CN106854618B - 一种在芯片内部平铺液滴的方法 - Google Patents

一种在芯片内部平铺液滴的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在芯片内部平铺液滴的方法，所述芯片包括上片和下片，上片和下片之间具有用于平铺储存液滴的液滴存储腔以及与所述液滴存储腔连通的液滴形成孔道和排油孔道，所述液滴形成孔道的高度低于所述腔室，使得液滴形成孔道与所述液滴存储腔的连接处具有形成液滴的台阶结构，所述方法包括：(1)将油相充满整个液滴存储腔；(2)将水相通过压力泵从进样孔道输入芯片，水相在所述台阶结构处形成液滴，平铺在所述液滴存储腔内，同时油相从排油孔道排出。本发明方法通过将油相充满液滴存储腔，水相通过压力泵从液滴形成孔道输入芯片，水相在台阶结构处形成液滴并平铺开来，同时油相从排油孔道排出，从而快速、方便在芯片上制备大量液滴。

Description

一种在芯片内部平铺液滴的方法
技术领域
本发明涉及生物芯片检测技术领域，特别是涉及一种在芯片内部平铺液滴的方法。
背景技术
荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR)已发展成为分子生物学领域的一项关键的常规技术，极大地推动了生命科学各个领域的发展。但是，PCR扩增过程中影响其扩增效率的因素很多，很难保证实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率相同，由此导致其定量分析所依赖的基础—循环阈值(Ct值)不是恒定不变的。因此qPCR的定量只是相对定量，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。另外，由于PCR扩增产物对酶催化反应的抑制作用，目前基于qPCR技术的基因变异检测方法对体细胞中低丰度的基因变异常常无能为力的。
数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR不同，数字PCR通过直接计数的方法，可以实现起始DNA模板的绝对定量。
另外，数字PCR还是一种可以在大量的野生型DNA背景中鉴定出微量突变体的方法。由于数字PCR技术可以将模板DNA分子事先分隔开来单独进行扩增，这就避免了高丰度等位基因核酸对变异核酸的扩增抑制，因此提高了微量变异核酸的检出效率。乳滴数字PCR技术能够检测低至0.001％的突变片段，而测序及常规实时荧光定量PCR法对少于1％的突变是无能为力的，因此微滴式数字PCR技术可将突变检测灵敏度提高1000倍。
传统的数字PCR技术的一般操作流程比较复杂，通常是首先通过手工逐级稀释并分配样品至微孔板中，然后将微孔板置于热循环仪上进行PCR反应，反应结束后通过仪器读取每个微孔中的荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，结合分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。这种方式操作繁琐、通量小、效率低，而且较少的液滴分解数目也限制了其精度和可测的动态范围，应用方面有很大的局限。近年来，微流控技术的发展为数字PCR技术的发展注入了新的活力。由于微流控技术在微流体操控方面的优势，使得我们可以将样品分解为纳升甚至皮升级，获得更多的样品分解数目，从而大大提高数字PCR技术的检测灵敏度、可信度和动态范围度。另外，微流控技术自动化、易集成、通量高的优势，也可极大地提高数字PCR技术的检测效率。
借助微流控技术在微流体操控方面的优势，最近国际上已有多个研究小组和公司开发了基于微流控技术的数字PCR系统。比较典型的包括Fluidigm公司推出的基于微室型的BioMarkTM系统和Bio-Rad公司推出的基于液滴型的QX100TM系统。
微液滴技术是指利用不互溶相形成油包水或水包油的相对稳定的独立微体积液滴。乳化方式有多种，其中基于微流控芯片的液滴生成技术最近几年得到快速发展，广泛应用于生物界和材料界，是一种非常重要的技术。其原理主要是通过两相液流之间一定角度户型挤压作用下，其中一相连续液流断裂形成液滴。目前常用的液滴制备方式有正交结构(T-junction)和流式聚焦(Flow-focusing)等。这些方法整体设备的系统比较复杂，对流体控制系统的要求比较高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种在芯片内部平铺液滴的方法，使用本发明方法可以快速方便地在芯片上平铺出大量大小均一、稳定的液滴，检测时只需对芯片整体进行成像检测即可，不需要像流式细胞仪那样对液滴进行单颗的检测。
