CN108004135A - 基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，该装置包括：一用于控制液滴的产生的Inkjet进样系统，其中，液滴中包裹着不同稀释浓度的模板DNA；一用于对液滴进行单个反应单元内DNA扩增反应的毛细管连续流动式PCR扩增系统；一用于对扩增后的液滴进行荧光信号的检测和计数的激光诱导荧光检测系统；一用于控制液滴间的间距和液滴运输的液滴传送系统。本发明方法与现有的技术相比，具有如下技术效果：全自动化，成本低，易操作，连续在线无污染，干扰因素少，试剂用量少，可以节约大量的时间和物力，利于多种群体使用。
Description
技术领域
本发明是关于一种在线DNA扩增技术及液滴生成测定的实验装置，特别是一种基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，涉及化学生物技术领域。
背景技术
疾病的发生一般都要经历从分子变异、到细胞病变、再到组织坏死的过程，如果能够早期在分子或细胞水平上发现已经发生的病变，则大多数情况下都可以找到救治方法，使患者康复或者延长其生存期。在分子水平上，特别是在癌症早期诊断中，突变的基因在体内的丰度非常低，现有检测方法的检测能力有限。目前人们所拥有的诊断手段，大多只能在组织发生器质性变化或者症状已经十分明显后才能做出准确的判断，因而严重影响其治疗效果，导致死亡率居高不下，可见实现分子水平早期诊断的重要性。
目前常规的分子诊断手段在进行生物研究和实际检测时，是将靶核酸直接扩增实现信号放大，主要包括聚合酶链式扩增反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、多重置换反应(Multiple displacement amplification,MDA)、环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)等。虽然这些技术已广泛应用于生命科学研究及相关领域，并且在应用的过程中不断得到改进，但是目前仍然存在着操作繁琐，试剂消耗量大，扩增结果不稳定无法实现核酸精确定量。数字PCR是PCR技术的新前沿，可以进行单细胞甚至单分子研究，其采用的策略概括起来就是“分而治之”，将一个标准PCR反应试剂分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现单分子模板PCR扩增。扩增结束后，通过直接计数而实现绝对定量。不过，采用小试管或微孔板实现传统数字PCR技术的操作工作量很大，肉眼判断存在人为因素，难以做到绝对计数测量，而且加样环节多，易发生杂质污染。现阶段微流控芯片技术为数字PCR提供了更为简易的分配技术(产生液滴方法)。微流控芯片液滴数字PCR技术是将两种不相容的液体，以其中的一种作为连续相(油相)，另一种作为分散相(水相)，在水/油两相表面张力和剪切力共同作用下分散相以微小体积单元的形式分散于连续相中，形成液滴，常用作微反应器。但是必须注意的是，通常情况下制作微流控芯片成本相对昂贵且需要较为复杂的工艺和娴熟的技巧。而且在液滴产生过程中，不同大小体积的液滴需要通过外加注射泵控制，PCR反应结束后需将收集取出转移至相关仪器进行每个液滴的荧光信号检测，然后进行统计分析。这样的过程繁琐，而且容易发生污染。因此，现有技术中迫切需要一种成本较低且便于操作的用于产生液滴和连接PCR扩增技术的液滴数字PCR装置。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种制作简单、操作容易且成本低廉的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，该装置包括：
一用于控制液滴的产生的Inkjet进样系统，其中，产生液滴中包裹着不同稀释浓度的模板DNA；
一用于对液滴进行单个反应单元内DNA扩增反应的毛细管连续流动式PCR扩增系统；
一用于对扩增后的液滴进行荧光信号的检测和计数的激光诱导荧光检测系统；
一用于控制液滴间的间距和液滴运输的液滴传送系统。
进一步地，所述Inkjet进样系统包括Inkjet装置、储液池和X-Y-Z移动平台，所述Inkjet装置用于产生不同大小的液滴，所述储液池装有用于作为连续相的油，所述Inkjet装置浸入所述储液池的油中，所述X-Y-Z移动平台顶部固定设置所述Inkjet装置和储液池。
进一步地，所述毛细管连续流动式PCR扩增系统包括毛细管和PCR加热模块，所述毛细管多圈周向缠绕在所述PCR加热模块外侧，所述毛细管的一端进口连接所述Inkjet装置的喷嘴，所述毛细管的另一端出口连接所述液滴传送系统，所述激光诱导荧光检测系统固定设置在所述毛细管的出口段。
