CN112176036A - 单分子收集方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单分子收集方法和收集系统，其中单分子收集方法包括：将待分离的单分子样品与反应试剂混合在一起，通过液滴制备技术，将单分子与反应试剂包裹到一个液滴中；通过信号放大系统将液滴中的单分子信号进行放大；对液滴中的信号进行检测；通过液滴收集系统，将包含特定信号的目标液滴收集出来，实现单分子的收集。本发明的收集方法具有快速，高通量，低成本的特点，可以实现单分子的高通量检测，捕获，收集，可以广泛应用于分子进化、合成生物学、分子筛选、抗体工程、酶工程、靶向测序等领域。

Description

单分子收集方法及系统

技术领域

本发明涉及一种单分子收集技术，特别涉及单分子收集方法及系统。

背景技术

随着科学研究的深入，我们经常需要对复杂样品中特定的单个分子进行研究。在抗体筛选、酶的进化以及核酸适配体筛选等实验中，需要从复杂的分子文库中，分选出具有特定性质的分子。传统的方法耗时费力，而且周期很长。因此开发出直接从复杂分子库中，收集出单个分子的技术具有重要的意义。单分子收集可用于检测核酸与核酸、核酸与蛋白相互作用、可以用于抗体筛选、酶进化、核酸适配体筛选、核酸单分子测序等。单分子收集技术可以显著提高生命科学研究的效率，生物学家可以快速、高通量检测样本中致病基因的变化，获得高亲和力的核酸适配体等。以核酸适配体的筛选为例，传统的筛选方法在获得富集的文库分子之后，还需要进行高通量测序、生物信息学分析、合成单克隆、检测亲和力等步骤。利用本发明的方法，可以一步完成从筛选到鉴定的所有步骤，大大提升了效率。

目前还没有能从复杂体系中高通量分选出特定单分子的方法，急需低成本，高通量的技术来弥补现有技术的不足。传统的分选流式细胞仪只能用来分选固相的材料，如细胞，或者微珠。已有研究人员尝试将液滴离线进行双层包裹后，利用流式进行收集。但该方法会涉及液滴破碎，融合，液滴不稳定等诸多问题，而且步骤繁杂。本发明利用一体化的装置，可以实现快速、简便、高通量的单分子收集。与现有方法相比，操作简单，整个单分子收集过程可以通过一体化仪器完成，避免传统方法多次转移样品带来的液滴破碎，融合等问题。同时，将传统的流式细胞分选技术拓展到分子水平的收集，为多个领域提供了强大的研究工具。目前即便是最高通量的药物自动化筛选仪器，通量每天也只有数万到百万。如果能实现液滴中单分子的分选，筛选通量可以轻松突破千万液滴。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种单分子的检测与收集方法，从多分子的混合物中，快速简便的收集得到大量特定的单分子。

