CN114292734A - 一种全流程集成液滴数字pcr芯片、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种包含核酸纯化的全流程集成液滴数字PCR芯片，属于核酸检测技术领域，所述PCR芯片包括芯片本体，所述芯片本体包括样品处理单元、液滴生成结构和液滴平铺腔室，所述样品处理单元包括依次连通的裂解腔室、一个或多个洗涤腔室和混合腔室，所述混合腔室通过所述液滴生成结构与所述液滴平铺腔室连通，位于所述混合腔室中的液滴在外加正压或负压下，经过所述液滴生成结构后形成多个微液滴，多个微液滴平铺于所述液滴平铺腔室内。本发明集成了样品处理、液滴生成、PCR反应、平铺检测功能，在芯片上实现了核酸分析的全部流程，能够集成化、自动化、封闭地纯化核酸样品并实现数字化PCR检测。

Description

一种全流程集成液滴数字PCR芯片、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种全流程集成液滴数字PCR芯片、制备方法和应用。

背景技术

核酸检测是一种重要的的生物检测手段，在肿瘤诊断、致病菌检测、传染病筛查等领域有着广泛的应用。使用微流控技术对核酸检测流程进行改进，对于其进一步的应用推广具有潜在社会经济价值。在现有核酸检测流程中，需要将样品提取核酸分子(即核酸纯化)后再进行PCR反应并检测，其中的样品处理过程较为繁琐、效率低、集成化程度低、自动化水平低，且存在核酸泄露污染的问题。

目前，芯片上样品处理的一种解决方案被称为油浸式无损微全分析系统(OilImmersed Lossless Total Analysis System,OIL-TAS)，此方案中样品被加入到串联腔体中被油包裹的试剂液滴中进行处理，并以被磁铁驱动的磁珠作为中介，将吸附在磁珠上的核酸分子转移到不同试剂液滴中进行反应，最后在芯片腔体内以毫米直径的液滴形式完成荧光定量PCR(Quantitative polymerase chain reaction,QPCR)检测。

通过增加液滴生成芯片，可以高灵敏度的数字PCR检测(ddPCR)来达到更高精度和更低的检测限。然而目前这些ddPCR方案不具有核酸纯化的样品处理功能，需要将样品在芯片外处理，再转移到额外的液滴生成芯片中得到微液滴，其转移过程中存在样品损失和污染的问题，也不能实现从“样品进，结果出”的全流程的片上集成。另外，如果要将常规数字PCR与油浸式无损微全分析系统相结合，从油中无污染地分离出样品用于生成液滴是一大难点。上述问题限制了液滴式数字PCR芯片在全流程自动化、集成化、高灵敏度核酸样品检测方面更广泛的应用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种全流程集成液滴数字PCR芯片、制备方法和应用，集核酸样品裂解、洗涤、洗脱、PCR反应液混合、液滴生成、ddPCR反应全流程于一体的微流控芯片及其液滴生成方法与应用，能够集成化、自动化、封闭地纯化核酸样品并实现数字化PCR检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供一种全流程集成液滴数字PCR芯片，包括芯片本体，所述芯片本体包括样品处理单元、液滴生成结构和液滴平铺腔室；

所述样品处理单元包括依次连通的裂解腔室、一个或多个洗涤腔室和混合腔室；

所述混合腔室通过所述液滴生成结构与所述液滴平铺腔室连通；

位于所述混合腔室中的液滴在外加正压或负压下，经过所述液滴生成结构后形成多个微液滴，多个微液滴平铺于所述液滴平铺腔室内。

采用本发明的全流程集成液滴数字PCR芯片，可以实现对核酸样品片上处理、液滴生成和检测，完全实现“样品进，结果出”的全流程片上集成。

在本发明的一些实施方式中，所述芯片本体包括相贴合的第一盖片和第一基片；

所述第一盖片设有多个通孔，分别用于形成所述裂解腔室、洗涤腔室和混合腔室；与所述第一基片相贴合的第一盖片的一面设有依次将裂解腔室、洗涤腔室和混合腔室连通的微流控通道。

