CN103913542A

CN103913542A - 一种针对靶标的即时定量分析方法

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Publication number: CN103913542A
Application number: CN201410057505.1A
Authority: CN
Inventors: 杨朝勇; 官志超; 郏莎莎; 朱志
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2034-02-20
Also published as: CN103913542B

Abstract

本发明公开了一种针对靶标的即时定量分析方法，包括如下步骤：（1）根据靶标选择合适的核酸适体，并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A，以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B；在链A、链B上分别修饰水凝胶单体；（2）将修饰单体的链A、链B聚合，并与包含有核酸适体的linker链混合形成水凝胶，同时将信号放大分子，包埋在该水凝胶结构中；（3）在水凝胶中加入靶标，靶标刺激水凝胶瓦解从而释放出包埋其中的信号放大分子；（4）滑动芯片中放置溶液相底物，信号放大分子作用于溶液相底物，催化产生可由滑动芯片读出的信号分子；（5）记录检测结果。该方法具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点。

Description

一种针对靶标的即时定量分析方法

技术领域

本发明涉及一种针对可卡因等多种靶标的即时可视化定量分析方法，属于可视化定量分析方法技术领域。

背景技术

水凝胶是一类亲水性的高分子聚合物，能够在水环境下发生溶胀，依靠物理交联或化学交联两种方式生成。凝胶结构能够响应多种环境参数，如温度，pH，离子强度和溶剂组成等，而发生改变，因而也被称作“智能水凝胶”。基于各种传统意义上的水凝胶构建的传感器在响应各种外界信号并发生性质改变后，通常还要结合一些复杂、精密的仪器对特征变化进行表征和记录，这样往往耗时费力，不适合普及。DNA交联水凝胶的出现，极大地扩展了水凝胶传感器的应用范围（1、Liu J，Liu H，Kang H，et.al.，Aptamer-incorporatedhydrogels for visual detection，controlled drug release,and targeted cancer therapy[J].AnalBioanal Chem(2012)402:187–194.）。

核酸适体作为一类新型的分析、诊断分子，自出现以来，受到科研工作者的广泛关注。因其优于传统蛋白单克隆抗体的诸多特性，核酸适体已成为新兴的研究工具，在科研、疾病诊断和治疗试剂等方面逐步取代传统的抗体类诊断和生物技术产品（2、Gold L.，PoliskyB.，Uhlenbeck O.，et.al.，Diversity of oligonucleotide functions,Annual Review ofBiochemistry[J].1995,64.763-797；3、Jayasena S.，Aptamers:An emerging class of moleculesthat rival antibodies in diagnostics,Clinical Chemistry[J].1999,45.1628-1650；4、Wilson D.，Szostak J.，In vitro selection of functional nucleic acids,Annual Review of Biochemistry[J].1999,68.611-647；5、Joyce G.，In-vitro evolution of nucleic-acids，Current Opinion inStructural Biology[J].1994,4.331-336.）。核酸适体是指从人工合成的DNA/RNA库中筛选得到的能够与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体技术存在的基础是核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成的特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G-四聚体等（6、Li,F.,Zhang,J.,Cao,X.N.,Wang,L.H.,Li,D.,Song,S.P.,Ye,B.C.,Fan,C.H.,Adenosine detection by using gold nanoparticles and designed aptamer sequences,Analyst[J].2009,134.1355-1360.）。另一方面，核酸适体的特异性很高，如茶碱与其RNA核酸适体的亲和力相当于其类似物如咖啡因(与茶碱只相差一个碱基)的10,000倍（7、Kato,T.,Takemura,T.,Yano,K.,Ikebukuro,K.,Karube,I.,In vitro selection of DNA aptamerswhich bind to cholic acid,Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression[J].2000,1493.12-18.），还可以将氨基酸、腺苷等生物小分子的突变体、异构体区分开来。核酸适体技术在分子生物学中的应用对象相当广泛，涵盖了离子、小分子、生物大分子以及细胞。应用目的则相对专一，主要是检测和分析。

与此同时，遗传变异、疾病诊断、治疗等与人类健康息息相关的问题受到越来越广泛的重视。致力于解决上述问题的生物小分子、生物大分子、细胞，特别是癌变细胞等的检测，也因此成为化学、生物医学等相关领域的研究热点。其中基于核酸适体的放大技术凭借其高分析灵敏度，在超痕量核酸序列检测中大放异彩，向着普及化、便携化、低污染等方向发展。目前有代表性的涉及核酸相关酶的分子生物学信号放大研究方向有以下几种：基于飞速发展的纳米生物技术的DNA的可视化检测、癌症检测等；应免疫学和癌症生物学发展要求涌现的新型诊断和治疗工具以及灵敏的系统监测技术；更有利于生物分析及临床诊断的对实际样品中小分子及蛋白质的检测；与基于核酸适体的免疫磁分离相结合的血液、血浆等各种体液中存在的疾病标志物的检测；多态效应的评估；应用于酶活性的表征的核酸放大技术、miRNA的定量分析及治疗研究；新的DNAzyme。

