CN116747917A - 一种微流控芯片及其应用 - Google Patents

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CN116747917A CN202310464191.6A CN202310464191A CN116747917A CN 116747917 A CN116747917 A CN 116747917A CN 202310464191 A CN202310464191 A CN 202310464191A CN 116747917 A CN116747917 A CN 116747917A
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刘一凡
施清源
李婕
张蓉
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Abstract

本申请公开了一种微流控芯片，所述微流控芯片上设置有稀释液入口、待稀释液入口、管道流阻、混沌微型混合器和阶梯乳化液滴生成器；所述管道流阻包括稀释液管道流阻及稀释模块出口管道流阻；所述稀释液管道流阻包括第1至第N级稀释液管道流阻，按照液流方向，所述稀释液入口依次连通各级稀释液管道流阻，N为大于1的整数；所述稀释模块出口管道流阻包括第1至第N级稀释模块出口管道流阻；所述混沌微型混合器包括第1至第N+1级混沌微型混合器，按照液流方向，所述待稀释液入口依次连通各级混沌微型混合器。

Description

一种微流控芯片及其应用
技术领域
本说明书涉及核酸检测技术领域，特别涉及一种微流控芯片及其应用。
背景技术
1983年PCR(聚合酶链式反应)技术的发明为分子生物学带来了技术上的巨大突破，目前已成为分子生物学最常用也最重要的一项技术，其应用范围从基因扩增到基因克隆、传染病源检测、遗传鉴定等。
PCR的发展进程总体而言可分为三代。第一代PCR技术采用利用凝胶电泳来进行终点分析以获得定性结果。第二代PCR技术是实时荧光qPCR技术，它利用荧光探针监测每个循环后的扩增进程来实现半定量。qPCR中定量信息需要通过循环阈值(CT)来获得，循环阈值是在标准荧光曲线上信号高于背景的一个点。因此需要利用标准曲线来定量未知浓度的样品，另外不完全的扩增效率会影响CT值，进而限制该技术绝对定量的准确性。数字PCR(dPCR)技术也被称为第三代PCR技术，是一种高灵敏检测和绝对定量的新方法。与传统的PCR相比，数字PCR增加了对反应体系进行分隔的操作，将几十微升的反应体系分隔成了数万个微小独立反应体系，稀释过的核酸模板在分隔过程中随机分装入这数万个反应体系中，根据泊松分布，有一些反应体系中含有一个或多个模板分子，而剩下的反应体系则不含有模板分子。经过扩增反应达到了PCR最终平台期后，含有模板分子的反应体系会变成阳性，而不含有模板分子的则保持为阴性。柏松统计原理如下公式所示，
λ＝-ln(1-p)
其中λ是每个反应单元内的目标DNA分子的平均数量，p是阳性液滴的比例，再通过液滴体积和数量的估计，从而得到定量靶标DNA浓度的估计值。
dPCR相较于qPCR有着很明显的优势。首先dPCR不需要依赖标准曲线和ct值来定量未知样品的浓度，而只需统计阴阳液滴的比例就能做到绝对定量靶标DNA。其次dPCR的结果不依赖于PCR的扩增效率，因此准确性会相对提高。目前已有文献报道，dPCR有高于qPCR500倍的灵敏度。另外dPCR具有很高的灵敏度和特异性，对突变基因和变异病毒的检测也非常准确。新型冠状病毒的流行衍生出了Delta、Lambda以及Omicron等变异株病毒，并已经出现在全球90多个国家，如何快速准确的诊断病毒特别是变异株，对治疗和防疫工作具有重要意义。基于dPCR的高灵敏度、高准确性以及抗干扰能力强等优点，更多的实验室和医院将目光投向dPCR技术。
由于dPCR是基于泊松分布的原理，其动态范围也受柏松统计原理的限制。当所有液滴中的DNA分子都大于1，也就是当所有液滴都为阳性液滴时，此时泊松统计失效，达到了检测上限。由于此特点，dPCR的动态范围往往与液滴数量在同一数量级，约为105拷贝左右，qPCR的动态范围在109拷贝左右。然而当医院进行病毒检测时，病人的病毒载量往往过于高，以至于超出了dPCR的动态检测范围，无法不稀释样本而达到绝对定量病毒载量，病毒载量通常是衡量病灶严重程度的重要指标，因此目前医院最常用的检测手段依然是qPCR技术。为了更早且更精确的检测出病毒以及其他罕见基因突变和变异株病毒，对于扩大动态范围的dPCR研究是十分有必要的。
目前为止也有许多工作努力提高dPCR的动态检测范围，有通过调节分装体积来实现的，Rustem实验室发明的滑动芯片通过改变反应腔室的容积来达到扩大反应的动态范围的目的，容积大的腔室可用于检测低浓度样本模板量，贡献检测下限，而容积小的腔室可用于检测高浓度样本模板，贡献检测上限，但缺点是动态范围仍然只有106拷贝左右并且腔室数量不到1000个，数据可靠性不够。
