CN110653015B - 一种具有高样品填充率的微生物检测芯片及其填充方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有高样品填充率的微生物检测芯片及其填充方法:所述芯片具有阵列化的微反应腔和微通道,所述微反应腔为两端贯通的开放式结构,液滴可选择性的从其底部或顶部进入;同时芯片内部通道的壁面均具有疏水特性,填充流体在其表面能够形成良好的润湿,因而能够对内部通道进行良好的排气,减少空白微反应腔的数目;进样时,液体在微反应腔入口处的主体流动方向与样品液滴填充进入微反应腔的运动方向一致,且在样品液滴进入微反应腔的过程中,原本占位的填充流体会被芯吸排出,不会对样品液滴的进入形成阻力;由于分配通道具有圆滑的过渡,且芯片内部通道具有疏水性表面,可以保证样品液滴尺寸的基本恒定;本发明的装置和填充方法能够有效提高微反应腔阵列的样品填充率,改善检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片,具体的涉及一种具有高样品填充率的数字PCR检测芯片。
背景技术
数字PCR(digital PCR,dPCR)是在常规聚合酶链式反应(PCR)检测方法上发展出来的一种新的微生物检测方法。其依托于具有阵列化微反应腔室的微流体芯片,将扩增前的样品进行液滴化处理从而分成几十到几万份,然后分配到不同的微反应腔室中;液滴化的样品中可能含有一个或多个待检测的核酸靶分子,也可能不含有待检测的核酸靶分子。在微反应腔室中进行扩增后,对液滴样品进行荧光检测,并分析荧光信号。
对于荧光信号的分析处理,通常的做法是将有荧光信号的液滴作为阳性结果,无荧光信号反馈的液滴则作为阴性结果,然后再依据泊松分布原理及阳性结果的比例即可得到核酸靶分子的初始拷贝数。这种荧光信号处理方式依据的是荧光检测结果中阳性结果的比例。但在实际应用中,阵列化的微反应腔室中有较多的腔室未被填充样品液滴,这些未被填充样品液滴的微反应腔室中并未发生扩增反应,属于无效腔室,因而在荧光检测过程中没有荧光信号;但在计算阳性结果的比例时,仍然以总腔室数作为分母,导致检测获得的阳性结果比例比真实数值小。而且,这种误差是随机的,取决于微反应腔室的实际填充率差异,在不同芯片上进行的检测分析结果可能存在不同程度的误差。
现有技术中有研究者提出,通过设置分配通道增加液滴在微反应腔中的填充率,甚至有些方案中,分配通道可以直达每一个微反应腔(参见中国专利CN109852530A)。但事实上,在进行样品液滴填充的过程中,微反应腔通常被未排净的空气或填充流体占据,同时在微反应腔的入口处,液体的主体流动方向与样品液滴进入微反应腔的运动方向不同,这两个因素均导致样品液滴在微反应腔入口处难以进入微反应腔,进而导致微反应腔阵列的液滴填充率偏低。
发明内容
为解决现有技术中的问题,本发明提供一种具有高样品填充率的微生物检测芯片及其填充方法,其能够实现对微反应腔阵列的高效率填充。
为实现上述目的,本发明具体的提供如下解决方案:
一种具有高样品填充率的微生物检测芯片;所述的微生物检测芯片包括由上之下叠加设置的至少四层结构,分别为盖片层,微通道层,微反应腔层和基底层;所述盖片层为透明材质,其能够允许激励光和辐射光透过,其上设置有三个贯通开口,分别为填充流体进口、样品液滴进口和出口,其中所述填充流体进口与样品液滴进口相邻设置于所述盖片层的同一侧,所述出口设于所述盖片层的另一侧。