进一步地，所述毛细管进口段的长度为20cm，所述毛细管出口段的长度为50cm。
进一步地，所述PCR加热模块包括三个弧形薄膜加热器、圆柱塑料芯体、三个恒温控制器、三个温度传感器和交流电供给装置；三个所述弧形薄膜加热器周向间隔固定设置在所述圆柱塑料芯体外侧构成三个恒温区，每一所述弧形薄膜加热器均包括两层薄铜片、一层塑料绝缘片和一层薄膜加热器，每一所述弧形薄膜加热器从内到外按照塑料绝缘片、第一层薄铜片、薄膜加热器及第二层薄铜片两两之间均采用双面胶紧紧粘贴成一体，三个所述恒温控制器分别连接相应所述薄膜加热器精准控制PCR扩增所需要的三个温度，三个所述温度传感器分别相应粘附在所述弧形薄膜加热器最外层的薄铜片表面，且每一所述温度传感器均相应连接所述恒温控制器。
进一步地，PCR扩增所需要的三个温度即解链温度94℃、退火温度48～68℃以及延伸温度72℃，所述毛细管从所述PCR加热块底部开始沿着解链区带到退火区带再经延伸区带的顺序缠绕在所述PCR加热模块三个温度区带上，所述毛细管每缠绕一圈即形成一个PCR循环。
进一步地，所述液滴传送系统包括压力泵、废液瓶和液滴进样控制系统，所述压力泵的进口连接所述毛细管的出口，所述压力泵的出口连接所述废液瓶，所述液滴进样控制系统用于根据设定要求控制所述压力泵和Inkjet装置的工作，进而控制液滴间的间距和液滴运输。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的Inkjet装置在DNA反应单元的生成中可以通过简单的控制调节驱动电压和脉冲时间就能完成对于不同大小液滴的需求，极大地简化了操作流程和实验芯片的设计，减小了其实验的操作时间和试剂的用品量，更容易满足实验人员的需求。2、本发明在PCR扩增环节采用了毛细管连续流动式PCR扩增系统，首先构建非常简单，只要把毛细管环绕在PCR扩增所需的三个恒温的温度体系上，PCR扩增的循环数目很容易实现且可变化形式；其次，在同一装置可以采用不同内径的毛细管作为PCR反应体系来满足不同的需要；另外，PCR是以连续流动的方式实现DNA扩增，其加热/冷却速度不再受PCR装置的恒温系统热容量所限制，而是受PCR混合物流动速度以及其热容量所控制；更为重要的是，对比微流控芯片连续流动式PCR，毛细管连续流动式PCR的三个温度带总是呈圆柱形，目标物DNA模板高温解链后直接流动经过低温度区进行引物退火，再流动经过中温度区进行延伸，这种温度布置形式可以避免已解链的单链DNA经过延伸温度带时可能会与模板链或他们的互补链结合形成双链而降低PCR扩增的效率。3、本发明PCR加热模块的三个弧形薄膜加热器周向间隔固定设置在圆柱塑料芯体外侧构成三个恒温区，因此能够有效地避免温度区带之间可能存在的热交互式污染。4、本发明通过控制液滴的进样频率和压力泵速率，有效地控制相邻两个液滴的距离。5、对于荧光信号的分析，传统的数字PCR则是通过收集扩增后的液滴并转移至流失细胞仪进行阳性液滴数字的统计，本发明采用的是在线结合激光诱导荧光检测系统，有效地减少实验操作时间和避免发生样品污染，实现在线全自动化的液滴数字PCR装置的开发。综上所述，与现有的技术相比，本发明具有全自动化，成本低，易操作，连续在线无污染，干扰因素少，试剂用量少的特点，可以节约大量的时间和物力，利于多种群体使用。
附图说明
图1为本发明的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置的结构示意图；
图2为本发明的PCR加热模块结构示意图，其中，(A)为整体结构示意图，(B)为单个弧形薄膜加热器的结构示意图，(C)为三个温度区带示意图；
图3为本发明的单分散液滴产生的原理示意图；
图4为本发明PCR扩增后各稀释浓度DNA样品的终点荧光信号图，(A)到(D)分别为样品稀释浓度为103、102、101和100倍时的信号强度示意图，横坐标均为Time(时间)，单位为min，纵坐标为Signal intensity(信号强度)，单位为mV。
具体实施方式
以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。
如图1所示，本发明提供的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，包括Inkjet进样系统、毛细管连续流动式PCR扩增系统、激光诱导荧光检测系统和液滴传送系统。
Inkjet进样系统用于控制液滴的产生，其中，产生的液滴中包裹着不同稀释浓度的模板DNA；