还有通过稀释来实现增加动态范围的，但是稀释方法仍然是手动稀释再进行分装入液滴。Garsteckid实验室设计的数字液滴集落形成单位通过在样品制备时将样品手动稀释成十个数量级，再通过这些样品分装入液滴，随后在液滴中孵育，最后对液滴的荧光信号进行分析，从而实现动态范围的增加，但显然该操作的步骤过于繁琐，不具有实际应用价值。因此，一种可以拓宽现有dPCR系统动态范围并实际应用的方法亟待被开发。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供一种适用于连续稀释液滴数字PCR(serialdilution droplet digital PCR，SD3PCR)的微流控芯片。
本申请提供一种微流控芯片，所述微流控芯片上设置有稀释液入口、待稀释液入口、管道流阻、混沌微型混合器、阶梯乳化液滴生成器；所述PCR预混液与所述样品和荧光指示剂溶液分别通过稀释液入口、待稀释液入口进入微流控芯片的管道流阻中；所述管道流阻包括稀释液入口管道流阻、蛇形稀释剂管道流阻和稀释模块出口管道流阻；所述混沌微型混合器通过所述稀释模块出口管道流阻与阶梯乳化液滴生成器连通。
本申请还提供一种数字PCR检测定量系统，包括上述的微流控芯片、液滴温度循环装置、光学成像与检测装置；所述微流控芯片用于将样本溶液进行稀释和包埋进入液滴；所述液滴温度循环装置用于对所述液滴进行温度循环以完成所述样本溶液的PCR扩增；所述光学成像与检测装置用于对完成PCR扩增的液滴进行荧光信号采集并绘制相应散点图以计算得到所述样本溶液的模板数量。
本申请还提供一种数字PCR定量检测方法，包括以下步骤：a.使用上任意项所述的微流控芯片将样本溶液进行稀释和包埋进入液滴；b.将液滴内样本溶液进行PCR反应；c.测量和编码液滴的PCR荧光值和指示剂荧光值；d.解码液滴的荧光值，区分液滴并计算初始拷贝数。
本申请还提供上述的微流控芯片、上述的数字PCR检测定量系统在制备数字PCR检测产品中的用途。
本说明书提出的微流控芯片，带来的有益效果包括但不限于：(1)生成液滴数量能够达到1～+∞个，使数据更可靠；(2)在保证液滴数量的同时得到四类浓度不同的液滴，四类液滴通过指示剂荧光信号区分，通过对数稀释初始样本来提高数字PCR的动态范围；(3)实现对样品溶液的连续稀释，从而扩大了ddPCR的动态检测范围至1×107。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1为根据本申请一些实施例所示的微流控芯片设计示意图；
图2为根据本申请一些实施例所示的微流控芯片设计示意图；
图3为根据本申请一些实施例所示的微流控芯片设计示意图；
图4为根据本申请一些实施例所示的微流控芯片设计示意图；
图5为根据本申请一些实施例所示的微流控芯片设计示意图；
图6为根据本申请一些实施例所示的阶梯乳化液滴部件实拍图；
图7为根据本申请一些实施例所示的PCR预混液和样品和荧光指示剂溶液的交界处实拍图；
图8为根据本申请一些实施例所示的微流控芯片设计示意图(A)和对应器件简化图(B)；
图9为根据本申请一些实施例所示的混沌微型混合器5的表征荧光显微镜照片，AA’和BB’分别对应通道的入口和出口；
图10为根据本申请一些实施例所示的混沌微型混合器5中AA’和BB’处的荧光强度分布图；
图11为根据本申请一些实施例所示的液滴滴落(dripping)状态示意图；
图12为根据本申请一些实施例所示的液滴喷射(jetting)状态示意图；
图13为根据本申请一些实施例所示的数字PCR的流程图；
图14为根据本申请一些实施例所示的稀释不同浓度的荧光溶液的稀释曲线图；
图15为根据本申请一些实施例所示的荧光溶液预期浓度和实际浓度的正交对比图；
图16A为根据本申请一些实施例所示的四类液滴的明场实拍图；
图16B为根据本申请一些实施例所示的四类液滴的荧光场实拍图；
图16C为根据本申请一些实施例所示的四类液滴荧光值分布图；
图16D为根据本申请一些实施例所示的四类液滴的直径分布图；
图17为根据本申请一些实施例所示的HPV16质粒在对数稀释数字PCR和普通数字PCR的结果图；
图18为根据本申请一些实施例所示的使用SD3PCR系统检测HPV16质粒的结果图。
附图说明：
1：稀释液入口；
2：待稀释液入口；
3：阶梯乳化液滴生成器；
31：油相入口；
32：液滴出口；
33：液滴储存器；
34：阶梯乳化液滴部件；
341：第1级阶梯乳化液滴部件；
3411：阶梯乳化液滴管道；
3412：楔形管道；
342：第2级阶梯乳化液滴部件；
343：第3级阶梯乳化液滴部件；
344：第4级阶梯乳化液滴部件；
4：管道流阻；
41：稀释液入口管道流阻；
42：稀释液管道流阻；
421：第1级稀释液管道流阻；
422：第2级稀释液管道流阻；
423：第3级稀释液管道流阻；
43稀释模块出口管道流阻；
431：第1级稀释模块出口管道流阻；
432：第2级稀释模块出口管道流阻；
433：第3级稀释模块出口管道流阻；
434：第4级稀释模块出口管道流阻；
5：混沌微型混合器；
51：第1级混沌微型混合器；
52：第2级混沌微型混合器；
53：第3级混沌微型混合器；
54：第4级混沌微型混合器；
6：直形管道流阻；
61：第1级直形管道流阻；
62：第2级直形管道流阻；
