子量梯度物；泳道11，空；和泳道12，空。
利用ImageJ 1.33u版软件分析图像，其中提取强度数据以获得积分强度及包括扣除本底的计算值，不进行其他标准化。样品A的条带强度是0.07，样品B的条带强度是3.62，样品C的条带强度是3.77，和样品D的条带强度是3.19。
这些数据表明本发明的系统和方法即使不比标准商品化系统的实例(Perkin Elmer 480装置)更有效，也与其一样有效。制备3种相同的反应混合物，一个样品以其无模板的未扩增形式被检测(样品A)，一个样品用本发明的系统运行(样品B)，一个样品先用本发明的系统运行再用常规商品化系统运行(样品C)，和一个样品用常规商品化系统运行(样品D)。凝胶上目标质量(300bp)处条带的强度是产生的DNA产物数量的指标。
样品C产生最强的条带，但是它并不比单独用本发明产生的样品强很多。因为样品C经历热循环系统100实施方案的30个循环，然后经历商品化系统的30个循环，如果离开本发明使用的装置后仍然剩余活性试剂，则可以合理预期一些额外的扩增。
样品B(利用本发明使用的装置产生的DNA)产生第二强的条带。包括样品D是为了显示从常规商品化系统Perkin Elmer系统预期的DNA的相对量。来自该商品化系统的条带(样品D)的强度要低于来自本发明的所述系统和方法的条带(样品B)。这表明本发明使用的系统和方法的效率等于或高于该商品化系统。样品A用于指示在经历扩增条件(在Perkin Elmer商品化系统中)但无模板DNA的系统中没有观察到DNA(或可忽略量的信号)，并且在反应溶液中没有污染物(其可能被误解为扩增)。该数据的重要特征是样品B条带比在常规系统中实施的相同反应更强(指示更好的反应)。
实施例2
通过将3％重量/体积的普朗尼克F127与水混合并将其添加到PCR反应混合物中构建含普朗尼克的反应混合物，得到下列浓度：
  试剂   母液浓度   最终溶液％
  MilliQ水   79.9％
普朗尼克F127溶液   向水中添加3％粉末溶解，轻微增加体积 3％
  PCR缓冲液(匹配制造商的酶)   10×   10％
  pGEM 3ZF+质粒   5毫克/毫升   0.06％
  MgCl2   150毫摩   2％
  正向引物CGATTTCGGCCTATTGGTTA   20微摩   2％
  反向引物CGGTGAAAACCTCTGACACA   20微摩   2％
  Taq DNA聚合酶   5单位微升   0.6％
  脱氧核苷酸混合物   每核苷酸10微摩   2％
  100％
在泵入所述装置前及收集后，均低温保存PCR混合物。所述装置使用30圈的PFTE管道，其内径(ID)为1/16英寸，外径(OD)为1/8英寸。将PCR混合物体积补足500ml，循环前在4摄氏度保存。该实施例中，所述装置的扇区被等分成12个扇区。前4个扇区被加热到95摄氏度，接下来4个扇区被加热到58摄氏度，最后4个扇区被加热到72摄氏度。维持泵的流速，以致流体用33秒流过4个扇区，管道每个顺序圈共用99秒，溶液第一次完全穿过管道共用2970秒。
实施例3
描述普朗尼克的浓度范围，利用如实施例2所述的相同DNA模板、寡核苷酸引物和温度/流动浓度及含普朗尼克F108的反应混合物，所述反应混合物通过将1.5％重量/体积的普朗尼克F108与水混合并将其与适量MilliQ水添加到PCR反应混合物中使终体积到100％而制备。
  试剂   母液浓度   最终溶液％
  MilliQ水   64％-0％
  普朗尼克F108   向水中添加1.5％粉末溶解   8％-72％
  PCR缓冲液(匹配制造商的酶)   10×   8％
  pGEM 3ZF+质粒   0.1毫克/毫升   8％
  MgCl2   25毫摩   12％
  正向引物CGATTTCGGCCTATTGGTTA   10微摩   4％
  反向引物CGGTGAAAACCTCTGACACA   10微摩   4％
  Taq DNA聚合酶   5单位/微升   0.33％
  脱氧核苷酸混合物   每核苷酸10微摩   2％
  100％
在泵入所述装置前及收集后，均低温保存PCR混合物。所述装置使用30圈的PFTE管道，其内径(ID)为1/16英寸，外径(OD)为1/8英寸。将PCR混合物体积补足至50ml，循环前在4摄氏度保存。该实施例中所述装置的扇区被等分成12个扇区。前4个扇区被加热到95摄氏度，接下来4个扇区被加热到58摄氏度，最后4个扇区被加热到72摄氏度。维持泵的流速，以致流体用33秒流过4个扇区，管道每个连续圈共用99秒，溶液第一次完全穿过管道共用时2970秒。
实施例4
该实施例描述使用1.5％普朗尼克溶液清洗1次装置中的管道，时间范围为30分钟到60分钟以预处理该管道，然后泵入不含普朗尼克或其他表面吸附聚合物的PCR试剂混合物。该实施例使用实施例2的反应混合物中相同的DNA模板、寡核苷酸引物和温度/流动浓度。
  试剂   母液浓度   最终溶液％
  MilliQ水   62％-0％
  PCR缓冲液(匹配制造商的酶)   10×   8％
  pGEM 3ZF+质粒   0.1毫克/毫升   8％