一种在芯片内部平铺液滴的方法，所述芯片包括上片和下片，上片和下片之间具有用于平铺储存液滴的液滴存储腔以及与所述液滴存储腔连通的液滴形成孔道和排油孔道，所述液滴形成孔道的高度低于所述腔室，使得液滴形成孔道与所述液滴存储腔的连接处具有形成液滴的台阶结构，所述方法包括：
(1)将油相充满整个液滴存储腔；
(2)将水相通过压力泵从液滴形成孔道输入芯片，水相在所述台阶结构处形成液滴，平铺在所述液滴存储腔内，同时油相从排油孔道排出。
所述芯片本体内部还设有进样腔和排油腔，所述进样腔和液滴存储腔之间、液滴存储腔与排油腔之间分别设有多个液滴形成孔道和排油孔道，芯片本体表面设有分别与进样腔和排油腔连通的进样孔和排油孔。
所述液滴存储腔为U型结构，所述进样腔为直线型结构，设于U型结构的两臂之间，且与两臂之间设有多个平行布置的液滴形成孔道；所述排油腔设于所述U型结构的外周。这样设计使得长条形的进样腔伸入液滴存储腔内部，在进样腔的顶部和长长的两侧可以设置大量液滴形成孔道，提高液滴制备的通量，同时，也使得液滴存储腔的各个边界不会离液滴形成孔道太远，避免产生的液滴迁移过远的距离而发生破坏和损失。
所述进样孔靠近U型结构开口的端部为进样端，进样端与进样孔之间设有狭长的衔接段。
所述液滴形成孔道连接液滴存储腔的端部设有圆弧倒角，所述圆弧倒角在液滴形成方向上的长度为1～100μm。设置倒角也是为了利于液滴的生成和移动。所述圆弧倒角在液滴形成方向上的长度大小会影响生成液滴的大小，在一定范围内，液滴大小随着这个长度增加而增大。
所述液滴形成孔道的横截面为矩形，宽度为10～200μm，高度为1～100μm，液滴存储腔高度为10～200μm。液滴的大小与液滴形成孔道的大小有直接关系，液滴形成孔道的宽度与高度越大产生的液滴就越大，所以液滴形成孔道的大小需要在合适的范围内。
所述液滴形成孔道的排布密度从所述进样端起始密度逐渐增大，所述液滴形成通道靠近液滴存储腔一端宽度变大形成喇叭口状。这种形成一定梯度的排列，可以使各处生产液滴的速度接近。此设计可避免通道均匀分布所造成的离进样端较近的通道压力过大，水相流速过快，产生液滴过多。喇叭口状有利于液滴的生成和移动。
所述进样孔入口设有硅胶材质的密封接口塞，所述密封接口塞设有连通进样腔的通孔。硅胶材质具有良好的弹性，使用具有弹性的密封接口塞可以保证加油相和水相时，移液管可以与密封塞紧密配合，确保加样时芯片流道内的密闭性，使流速和压力都能稳定实施，促使液滴形成的均匀一致。
所述的芯片本体上设有多个反应区，每个反应区内部均设有进样腔、液滴存储腔以及排油腔，芯片本体表面设有分别与进样腔和排油腔连通的进样孔和排油孔，所述进样腔和液滴存储腔之间、液滴存储腔与排油腔之间分别设有多个液滴形成孔道和排油孔道，所述液滴形成孔道和排油孔道的高度均小于液滴存储腔的高度。在一块芯片上集成多个反应区可以增加反应的通量，方便进行多个样品的实验。
微滴式数字芯片构体是具有产生微滴颗粒复杂结构的，是用来生成和储存微液滴颗粒的载体，在微滴式数字芯片构体内首先要注入油相成分溶液，而油相成分溶液是用来生成微滴颗粒必备条件，(这就是水相试剂在油相溶液中，由于表面张力的作用而形成的一个独立的油包水颗粒)也是为微液滴颗粒生存提供环境，同时也为微液滴颗粒进行扩增时需要提供温度的热传导介质。因此需要有一种液滴制备的油相组合物，使生成的液滴大小均一，热稳定性好，不易挥发，不易产生气泡，不抑制PCR扩增。
所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分为矿物油和烷烃，所述表面活性剂为EM90和TritonX-100，其中，所述烷烃为12～16烷中的一种或混合。
目前液滴制备时常用的为氟化油，如FC-40、FC-7500，配用的表面活性剂有：PFPE-PEG-PFPE、1,1,2,2-四氢全氟癸醇等。一方面氟化油易挥发，易溶解气体在加热时会产生大量气泡，另一方面氟化油相关的一些表面活性剂价格比较昂贵，增加了制备液滴成本。而矿物油具有非极性不溶于水、不易挥发、性质稳定、对PCR扩增无抑制作用、轻质油运动粘度(cps)较低等优点，常被用于对PCR反应液进行液封等。矿物油(又名石蜡油)，是石油所得精炼液态烃的混合物，为饱和的环烷烃与链烷烃混合物。所以本发明选择使用矿物油作为主体成分的基础。