63：第3级直形管道流阻；
64：第4级直形管道流阻；
7：稀释液入口流阻管道；
8：直形稀释液管道流阻
9：分流管道；
91：第1级分流管道；
92：第2级分流管道；
93：第3级分流管道。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
在进行生物研究和实际检测时，有时待测DNA样品的量较少或者从样品中提取的待测DNA分子浓度较低时，为了得到较好的结果，通常需要先对样品分子的量进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。
基于微流控技术发展产生的数字PCR，具有比常规的PCR更小的反应体积、更快的反应速度、更低的系统噪声和更高的灵敏度。数字PCR技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面体现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。目前市场上常见的数字PCR技术依赖于微流控液滴芯片、硅片微孔阵列、压电喷头和PDMS阵列等方式。微流控液滴芯片的操作需要连接泵等设备，操作复杂；微液滴的形成和运输对连续相液体要求较高，否则有液滴破裂的风险。
本申请提供一种微流控芯片，如图1-图6所示，所述微流控芯片上设置有稀释液入口(1)、待稀释液入口(2)、管道流阻(4)、混沌微型混合器(5)和阶梯乳化液滴生成器(3)；所述管道流阻(4)包括稀释液管道流阻及稀释模块出口管道流阻；所述稀释液管道流阻包括第1至第N级稀释液管道流阻，按照液流方向，所述稀释液入口(1)依次连通各级稀释液管道流阻，N为大于1的整数；所述稀释模块出口管道流阻包括第1至第N级稀释模块出口管道流阻；
所述混沌微型混合器(5)包括第1至第N+1级混沌微型混合器，按照液流方向，所述待稀释液入口(2)依次连通各级混沌微型混合器；第n级稀释液管道流阻的进液端均设有接通第n级混沌微型混合器进液端的分支管道，所述n选自1～N，第N级稀释液管道流阻的出液端连通第N+1级混沌微型混合器进液端；第n级混沌微型混合器的出液端至第n+1级混沌微型混合器的入液端之间设有分支管道，所述分支管道经第n级稀释模块出口管道流阻连通所述阶梯乳化液滴生成器(3)，所述n选自1～N；第N+1级混沌微型混合器的出液端连通所述阶梯乳化液滴生成器(3)。
在一些实施例中，所述稀释液可以为PCR预混液。在一些实施例中，所述PCR预混液可以包括PCR反应所需的所有试剂和酶。在一些实施例中，所述待稀释液可以为样品溶液。在一些实施例中，所述样品可以为病毒DNA分子。在一些实施例中，所述待稀释液可以为荧光指示剂溶液。在一些实施例中，所述荧光指示剂可以为异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、藻红蛋白(PE)以及AlexaFluor系列染料等。在一些实施例中，所述待稀释液可以为样品和荧光指示剂的混合液。在一些实施例中，所述荧光指示剂可以与样品结合。在一些实施例中，可以利用荧光指示剂的荧光强度计算样品含量或拷贝数。在一些实施例中，PCR预混液可以通过稀释液入口1进入微流控芯片。在一些实施例中，样品溶液、荧光指示剂溶液或样品和荧光指示剂混合液可以通过待稀释液入口2进入微流控芯片。在一些实施例中，稀释液和待稀释液可以分别通过输送泵进入微流控芯片。
所述管道流阻(4)还包括待稀释液入口管道流阻(41)，设于待稀释液入口(2)与第1级混沌微型混合器(51)之间；所述第n级稀释液管道流阻小于第n+1级稀释液管道流阻；所述第n级稀释模块出口管道流阻大于第n+1级稀释模块出口管道流阻；所述管道流阻(4)还包括第N+1级稀释模块出口管道流阻，第N+1级混沌微型混合器的出液端经所述第N+1级稀释模块出口管道流阻连通所述阶梯乳化液滴生成器(3)；在一些实施例中，所述N可以小于12，例如N为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。在一些实施例中，优选的，N可以为3。
在一些实施例中，所述管道流阻(4)均可以为蛇形管道流阻。需要说明的是，图1-图4中所示管道流阻和混沌微型混合器的数量只是为了解释说明，并不能限制本发明的范围。例如，稀释液管道流阻的数量可以是2、4、6等。
所述阶梯乳化液滴生成器(3)设置有油相入口(31)和液滴出口(32)、液滴储存器(33)和阶梯乳化液滴部件(34)，所述油相入口(31)和液滴出口(32)之间通过液滴储存器(33)连通；所述阶梯乳化液滴部件(34)包括第1至第N+1级阶梯乳化液滴部件，第n级稀释模块出口管道流阻经第n级阶梯乳化液滴部件连通所述液滴储存器(33)，所述n为1～N，第N+1级混沌微型混合器的出液端经第N+1级阶梯乳化液滴部件连通所述液滴储存器(33)。
在一些实施例中，所述阶梯乳化液滴部件(34)可以包括若干连通液滴储存器(33)的出液口。在一些实施例中，所述出液口可以为楔形喷嘴。