即时诊断是近年来日渐成熟的一项诊断技术。所谓即时诊断（Point of Care Test，POCTest），是指在病人身旁迅速获得检测结果。该技术方便、快捷，不依赖昂贵的实验仪器设备或者专业的技术人员，亦不需借助复杂的样品处理步骤，依靠简单的设备读出信号或者通过观测试纸上条纹、斑点等的颜色变化来反映检测结果。除应用于医院、诊所中迅速获取病人信息外，即时诊断使疫情早期预警、家庭保健防护、贫困地区医疗乃至食物、水、环境等的现场监测等成为可能。

发明内容

本发明针对现有仪器手段复杂、价格昂贵等问题，提出一种快速、灵敏、特异性分析复杂体系中靶标的可视化定量分析方法。

本发明的技术方案为：

一种针对靶标的即时定量分析方法，包括如下步骤：

（1）根据靶标选择合适的核酸适体，并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A，以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B；在链A、链B上分别修饰水凝胶单体；

（2）将修饰单体的链A、链B聚合，并与包含有核酸适体的linker链混合形成水凝胶，同时将信号放大分子，包埋在该水凝胶结构中；

（3）在水凝胶中加入靶标，靶标刺激水凝胶瓦解从而释放出包埋其中的信号放大分子；

（4）滑动芯片中放置溶液相底物，信号放大分子作用于溶液相底物，催化产生可由滑动芯片读出的信号分子；

（5）根据滑动芯片的示数，记录检测结果。

其中，步骤（2）中，水凝胶中三条DNA链的终浓度优选分别为100μM-1mM。

其中，步骤（3）在缓冲液中进行，使用的缓冲液体系优选采用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

其中，溶液相底物为H₂O₂，信号分子为O₂时，信号放大分子选自过氧化氢酶、AuNPs、AuPtNPs中的一种。优选采用AuPtNPs，因其可催化H₂O₂产生O₂，且催化效果好。

其中，信号放大分子采用为AuPtNPs时，其在水凝胶中的包埋量优选采用1nM-100μM。

其中，步骤（3）中，水凝胶与靶标溶液体积比为1:1-10。

前述的针对靶标的即时定量分析方法，用于可卡因检测时，该方法包括如下步骤：（1）将两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子与AuPtNPs混合，制备核酸适体交联水凝胶；（2）将含有不同已知浓度分析物的溶液加入上述水凝胶中，30℃条件下反应1小时，释放出AuPtNPs；（3）利用slip chip，使AuPtNPs与H₂O₂接触并催化H₂O₂产生O₂，从而测定反应产物中的纳米粒子含量。

在步骤（1）中采用修饰有丙烯酸亚磷酰胺单体的DNA和丙烯酰胺的自由基聚合反应制备聚合物链，按照反应配比1:1:0.6分别加入两条聚合物链、一条核酸适体链并包裹AuPtNPs，制备的水凝胶中DNA链的浓度为110μM，AuPtNPs浓度为4.6nM。

在步骤（2）中使用的水凝胶体积为10μL，分析物溶液体积为50μL。

在步骤（3）中使用的H₂O₂浓度为30%，催化反应时间为15min-1hr。

优选方法如下：

（1）合成丙烯酸亚磷酰胺单体

（2）甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1；合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水=1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清；向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min；酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min，弃上清；将得到的粗产物纯化；定量后真空浓缩；

（3）水凝胶的制备

将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液。分别配制10%的过硫酸铵和5%的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5mL超纯水和25μL TEMED溶解于0.5mL超纯水。将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10min，加入终浓度为1.4%的新鲜配制的引发剂过硫酸铵和加速剂TEMED，混匀后将反应体系置于真空干燥器中，30℃条件下抽真空反应15min，得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；将PS-A与PS-B按照1:1混合后，加入反应缓冲液，之后加入AuPtNPs，振荡混匀后再加入与PS-A、PS-B浓度比为1:1:0.6的linker核酸适体；重复振荡、加热步骤，直至得到包裹有AuPtNPs的三维交联水凝胶；