本发明一方面提供一种单分子收集方法，包括：

将待分离的单分子样品与反应试剂混合在一起，通过液滴制备技术，将单分子与反应试剂包裹到一个液滴中；

通过信号放大系统将液滴中的单分子信号进行放大；

对液滴中的信号进行检测；

通过液滴收集系统，将包含特定信号的目标液滴收集出来，实现单分子的收集。

在进一步的实施方式中，单分子是核酸或者可以被核酸标记的物质。

在进一步的实施方式中，可以被核酸标记的物质为小分子、小肽、核酸、蛋白质、酶分子或者细胞。

在进一步的实施方式中，反应试剂是能够对待测目标分子进行信号放大的各种成分的试剂，包括聚合酶链式反应体系。

在进一步的实施方式中，通过信号放大系统将液滴中的单分子信号进行放大，包括：通过聚合酶链式反应、酶促反应方法或链置换反应。

在进一步的实施方式中，对液滴中的信号进行检测包括：采集每个液滴特定目标分子的发射波长信息，或者采集每个液滴的前向散射或侧向散射信息。

在进一步的实施方式中，将包含特定信号的液滴收集出来，包括：通过外加电场或磁场使目标液滴偏转，将目标液滴牵引至特定的收集容器中。

在进一步的实施方式中，液滴加电的方法包括：将油包水的液滴进行双层包裹，使其形成水包油包水的双包液滴，以便使液滴能够带电，从而使目标液滴在电场中实现偏转。

本发明另一方面，提供了一种单分子收集系统，包括：

反应试剂储存装置，用于储存单分子的混合样品和反应试剂；

动力装置，用于推动反应试剂与单分子以及油相相互混合；

液滴发生装置，经推动的反应试剂、单分子和油相在其中生成油相包裹单分子的单层包裹液滴；

液滴PCR反应模组，用于对液滴内的单分子信号进行放大；

液滴双层包裹装置，进一步通过鞘液包裹液滴，形成双层包裹液滴；

信号检测器，用于对液滴中的信号进行检测；液滴收集装置，用于将包含特定信号的目标液滴收集出来，实现单分子的收集。

在进一步的实施方式中，信号检测器和液滴收集装置为集成的流式分选系统。

本发明还提供一种应用上述的单分子收集系统，进行单分子DNA的收集，核酸适配体的筛选，分子间的相互作用研究，突变的检测，酶进化、合成生物学设计或靶向片段测序。

本发明具有快速，高通量，低成本的特点，通过这些装置的配合使用可以实现单个分子的高通量检测，捕获，收集。该技术和装置可以广泛应用于分子进化、合成生物学、分子筛选、抗体工程、酶工程、靶向测序等领域。

附图说明

图1为本发明实施例的单分子收集方法示意图；

图2为本发明实施例的单分子收集系统；

图3为双层包裹的液滴示意图；

图4为一种实施例的贝克曼超高速流式分选系统MoFlo采用的进样方式示意图；

图5为流式细胞仪液滴检测和分选设置图；

图6A为单分子收集系统收集得到双层包裹了目标分子的液滴，由图 A的明场和荧光的图片；分选之前的液滴荧光值有高有低，经过分选后，荧光值高的液滴被收集到。图6B为收集到的荧光值高的液滴的放大图片；

图7为实施例3中荧光定量PCR检测收集到的不同数量液滴的扩增情况示意图；

图8为本发明实施例的双层包裹液滴最外层液滴大小伴随流量变化情况示意图；

图9为将液滴偏转收集到玻璃片上，用荧光显微镜观察拍照记录示意图。

图10为实施例4中荧光定量PCR检测收集到的不同数量液滴的扩增情况示意图。

具体实施方式

本发明是通过以下技术方案实现的：第一步将样品进行单分散，并与反应试剂混合在一起；第二步，通过液滴制备技术，将样品进行稀释与反应试剂一起包裹到液滴中，每个液滴包含最多一个目标分子；第三步，将液滴中的目标分子信号进行放大(例如通过信号放大系统，如液滴PCR 反应模组)；第四步，利用激光诱导荧光或其它高灵敏的检测技术对液滴中的信号进行检测；第五步，通过收集系统将包含特定信号的液滴收集出来，从而实现单个目标分子的收集。

所述的第一步中样品可以为核酸，或者能被核酸标记的样品例如细胞或者其它物质。反应试剂可以为各种试剂、缓冲液，如PCR反应体系等。上述的用核酸进行标记的分子或细胞：是指可以利用液滴数字PCR技术检测到单个的标记DNA分子，如果满足要求，则将该液滴中包含的目标分子收集出来。

关联的其它物质：特定的颗粒、分子等，只要能带上特定的DNA标记，都可以将其分选出来。

所述的第二步通过液滴制备技术，将混合好的单分子与反应试剂包裹到液滴中，每个液滴包含一个或者零个目标分子(即模板)，同时每个液滴中都加入了荧光标记过的探针或者DNA染料，最后可以通过荧光信号的强度表征是否包含目标分子。