所述微通道层包括与所述填充流体进口对应的第一通孔,所述第一通孔允许来自填充流体进口的填充流体通过;所述微通道层还包括与所述样品液滴进口连通的分配通道;所述分配通道用于从样品液滴进口处接收填充流体和包裹在所述填充流体内部的样品液滴;所述的分配通道为非贯通结构;所述的微通道层还包括位于所述分配通道下游并与所述分配通道流体连通的分配槽,所述的分配槽为贯通槽;所述的微通道层还包括位于所述分配槽下游并与之流体连通的收集槽,所述收集槽为非贯通结构,且其末端与出口流体连通。
优选的,所述分配通道具有圆滑转角,以防止样品液滴在分配过程中破裂;为进一步的保证进入分配槽中的液滴尺寸的均匀性,优选所述分配通道及所述盖片层的下表面具有疏水特性,进而可以防止水性样品液滴在流动过程中发生附壁残留(指水性样品液滴因能够与避免形成良好润湿而在流动过程中被通道臂吸附,而将液滴撕裂,并在通道壁处形成水性样品残留)。
所述微反应腔层具有与所述第一通孔对应的第二通孔;所述第二通孔允许来自第一通孔的填充流体通过;所述填充流体进口、第一通孔、第二通孔共同构成填充流体通道;所述微反应腔层还包括与所述分配槽对应的微反应腔的阵列;所述微反应腔的阵列的尺寸允许其被所述分配槽完整的覆盖,进而来自于分配槽的填充流体及样品液滴能够被分配进入所述微反应腔;所述的微反应腔为贯通的孔。
所述基底层包括至少覆盖所述微反应腔的阵列的下部的填充流体腔、芯吸腔、第一微阀、第二微阀及芯吸通道;所述填充流体腔与所述填充流体通道连通,且其连通路径上设有第一微阀,所述第一微阀能够选择性的接通和断开所述填充流体腔与所述填充流体通道的连接;所述填充流体腔的另一侧通过芯吸通道与所述芯吸腔连通,且所述芯吸通道内设置有第二微阀,其能够选择性的接通和断开所述芯吸通道。
所述填充流体腔、芯吸腔及芯吸通道均为非贯通结构;所述芯吸通道优选为多个,且每个芯吸通道内均设置有第二微阀,从而能够提高从所述芯吸腔吸取填充流体的均匀程度;优选的,位于不同芯吸通道中的第二微阀可以独立控制,以允许通过开启或关闭不同芯吸通道中的第二微阀,调整对填充流体腔不同区域的芯吸强度。
所述芯吸腔可接通微泵,以提供芯吸动力;更优选的是,所述芯吸腔内填充吸油材料,如吸油毡、吸油纸等。
或者,所述填充流体腔及芯吸通道为非贯通结构,所述芯吸腔可从底部或侧面被开启,以允许更换或补充吸油材料。
优选的,所述填充流体腔的壁面具有疏水特性,且所述填充流体腔的深度小于样品液滴的数均半径;因而位于微反应腔中的水性液滴不会因为润湿现象被吸入填充流体腔。
本发明还提供一种用于上述微生物检测芯片的样品填充方法,具体包括如下步骤:
1)、排气;开启第一微阀,关闭所有第二微阀,从填充流体进口、样品液滴进口处同时通入填充流体,当所述填充流体从出口处流出,且不再伴随有气泡时,排气结束。
由于所述填充流体为油性介质,能够与微生物检测芯片内部通道的避免形成良好润湿;同时,进入填充流体腔的填充流体将由下而上的穿过微反应腔,进而使用填充流体置换微生物检测芯片的内部通道中的空气,对其内部尤其是微反应腔进行充分的排气。
2)、进样,整体填充;关闭第一微阀和出口,开启全部第二微阀;从所述样品液滴进口处通入包裹有样品液滴的填充流体;此过程中,芯片内部的液体主体流动路径为:样品液滴进口、分配通道、分配槽、微反应腔、填充流体腔、芯吸通道、芯吸腔;样品液滴随液体主体流动快速进入微反应腔;由于填充流体腔的深度小于样品液滴的数均半径,且其表面具有疏水特性,因此已进入微反应腔的样品液滴将被截留,并阻塞该微反应腔的流体通路;填充流体及其夹带的样品液滴流向其他尚未被填充的微反应腔。
此过程中,在微反应腔的上部开口处,液体主体流动方向与样品液滴的进入微反应腔的运动方向一致,因此,微反应腔阵列的样品填充率大大提高。同时,由于对填充流体腔深度和表面特性的控制,已分配进入微反应腔的样品液滴可以被截留并阻塞通道,进而增加其他尚未被填充的微反应腔的填充速率和几率。