（4）制作滑动芯片

（5）DNA水凝胶可视化定量检测

利用缓冲液配制靶标溶液，并加入到装有水凝胶的离心管中。将离心管转移至摇床上，于30℃，150rpm的转速下进行充分反应；反应结束后，取反应上清液用于slip chip催化反应；分别在加样孔，底物孔，染料孔加入反应上清液，H₂O₂和罗丹明6G，滑动芯片，使AuPtNPs与H₂O₂接触并催化H₂O₂产生O₂，根据产生气体量进行读数，并记录数据。

本发明的优点在于：首先，该方法在设计上符合ASSURED（Martinez A.，Phillips S.，Whitesides G.，et.al.，Diagnostics for the Developing World:Microfluidic Paper-BasedAnalytical Devices,Analytical Chemistry[J].2010,82.3-10.）的国际标准，同时它灵敏度高、选择性好，检测结果可靠的；其次，相对于过氧化氢酶易在H₂O₂中失活，AuNPs催化能力差，AuPtNPs具有可长时间催化，易保存等特点。通过延长AuPtNPs与H₂O₂的反应时间，即可实现超低靶标的检测，通过产生O₂的体积量，最终我们建立起了靶标浓度和slipchip读数的定量关系；另外，由于SELEX技术的飞速发展，现在已经有很多可用的核酸适体，此外还可以通过SELEX筛选得到更广泛的靶标的核酸适体，而我们只需简单的将水凝胶中特异性的核酸适体序列替换掉就能够将我们的发展方法用于更多其它靶标的快速、定量分析。鉴于成本低廉，检测快速，用户友好以及slip chip的广泛可用性，我们提出的基于DNA水凝胶的可视化定量检测方法有可能发展成为公众用于广泛的靶标定量检测工具。

本发明方法检测灵敏度高，例如，在缓冲液中可卡因检出灵敏度为0.25μM。本发明方法具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点，且通用性好，可用于复杂体系，包括生物小分子、重金属离子、蛋白质等各种物质的快速、高灵敏定量检测。

附图说明

图1为丙烯酸亚磷酰胺单体合成路线。

图2为过氧化氢酶、AuNPs、AuPtNPs催化效率对比。（A）0.25nM AuPtNPs催化H₂O₂产生O₂slip chip实物图；（B）30min内不同催化剂催化H₂O₂产生的气体量。

图3为slip chip芯片用于可卡因梯度浓度检测。

图4为slip chip芯片对于250μM可卡因和2.5mM苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的响应。

图5为slip chip芯片用于可卡因超低浓度检测。

图6为使用DNA水凝胶可视化定量检测方法用于检测Adenosine。

具体实施方式

实施例1丙烯酸亚磷酰胺单体的合成

参见图1，丙烯酸亚磷酰胺单体的合成分为三个步骤：1）将6-氨基-1-己醇（1g，8.53mmol），三乙胺（2.36mL，17mmol）加入100mL二氯甲烷中冰浴，在无水无氧条件下逐滴加入甲基丙烯酰氯（2.67g，2.55mmol），之后整个体系在室温条件下搅拌反应2小时。2）将溶剂旋干，向产物中加入10mL乙醇和15%NaOH（4mL）将产物选择性水解成N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide。将N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide用乙酸乙酯在硅胶柱分离之后进行下一步反应。3）将纯化后的N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide（0.50g，2.70mmol）溶于10mL无水二氯甲烷中，在0℃条件下逐滴加入N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，0.98g，7.5mmol），再逐滴加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺（0.87mL，3.25mmol），在室温反应2小时。将溶剂旋干后，将产物用乙酸乙酯:石油醚:三乙胺40:60:3的洗脱液在硅胶柱上洗脱。得到的终产物为无色油状液体。终产物的核磁表征数据如下：¹H NMR(CDCl₃):δ5.92(br,1H),5.63(m,1H),5.27(m.1H),3.86-3.72(m,2H),3.66-3.49(m,4H),3.30-3.23(m,2H),2.61(t,2H),1.92(m,3H),1.58-1.50(m,4H)1.37-1.32(m,4H)1.17-1.13(m,12H).¹³C NMR(CDCl₃):δ168.6,140.4,119.3,118.0,63.8,63.6,58.6,58.3,43.2,43.1,39.8,31.3,29.7,26.8,25.8,24.9,24.8,24.7,19.0.31P(CDCl3):δ148.