为了获得所需的液滴稀释倍数，在一些实施例中，所述稀释液与所述待稀释液可以按照预设的流量比例分别通过稀释液入口1、待稀释液入口2进入微流控芯片的管道流阻4中。在一些实施例中，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为18:1～40:1。在一些实施例中，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为20:1～38:1。在一些实施例中，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为22:1～36:1。在一些实施例中，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为24:1～34:1。在一些实施例中，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为26:1～32:1。在一些实施例中，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为28:1～30:1。在一些实施例中，优选的，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为20:1～36:1。在一些实施例中，进一步优选的，所述稀释液与所述待稀释液预设流量比例可以为20:1。
示例性的，当N为3时，可以将待稀释液连续稀释4个梯度，下面以N为3为例进一步详细描述本申请提供的微流控芯片。所述管道流阻4包括稀释液入口管道流阻41、稀释液管道流阻42、稀释模块出口管道流阻43。在一些实施例中，所述稀释液管道流阻42可以包括第1级稀释液管道流阻421、第2级稀释液管道流阻422和第3级稀释液管道流阻423。所述第1级稀释液管道流阻421、第2级稀释液管道流阻422和第3级稀释液管道流阻423之间通过直行稀释液管道流阻8连通，所述第1级稀释液管道流阻421、第2级稀释液管道流阻422和第3级稀释液管道流阻423的流阻依次增大。
在一些实施例中，所述稀释模块出口管道流阻43可以包括第1级稀释模块出口管道流阻431、第2级稀释模块出口管道流阻432、第3级稀释模块出口管道流阻433和第4级稀释模块出口管道流阻434，所述第1级稀释模块出口管道流阻431、第2级稀释模块出口管道流阻432、第3级稀释模块出口管道流阻433和第4级稀释模块出口管道流阻434的流阻依次减小。
在一些实施例中，所述稀释液管道流阻42内通有稀释液。在一些实施例中，所述稀释液管道流阻42可以用于给稀释液的流动增加阻力。在一些实施例中，所述稀释模块出口管道流阻43中通有待稀释液。在一些实施例中，稀释模块出口管道流阻43可以用于给待稀释液的流动增加阻力。
所述稀释液管道流阻42通过直形管道流阻6与混沌微型混合器5连通，在一些实施例中，所述直形管道流阻6包括第1级直形管道流阻61、第2级直形管道流阻62、第3级直形管道流阻63和第4级直形管道流阻64，第1级直形管道流阻61、第2级直形管道流阻62、第3级直形管道流阻63和第4级直形管道流阻64从微流控芯片入口端到出口端依次排列。
所述稀释液入口1与所述第1级稀释液管道流阻421之间设有稀释液入口管道流阻7；所述稀释液入口管道流阻7分别与第1级稀释液管道流阻421和第1级直形管道流阻61相通，
在一些实施例中，所述混沌微型混合器5可以包括第1级混沌微型混合器51、第2级混沌微型混合器52、第3级混沌微型混合器53和第4级混沌微型混合器54。在一些实施例中，所述第1级混沌微型混合器51、第2级混沌微型混合器52、第3级混沌微型混合器53和第4级混沌微型混合器54之间通过分流管道9连通。在一些实施例中，所述分流管道9可以包括第1级分流管道91、第2级分流管道92和第3级分流管道93。
所述混沌微型混合器5通过所述稀释模块出口管道流阻43与阶梯乳化液滴生成器3连通。在一些实施例中，管道可以是方形管道，因此管道流阻与长度成正比，与宽度成反比。在一些实施例中，混沌微型混合器5底部可以使用浮雕的人字形结构(本结构中设计为整体微通道高度的二分之一)，从而产生稳定的压力驱动流使流体倾向均匀化。在一些实施例中，混沌微型混合器5内部可以设置挡板或桨叶。在一些实施例中，混沌微型混合器5可以将稀释液和待稀释液混合均匀。
每一次稀释的浓度由样品和荧光指示剂溶液与PCR预混液(稀释液)交界处(如图7所示)两个流速的比值决定。待稀释样品与所述PCR预混液在交界处融合后，将所述组合的溶液通过混沌微型混合器5区域进行混合。稀释的性能取决于PCR预混液和样品和荧光指示剂溶液的流速和混合效果。根据流体力学原理，微流体回路可类比为电路，根据基尔霍夫电压定律：在任何一个闭合回路中，各元件上的电压降的代数和等于电动势的代数和，即从一点出发绕回路一周回到该点时，各段电压的代数和恒等于零。