3)洗样;待微反应腔的阵列被完全填充后,关闭所有第二微阀,打开出口;从样品液滴进口处通入纯的填充流体;此时,芯片内的液体主体流动仅发生在微通道层,且不会对微反应腔内的样品液滴造成扰动;通入的填充流体可以置换分配通道、分配槽内残存的样品液滴,并将其从出口处排出;该步骤可以显著提高实际被检测的样品液滴的数目与微反应腔数目的一致性。
所述微反应腔阵列的完全填充可通过如下方法判断:在步骤2开始一段时间后判定为完全填充。所述的一段时间可通过模拟实验进行标定,例如,使用包含荧光物质的液滴替代样品液滴,进行填充模拟实验,通过荧光检测分析液滴的填充率,并分别记录填充开始后不同时间内的填充率数值,获取填充率随填充时间变化的曲线,并得出完全填充参考时间。
优选的是,在上述步骤2和步骤3之间还包括如下步骤:
进样,局部填充;使若干第二微阀中靠近边缘的一个开启,其余的关闭,从而在所述填充流体腔中的,靠近该开启的第二微阀的区域形成局部芯吸,并保持一定时间;按顺序依次开启相邻的第二微阀,并同时关闭原开启的第二微阀,调整局部芯吸区域的位置,直至所有第二微阀均被开启并关闭。
本发明相比于现有技术至少能够取得如下有益效果:微反应腔为两端贯通的开放式结构,液滴可选择性的从其底部或顶部进入;同时芯片内部通道的壁面均具有疏水特性,填充流体在其表面能够形成良好的润湿,因而能够对内部通道进行良好的排气,减少因空气占位因素导致的空白微反应腔的(指未被样品液滴填充的微反应腔)数目;进样过程中,填充流体夹带样品液滴在微反应腔入口处的主体流动方向与样品液滴填充进入微反应腔的运动方向一致,且在样品液滴进入微反应腔的过程中,原本处在微反应腔内的填充流体由于芯吸动力被吸入填充流体腔,不会对样品液滴的进入形成阻力;由于分配通道具有圆滑的过渡,且芯片内部通道具有疏水性表面,样品液滴不会因与分配通道尖角的撞击或因在通道内的残留而破裂,因此,可以保证样品液滴尺寸的基本恒定;这允许了通过控制填充流体腔的深度,进而将已进入微反应腔的样品液滴截留,并阻塞该微反应腔的流动路径;完全填充后,使用纯填充流体冲洗分配通道和分配槽,将多余的样品液滴置换并从出口处排出;可以显著提高实际被检测的样品液滴的数目与微反应腔数目的一致性。
附图说明
图1为本发明微生物检测芯片的组合剖视图;
图2为本发明微生物检测芯片的立体组合示意图;
图3为本发明微生物芯片各层的平面示意图。
图中:1为微生物检测芯片,2为盖片层,21为填充流体进口,22为样品液滴进口,23为出口,3为微通道层,31为第一通孔,32为分配通道,33为分配槽,34为收集槽,4为微反应腔层,41为第二通孔,42为微反应腔,5为基底层,51为填充流体腔,52为芯吸腔,53为第一微阀,54为第二微阀,55为芯吸通道。
具体实施方式
实施例1
参见图1-3所示,一种具有高样品填充率的微生物检测芯片1,包括由上至下叠加设置的盖片层2,微通道层3,微反应腔层4和基底层5;所述盖片层2为透明材质,其上设置有贯通盖片层2的填充流体进口21、样品液滴进口22和出口23,其中所述填充流体进口21与样品液滴进口23相邻设置于所述盖片层2的同一侧,所述出口23设于所述盖片层的另一侧。
所述微通道层3包括第一通孔31和依次连通的分配通道32、分配槽33、收集槽34;所述分配通道32与所述样品液滴进口22连通;所述收集槽34与出口23连通;
所述微反应腔层4具有第二通孔41和微反应腔42的阵列;所述微反应腔42为贯通微反应腔层4的孔;所述微反应腔42的阵列与所述分配槽33对应,并与之流体连通;
所述填充流体进口21、第一通孔31、第二通孔41共同构成填充流体通道;