所述的第三步的信号放大可以为液滴数字PCR方法或者其它方法，扩增单个DNA分子。

所述的第四步对液滴中的信号进行检测，可以为使用不同波长的激发光束照射，采集每个液滴特定的发射波长的荧光数据，也可以为其它方法例如磁场力，散射信号等。

所述的第五步收集系统，可以为通过给目标液滴加电偏转收集，或者其它收集方法。

进一步的，提供一种基于上述单分子收集技术方案的单分子收集系统。包括反应试剂储存装置，动力装置，液滴发生装置，液滴PCR反应模组 (或单分子信号放大装置)，荧光检测控制器，液滴收集装置，PC控制模块。

利用单分子DNA的标记技术，单分子收集的应用非常广泛。基于该装置可以快速测量、存贮、显示分散在液滴中的单分子的一系列重要特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的液滴亚群从中分选出来。

进一步，基于上述单分子收集系统应用到检测两个单分子相互作用。分别将两个分子带上不同的DNA序列标签，采用单分子包裹技术，如果检测到液滴中同时存在两个分子，则根据概率可以判定，两者是否有相互作用关系。这点，也可以发展成核酸适配体筛选技术，直接可以获得与靶标物质结合的核酸适配体分子。

进一步，基于上述单分子收集系统应用到转基因插入位置检测：目前为了检测转基因插入到基因组的位置，通常是将整个基因组测序，而不是只针对目标基因进行测序。如果能实现单分子收集，就可以收集出带有目标基因的染色体片段，针对性测序，大幅降低成本，提升效率。

进一步，基于上述单分子收集系统应用到酶进化、合成生物学等多分子的进化筛选。

本发明方法中，液滴生成装置的进样速度用精密进样控制器控制，可以控制生成的液滴大小和数量。与现有技术相比，本发明具有如下的优点：制备出的目的液滴数量多，实现超高通量的分选。直接获得目标液滴，准确、便捷，不需要借助光学显微镜或荧光显微镜辅助，也不需要复杂而缓慢的光镊、磁镊或原子力显微镜操作步骤，不需要使用单细胞收集仪器和芯片；目的液滴里的单分子经修饰可用于在单分子水平研究DNA与相关蛋白相互作用、单细胞测序样品制备、核酸适配体的快速筛选、分子进化、合成生物学、抗体工程、酶工程、靶向测序等领域。

目前的流式细胞仪尽管可以收集单细胞，但只能通过抗体标记特定的蛋白。无法标记特定的DNA或RNA分子。本发明中可以将单细胞包裹在液滴中，通过设计探针，检测细胞中是否包含特定的DNA或RNA序列，如果检测到包裹的细胞中包含某个特定的DNA或RNA片段，则将包含了这个细胞的液滴收集出来。

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造商所建议的条件进行。

实施例1

本实施例为一种基于贝克曼超高速流式分选系统MoFlo进行单分子收集的装置

如图2所示，本装置包括反应试剂储存装置，动力装置，液滴发生装置，液滴PCR反应模组，液滴双层包裹装置，贝克曼超高速流式分选系统MoFlo的检测和分选模块。

首先将样品用PCR反应试剂稀释进行单分散，分散好的样品通过反应试剂推进器以及油相推进器推进入液滴发生装置中，在液滴发生装置中产生大量油包反应试剂皮升级液滴，通过反应试剂推进器以及油相推进器来调节液滴发生装置的进出口流量，进而形成对液滴生成以及液滴大小的控制；液滴发生装置的出口接入液滴PCR反应模组，通过热循环温度控制模块对样品温度进行控制；液滴在热循环模块中经过热循环后实现信号放大，出口的液滴再一次进行包裹，即形成双层包裹的液滴。