在微通道中，流体流率可以类比为电压Q，管道可以类比为电阻R，输出的流量可以类比为电流V，如图8所示，本微流控器件可简化为电路图，稀释液入口流阻管道7可表示为A1的电阻示意图，第1级稀释液管道流阻421表示为A2，第2级稀释液管道流阻422表示为A3，第3级稀释液管道流阻423表示为A4；第1级直形管道流阻61表示为B1，第2级直形管道流阻62表示为B2，第3级直形管道流阻63表示为B3，第4级直形管道流阻64表示为B4；稀释液入口管道流阻41表示为D1，第1级分流管道91表示为D2，第2级分流管道92表示为D3，第3级分流管道93表示为D4；第1级混沌微型混合器51表示为M1，第2级混沌微型混合器52表示为M2，第3级混沌微型混合器53表示为M3，第4级混沌微型混合器54表示为M4；第1级稀释模块出口管道流阻431和第1级阶梯乳化液滴部件341表示为C1，第2级稀释模块出口管道流阻432和第2级阶梯乳化液滴部件342表示为C2，第3级稀释模块出口管道流阻433和第3级阶梯乳化液滴部件343表示为C3，第4级稀释模块出口管道流阻434和第4级阶梯乳化液滴部件344表示为C4。
微流体管道内内流过B1、B2、B3、B4流阻内的液体的流率为QBK，其中K＝1,2,3,4。流过D1、D2、D3、D4、流阻内液体的流率为QDK，流过A1、A2、A3、A4流阻内的液体的流率为QAK，流过C1、C2、C3、C4流阻内的液体的流率为QCK。
稀释模块出口管道内流体的流率表示为为和/>对应的出口流量分别为/>和/>混沌微混合器5M1、M2、M3、M4和缓冲分配通道6B1、B2、B3、B4流阻的流体阻力分别用/>和/>来表示，以及收集出口需要补充的分流管道之间的简单连接通道阻力用/>表示。可调电阻为缓冲入口通道电阻/>和出口通道电阻/>如公式(1和公式(2所示。各通道尺寸如表1所示。
表1SD3PCR微流控器件微通道尺寸
PCR预混液中含有生物大分子，经过稀释后的样品和稀释液需要经过充分的混合，否则会导致PCR反应的不完全。为了达到理想的稀释性能，我们测试了混沌微型混合器5的混合性能。将混沌微型混合器5放入2cm的长直线微通道中如图9所示，其中，AA’和BB’分别对应通道的入口和出口。我们将荧光溶液和去离子水分别注入混沌微型混合器5设计的两个入口中。在微通道的入口和出口区域的荧光图像如图10所示，图10展示了微通道位移和荧光强度的关系。从图10可以看出，入口处(AA’的荧光强度有明显的不连续性，出口处(BB’荧光比较均匀，说明在经过混沌微型混合器5后的溶液在出口处(BB’得到了比较彻底的混合，证明了混沌微型混合器5的混合效率。
所述阶梯乳化液滴生成器3包括油相入口31和液滴出口32、液滴储存器33和阶梯乳化液滴部件34，所述阶梯乳化液滴部件34用于连通稀释模块出口管道流阻43和液滴储存器33；所述阶梯乳化液滴部件34包括第1级阶梯乳化液滴部件341、第2级阶梯乳化液滴部件342、第3级阶梯乳化液滴部件343和第4级阶梯乳化液滴部件344。
阶梯乳化是一种可用于微尺度液滴生成的技术，可以生成直径从几纳米到数百微米的液滴。本申请的阶梯乳化液滴部件34使稀释模块出口管道流阻43中的水相进入阶梯乳化液滴管道后产生两个支流，进一步进入楔形管道产生4个支流，即本申请的阶梯乳化液滴生成器3可以一次生成8个液滴。
如图6所示，所述第1级阶梯乳化液滴部件341包括阶梯乳化液滴管道3411和楔形管道3412，所述楔形管道3412的喷嘴延伸至液滴储存器33内部。在一些实施例中，所述液滴储存器33中储有油相。
本文中使用的术语“油相”意指与水相(water phase)或水相(aqueous phase)不混溶的液相。油相的实例包含但不限于聚丙二醇(PPG)、矿物油(例如，粘度是水相粘度的至少2.5倍的矿物油)、与水不混溶的任何高粘度(例如，1,300cP)液体。
本申请中所述稀释液、待稀释液均为水相。在一些实施例中，水相和油相的流动均由注射泵维持。在一些实施例中，水相和油相的流动均由蠕动泵维持。
第2级阶梯乳化液滴部件342、第3级阶梯乳化液滴部件343和第4级阶梯乳化液滴部件344的结构与第1级阶梯乳化液滴部件341相同，未示出放大图。
在一些实施例中，稀释液经过稀释液入口管道流阻7后，一部分直接进入第1级稀释液管道流阻421，一部分通过第1级直形管道流阻61进入第1级混沌微型混合器51。同时，待稀释液经过稀释液入口管道流阻41，进入第1级混沌微型混合器51。在一些实施例中，稀释液与待稀释液在第1级混沌微型混合器51中混合完全，实现对待稀释液的第一次稀释，得到第一混合液。在一些实施例中，第1级混沌微型混合器51中部分第一混合液可以通过第1级分流管道91进入第1级稀释模块出口管道流阻431，并通过第1级阶梯乳化液滴部件341进行液滴的分装。在一些实施例中，第一混合液可以通过阶梯乳化液滴管道3411进入楔形管道3412。在一些实施例中，第一混合液可以通过楔形管道单元3412形成液滴。在一些实施例中，液滴可以进入液滴储存器33中并通过液滴出口32进行收集。
在一些实施例中，第1级稀释液管道流阻421的稀释液部分通过直行稀释液管道流阻8进入第2级稀释液管道流阻422，部分通过第2级直形管道流阻62进入第2级混沌微型混合器52。在一些实施例中，第1级混沌微型混合器51中部分第一混合液可以通过第1级分流管道91流入第2级混沌微型混合器52，稀释液与第一混合液在第2级混沌微型混合器52中混合完全，实现对待稀释液的第二次稀释，得到第二混合液。在一些实施例中，第2级混沌微型混合器52中部分第二混合液可以通过第2级分流管道92进入第2级稀释模块出口管道流阻432，并通过第2级阶梯乳化液滴部件342进行液滴的分装。在一些实施例中，液滴可以进入液滴储存器33中并通过液滴出口32进行收集。