在本发明的一些实施方式中，所述液滴平铺腔室由第二盖片、连接件和第二基片依次贴合形成，其中第一基片和第二基片可选同一基片；具体的，样品处理单元位于基片的一端，液滴平铺腔室位于基片的另一端。

本发明的第二方面提供一种全流程集成液滴数字PCR芯片的制备方法，包括如下步骤：

S1、采用软光刻技术制作硅片模具，刻蚀出样品处理单元中的裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室的边缘线及依次连通各腔室的微流控孔道，和与混合腔室边缘线相接的液滴生成结构；

S2、在硅片模具上浇铸形成样品处理单元、液滴生成结构的材料的预聚物和固化剂混合物，倒模后，在裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室的边缘线处打通孔，制成功能化结构；

S3、采用等离子键合封装技术，将功能化结构与基片的一端贴合，而形成连通的裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室，以及与混合腔室连通的液滴生成结构；

S4、采用连接件将带有开孔的盖片与基片的另一端上下贴合形成液滴平铺腔室，且所述液滴平铺腔室的开口端与所述液滴生成结构连通。

本发明的第三方面提供第一方面所述的全流程集成液滴数字PCR芯片或第二方面流程集成液滴数字PCR芯片的制备方法制备的PCR芯片在生物分子检测中的应用。

本发明提供的全流程液滴数字PCR芯片，具有如下有益效果：

1)集成了样品(细胞或病毒)处理(裂解，两次或多次洗涤、以及核酸与PCR反应液混合)、液滴生成、PCR反应、检测功能，在芯片上实现了核酸分析的全部流程；

2)样品在芯片上以油中的液滴形式存在，避免了核酸分子以气溶胶形式污染检测环境；且由于油的隔离作用，样品全程与芯片结构不直接接触，避免了核酸分子吸附在芯片通道表面导致损失的情况，也使得芯片具有了重复使用的潜力，因为使用同一芯片上依次进行的检测间不会相互污染；

3)创新设计的液滴生成结构能够与微通道一起通过软光刻工艺加工，因此加工简单、集成化程度高，且其生成液滴的过程稳定、均一；

4)以磁珠为中介富集核酸，携带生物分子在互不干扰的试剂中发生反应，能够精确控制反应时间，且能通过自动化磁控系统实现批量处理。

附图说明

图1为本发明全流程集成数字PCR芯片的结构示意图；

图2为图1所述全流程集成数字PCR芯片的爆炸图；

图3为本发明全流程集成数字PCR芯片的俯视结构示意图；

图4为本发明各腔室及液滴生成结构的连通关系示意图(或称为用于软光刻的掩模版设计图)；

图5为本发明全流程集成数字PCR芯片的使用过程原理图；

图6为采用本发明的PCR芯片中微液滴生成结构的工作过程显微照片；

图7为均匀微液滴在液滴平铺腔室内平铺的情况；

图8为完成PCR反应后的微液滴的显微照片，其中较亮的是阳性液滴，代表其中有目标核酸分子，较暗的是阴性液滴，代表其中没有目标核酸分子。

图中标号：

1、第一盖片；

100、基片；

11、裂解腔室；12、洗涤腔室；13、混合腔室；131、通过口；

2、液滴生成结构；

21、内置件；211、液滴生成口；22、延伸件；221、阻隔件；

3、液滴平铺腔室；

31、第二盖片；311、开孔；32、连接件。

具体实施方式

本发明的发明人经过设计一种全流程集成液滴数字PCR芯片、制备方法和应用，将液滴式数字PCR芯片与油浸式无损微全分析系统的功能合二为一，与现有油浸式无损微全分析系统，优势在于通过数字PCR提高了核酸等生物分子检测的灵敏度。与现有的液滴式数字PCR芯片相比，集核酸样品裂解、洗涤、洗脱、PCR反应液混合、液滴生成、ddPCR反应全流程于一体的微流控芯片及其液滴生成方法与应用，能够集成化、自动化、封闭地纯化核酸样品并实现数字化PCR检测。在此基础上，完成了本发明。