实施例2甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰上实施例1中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1。合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水=1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min。酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min，弃上清。将得到的粗产物溶解在0.1mol/L的醋酸三乙胺（TEAA）中，使用反相高效液相色谱仪进行纯化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥，溶于超纯水后使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩。

表1实施例2中所用DNA序列

实施例3水凝胶的制备

将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液。分别配制10%的过硫酸铵和5%的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5mL超纯水和25μl TEMED溶解于0.5mL超纯水。将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10min。加入终浓度为1.4%的新鲜配制的引发剂（过硫酸铵）和加速剂（TEMED），混匀后将反应体系置于真空干燥器中，30℃条件下抽真空反应15min，得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B。将PS-A与PS-B按照1:1混合后，加入10×反应缓冲液1μL，（可卡因使用PB缓冲液：77mM Na₂HPO₄,23mM NaH₂PO₄,50mM NaCl,5mMMgCl₂,pH7.3；腺苷使用Tris-HCl缓冲液：10mM Tris-HCl,100mM NaCl,10mM MgCl₂，pH8.0），之后加入23nM AuPtNPs2μL，振荡混匀后再加入与PS-A、PS-B浓度比为1:1:0.6的linker aptamer。重复振荡、加热步骤，直至得到包裹有AuPtNPs的三维交联水凝胶。上述反应在干浴器中进行，加热步骤在65℃保持5min，最后自然冷却至室温。

实施例4slip chip（滑动芯片）的制作

使用AutoCAD软件画出芯片的二维结构，并制作掩膜版。利用软光刻技术将图形转移到铬板玻璃上，显影坚膜去铬层后，将芯片置于腐蚀液（HF:HNO₃:H₂O=1:2:17）中腐蚀100min，即可获得芯片结构，并去除剩余的光刻胶和铬层。采用打孔机用1.8mm的钻头进行打孔。之后将芯片放入食人鱼洗液（浓硫酸/H₂O₂，v:v=3:1）中加热40min以保证芯片的洁净。干燥后，使用2%氯代全氟硅烷（1H,1H,2H,2H-perfluorooctyldimethyl-chlorosilane）/氟化油FC40(w/w)进行疏水化处理，在85℃加热1hr即得到slip chip。

实施例5DNA水凝胶可视化定量检测步骤

使用前用超纯水将制备好的水凝胶清洗3次，以除去残留在离心管管壁上及水凝胶表面的信号放大分子，并将纯水除去。检测时，利用缓冲液配制靶标溶液，并加入到装有水凝胶的离心管中。将离心管转移至摇床上，于30℃，150rpm的转速下进行充分反应。反应结束后，取反应上清液用于slip chip催化反应。在slip chip上层芯片上滴加20μL氟油FC40，将空白玻片在其表面进行滑动，使得氟油均匀平铺在slip chip上层芯片上。盖上slip chip底层芯片，通过左右滑动，排除芯片间空隙使得通道密闭。分别在加样孔，底物孔，染料孔加入反应上清液，H₂O₂和罗丹明6G(C₂₈H₃₁N₂O₃Cl)，滑动芯片，使信号放大分子与H₂O₂接触并催化H₂O₂产生O₂，根据产生气体量进行读数，并记录数据。

图2为过氧化氢酶、AuNPs、AuPtNPs催化效率对比。使用实施例4制作的slip chip芯片。在slip chip上层芯片上滴加20μL氟油FC40，将空白玻片在其表面进行滑动，使得氟油均匀平铺在slip chip上层芯片上。盖上slip chip底层芯片，通过左右滑动，排除芯片间空隙使得通道密闭。分别在加样孔，底物孔，染料孔加入反应上清液，H₂O₂和罗丹明6G(C₂₈H₃₁N₂O₃Cl)，滑动芯片，使AuPtNPs与H₂O₂接触并催化H₂O₂产生O₂，根据产生气体量进行读数，并记录数据。实验中在前十分钟每隔一分钟记录一次距离长度，在后20分钟，每隔五分钟记录一次。（A）0.25nM AuPtNPs催化H₂O₂产生O₂slip chip实物图；（B）30min内不同催化剂催化H₂O₂产生的气体量。

图3为slip chip芯片用于可卡因梯度浓度检测。DNA水凝胶解胶实验在PB缓冲液（77mM Na₂HPO₄,23mM NaH₂PO₄,50mM NaCl,5mM MgCl₂,pH7.3）中于30℃，150rpm反应1hr。收集反应上清液，在如图3所示slip chip上与H₂O₂反应15min，根据气体产生量进行读数，并记录数据。（A）slip chip实物图；（B）可卡因浓度梯度标准曲线。