双层包裹的液滴直接接入流式分选仪器的进样管，如图3所示。液滴经过样品管后在鞘液的包裹下从喷嘴射出，鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周。由于鞘液的作用，被检测液滴限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。压电晶体在相应频率的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成稳定的液滴。反应后的液滴通过荧光检测控制器，荧光检测控制器对已经通过热循环后的液滴进行实时在线荧光检测，液滴通过荧光检测位置后，进入到流式细胞仪的充电电路和偏转板，仪器对选定的荧光信号的包裹了液滴的鞘液滴进行充电，带电的鞘液液滴携带产生的反应液滴通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉。这样，通过上述单分子分散与信号放大装置与流式分选系统的结合，实现了单分子的收集。

实施例2

本实施例中用基于贝克曼超高速流式分选系统MoFlo的单分子收集系统，采用200μm喷嘴收集到双层包裹的液滴

配制2×PBS(NaCl：16g/L，KCl：0.4g/L，Na2HPO4：2.3g/L， KH2PH4：0.4g/L，CaCl2：0.2g/L，MgCl2·6H2O：0.2g/L；PH7.4)，然后按照质量比1：1将甘油与该PBS混合均匀后，加入1％的表面活性剂F127。用0.45μm滤膜的过滤装置抽滤后，121度灭菌30分钟。冷却后作为流式细胞仪的鞘液。

按照步骤1中配制好的鞘液，取出一部分作为连续相流体，采用添加 EM90的矿物油作为中间层，含有目标DNA模板的样品则作分散相流体，以此来产生含有模板分子的单分散液滴。其中，矿物油内所含的EM90体积分数为2％，含有DNA模板的样品具体配比如下：每1mL PCR Mix反应试剂中含873μL的ddH2O、100μL的10×Buffer、20μL的dNTP Mix、 0.9μL的Lib5S1、0.9μL的Lib3A2以及5μL的Pfu酶5U/mL，待上述配比完成后，再向其中加入4％的EvaGreen染料,该染料与DNA结合后，受特定波长的光激发后会产生荧光，其荧光强度可用于表征本实验扩增效率。

模板信息如下：

5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-40N-CCTATGCGTGCTACCGTGAA

-3’，其中，“40N”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该模板由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物信息如下：正向引物

5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-3’，反向引物为

5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’

通过反应试剂推进器以及油相推进器将试剂推进入液滴发生装置中，形成第一层包裹，通过调整推进器流量来控制液滴发生装置所生成液滴大小。在液滴发生装置中产生大量油包反应试剂的皮升级液滴；液滴发生装置出口与热循环模块入口相连接。

热循环扩增：热循环温度控制模块对流道的温度进行控制，热循环模块是一个呈8字形均匀缠绕于两个不同温度刚性圆柱体上的流道，液滴在流道中沿着两个不同温度区的圆柱体来回稳定流动，圆柱体中间部位安置圆柱形加热装置的孔槽，两个圆柱体分别控制为95度和60度，来回共缠绕50圈，即扩增50个循环。

液滴经过热循环后再通过鞘液相包裹最外层，形成双层包裹的液滴，结构图如图3。具有拉尖结构的铁三通作为液滴发生器，分散相：油相：鞘液相流量比稳定在一定比例，从而生成不同大小的双层包裹的液滴。图 8为双层包裹液滴最外层液滴大小伴随流量变化情况，其中，Q_i表示内层流量，Qm表示中间层流量，Q_o表示外层流量，D表示外层液滴的直径，d表示内层液滴的直径。

将双层包裹的液滴推入流式细胞仪(型号为：Beckman Coulter MoFlo Astrios)的流动室，进样方式如图4。鞘液包裹着液滴通过200μm的喷嘴后被检测到。流式细胞仪设置的参数为：鞘液压力17psi，震荡频率为 12000Hz，振幅80.