毛细管连续流动式PCR扩增系统用于对液滴进行单个反应单元内DNA扩增反应；
激光诱导荧光检测系统LIF用于对扩增后的液滴进行荧光信号的检测和计数；
液滴传送系统用于控制液滴间的间距和液滴运输。
在一个优选的实施例中，Inkjet进样系统包括Inkjet装置1(Inkjet打印喷头)、储液池2和X-Y-Z移动平台3，Inkjet装置1用于产生不同大小的液滴，储液池2设置装有油用于作为连续相，Inkjet装置1浸入储液池2的油相中，X-Y-Z移动平台3的顶部固定设置有Inkjet装置1和储液池2，其用于调整Inkjet装置1和储液池2相对应的位置。
在一个优选的实施例中，如图2所示，毛细管连续流动式PCR扩增系统包括毛细管4和PCR加热模块5，PCR加热模块5包括三个弧形薄膜加热器a～c、一圆柱塑料芯体d、三个恒温控制器、三个微型温度传感器和交流电供给装置。三个弧形薄膜加热器a～c周向间隔固定设置在圆柱塑料芯体d外侧构成三个恒温区，每一弧形薄膜加热器均包括两层厚度均约为0.3mm薄铜片51、52、一层塑料绝缘片53和一层薄膜加热器54，薄膜加热器54的电压为12V，功率为8W，尺寸为87mm x 30mm x 0.2mm，每一弧形薄膜加热器从内到外按照塑料绝缘片53、第一层薄铜片51、薄膜加热器54及第二层薄铜片52两两之间均采用厚度约为0.1mm的耐高温双面胶55紧紧粘贴成一体。三个恒温控制器分别连接相应薄膜加热器精准控制PCR扩增所需要的三个温度即解链温度(Denaturation)94℃、退火温度(Annealing)48～68℃以及延伸温度(Extension)72℃。三个微型温度传感器分别相应粘附在弧形薄膜加热器的最外层的薄铜片52表面来测量温度并发送到相应恒温控制其对温度进行实时调整。毛细管4多圈周向缠绕在PCR加热模块5外侧，为了实现连续流动式PCR扩增，本发明采用毛细管4的长度为4.5m(依次为例，不限于此，可以根据实际实验进行选择)，长为4.5mm的毛细管4从PCR加热块5底部开始沿着解链区带到退火区带再经延伸区带的顺序缠绕在PCR加热模块5三个温度区带上，毛细管4每缠绕一圈即形成一个PCR循环。本发明实施例共缠绕36圈(依次为例，不限于此，可以根据实际实验进行选择)。在每个PCR循环中毛细管4的长度大约为10.8cm，本发明实施例中每一弧形薄膜加热器的宽度约为2.5cm，而相邻的两个温度区带之间的空间间隔大约为1.1cm。毛细管4的一端进口连接Inkjet装置1的喷嘴，毛细管4的另一端出口连接液滴传送系统，其中，进口段的毛细管4长度为20cm，出口段的毛细管4的长度为50cm。
在一个优选的实施例中，激光诱导荧光检测系统LIF采用现有技术包括有激光器、光电倍增管PMT以及信号转化器等，激光诱导荧光检测系统处于暗箱内固定设置在毛细管4出口段，使经过扩增后的DNA模板液滴能有序的被激光诱导荧光检测和计数。
在一个优选的实施例中，液滴传送系统包括压力泵6、废液瓶7和液滴进样控制系统，压力泵6的进口连接毛细管4的出口，压力泵6的出口连接废液瓶7，液滴进样控制系统用于根据设定要求控制压力泵4和Inkjet装置1的工作，进而控制液滴间的间距和液滴运输。
下面结合具体实施例详细说明本发明的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置的使用方法。需要说明的是本实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径购得，Caski细胞均为中国医学科学院肿瘤医院产品，Caski细胞含有HPV16病毒。
PCR引物的设计
所述上游引物：5’-3’GCA CAG GGA CAT AAT AAT GG
所述下游引物：5’–3’CGT CCC AAA GGA AAC TGA TC
PCR混合试剂：SYBR Premix EcTaqⅡ(TakaRa Ex Taq Hs,Dntp Mixture,Mg,TliRNseH,SYBR GreenⅠ)。
本发明的基于Inkjet产生液滴实现全自动在线液滴数字PCR装置的全自动在线数字PCR的操作流程如下：加样→进样(产生大量的独立反应单元)→液滴PCR扩增→检测→后期数据处理，详细过程为：