本发明第一方面提供一种全流程集成液滴数字PCR芯片，包括芯片本体，所述芯片本体包括样品处理单元、液滴生成结构和液滴平铺腔室；所述样品处理单元包括依次连通的裂解腔室、一个或多个洗涤腔室和混合腔室；所述混合腔室通过所述液滴生成结构与所述液滴平铺腔室连通；位于所述混合腔室中的液滴在外加正压或负压下，经过所述液滴生成结构后形成多个微液滴，多个微液滴平铺于所述液滴平铺腔室内。

具体的，所述芯片本体包括相贴合的第一盖片和第一基片，所述第一盖片设有多个通孔，分别用于形成所述裂解腔室、洗涤腔室和混合腔室；与所述第一基片相贴合的第一盖片的一面设有依次将裂解腔室、洗涤腔室和混合腔室连通的微流控通道。一般裂解腔室为一个，洗涤腔室为两个，混合腔室为一个。所述液滴平铺腔室由第二盖片、连接件和第二基片依次贴合形成，其中第一基片和第二基片可选同一基片；具体的，样品处理单元位于基片的一端，液滴平铺腔室位于基片的另一端。

在本发明一些实施方式中，所述混合腔室底部设有通过口，所述液滴生成结构通过所述通过口与所述混合腔室连通。位于混合腔室中的大液滴(液滴直径为1～3mm)在正压或负压条件下通过通过口及液滴生成结构形成大小均一的微米级微液滴(液滴直径为70～150μm)，其中微液滴的大小可以根据压力大小进行控制。

在本发明一些实施方式中，所述液滴生成结构包括内置件和延伸件，所述内置件位于所述混合腔室，且所述内置件设有液滴生成口，且所述液滴生成口靠近所述通过口；所述延伸件一端与所述通过口连通，另一端与所述液滴平铺腔室连通。进一步说明，内置件上的液滴生成口的口径是通过口口径的0.5～3倍，可选0.5～1倍，1～2倍，2～3倍，位于混合腔室中的大液滴随着油相在压力作用下首先通过液滴生成口，在液滴生成口形成液滴变得细长，在压力及液滴生成口的剪切作用下液滴缓慢形成独立的微液滴，并经过通过口、及延伸件进入液滴平铺腔室，进行后续检测流程。

在本发明一些实施方式中，所述混合腔室为圆柱形腔室；所述内置件包括两个弧形件，两个弧形件分别位于所述通过口的两侧，并靠近所述混合腔室内壁；且所述两个弧形件相互靠近的一端形成所述液滴生成口，圆柱形腔室方便加工。

在本发明一些实施方式中，所述延伸件包括延伸微通道；所述延伸微通道一端通过所述通过口与所述混合腔室连通，另一端与所述液滴平铺腔室连通；且所述延伸微通道的内径由靠近所述通过口一侧至所述液滴平铺腔室一侧逐渐增大；优选的，所述延伸微通道内设有阻隔件，用于将所述延伸微通道分隔为两个支路通道。

在本发明一些实施方式中，所述第一盖片和第一基片通过热压键合或等离子键合封装制成；所述第一盖片由PMMA或PDMS制成，所述第一基片由PDMS或玻璃制成；优选的，所述第一盖片由PDMS制成，第一基片由玻璃制成(盖玻片)，可选的，使用等离子体键合技术将上述PDMS制成的第一基片键合于载玻片一端，然后在烘箱中105度加热处理8h使得结构疏水化以便于生成油包水液滴。

所述液滴平铺腔室由第二盖片、连接件和第二基片依次贴合形成；所述第二盖片和第二基片由PDMS或玻璃制成，所述连接件由粘合剂制成；优选的，第一基片和第二基片可为同一基片(载玻片)，使用约2*50*0.1mm的双面胶条沿载玻片剩余一端两侧长边贴好，然后将另一块定制的玻璃带开口的第二盖片远离第一基片一端，另一端紧密抵在第一基片的出口处，贴在载玻片上面，形成夹层玻璃腔，即为液滴平铺腔室，最后以紫外胶密封首尾两端边沿，使得整个玻璃腔密封。形成的液滴平铺腔室的高度为微液滴直径的1.05～1.3倍，优选为1.15～1.25倍，玻璃开口用于外接负压泵，所述负压范围为-5kPa至-30kPa。其中，采用玻璃制备的液滴平铺腔室能够实现稳定的ddPCR反应，避免了因PDMS透气特性导致的微液滴在PCR反应中的融合。