通过流式细胞仪实现液滴的检测和收集，通常用两种散射方向的散射光进行测量：前向角散射FSC和侧向散射SSC。在本实验中液滴荧光检测结果中，前向散射光FSC的测量值反映的便是液滴的大小，而侧向散射光 SSC的测量值反映的则是液滴的内部结构。基于在之前的样品配制中，使用的荧光染色剂Evagreen染料，其与双链DNA模板结合后，受到488nm 波长的激光的激发便会发出绿色的荧光，故在进行检测时，通过FSC和 SSC选择我们需要的颗粒群，再通过采集488激发，513发射通道的荧光值的高低，选择我们需要分选的细胞群。见图5，将液滴偏转收集到玻璃片上，用荧光显微镜观察拍照记录。如图6A和图6B所示，图6A显示分选前和分选后的液滴图片，可以看出我们通过流式细胞仪的设门，可以收集到的需要的荧光值高的液滴，图6B图显示收集到的荧光液滴的放大图片。

实施例3

本实施例为荧光定量PCR鉴定收集不同数量液滴后的扩增情况

按照实施例2中所述的实验步骤，分别收集不同数量的液滴到96孔 PCR管中，PCR管中每孔已经分装了30ul mix。Mix配方为每1mL含873μL 的ddH2O、100μL的10×Buffer、20μL的dNTP Mix、0.9μL的正向引物、0.9μL的反向引物以及5μL的Pfu酶5U/ml，4％的EvaGreen染料。引物信息同实施例2。

收集后混匀离心，使用荧光定量PCR扩增，扩增程序为：98℃预变性2分钟，98℃30s，60℃30s，72℃30s扩增35个循环。

得到扩增曲线见图7。可以看出不同液滴数量扩增出来的Cq值有规律的差异，反应出模板数的差别，进一步验证了我们收集到的液滴的准确性。

实施例4

本实施例用基于贝克曼超高速流式分选系统MoFlo的单分子收集系统，采用120μm喷嘴收集到双层包裹的液滴

同实施例2的步骤1，配制2×PBS(NaCl：16g/L，KCl：0.4g/L， Na2HPO4：2.3g/L，KH2PH4：0.4g/L，CaCl2：0.2g/L，MgCl2·6H2O：0.2g/L； PH7.4)，然后按照质量比1：1将甘油与该PBS混合均匀后，加入1％的表面活性剂F127。用0.45μm滤膜的过滤装置抽滤后，121度灭菌30分钟。冷却后作为流式细胞仪的鞘液。

按照步骤1中配制好的鞘液，取出一部分作为连续相流体，采用添加 EM90的矿物油作为中间层，含有目标DNA模板的样品则作分散相流体，以此来产生含有模板分子的单分散液滴。其中，矿物油内所含的EM90体积分数为2％，含有DNA模板的样品具体配比如下：每1mL PCR Mix反应试剂中含873μL的ddH2O、100μL的10*Buffer、20μL的dNTP Mix、 0.9μL的Lib5S1、0.9μL的Lib3A2以及5μL的Pfu酶5U/mL，待上述配比完成后，再向其中加入4％的EvaGreen染料,该染料与DNA结合后，受特定波长的光激发后会产生荧光，其荧光强度可用于表征本实验扩增效率。

模板信息如下：

5’-GCACGACACCACGACAAGT-38N-TGTCGTGGTGTGCTTCGTG- 3’其中，“38N”表示38个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该模板由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

引物信息如下：正向引物为：5‘-GCACGACACCACGACAAGT

反向引物为：5’-CACGAAGCACACCACGACA

引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

通过反应试剂推进器以及油相推进器将试剂推进入液滴发生装置中，形成第一层包裹，通过调整推进器流量来控制液滴发生装置所生成液滴大小。在液滴发生装置中产生大量油包反应试剂的皮升级液滴；液滴发生装置出口与热循环模块入口相连接。

热循环扩增：热循环温度控制模块对流道的温度进行控制，热循环模块是一个呈8字形均匀缠绕于两个不同温度刚性圆柱体上的流道，液滴在流道中沿着两个不同温度区的圆柱体来回稳定流动，圆柱体中间部位安置圆柱形加热装置的孔槽，两个圆柱体分别控制为95度和60度，来回共缠绕55圈，即扩增55个循环。