  MgCl2   25毫摩   12％
  正向引物CGATTTCGGCCTATTGGTTA   10微摩   4％
  反向引物CGGTGAAAACCTCTGACACA   10微摩   4％
  Taq DNA聚合酶   5单位/微升   0.33％
  脱氧核苷酸混合物   每核苷酸10微摩   2％
  100％
在泵入所述装置前及收集后，均低温保存PCR混合物。所述装置使用30圈的PFTE管道，其内径(ID)为1/32英寸，外径(OD)为1/16英寸。将PCR混合物体积补足至10ml，循环前在4摄氏度保存。该实施例中所述装置的扇区被等分成12个扇区。前4个扇区被加热到95摄氏度，接下来4个扇区被加热到58摄氏度，最后4个扇区被加热到72摄氏度。维持泵的流速，以致流体用33秒流过4个扇区，管道每个连续圈共用99秒，溶液第一次完全穿过管道共用时2970秒。
实施例5
如下构建75毫升的反应混合物。将装置预设为按以下温度和时间运行：95摄氏度30秒，56摄氏度30秒和72摄氏度45秒，共36个循环。流速为0.222813ml/分钟。在合适大小的聚丙烯容器内制备PCR反应混合物，通过颠倒(无需涡旋)进行混合。移出50微升的等分试样用作无模板对照。
  试剂   母液浓度   最终溶液％
  MilliQ水   75.3％
普朗尼克F108   2.5％粉末质量/体积，溶于MilliQ水 6％
  PCR缓冲液(Nature Technologies)   10×   10％
  pGEM 3ZF+质粒pGEM 3ZF+DNA插入物范围从0到1200bp的质粒   100ng/毫升   0.06％
  MgCl2   25微摩   2％
  正向引物5’AAAGGGAATAAGGGCGACAC3’   10微摩   2％
  反向引物5’CCTGATGCGGTATTTTCTCC3’   10微摩   2％
  Nature Technologies的Taq DNA聚合酶   5单位/微升   0.7％
  脱氧核苷酸混合物   每核苷酸10微摩   2％
  100％
在泵入所述装置前及收集后，均低温保存PCR混合物。所述装置使用36圈的PFTE管道，其内径(ID)为1/16英寸，外径(OD)为1/8英寸。将PCR混合物体积补足至250ml，循环前在4摄氏度保存。该实施例中所述装置的扇区被等分成24个扇区。前6个扇区被加热到95摄氏度，接下来6个扇区被加热到56摄氏度，最后10个扇区被加热到72摄氏度。维持泵的流速，以致流体用105秒流过管道的每个连续圈，溶液第一次完全穿过管道共用时3780秒。冷却扇区被用于装置的被设为56摄氏度的第一个6个扇区。自来水流过冷却扇区以便散热并且更快的将溶液从95摄氏度降到56摄氏度。在多次使用之间，该装置的管道用10％漂白剂或商品化PCR清洁剂诸如Bleachrite清洗，并在多次使用之间用MilliQ水清洗。通过膜滤法和乙醇沉淀，从样品中去除核苷酸和引物后，该实验中475个碱基对DNA扩增子的产量是1263微克。

Claims (9)

1.进行聚合酶链式反应的方法，包括将液体运输通过聚合管道，所述聚合管道被设置为通过第一反应循环区域和至少第二反应循环区域，所述区域中的每个均包含至少第一和第二温度带，所述至少第二区域中每个带的温度与所述第一区域中相应的第一和第二带的温度基本相同，其中所述液体是含有聚合酶链式反应的反应物和表面吸附聚合物的水溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括输送所述液体通过约10到40个反应循环区域，所述区域中的每个均包含至少第一和第二温度带，所述区域中每个带的温度与所述第一区域中对应带的温度基本相同。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合管道是柔性聚四氟乙烯管道。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述表面吸附聚合物是氧化乙烯和环氧丙烷的嵌段共聚物。
5.如权利要求1所述的方法，其中输送所述液体进入、通过并流出所述聚合管道，所述聚合管道中没有物理屏障。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述液体是均质水溶液。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述区域中的每个均包含第一、第二和第三温度带。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一温度带的温度为约94-96℃，所述第二温度带的温度为约55-60℃，和所述第三温度带的温度为约70-73℃。
9.进行聚合酶链式反应的方法，其包括以下步骤：
a)将含有表面吸附聚合物的水溶液输送通过聚合管道，继之以；
b)在足以引起所述聚合酶链式反应的温度下，将含有聚合酶链式反应物的第二水溶液运输通过所述管道。
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