步骤一：将20μL PCR混合样品(10μL SYBR Premix EcTaqⅡ；0.4μL ROXreference dye；0.8μL each of primers；2μL目标DNA模板以及6μL dH2O)混合放入PCR试剂管内预热95℃ 3min激活Taq酶。PCR混合试剂样品中的Taq酶是必须经过高温才能激活的酶，在激活之前它是没有活性的，不会产生非特异性扩增，所以在反应前激活可以大大提高PCR扩增的特异性，再将预热后的PCR混合样品加样到Inkjet装置1内待用。如图3所示，Inkjet装置1通过控制调节驱动电压和脉冲宽度完成对于不同大小液滴的产生，在液滴产生之后将其引入到毛细管4中，而每个由连续油相分离的液滴可以被认为是一个单独的PCR反应单元。
步骤二：设置PCR加热模块5预热的数字PCR反应温度：弧形薄膜加热器a：95℃变性区带；弧形薄膜加热器b：55℃退火区带；弧形薄膜加热器c：72℃延伸区带。
步骤三：数字PCR的关键是稀释模板，通过将一个样本分成几十到几万分，分配到不同的反应单元。让每个单元包含0个或者一个(至多数个拷贝)的目标分子。这就要求对于模板的稀释和液滴大小进行优化。在本实施例中提取的Caski细胞原始浓度的DNA模板被10倍连续梯度稀释得到100，101，102，103倍数浓度。Inkjet进样条件为驱动电压100V和脉冲时间为20μs,得到液滴大小为100μm，进样频率为0.33HZ。
步骤四：基于Inkjet的进样条件100μm大小的液滴包裹着不同稀释浓度的模板DNA，在10Kpa的压力泵6的作用下，液滴以0.21cm/s的速度通过3个不同的温度区带。完成在每个反应单元中分别对目标分子进行解链、退火、延伸的工作。
步骤五：经过36个循环，液滴PCR扩增结束后，液滴有序的通过激光诱导荧光检测系统，对每个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
步骤六：数字PCR采用直接计数的方法进行定量分析，即在PCR扩增结束后有荧光信号的反应单元记为1，无荧光型号的则记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子。理论上，在样品中目标DNA浓度较低的情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是，在通常的情况下，数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，这时需要采用泊松概率分布公式进行计算。
(Copies per droplet)λ＝-ln(1-p) (1)
式中，λ为每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数，p为有荧光信号的反应单元的概率数。
C＝λ/v (2)
式中，C为样品的原始拷贝数(浓度)，v为液滴的体积。
根据数字PCR反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的系数倍系数，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。
基于上述的原理和泊松分布的概率，根据如图4所示的结果，当液滴大小为100μm时，样品稀释浓度为102倍数的DNA模板可用于计算其样品的最初拷贝数。而样品稀释浓度为100，101倍数时，由于高浓度的样品含量，其单个液滴包含的DNA分子量大于1个甚至包含多个的目标分子数，这样的结果并不符合数字PCR的原理。另一方面，当样品稀释浓度为103倍数时，由于低浓度的样品含量，则需要大于100μm体积液滴来满足单个液滴包含0个或者一个(至多数个拷贝)的目标分子，具体结果如表1：
表1为对不同稀释样本倍数的检测的结果
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
Claims (7)
1.一种基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，该装置包括：
一用于控制液滴的产生的Inkjet进样系统，其中，产生液滴中包裹着不同稀释浓度的模板DNA；
一用于对液滴进行单个反应单元内DNA扩增反应的毛细管连续流动式PCR扩增系统；
一用于对扩增后的液滴进行荧光信号的检测和计数的激光诱导荧光检测系统；
一用于控制液滴间的间距和液滴运输的液滴传送系统。
2.如权利要求1所述的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，所述Inkjet进样系统包括Inkjet装置、储液池和X-Y-Z移动平台，所述Inkjet装置用于产生不同大小的液滴，所述储液池装有用于作为连续相的油，所述Inkjet装置浸入所述储液池的油中，所述X-Y-Z移动平台顶部固定设置所述Inkjet装置和储液池。