值得说明的是，上述依次连通的裂解腔室、一个或多个洗涤腔室和混合腔室、液滴生成结构、所述微流控通道为通过对第一盖片刻蚀或打孔获得，或采用定制模板倒模获得，对获得方式不做具体限定。

上述PCR芯片形成微液滴的原理进行说明如下：

图5全流程集成数字PCR芯片的使用过程原理图。微液滴生成过程分为以下三个步骤：(1)施加负压使得腔体中液滴随着流动的油相到达液滴生成口，(2)液滴在拦截类似水坝结构的狭窄开口处被拉长剪切为独立的微液滴，(3)微液滴向后运输到玻璃夹层中的扁平空间中平铺、等待反应检测等。在这种方式中，微液滴的大小可由压力控制。

上述PCR芯片使用原理进行说明如下：

核酸样品与裂解液、磁珠等试剂混合后，通过芯片上腔室中注入油中形成毫米直径的液滴，然后核酸分子被磁珠吸附在表面，磁珠被在芯片底部运动的磁铁驱动转移到两个相邻的洗涤腔，最后纯净的核酸在最后一个腔体内脱离磁珠并与PCR反应液混合。混合后的PCR反应液将被负压驱动，在微液滴生成结构处生成大小均一的微米级直径的微液滴，微液滴最后储存在液滴平铺腔体内实现PCR热循环反应。这种方法以大量微液滴作为数字PCR的反应与检测单元的方法被称为ddPCR(droplet digital PCR)，能够显著提高检测灵敏度。

本发明的第二方面提供一种全流程集成液滴数字PCR芯片的制备方法，包括如下步骤：

S1、采用软光刻技术制作硅片模具，刻蚀出样品处理单元中的裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室的边缘线及依次连通各腔室的微流控孔道，和与混合腔室边缘线相接的液滴生成结构；

S2、在硅片模具上浇铸形成样品处理单元、液滴生成结构的材料的预聚物和固化剂混合物，倒模后，在裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室的边缘线处打通孔，制成功能化结构(PDMS功能化结构)；

S3、采用等离子键合封装技术，将功能化结构与基片(载玻片)的一端贴合，而形成连通的裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室，以及与混合腔室连通的液滴生成结构；

具体的，然后将连通载玻片即PDMS功能化结构在烘箱中105度加热处理8h使得结构疏水化以便于生成油包水液滴；

S4、采用连接件将带有开孔的盖片与基片的另一端上下贴合形成液滴平铺腔室，且所述液滴平铺腔室的开口端与所述液滴生成结构连通；

具体的，使用约2*50*0.1mm的双面胶条沿载玻片剩余一端两侧长边贴好，然后将另一块定制的带开孔的玻璃远离PDMS一端，另一端紧密抵在PDMS块的出口处，贴在载玻片上面，形成夹层玻璃腔(液滴平铺腔室)。最后以紫外胶密封首尾两端边沿，使得整个玻璃腔密封，并将引出管道粘接在上层玻璃开孔处形成与负压泵的连接通道。

本发明的第三方面提供第一方面所述的全流程集成液滴数字PCR芯片或第二方面流程集成液滴数字PCR芯片的制备方法制备的PCR芯片在生物分子检测中的应用。

以包括两个洗涤腔室为例，进行应用说明：

将本发明所提供的实例芯片中功能化的四个腔室填满油，等待油自动填充后端液滴平铺腔室，然后在填满油的四个腔体分别加入混有磁珠的裂解液、洗涤液、洗涤液、PCR反应液形成试剂液滴，完成上述过程后芯片准备即完成。然后开始样品处理过程，在第一个腔体加入样品，在芯片底部隔着载玻片晃动磁铁1分钟并60度孵育以使得核酸从病毒/细胞中释放出来吸附在磁珠上，然后拖动磁珠依次在后面三个腔体中晃动1分钟，最后将磁珠转移到倒数第二个腔体中，然后将芯片后端管道与负压泵连接，开启负压后微液滴将以如图5所示的方式生成并运输到后端玻璃夹层腔体。然后开始反应与检测过程，将芯片转移到PCR仪上完成热循环，完成PCR反应后转移到荧光显微镜下对各区域液滴依次成像，最后通过软件统计阳性(有荧光)与阴性(无荧光)微液滴比例，根据数字PCR计算公式得出样品核酸浓度。同样的，此芯片能够按照与以上所述类似的工作方式，应用于蛋白质样品的处理并实现数字酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。