液滴经过热循环后再通过鞘液相包裹最外层，形成双层包裹的液滴，结构图如图3。具有拉尖结构的铁三通作为液滴发生器，分散相：油相：鞘液相流量比稳定在一定比例，从而生成不同大小的双层包裹的液滴。图 8为双层包裹液滴最外层液滴大小伴随流量变化情况。

将双层包裹的液滴推入流式细胞仪(型号为：Beckman Coulter MoFlo Astrios)的流动室，进样方式如图4。鞘液包裹着液滴通过120μm的喷嘴后被检测到。流式细胞仪设置的参数为：鞘液压力30psi，震荡频率为 32000HZ，振幅80。

通过流式细胞仪实现液滴的检测和收集，通常用两种散射方向的散射光进行测量：前向角散射FSC和侧向散射SSC。在本实验中液滴荧光检测结果中，前向散射光FSC的测量值反映的便是液滴的大小，而侧向散射光 SSC的测量值反映的则是液滴的内部结构。基于在之前的样品配制中，使用的荧光染色剂Evagreen染料，其与双链DNA模板结合后，受到488nm 波长的激光的激发便会发出绿色的荧光，故在进行检测时，通过FSC和 SSC选择我们需要分析的液滴群，再通过采集488激发，513发射通道的荧光值的高低，选择我们需要分选的液滴群。将液滴偏转收集到玻璃片上，用荧光显微镜观察拍照记录，如图9所示。

收集不同数量的液滴，步骤同实施例3，得到的扩增曲线见图10.

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种单分子收集方法，包括：

将待分离的单分子样品与反应试剂混合在一起，通过液滴制备技术，将单分子与反应试剂包裹到一个液滴中；

通过信号放大系统将液滴中的单分子信号进行放大；

对液滴中的信号进行检测；

通过液滴收集系统，将包含特定信号的目标液滴收集出来，实现单分子的收集。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单分子是核酸或者可以被核酸标记的物质。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述可以被核酸标记的物质为小分子、小肽、核酸、蛋白质、酶分子或者细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应试剂是能够对待测目标分子进行信号放大的各种成分的试剂，包括聚合酶链式反应体系。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过信号放大系统将液滴中的单分子信号进行放大，包括：

通过聚合酶链式反应、酶促反应方法或链置换反应。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对液滴中的信号进行检测包括：

采集每个液滴特定目标分子的发射波长信息，或者采集每个液滴的前向散射或侧向散射信息。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将包含特定信号的液滴收集出来，包括：

通过外加电场或磁场使目标液滴偏转，将目标液滴牵引至特定的收集容器中。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，液滴加电的方法包括：

将油包水的液滴进行双层包裹，使其形成水包油包水的双包液滴，以便使液滴能够带电，从而使目标液滴在电场中实现偏转。

9.一种单分子收集系统，其特征在于包括：

反应试剂储存装置，用于储存单分子的混合样品和反应试剂；

动力装置，用于推动反应试剂与单分子以及油相相互混合；

液滴发生装置，经推动的反应试剂、单分子和油相在其中生成油相包裹单分子的单层包裹液滴；

液滴PCR反应模组，用于对液滴内的单分子信号进行放大；

液滴双层包裹装置，进一步通过鞘液包裹液滴，形成双层包裹液滴；

信号检测器，用于对液滴中的信号进行检测；液滴收集装置，用于将包含特定信号的目标液滴收集出来，实现单分子的收集。

10.根据权利要求9所述的单分子收集系统，其特征在于，所述信号检测器和液滴收集装置为集成的流式分选系统。

11.应用权利要求9或10所述的单分子收集系统，进行单分子DNA的收集，核酸适配体的筛选，分子间的相互作用研究，突变的检测，酶进化、合成生物学设计或靶向片段测序。

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