所述烷烃为正十四烷，烷烃的体积占所述主体成分质量的10％-50％。由于单独使用矿物油作为油相的主体成分运动粘度仍然偏高，液滴形成和沉降速度偏低，所以还需要添加其他成分解决这个问题。所以又加入了具有较为合适的粘度的物质来降低油相的粘度。经过实验，发现烷烃类，特别是正十四烷，具有良好的效果，能够形成较好的液滴，且液滴经PCR扩增等步骤后，仍具有良好的形态，不易破碎或融合。进一步优选的，所述烷烃的质量占所述主体成分质量的30％-40％。实验发现，所述烷烃添加的量有一定的限度，添加量过高的话，所得的液滴也容易破碎或发生融合。
所述表面活性剂中，EM90的质量为主体成分的1％～3％，TritonX-100的质量为主体成分的1％～3％。进一步优选的，所述表面活性剂中，EM90的质量为主体成分的2％～3％，TritonX-100的质量为主体成分的2％～3％。更进一步优选的，所述表面活性剂中，EM90的体质量为主体成分的3％，TritonX-100的质量为主体成分的3％。在表面活性剂的选择上，需有优异的高温稳定性，与其它活性成分有良好的相容性。表面活性剂EM90属硅酮表面活性剂，硅氧烷链上接聚氧乙烯醚链，以PEG作为亲水基，聚硅氧烷作为亲油基。表面活性剂TritonX-100是一种非离子型表面活性剂，在溶液中不是以离子状态存在，所以稳定性高，与其他类型表面活性剂能混合使用，相容性好，在各种溶剂中均有良好的溶解性。
本发明方法通过将油相充满整个液滴存储腔，然后将水相通过压力泵从液滴形成孔道输入芯片，水相在所述台阶结构处形成液滴，平铺在所述液滴存储腔内，同时油相从排油孔道排出，从而能够快速、方便在芯片上制备大量液滴，水相的液滴一个个独立平铺在芯片的液滴存储腔中，然后可以直接将芯片放置到PCR仪器上进行反应，反应后再使用成像装置进行成像，数据分析。
附图说明
图1为本发明芯片的剖面结构示意图；
图2为上片位于芯片内部一面的结构示意图；
图3为本发明芯片按图1中A-A方向的剖面结构示意图；
图4为图2中B局部放大图；
图5为液滴形成孔道与液滴存储腔的局部结构示意图；
图6为实施例5中组合物(1)、(3)中形成的液滴图；
图7为实施例5中组合物(2)、(4)中形成的液滴图；
图8为实施例6中组合物(4)～(8)中形成的液滴图；
图9为实施例6中组合物(4)～(8)中形成的液滴荧光信号检测图；
图10为实施例7中各组合物形成的液滴图，其中图(1)～(7)分别为组合物(1)～(7)中形成的液滴图。
具体实施方式
实施例1
如图1～5所示，一种微滴式数字PCR反应所使用的芯片，包括由上片1和下片2贴合形成的芯片本体，所述芯片本体内部在上片1上设有进样腔3、液滴存储腔4以及排油腔5。
液滴存储腔4为U型结构，进样腔3为直线型结构，设于U型结构两臂之间，且与两臂之间设有多个平行布置的液滴形成孔道6；排油腔5设于所述U型结构的外周。液滴存储腔4与排油腔5之间设有多个排油孔道7。液滴形成孔道6和排油孔道7的高度均小于液滴存储腔4的高度，使得液滴形成孔道6与液滴存储腔4的连接处具有形成液滴的台阶结构。
液滴存储腔4为U型结构使得长条形的进样腔3伸入液滴存储腔4内部，在进样腔3的顶部和长长的两侧可以设置大量液滴形成孔道6，增加液滴制备的速度，同时，也使得液滴存储腔4的各个边界不会离液滴形成孔道6太远，避免产生的液滴迁移过远的距离而发生破坏和损失。
芯片本体表面设有分别与进样腔3和排油腔5连通的进样孔8和排油孔9。进样孔8靠近U型结构开口的端部为进样端，进样端与进样孔8之间设有狭长的衔接段10。液滴形成孔道6的排布密度从进样端起始密度逐渐增大。这种形成一定梯度的排列，可以使各处生产液滴的速度接近。如果是均匀排布的话，离进样端较近的液滴形成孔道6由于压力较大，水相流速较快，产生液滴会较多。
液滴形成孔道6连接液滴存储腔4的端部设有圆弧倒角11。圆弧倒角11在液滴形成方向上的长度为1～100μm。圆弧倒角11在液滴形成方向上的长度大小会影响生成液滴的大小，在一定范围内，液滴大小随着这个长度增加而增大。
液滴形成孔道6的横截面为矩形，宽度为10～200μm，高度为1～100μm，液滴存储腔高度为10～200μm。液滴形成孔道6靠近液滴存储腔4一端宽度变大形成喇叭口状。液滴的大小与液滴形成孔道6的大小有直接关系，液滴形成孔道6越大产生的液滴就越大，所以液滴形成孔道6的大小需要在合适的范围内。喇叭口状有利于液滴的生成和移动。
进样孔8入口密封有硅胶材质的密封塞。硅胶材质具有良好的弹性，使用具有弹性的密封塞可以保证加油相和水相时，移液管可以与密封塞紧密配合，确保芯片流道内的密闭性，使流速和压力都能稳定实施，促使液滴形成的均匀一致。