图4为slip chip芯片对于250μM可卡因和2.5mM苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的响应。苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯为可卡因的水解产物。通过考察该水凝胶对可卡因以及苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的响应来判断其专一性。DNA水凝胶解胶实验在PB缓冲液（77mMNa₂HPO₄,23mM NaH₂PO₄,50mM NaCl,5mM MgCl₂,pH7.3）中于30℃，150rpm反应1hr。收集反应上清液，在slip chip上与H₂O₂反应15min。根据气体产生量进行读数，并记录数据。（A）slip chip实物图，1、3、5为2.5mM苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯，2、4、6为250μM可卡因；（B）柱状图。

图5为slip chip芯片用于可卡因超低浓度检测。实验中比较了三种信号放大分子的放大效果及优缺点，发现铂纳米粒子具有催化寿命长，且催化效率稳定等优点，因此，只要存在足够多的H₂O₂与其反应，就可产生足够多的O₂进行检测。DNA水凝胶解胶实验在PB缓冲液（77mM Na₂HPO₄,23mM NaH₂PO₄,50mM NaCl,5mM MgCl₂,pH7.3）中于30℃，150rpm反应1hr。收集反应上清液，在slip chip上与H₂O₂反应1hr，其检出限为0.058μM。（A）slip chip实物图；（B）可卡因浓度梯度标准曲线。

图6为使用DNA水凝胶可视化定量检测方法用于检测Adenosine。根据靶标改变水凝胶中的DNA序列，就可实现对其相应靶标的检测。DNA水凝胶解胶实验在Tris-HCl缓冲液（10mMTris-HCl,100mM NaCl,10mM MgCl₂，pH8.0）中于30℃，150rpm反应2hr。收集反应上清液，在slip chip上与H₂O₂反应15min。（A）slip chip实物图；（B）腺苷浓度梯度标准曲线。

Claims

1.一种针对靶标的即时定量分析方法，包括如下步骤：

（5）根据滑动芯片的示数，记录检测结果。

2.如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法，其特征在于：步骤（2）中，水凝胶中三条DNA链的终浓度分别为100μM-1mM。

3.如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法，其特征在于：步骤（3）在缓冲液中进行，使用的缓冲液体系为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

4.如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法，其特征在于：溶液相底物为H₂O₂，信号分子为O₂时，信号放大分子选自过氧化氢酶、AuNPs、AuPtNPs中的一种。

5.如权利要求4所述的一种针对靶标的即时定量分析方法，其特征在于：信号放大分子采用为AuPtNPs，其在水凝胶中的包埋量为1nM-100μM。

6.如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法，其特征在于：步骤（3）中，水凝胶与靶标溶液体积比为1:1-10。

7.如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法，用于可卡因检测，包括如下步骤：（1）将两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子与AuPtNPs混合，制备核酸适体交联水凝胶；（2）将含有不同已知浓度分析物的溶液加入上述水凝胶中，30℃条件下反应1小时，释放出AuPtNPs；（3）利用滑动芯片，使AuPtNPs与H₂O₂接触并催化H₂O₂产生O₂，从而测定反应产物中的纳米粒子含量。

8.如权利要求7所述的一种针对靶标的即时定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成丙烯酸亚磷酰胺单体

（2）甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体，具体合成的序列见表1；合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水=1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来；氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清；向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min；酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min，弃上清；将得到的粗产物纯化；定量后真空浓缩；

（3）水凝胶的制备

将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液，分别配制10%的过硫酸铵和5%的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5ml超纯水和25μL TEMED溶解于0.5mL超纯水；将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10min，加入终浓度为1.4%的新鲜配制的引发剂过硫酸铵和加速剂TEMED，混匀后将反应体系置于真空干燥器中，30℃条件下抽真空反应15min，得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；将PS-A与PS-B按照1:1混合后，加入反应缓冲液，之后加入AuPtNPs，振荡混匀后再加入与PS-A、PS-B浓度比为1:1:0.6的linker核酸适体；重复振荡、加热步骤，直至得到包裹有AuPtNPs的三维交联水凝胶；

（4）制作滑动芯片

（5）DNA水凝胶可视化定量检测

利用缓冲液配制靶标溶液，并加入到装有水凝胶的离心管中。将离心管转移至摇床上，于30℃，150rpm的转速下进行充分反应；反应结束后，取反应上清液用于滑动芯片催化反应；分别在加样孔，底物孔，染料孔加入反应上清液，H₂O₂和罗丹明6G，滑动芯片，使AuPtNPs与H₂O₂接触并催化H₂O₂产生O₂，根据产生气体量进行读数，并记录数据。