在一些实施例中，第2级稀释液管道流阻422的稀释液部分通过直行稀释液管道流阻8进入第3级稀释液管道流阻423，部分通过第3级直形管道流阻63进入第3级混沌微型混合器53。在一些实施例中，第2级混沌微型混合器52中部分第二混合液可以通过第2级分流管道92流入第3级混沌微型混合器53，稀释液与第二混合液在第3级混沌微型混合器53中混合完全，实现对待稀释液的第三次稀释，得到第三混合液。在一些实施例中，第3级混沌微型混合器53中部分第三混合液可以通过第3级分流管道93进入第3级稀释模块出口管道流阻433，并通过第3级阶梯乳化液滴部件343进行液滴的分装。在一些实施例中，液滴可以进入液滴储存器33中并通过液滴出口32进行收集。
在一些实施例中，第3级稀释液管道流阻423的稀释液部分通过直行稀释液管道流阻8进入第4级稀释液管道流阻424，部分通过第4级直形管道流阻64进入第4级混沌微型混合器54。在一些实施例中，第3级混沌微型混合器53中部分第三混合液可以通过第3级分流管道93流入第4级混沌微型混合器54，稀释液与第三混合液在第4级混沌微型混合器54中混合完全，实现对待稀释液的第四次稀释，得到第四混合液。在一些实施例中，第4级混沌微型混合器54中第三混合液可以进入第4级稀释模块出口管道流阻434，并通过第4级阶梯乳化液滴部件344进行液滴的分装。在一些实施例中，液滴可以进入液滴储存器33中并通过液滴出口32进行收集。
液滴的生成需要利用阶梯乳化液滴部件34，阶梯乳化液滴部件34产生液滴的原理主要是通过将分散相通过一个浅的楔形通道3412注入到一个比最终液滴直径更深并包含油相的液滴储存器33中。为了在阶梯乳化液滴部件34触发液滴的形成，楔形通道3412的喷嘴的耗尽速度必须快于重新填充速度，从而导致颈部宽度随时间推移而减少。喷嘴的填充情况可以用无量纲的毛细管数Ca来描述，当Ca很小时，液滴的大小可以通过调整液体的接触角和液滴生成通道的几何形状来控制。
其中d为液滴直径，α为接触角大小，Ws为通道高度。公式(3的比例关系仅在低毛细管数下有效，在低毛细管数下，液滴直径由接触角控制，与连续相流流速无关。当接近喷射极限，超过了低毛细管数时的阈值时，液滴大小会迅速增长，从滴落(dripping状态变成喷射(jetting状态如图11和图12所示，图11为液滴滴落(dripping状态，图12为液滴喷射(jetting状态。为了保持稳定的液滴大小，我们将每个楔形通道3412的分散相流速控制在200uL/h以内从而将毛细管数控制在较低的范围。考虑到dPCR的最佳液滴大小，楔形通道3412的高度被设定为20μm，以产生90μm的液滴。样品经过稀释后通过楔形通道3412被分装包埋入液滴，并将含有四种浓度的液滴注入液滴储存器33中，所有液滴都从液滴储存器33的液滴出口32处进行收集，储存到200μL的PCR管中，再送去进行后续的PCR反应。
本申请还提供一种数字PCR检测定量系统，包括上述的微流控芯片、液滴温度循环装置、光学成像与检测装置；所述微流控芯片用于将样本溶液进行稀释和包埋进入液滴；所述液滴温度循环装置用于对所述液滴进行温度循环以完成所述样本溶液的PCR扩增；所述光学成像与检测装置用于对完成PCR扩增的液滴进行荧光信号采集并绘制相应散点图以计算得到所述样本溶液的模板数量。
在一些实施例中，所述液滴温度循环装置可以选自水浴锅、金属浴、热循环仪。在一些实施例中，所述稀释可以为连续稀释。
本申请还提供一种数字PCR定量检测方法，参见图13数字PCR流程图，包括以下步骤：a.使用上述的微流控芯片将样本溶液进行稀释和包埋进入液滴；b.液滴内样本溶液进行PCR反应；c.测量和编码液滴的PCR荧光值和指示剂荧光值；d.解码液滴的荧光值，区分液滴并计算初始拷贝数。
初始拷贝数的计算：
SD3PCR遵循ddPCR的分析方法。单个液滴为阳性的概率为p，可以得到公式(3.1)：
其中打是含有目标样本的液滴数量，C为总体液滴的数量。随着液滴总数的不断增多，在每个液滴内的目标分子数量λ如公式(3.2)：
λ＝-ln(1-p)(copy numberper droplet) (3.2)
PCR溶液中目标拷贝数的浓度，那么对于一次ddPCR反应来说，总体积V等于分装体积Vd乘上分装数量C如公式(3.3)所示：
V＝C×Vd (3.3)
考虑到在SD3PCR系统中，DNA分子经过连续稀释进入PCR溶液中，则目标拷贝数CN的推导方法为公式(3.4)所示：
其中D为稀释系数。为了对经过梯度稀释液滴进行更有说服力的分类，我们使用Skfuzzy的聚类算法对不同稀释系数的液滴进行分类，该程序在Python 3.9.1版本中使用。
在一些实施例中，所述液滴数量可以为1～+∞。在一些实施例中，所述液滴数量可以为18000～22000。在一些实施例中，所述液滴数量可以为18500～21500。在一些实施例中，所述液滴数量可以为19000～21000。在一些实施例中，所述液滴数量可以为19500～20500。在一些实施例中，优选的，所述液滴数量可以为20000。