所述基底层5包括覆盖所述微反应腔42的阵列的下部的填充流体腔51、芯吸腔52、第一微阀53、第二微阀54及芯吸通道55;所述填充流体腔51与所述填充流体通道连通,且其连通路径上设有第一微阀53;所述填充流体腔51的另一侧通过芯吸通道55与所述芯吸腔52连通,且所述芯吸通道55内设置有第二微阀54。
优选的,所述分配通道32和收集槽34为非贯通结构;所述的分配槽33为贯通槽。
优选的,所述填充流体为非极性流体(或油性流体),所述样品液滴为水性液滴;所述微生物检测芯片1的所有内部通道均具有疏水表面。
优选的,所述分配通道32具有圆滑转角。
优选的,所述填充流体腔51、芯吸腔52及芯吸通道55均为非贯通结构;所述芯吸通道55优选为多个,且其均匀分布在填充流体腔51和芯吸腔52之间;每个芯吸通道55内均设有至少一个第二微阀54。
优选的,位于不同芯吸通道55中的第二微阀54可以独立控制。
优选的,所述芯吸腔52接通微泵,以提供芯吸动力。
优选的,所述芯吸腔52内填充吸油材料,如吸油毡、吸油纸等;所述填充流体腔51及芯吸通道55为非贯通结构,所述芯吸腔52可从底部或侧面被开启,以允许更换或补充吸油材料。
优选的,所述填充流体腔51的壁面具有疏水特性,且所述填充流体腔51的深度小于样品液滴的数均半径。
实施例2
一种用于上述微生物检测芯片的样品填充方法,包括如下步骤:
1)、排气;开启第一微阀53,关闭所有第二微阀54,从填充流体进口21、样品液滴进口22处同时通入填充流体,当所述填充流体从出口23处流出,且不再伴随有气泡时,排气结束;
2)、进样,整体填充;关闭第一微阀53和出口23,开启全部第二微阀54;从所述样品液滴进口22处通入包裹有样品液滴的填充流体;
3)洗样;待微反应腔42的阵列被完全填充后,关闭所有第二微阀54,打开出口23;从样品液滴进口22处通入纯的填充流体;一定时间后停止通入纯的填充流体,并封闭微生物检测芯片1的全部开口。
所述微反应腔42阵列的完全填充可通过如下方法判断:在步骤2开始一段时间后判定为完全填充。所述的一段时间可通过模拟实验进行标定,例如,使用包含荧光物质的液滴替代样品液滴,进行填充模拟实验,通过荧光检测分析液滴的填充率,并分别记录填充开始后不同时间内的填充率数值,获取填充率随填充时间变化的曲线,并得出完全填充的参考时间。
同理,洗样所述的一定时间也可以通过类似的模拟实验进行标定,此处不再赘述。
优选的是,在上述步骤2和步骤3之间还包括如下步骤:
进样,局部填充;使若干第二微阀54中靠近边缘的一个开启,其余的关闭,从而在所述填充流体腔51中的,靠近该开启的第二微阀54的区域形成局部芯吸,并保持一定时间;按顺序依次开启相邻的第二微阀54,并同时关闭原开启的第二微阀54,调整局部芯吸区域的位置,直至所有第二微阀54均被开启并关闭。
以上记载仅是本发明解决方案的较佳实施方式的举例,不应当被理解成是本发明所有可能的实施方式,本领域的普通技术人员在不经过创造性劳动的情况下通过常规的改进、替换等方式得当的实施方式也应当被视为是本发明所披露的实施内容,本发明的具体保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种具有高样品填充率的微生物检测芯片,其特征在于:包括由上至下叠加设置的盖片层(2),微通道层(3),微反应腔层(4)和基底层(5);所述盖片层(2)为透明材质,其上设有贯通的填充流体进口(21)、样品液滴进口(22)和出口(23),其中所述填充流体进口(21)与样品液滴进口(22)相邻设置于所述盖片层(2)的同一侧,所述出口(23)设于所述盖片层(2)的另一侧;