本发明芯片还在进样腔3内刻有一系列大小已知的圆作为刻度，可以在显微镜下观察时，方便判断所制备的液滴大小。
使用时，先将油相通过进样孔注入到芯片内部，待芯片内部注满油相，排除空气后，通过进样孔8注入水相，在一定的压力下，水相从进样腔3进入液滴形成孔道6，然后在液滴形成孔道6出来进入到液滴存储腔4时，由于液滴形成孔道6的高度较液滴存储腔4小，在液滴形成孔道6与液滴存储腔4交界处形成台阶，在水相由较为狭窄的液滴形成孔道6进入到较为宽阔的液滴存储腔4时，水相在部分进入液滴存储腔4时，由于表面张力作用流动加速，而与液滴形成孔道6内的水相发生断裂，形成液滴。液滴产生进入液滴存储腔4后，相应体积的油相就通过排油孔道7排到排油腔5，最终经与排油腔5连通的排油孔9排出。排油孔道7高度小于液滴存储腔4的高度，使得液滴不容易从排油孔道7排出。所产生的大量液滴最后平铺在液滴存储腔4内，液滴为油包水结构，而外层的油相，相互之间为融合状态，相当于在油相内存在一颗颗相互独立的水相的液滴。液滴制备完成后，可以直接将该芯片放置到相应的PCR反应仪器中进行PCR扩增，扩增完成后，直接将该芯片放置于芯片分析仪器中进行荧光信号的成像和读取。
实施例2
所述的芯片本体上设有多个反应区，每个反应区内部均设有进样腔3、液滴存储腔4以及排油腔5，芯片本体表面设有分别与进样腔3和排油腔5连通的进样孔8和排油孔9，进样腔3和液滴存储腔4之间、液滴存储腔4与排油腔5之间分别设有多个液滴形成孔道6和排油孔道7，液滴形成孔道6和排油孔道7的高度均小于液滴存储腔4的高度。其余结构同实施例1。
实施例3
目前液滴制备时常用的为氟化油，如FC-40、FC-7500，配用的表面活性剂有：PFPE-PEG-PFPE、1,1,2,2-四氢全氟癸醇等。一方面氟化油易挥发，易溶解气体在加热时会产生大量气泡，另一方面氟化油相关的一些表面活性剂价格比较昂贵，增加了制备液滴成本。而矿物油具有非极性不溶于水、不易挥发、性质稳定、对PCR扩增无抑制作用、轻质油运动粘度(cps)较低等优点，常被用于对PCR反应液进行液封等。所以本发明选择使用矿物油作为主体成分的基础。但是单独使用矿物油作为油相的主体成分运动粘度仍然偏高，液滴形成和沉降速度偏低，所以还需要添加其他成分解决这个问题。
首先要考虑油相组合物的主体成分之间的相互溶解性，故设计了以下几种油相组合物(均以质量计)：
(1)1/2矿物油+1/2二甲基硅油
(2)1/2矿物油+1/2正十四烷
(3)1/2矿物油+1/2DEC
(4)1/3矿物油+1/3二甲基硅油+1/3正十四烷
(5)1/3矿物油+1/3二甲基硅油+1/3DEC
结果：组合物(1)、(4)和(5)中的两种或三种油不互溶。
实施例4
根据实施例3的实验结果，进一步对油相组合物加入不同的表面活性剂，根据不同表面活性剂和油相主体成分的溶解性，设计以下几种油相组合物(均以质量计)：
(1)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％EM90
(2)1/2矿物油+1/2DEC+3％EM90
(3)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％TritonX-100
(4)1/2矿物油+1/2DEC+3％TritonX-100
(5)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％EQ503
(6)1/2矿物油+1/2DEC+3％EQ503
各油相组合物中，矿物油和正十四烷的比例是指占主体成分的质量比例，而表面活性剂的比例为各自质量与主体成分的比值。
结果：油相组合物(5)和(6)中的表面活性剂与油相不相溶，其余能够较好相溶。
实施例5
使用实施例1中的芯片，使用实施例4筛选到的(1)～(4)组油相组合物进行液滴制备实验，并进行PCR扩增。具体流程如下：
(1)按上述(1)～(4)方案配制油相。
(2)配制水相即PCR反应体系。
模板来自非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株H1975，同时有T790M和L858R两种突变。
引物序列为：
F：5’-GCCTGCTGGGCATCTG-3’；
R：5’-TCTTTGTGTTCCCGGACATAGAC-3’
探针序列为：
5’-FAM-ATGAGCTGCATGATGAG-MGB-NFQ-3’，其中FAM为荧光报告基团，NFQ为荧光淬灭基团。