在一些实施例中，所述稀释可以为连续稀释。在一些实施例中，所述稀释的次数可以大于1。
在一些实施例中，所述液滴内样本与初始样本的浓度可以具有特定比例。在一些实施例中，所述液滴内样本与初始样本的浓度比可以为1～0。在一些实施例中，所述液滴内样本与初始样本的浓度比可以为0.05～0.001；在一些实施例中，所述液滴内样本与初始样本的浓度比可以为0.025～0.002；在一些实施例中，所述液滴内样本与初始样本的浓度比可以为0.0125～0.004；在一些实施例中，所述液滴内样本与初始样本的浓度比可以为0.006～0.008；在一些实施例中，优选的，所述液滴内样本与初始样本的浓度比可以为0.05、0.01、0.005、0.001。在一些实施例中，所述液滴可以通过指示剂荧光信号区分。
本申请还提供上述的微流控芯片、上述的数字PCR检测定量系统或上述的检测方法在制备检测试剂中的用途。在一些实施例中，所述检测试剂可以用于检测病毒含量、蛋白表达水平。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
使用100μM、50μM、10μM三种初始浓度的Alexa 488荧光溶液作为样品，去离子水作为稀释剂，分别注入适用于SD3PCR的微流控装置的待稀释液入口2和稀释液入口1中，样品和稀释剂的注射泵的流速比控制在1:36～1:30的比例范围内，随后在四个出口处收集经过连续稀释的荧光溶液，并使用酶标仪测量其对应的荧光值，然后将所得的荧光强度与Alexa488荧光溶液的荧光标准曲线进行对照，得到四种被稀释溶液的荧光值对应的荧光浓度值，根据计算可得到SD3PCR的连续稀释比例。根据图14所示，经过三次平行测试稀释实验，三条稀释不同浓度的荧光溶液的稀释曲线的走向基本一致，证明了SD3PCR稳定的稀释性能。图15则是预期浓度和实际浓度的正交对比图，说明了实际稀释比例基本保持与预期设计参数一致，在可接受的范围内有微小的变化，这说明SD3PCR能够对输入的样品进行连续多级且稳定的稀释。图16A为四类液滴的明场实拍图，图16B为四类液滴的荧光场实拍图，图16C为四类液滴荧光值分布图，图16D为四类液滴的直径分布图。最终得到的稀释倍数分别约为20、100、200、1000倍，四个梯度的样本与初始样本浓度比约为0.05、0.01、0.005、0.001。
实施例2
实验样本及耗材包括检测含有HPV16病毒基因组质粒，与该质粒对应的正、反向引物以及MGB探针引物(使用FAM荧光在探针引物5’端进行修饰，2×ddPCR universalMastermix(包含PCR buffer，dNTP，Taq DNA Polymerase，无核酶水，ddPCR液滴生成油均由浙江达普生物科技有限公司提供。
ddPCR的反应程序如表2所示：
表2ddPCR反应程序
连续稀释数字PCR的反应液分为两部分，第一部分为稀释剂溶液(PCR预混液，包含了如表3所示的内容。第二部分为样品和荧光指示剂溶液，包含了如表4所示的内容。稀释剂溶液将以300uL/hr的流速通入如图1所示的稀释液入口1。样品和指示剂荧光溶液以15uL/hr的流速通入如图1所示的待稀释液入口2。ddPCR液滴生成油将以400uL/hr的流速通入如图1所示的油相入口31。稀释剂溶液与样品和荧光指示剂溶液的配比分别如表3和表4所示。
表3稀释剂溶液
表4样品和荧光指示剂溶液
为了对SD3PCR(serial dilution droplet digital PCR)系统的动态范围进行测试与比较，我们使用相同的含有HPV16型部分病毒基因的质粒(浙江达普公司提供通入SD3PCR系统和常规的ddPCR系统。图17是SD3PCR系统与常规ddPCR系统检测动态范围的一个直接比较。如图17所示，SD3PCR系统(上与常规ddPCR系统(下同时用于检测HPV16型的质粒(500bp。饼状图代表阴阳液滴的比例，红色是阴性液滴的比例，绿色时阳性液滴的比例。在明场合并荧光场照片中，ddPCR中绿色的为阳性液滴，SD3PCR系统中绿色和黄色的液滴都为阳性液滴，红色代表了指示剂荧光。为了提供一个相对公平的比较方案，我们为这两种平台保持了相同的单液滴尺寸和产生的液滴总数。正如预期的那样，对于每种浓度，与SD3PCR系统相比，常规ddPCR中FAM荧光通道的阳性液滴比例更快达到饱和。例如，在HPV16质粒的初始浓度在200fg/μL时，我们使用常规ddPCR已经获得了100％的阳性液滴，而在SD3PCR方法下，在初始DNA分子浓度在10pg/μL时仍然有1.5％的阴性，这样的阴性液滴比例依然在dPCR不确定度的有效范围内。显然，动态范围的扩大是由于在原始样品在通过微流控芯片时连续稀释的影响。为了确定SD3PCR系统的动态范围，我们对使用的质粒样本进行Qubit的DNA分子浓度的测量，测量得到对照的质粒溶液的初始浓度为2ng/μL，相当于3.96×109分子/μL。我们把这个值和它的连续稀释值作为SD3PCR系统结果的基本真实浓度。图18描述了测量浓度与样品实际浓度的相关性。在对照常规ddPCR实验中，我们得到的动态范围在1×104至1×105之间。SD3PCR的测量范围从4拷贝/μL到1.98×107拷贝/μL，达到了1×107的动态范围。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