所述微通道层(3)包括第一通孔(31)和依次连通的分配通道(32)、分配槽(33)、收集槽(34);所述分配通道(32)与所述样品液滴进口(22)连通;所述收集槽(34)与出口(23)连通;
所述微反应腔层(4)具有第二通孔(41)和微反应腔(42)的阵列;所述微反应腔(42)为贯通微反应腔层(4)的孔;所述微反应腔(42)的阵列与所述分配槽(33)对应,并与之流体连通;
所述填充流体进口(21)、第一通孔(31)、第二通孔(41)共同构成填充流体通道;
所述基底层(5)包括覆盖所述微反应腔(42)的阵列的下部的填充流体腔(51),还包括芯吸腔(52)、第一微阀(53)、第二微阀(54)及芯吸通道(55);所述填充流体腔(51)与所述填充流体通道连通,且其连通路径上设有第一微阀(53);所述填充流体腔(51)的另一侧通过芯吸通道(55)与所述芯吸腔(52)连通,且所述芯吸通道(55)内设置有第二微阀(54)。
2.如权利要求1所述的微生物检测芯片,其特征在于:所述分配通道(32)和收集槽(34)为非贯通结构;所述的分配槽(33)为贯通槽。
3.如权利要求1所述的微生物检测芯片,其特征在于:所述填充流体为非极性流体,所述样品液滴为水性液滴;所述微生物检测芯片(1)的所有内部通道均具有疏水表面;所述分配通道(32)具有圆滑转角。
4.如权利要求1所述的微生物检测芯片,其特征在于:所述填充流体腔(51)、芯吸腔(52)及芯吸通道(55)均为非贯通结构;所述芯吸通道(55)为多个,且其均匀分布在填充流体腔(51)和芯吸腔(52)之间;每个芯吸通道(55)内均设有至少一个第二微阀(54)。
5.如权利要求4所述的微生物检测芯片,其特征在于:位于不同芯吸通道(55)中的第二微阀(54)可以独立控制。
6.如权利要求1所述的微生物检测芯片,其特征在于:所述芯吸腔(52)接通微泵,以提供芯吸动力。
7.如权利要求1所述的微生物检测芯片,其特征在于:所述芯吸腔(52)内填充吸油材料;所述填充流体腔(51)及芯吸通道(55)为非贯通结构,所述芯吸腔(52)可从底部或侧面被开启,以允许更换或补充吸油材料。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的微生物检测芯片,其特征在于:所述填充流体腔(51)的壁面具有疏水特性,且所述填充流体腔(51)的深度小于样品液滴的数均半径。
9.一种用于权利要求1-8中任一项所述的微生物检测芯片的样品填充方法,包括如下步骤:
1)、排气;开启第一微阀(53),关闭所有第二微阀(54),从填充流体进口(21)、样品液滴进口(22)处同时通入填充流体,当所述填充流体从出口(23)处流出,且不再伴随有气泡时,排气结束;
2)、进样,整体填充;关闭第一微阀(53)和出口(23),开启全部第二微阀(54);从所述样品液滴进口(22)处通入包裹有样品液滴的填充流体;
3)洗样;待微反应腔(42)的阵列被完全填充后,关闭所有第二微阀(54),打开出口(23);从样品液滴进口(22)处通入填充流体;一定时间后停止通入填充流体,并封闭微生物检测芯片(1)的全部开口。
10.如权利要求9所述的样品填充方法,其特征在于:在上述步骤2和步骤3之间还包括如下步骤:进样,局部填充;使若干第二微阀(54)中靠近边缘的一个开启,其余的关闭,并保持一定时间;按顺序依次开启相邻的第二微阀(54),并同时关闭原开启的第二微阀(54),直至所有第二微阀(54)均被开启并关闭。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20210423 Termination date: 20211030 |