目前常用的液滴数字PCR芯片通常使用两相不同的压力实现液滴生成，两相压力必须精确控制以保证液滴生成均一，而本发明使用负压仅需控制一相气压，简化了对气压控制设备的要求。且芯片对气压不敏感，以本发明制作的一个实例在-5kPa至-30kPa的负压范围内均可实现液滴生成，因此也有潜力通过注射器等简易负压装置替代负压泵实现无泵化液滴生成。

以下结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解的是，本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。

实施例1

如图1和图2所示，一种全流程集成液滴数字PCR芯片，芯片本体包括样品处理单元、液滴生成结构和液滴平铺腔室，其中，样品处理单元采用第一盖片1与基片配合形成处理腔体及微流控通道。采用任一方式，可选软光刻技术制作具有微米尺度结构的微流控通道和液滴生成结构的第一盖片1，然后使用打孔器打出通孔以保证能够形成具有足够溶剂的腔体，然后第一盖片1与基片100相贴合形成各腔室及连通各腔室的微流控通道，各腔室具体为裂解腔室11、两个洗涤腔室12和混合腔室13。混合腔室13通过所述液滴生成结构2与液滴平铺腔室3连通，位于所述混合腔室13中的液滴在外加正压或负压下，经过所述液滴生成结构2后形成多个微液滴，多个微液滴平铺于所述液滴平铺腔室3内。

在一个具体的实施例中，PCR芯片的样品处理单元由相贴合的第一盖片1和基片100构成，液滴平铺腔室3由第二盖片31、连接件32和基片100依次贴合形成。具体的，第一盖片1为PDMS制成PDMS功能块，基片100为载玻片，第二盖片31为玻璃薄片，连接件32为双面胶和紫外密封胶。使用等离子体键合技术将上述PDMS功能块键合于载玻片一端,PDMS功能块与载玻片相互贴合后形成了裂解腔室11、两个洗涤腔室12和混合腔室13及连通各腔室的微流控通道，优选的PDMS功能块为疏水化结构。然后2*50*0.1mm的双面胶条沿载玻片剩余一端两侧长边贴好，然后将带开孔311的玻璃薄片远离PDMS一端，另一端紧密抵在PDMS功能块的出口处，贴在载玻片上面，液滴平铺腔室。最后以紫外胶密封首尾两端边沿，使得整个玻璃腔密封，并将引出管道粘接在上层玻璃开孔处形成与负压泵的连接通道。

在一个具体的实施例中，如图3和图4所示，混合腔室13底部设有通过口131，液滴生成结构2通过口131与混合腔室13连通。具体的，混合腔室13为圆柱形腔室，液滴生成结构2包括内置件21和延伸件22，其中内置件21包括两个弧形件，两个弧形件分别位于通过口131的两侧，并靠近混合腔室13内壁，两个弧形件相互靠近的一端形成所述液滴生成口211。

在一个具体的实施例中，载玻片尺寸为1*25*74mm，第一盖片(PDMS功能块)5*20*25mm，第二盖片尺寸0.5*25*40mm，液滴生成口宽度为100μm，裂解腔室11、一洗涤腔室12和混合腔室13的内径均为5mm。

在一个具体的实施例中，如图4所示，延伸件22设有延伸微通道，延伸微通道一端通过通过口131与混合腔室13连通，另一端与液滴平铺腔室3连通，且延伸微通道的内径由靠近所述通过口131一侧至所述液滴平铺腔室3一侧逐渐增，另外延伸微通道内设有阻隔件221，用于将所述延伸微通道分隔为两个支路通道。分隔为两个支路通道，利于剪切形成的微液滴均匀分布在液滴平铺腔室中。