水相配方：
(3)将油相平铺在微滴发生装置内，使油相充满整个液滴存储腔。
(4)采用阶梯乳化的方式将水相通过压力泵从进样孔道输入芯片，水相在所述台阶结构处形成液滴，平铺在所述液滴存储腔内，同时油相从排油孔道排出。
(5)生成好的微滴按如下程序进行PCR扩增：
96℃预变性10min；98℃变性30s，62℃退火延伸1min，共39个循环；62℃延伸1min，25℃保温。
(6)扩增结束，显微镜观察液滴形态。若液滴均一稳定，阅读仪检测荧光信号。
结果：PCR扩增后，实施例4中组合物(1)、(3)中形成的液滴大小不均一，不太稳定(图6)；实施例4中组合物(2)、(4)中的液滴破碎(图7)，DEC稳定性太差。
实施例6
用矿物油-正十四烷混合物作为油相主体成分，EM90和TritonX-100分别作为表面活性剂，虽能与水相形成微滴，但大小不均一、易融合，可以结合使用以降低界面张力，提高液滴稳定性。故设计了以下几种油相组合物并进行液滴制备和扩增：
(1)1/2矿物油+1/2正十四烷+1％EM90+3％TritonX-100
(2)1/2矿物油+1/2正十四烷+2％EM90+3％TritonX-100
(3)1/2矿物油+1/2正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(4)2/3矿物油+1/3正十四烷+1％EM90+3％TritonX-100
(5)2/3矿物油+1/3正十四烷+2％EM90+3％TritonX-100
(6)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(7)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+2％TritonX-100
(8)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+1％TritonX-100
各组合物中，矿物油和正十四烷的比例是指占主体成分的质量比例，而EM90和TritonX-100的比例为各自质量与主体成分的比值。
使用实施例1中的芯片，液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例5中相同。
结果：组合物(1)～(3)制备的液滴不太稳定，易破碎，正十四烷所加的量过多，此外组合物(3)制备的液滴从破碎和融合的数量上看优于组合物(1)和(2)。
组合物(4)～(8)制备的液滴比较均一(图8)，液滴直径在80μm左右。PCR扩增后比较稳定，无明显融合，仪器可检测到较强荧光信号(图9)。
实施例7
确定油相组合物的成分为使用矿物油和正十四烷为主体成分，使用EM90和TritonX-100混合作为表面活性剂之后，继续对矿物油与正十四烷的添加比例进行进一步优化筛选。
(1)30％矿物油+70％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(2)40％矿物油+60％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(3)50％矿物油+50％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(4)60％矿物油+40％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(5)70％矿物油+30％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(6)80％矿物油+20％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(7)90％矿物油+10％正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
各组合物中，矿物油和正十四烷的比例是指占主体成分的质量比例，而EM90和TritonX-100的比例为各自质量与主体成分的比值。
使用实施例1中的芯片，液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例5中相同。
结果：组合物(1)中边缘区域有大量破碎液滴，整体有部分融合液滴；组合物(2)中破碎液滴减少，但融合液滴仍较多；组合物(3)中基本无破碎液滴，有少量融合液滴；组合物(4)～(7)中基本没有破碎和融合液滴(图10)。