3.如权利要求1所述的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，所述毛细管连续流动式PCR扩增系统包括毛细管和PCR加热模块，所述毛细管多圈周向缠绕在所述PCR加热模块外侧，所述毛细管的一端进口连接所述Inkjet装置的喷嘴，所述毛细管的另一端出口连接所述液滴传送系统，所述激光诱导荧光检测系统固定设置在所述毛细管的出口段。
4.如权利要求3所述的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，所述毛细管进口段的长度为20cm，所述毛细管出口段的长度为50cm。
5.如权利要求3所述的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，所述PCR加热模块包括三个弧形薄膜加热器、圆柱塑料芯体、三个恒温控制器、三个温度传感器和交流电供给装置；三个所述弧形薄膜加热器周向间隔固定设置在所述圆柱塑料芯体外侧构成三个恒温区，每一所述弧形薄膜加热器均包括两层薄铜片、一层塑料绝缘片和一层薄膜加热器，每一所述弧形薄膜加热器从内到外按照塑料绝缘片、第一层薄铜片、薄膜加热器及第二层薄铜片两两之间均采用双面胶紧紧粘贴成一体，三个所述恒温控制器分别连接相应所述薄膜加热器精准控制PCR扩增所需要的三个温度，三个所述温度传感器分别相应粘附在所述弧形薄膜加热器最外层的薄铜片表面，且每一所述温度传感器均相应连接所述恒温控制器。
6.如权利要求5所述的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，PCR扩增所需要的三个温度即解链温度94℃、退火温度48～68℃以及延伸温度72℃，所述毛细管从所述PCR加热块底部开始沿着解链区带到退火区带再经延伸区带的顺序缠绕在所述PCR加热模块三个温度区带上，所述毛细管每缠绕一圈即形成一个PCR循环。
7.如权利要求3～5任一项所述的基于Inkjet全自动在线液滴数字PCR装置，其特征在于，所述液滴传送系统包括压力泵、废液瓶和液滴进样控制系统，所述压力泵的进口连接所述毛细管的出口，所述压力泵的出口连接所述废液瓶，所述液滴进样控制系统用于根据设定要求控制所述压力泵和Inkjet装置的工作，进而控制液滴间的间距和液滴运输。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107446811A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-12-08 | 新疆昆泰锐生物技术有限公司 | 一种用于pcr的管式控温装置及包含该装置的反应仪 |
| CN109022263A (zh) * | 2017-06-08 | 2018-12-18 | 昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司 | 一种管式控温装置及包含该管式控温装置的反应仪 |
| CN110591911A (zh) * | 2019-09-30 | 2019-12-20 | 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 | 一种光机电一体化全自动数字pcr装置 |
| CN112176036A (zh) * | 2019-07-05 | 2021-01-05 | 中国科学技术大学 | 单分子收集方法及系统 |
| CN113652342A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-11-16 | 广东省科学院健康医学研究所 | 一种数字pcr装置、制备方法、设备及介质 |
| CN113967487A (zh) * | 2021-10-11 | 2022-01-25 | 华中科技大学 | 一种喷嘴、液滴光热操控系统及其应用 |
| CN114292734A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-08 | 上海前瞻创新研究院有限公司 | 一种全流程集成液滴数字pcr芯片、制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN202898426U (zh) * | 2012-07-12 | 2013-04-24 | 北京工业大学 | 一种面向空间的螺旋式微流控pcr实时荧光检测系统 |