实施例2

(2-1)使用AutoCAD软件绘制出设计的四个腔体以及液滴生成结构图形，制作成光刻用的胶片掩膜版；以四寸单晶硅片为衬底，采用软光刻技术制作硅片模具，在200μm厚度的SU8-3050光刻胶上刻蚀出样品处理单元中的裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室的边缘线及依次连通各腔室的微流控孔道，和与混合腔室边缘线相接的液滴生成结构；

(2-2)在硅片模具上浇铸形成样品处理单元、液滴生成结构的材料的预聚物和固化剂混合物，倒模后，在裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室的边缘线处打通孔，制成功能化结构；

(2-3)采用等离子键合封装技术，将功能化结构与基片的一端贴合，而形成连通的裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室，以及与混合腔室连通的液滴生成结构；

(2-4)采用100μm厚的双面胶条连接件将带有开孔的盖片与基片的另一端上下贴合形成液滴平铺腔室，且所述液滴平铺腔室的开口端与所述液滴生成结构连通。

(2-5)使用紫外固化胶填充液滴平铺腔末端开口和前端与功能化结构块形成的缝隙的外侧，以形成从液滴生成口到出口之间封闭的空间。

(2-6)使用紫外固化胶将2mm外径的管道粘接在盖片的开孔处，形成与负压泵连接的接口，然后使用紫外灯照射10秒使其固化。

实施例3

1.加矿物油：先在裂解腔室11中加满矿物油，然后稍稍倾斜让其流动至其它腔体中，然后再往裂解腔室11中补满矿物油，倾斜腔体使油相再次流动至其它腔体，最终使所有腔中的油相高度大概为腔体高度的一半。

2.加试剂：在裂解腔室11中加入8μL裂解体系试剂(裂解液，蛋白酶K，磁珠)；在第一个洗涤腔室12中加入4μL的洗涤液1(60％乙醇水溶液)；在第二个洗涤腔室12中加入4μL的洗涤液2(13％PEG-8000，1mM氯化镁溶液)；在混合腔室13中加入4μL的PCR反应液(引物，酶，水)；最后，在裂解腔室11中加入2μL的样品(新冠假病毒试剂)。

3.实验操作:

(3-1)裂解:在磁力架上混匀1分钟，后在60°恒温箱中放置10分钟等待病毒裂解释放核酸分子并与磁珠结合。

(3-2)洗涤:将磁珠拖至第一个洗涤腔室12内并混匀1分钟。

(3-3)洗涤:将磁珠拖至第二个洗涤腔室12内并混匀1分钟。

(3-4)洗脱:将磁珠拖至混合腔室13内并混匀1分钟，后静置5分钟等待核酸从磁珠上脱落。

(3-5)再将磁珠拖回至第二个洗涤腔室12，使用移液枪抽出裂解腔室11、第一个洗涤腔室12、第二个洗涤腔室12等三个腔室中的试剂液滴，以免干扰后续微液滴生成过程。

(3-6)将芯片出口管道与负压泵连接，设置负压为-5kpa，等待液滴生成完成，生成液滴的过程如图6所示，液滴平铺腔内微液滴如图7所示。

(3-7)将生成完液滴的芯片放置在原位PCR仪中，启动扩增程序。

(3-8)如图8所示，扩增后在荧光显微镜下检测液滴阴阳性，并统计计算病毒浓度。

上述实施例仅例示性说明本申请的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本申请所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种全流程集成液滴数字PCR芯片，包括芯片本体，其特征在于，所述芯片本体包括样品处理单元、液滴生成结构(2)和液滴平铺腔室(3)；

所述样品处理单元包括依次连通的裂解腔室(11)、一个或多个洗涤腔室(12)和混合腔室(13)；

所述混合腔室(13)通过所述液滴生成结构(2)与所述液滴平铺腔室(3)连通；

位于所述混合腔室(13)中的液滴在外加正压或负压下，经过所述液滴生成结构(2)后形成多个微液滴，多个微液滴平铺于所述液滴平铺腔室(3)内。

2.根据权利要求1所述的全流程集成液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述芯片本体包括相贴合的第一盖片(1)和第一基片；