Claims (11)

1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片上设置有稀释液入口(1)、待稀释液入口(2)、管道流阻(4)、混沌微型混合器(5)和阶梯乳化液滴生成器(3)；
所述管道流阻(4)包括稀释液管道流阻及稀释模块出口管道流阻；
所述稀释液管道流阻包括第1至第N级稀释液管道流阻，按照液流方向，所述稀释液入口(1)依次连通各级稀释液管道流阻，N为大于1的整数；
所述稀释模块出口管道流阻包括第1至第N级稀释模块出口管道流阻；
所述混沌微型混合器(5)包括第1至第N+1级混沌微型混合器，按照液流方向，所述待稀释液入口(2)依次连通各级混沌微型混合器；
第n级稀释液管道流阻的进液端均设有接通第n级混沌微型混合器进液端的分支管道，所述n选自1～N，第N级稀释液管道流阻的出液端连通第N+1级混沌微型混合器进液端；第n级混沌微型混合器的出液端至第n+1级混沌微型混合器的入液端之间设有分支管道，所述分支管道经第n级稀释模块出口管道流阻连通所述阶梯乳化液滴生成器(3)，所述n选自1～N；第N+1级混沌微型混合器的出液端连通所述阶梯乳化液滴生成器(3)。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，包括下列特征中的一项或多项：
所述管道流阻(4)还包括待稀释液入口管道流阻(41)，设于待稀释液入口(2)与第1级混沌微型混合器(51)之间；
所述第n级稀释液管道流阻小于第n+1级稀释液管道流阻；
所述第n级稀释模块出口管道流阻大于第n+1级稀释模块出口管道流阻；
所述管道流阻(4)还包括第N+1级稀释模块出口管道流阻，第N+1级混沌微型混合器的出液端经所述第N+1级稀释模块出口管道流阻连通所述阶梯乳化液滴生成器(3)；
所述N小于12，优选为3。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述管道流阻(4)均为蛇形管道流阻。
4.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述阶梯乳化液滴生成器(3)设置有油相入口(31)
和液滴出口(32)、液滴储存器(33)和阶梯乳化液滴部件(34)，所述油相入口(31)和液滴出口(32)之间通过液滴储存器(33)连通；所述阶梯乳化液滴部件(34)包括第1至第N+1级阶梯乳化液滴部件，第n级稀释模块出口管道流阻经第n级阶梯乳化液滴部件连通所述液滴储存器(33)，所述n为1～N，第N+1级混沌微型混合器的出液端经第N+1级阶梯乳化液滴部件连通所述液滴储存器(33)。
5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述阶梯乳化液滴部件(34)包括若干连通液滴储存器(33)的出液口，所述出液口为楔形喷嘴。
6.一种数字PCR检测定量系统，其特征在于，包括如权利要求1～5任意项所述的微流控芯片、液滴温度循环装置、光学成像与检测装置；
所述微流控芯片用于将样本溶液进行稀释和包埋进入液滴；
所述液滴温度循环装置用于对所述液滴进行温度循环以完成所述样本溶液的PCR扩增；所述光学成像与检测装置用于对完成PCR扩增的液滴进行荧光信号采集并绘制相应散点图以计算得到所述样本溶液的模板数量。
7.如权利要求6所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述液滴温度循环装置选自水浴锅、金属浴、热循环仪；所述稀释为连续稀释。
8.一种数字PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.使用如权利要求1～5任意项所述的微流控芯片将样本溶液进行稀释和包埋进入液滴；
b.液滴内样本溶液进行PCR反应；
c.测量和编码液滴的PCR荧光值和指示剂荧光值；
d.解码液滴的荧光值，区分液滴并计算初始拷贝数。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述液滴数量为1～+∞；所述液滴内样本与初始样本的浓度具有特定比例。
10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述稀释为连续稀释，所述稀释的次数大于1，所述液滴内样本与初始样本的浓度比为1～0；所述液滴通过指示剂荧光信号区分。
11.如权利要求1～5任意项所述的微流控芯片、如权利要求6或7所述的数字PCR检测定量系统在制备数字PCR检测产品中的用途。
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Citations (7)

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