| CN103698382A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-02 | 浙江大学 | 一种用于微量液滴阵列的毛细管电泳分析装置及其使用方法 |
| CN106520524A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-03-22 | 中国科学技术大学 | 一体式刚性流道液滴数字pcr系统及方法 |
| CN206109411U (zh) * | 2016-10-09 | 2017-04-19 | 戴敬 | 基于高效液滴微反应器的绝对定量数字核酸分析系统 |
-
2018
- 2018-01-16 CN CN201711246949.XA patent/CN108004135B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN202898426U (zh) * | 2012-07-12 | 2013-04-24 | 北京工业大学 | 一种面向空间的螺旋式微流控pcr实时荧光检测系统 |
| CN103698382A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-02 | 浙江大学 | 一种用于微量液滴阵列的毛细管电泳分析装置及其使用方法 |
| CN206109411U (zh) * | 2016-10-09 | 2017-04-19 | 戴敬 | 基于高效液滴微反应器的绝对定量数字核酸分析系统 |
| CN106520524A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-03-22 | 中国科学技术大学 | 一体式刚性流道液滴数字pcr系统及方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SUN ET AL: "Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing", 《LAB CHIP》 * |
| ZHU ET AL: "Sequential Operation Droplet Array: An Automated Microfluidic Platform for Picoliter-Scale Liquid Handling, Analysis, and Screening", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109022263A (zh) * | 2017-06-08 | 2018-12-18 | 昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司 | 一种管式控温装置及包含该管式控温装置的反应仪 |
| CN107446811A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-12-08 | 新疆昆泰锐生物技术有限公司 | 一种用于pcr的管式控温装置及包含该装置的反应仪 |
| CN112176036A (zh) * | 2019-07-05 | 2021-01-05 | 中国科学技术大学 | 单分子收集方法及系统 |
| CN110591911A (zh) * | 2019-09-30 | 2019-12-20 | 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 | 一种光机电一体化全自动数字pcr装置 |
| CN113652342A (zh) * | 2021-07-21 | 2021-11-16 | 广东省科学院健康医学研究所 | 一种数字pcr装置、制备方法、设备及介质 |
| CN113967487A (zh) * | 2021-10-11 | 2022-01-25 | 华中科技大学 | 一种喷嘴、液滴光热操控系统及其应用 |
| CN114292734A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-04-08 | 上海前瞻创新研究院有限公司 | 一种全流程集成液滴数字pcr芯片、制备方法和应用 |
| CN114292734B (zh) * | 2021-12-22 | 2023-08-18 | 上海前瞻创新研究院有限公司 | 一种全流程集成液滴数字pcr芯片、制备方法和应用 |
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