所述第一盖片设有多个通孔，分别用于形成所述裂解腔室(11)、洗涤腔室(12)和混合腔室(13)；

与所述第一基片相贴合的第一盖片(1)的一面设有依次将裂解腔室(11)、洗涤腔室(12)和混合腔室(13)连通的微流控通道；或与所述第一盖片(1)相贴合的第一基片的一面设有依次将裂解腔室(11)、洗涤腔室(12)和混合腔室(13)连通的微流控通道。

3.根据权利要求1所述的全流程集成液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述混合腔室(13)底部设有通过口(131)，所述液滴生成结构(2)通过所述通过口(131)与所述混合腔室(13)连通。

4.根据权利要求3所述的全流程集成液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述液滴生成结构(2)包括内置件(21)和延伸件(22)；

所述内置件(21)位于所述混合腔室(13)，且所述内置件(21)设有液滴生成口(211)，且所述液滴生成口(211)靠近所述通过口(131)；

所述延伸件(22)一端与所述通过口(131)连通，另一端与所述液滴平铺腔室(3)连通。

5.根据权利要求4所述的全流程集成液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述混合腔室(13)为圆柱形腔室；

所述内置件(21)包括两个弧形件，两个弧形件分别位于所述通过口(131)的两侧，并靠近所述混合腔室(13)内壁；

且所述两个弧形件相互靠近的一端形成所述液滴生成口(211)。

6.根据权利要求4或5所述的全流程集成液滴数字PCR芯片，其特征在于，液滴生成口的孔径为80～120μm；

和/或，所述裂解腔室(11)、洗涤腔室(12)和混合腔室(13)的内径均为3～7mm。

7.根据权利要求4所述的全流程集成液滴数字PCR芯片，其特征在于，所述延伸件(22)包括延伸微通道；

所述延伸微通道一端通过所述通过口(131)与所述混合腔室(13)连通，另一端与所述液滴平铺腔室(3)连通；

且所述延伸微通道的内径由靠近所述通过口(131)一侧至所述液滴平铺腔室(3)一侧逐渐增大；

优选的，所述延伸微通道内设有阻隔件(221)，用于将所述延伸微通道分隔为两个支路通道。

8.根据权利要求2所述的全流程集成液滴数字PCR芯片，其特征在于，包括如下技术特征中的一项或多项：

A1、所述液滴平铺腔室(3)由第二盖片(31)、连接件(32)和第二基片依次贴合形成；

优选的，所述第二盖片(31)和第二基片由PDMS或玻璃制成，所述连接件(32)由粘合剂制成；

A2、所述第一盖片(1)和第一基片通过热压键合或等离子键合封装制成；

A3、所述第一盖片(1)由PMMA或PDMS制成；

A4、所述第一基片由PDMS或玻璃制成；

A5、所述混合腔室(13)中的液滴直径为1～3mm，形成的微液滴直径为70～150μm；

A6、所述液滴平铺腔室(3)的高度为微液滴直径的1.05～1.3倍，优选为1.15～1.25倍；

A7、所述液滴平铺腔室(3)设有开孔(311)，用于外接负压泵，所述负压范围为-5kPa至-30kPa；

A8、所述液滴生成结构、所述微流控通道为通过对第一盖片刻蚀获得。

9.一种全流程集成液滴数字PCR芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、采用软光刻技术制作硅片模具，刻蚀出样品处理单元中的裂解腔室(11)、洗涤腔室(12)、混合腔室(13)的边缘线及依次连通各腔室的微流控孔道，和与混合腔室(13)边缘线相接的液滴生成结构(2)；

S2、在硅片模具上浇铸形成样品处理单元、液滴生成结构的材料的预聚物和固化剂混合物，倒模后，在裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室的边缘线处打通孔，制成功能化结构；

S3、采用等离子键合封装技术，将功能化结构与基片的一端贴合，而形成连通的裂解腔室、洗涤腔室、混合腔室，以及与混合腔室连通的液滴生成结构；

S4、采用连接件将带有开孔的盖片与基片的另一端上下贴合形成液滴平铺腔室(3)，且所述液滴平铺腔室的开口端与所述液滴生成结构连通。

10.如权利要求1-8任一项所述的全流程集成液滴数字PCR芯片或采用权利要求9全流程集成液滴数字PCR芯片的制备方法制备的PCR芯片在生物分子检测中的应用。

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