实施例8
确定油相组合物的成分为使用矿物油和正十四烷为主体成分，使用EM90和TritonX-100混合作为表面活性剂，以及各成分的用量之后，对正十四烷的潜在替代成分进行进一步筛选。
(1)2/3矿物油+1/3正十二烷+3％EM90+3％TritonX-100
(2)2/3矿物油+1/3正十三烷+3％EM90+3％TritonX-100
(3)2/3矿物油+1/3正十四烷+3％EM90+3％TritonX-100
(4)2/3矿物油+1/3正十五烷+3％EM90+3％TritonX-100
(5)2/3矿物油+1/3正十六烷+3％EM90+3％TritonX-100
各组合物中，矿物油和烷烃的比例是指占主体成分的质量比例，而EM90和TritonX-100的比例为各自质量与主体成分的比值。
使用实施例1中的芯片，液滴制备方法、水相配方及数字PCR实验步骤与实施例5中相同。
结果：各组合物中所得结果较为接近，均能获得较好的液滴，基本没有破碎和融合的液滴。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东医药（杭州）基因科技有限公司
<120> 一种在芯片内部平铺液滴的方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcctgctggg catctg 16
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctttgtgtt cccggacata gac 23
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgagctgca tgatgag 17

Claims (8)

1.一种在芯片内部平铺液滴的方法，所述芯片包括上片和下片，上片和下片之间具有用于平铺储存液滴的液滴存储腔以及与所述液滴存储腔连通的液滴形成孔道和排油孔道，所述液滴形成孔道的高度低于所述腔室，使得液滴形成孔道与所述液滴存储腔的连接处具有形成液滴的台阶结构，所述方法包括：
(1)将油相充满整个液滴存储腔；
(2)将水相通过压力泵从液滴形成孔道输入芯片，水相在所述台阶结构处形成液滴，平铺在所述液滴存储腔内，同时油相从排油孔道排出，
所述芯片本体内部还设有进样腔和排油腔，所述进样腔和液滴存储腔之间、液滴存储腔与排油腔之间分别设有多个液滴形成孔道和排油孔道，芯片本体表面设有分别与进样腔和排油腔连通的进样孔和排油孔，
所述油相包括主体成分和表面活性剂，所述主体成分为矿物油和烷烃，所述表面活性剂为EM90和TritonX-100，其中，所述烷烃为12～16烷中的一种或混合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液滴存储腔为U型结构，所述进样腔为直线型结构，设于U型结构的两臂之间，且与两臂之间设有多个平行布置的液滴形成孔道；所述排油腔设于所述U型结构的外周。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液滴形成孔道连接液滴存储腔的端部设有圆弧倒角，所述圆弧倒角在液滴形成方向上的长度为1～100μm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液滴形成孔道的横截面为矩形，宽度为10～200μm，高度为1～100μm，液滴存储腔高度为10～200μm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液滴形成孔道的排布密度从所述进样端起始密度逐渐增大，所述液滴形成通道靠近液滴存储腔一端宽度变大形成喇叭口状。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进样孔入口设有硅胶材质的密封接口塞，所述密封接口塞设有连通进样腔的通孔。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烷烃为正十四烷，烷烃的体积占所述主体成分质量的10％-50％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂中，EM90的质量为主体成分的1％～3％，TritonX-100的质量为主体成分的1％～3％。
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