CN104634919A - 一种针对多靶标的即时定性分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对多靶标的即时定性分析方法，包括如下步骤：(1)根据靶标选择合适的核酸适体，并合成可和核酸适体的一末端部分序列互补的链A，以及和核酸适体的另一末端序列互补的链B；通过化学修饰方法在链A、链B远离互补序列的一段修饰丙烯酰胺单体；(2)将修饰后的链A、链B与一定比例的丙烯酰胺单体聚合形成线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；(3)将PS-A、PS-B、以核酸适体链为主体的linker链和食用色素染料按一定顺序填充进各层亲水纤维素中，干燥后塑封成三维纸芯片；(4)把样品加入芯片进样口；(6)记录检测结果。该方法具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点。

Description

一种针对多靶标的即时定性分析方法

技术领域

本发明涉及一种针对可卡因，腺苷，Pb²⁺等多种靶标的即时可视化定性分析方法，属于可视化定性分析方法技术领域。

背景技术

水凝胶是一类亲水性的高分子聚合物，能够在水环境下发生溶胀，依靠物理交联或化学交联两种方式生成。凝胶结构能够响应多种环境参数，如温度，pH，离子强度和溶剂组成等，而发生改变，因而也被称作“智能水凝胶”。基于各种传统意义上的水凝胶构建的传感器在响应各种外界信号并发生性质改变后，通常还要结合一些复杂、精密的仪器对特征变化进行表征和记录，这样往往耗时费力，不适合普及。DNA交联水凝胶的出现，极大地扩展了水凝胶传感器的应用范围(1、Liu J，Liu H，Kang H，et.al.，Aptamer-incorporatedhydrogels for visual detection，controlled drug release,and targeted cancer therapy[J].AnalBioanal Chem(2012)402:187–194.)。

核酸适体作为一类新型的分析、诊断分子，自出现以来，受到科研工作者的广泛关注。因其优于传统蛋白单克隆抗体的诸多特性，核酸适体已成为新兴的研究工具，在科研、疾病诊断和治疗试剂等方面逐步取代传统的抗体类诊断和生物技术产品(2、Gold L.，PoliskyB.，Uhlenbeck O.，et.al.，Diversity of oligonucleotide functions,Annual Review ofBiochemistry[J].1995,64.763-797；3、Jayasena S.，Aptamers:An emerging class of moleculesthat rival antibodies in diagnostics,Clinical Chemistry[J].1999,45.1628-1650；4、Wilson D.，Szostak J.，In vitro selection of functional nucleic acids,Annual Review of Biochemistry[J].1999,68.611-647；5、Joyce G.，In-vitro evolution of nucleic-acids，Current Opinion inStructural Biology[J].1994,4.331-336.)。核酸适体是指从人工合成的DNA/RNA库中筛选得到的能够与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体技术存在的基础是核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成的特殊的三维结构，如发夹、假结、凸环、G-四聚体等(6、Li,F.,Zhang,J.,Cao,X.N.,Wang,L.H.,Li,D.,Song,S.P.,Ye,B.C.,Fan,C.H.,Adenosine detection by using gold nanoparticles and designed aptamer sequences,Analyst[J].2009,134.1355-1360.)。另一方面，核酸适体的特异性很高，如茶碱与其RNA核酸适体的亲和力相当于其类似物如咖啡因(与茶碱只相差一个碱基)的10,000倍(7、Kato,T.,Takemura,T.,Yano,K.,Ikebukuro,K.,Karube,I.,In vitro selection of DNA aptamers whichbind to cholic acid,Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression[J].2000,1493.12-18.)，还可以将氨基酸、腺苷等生物小分子的突变体、异构体区分开来。核酸适体技术在分子生物学中的应用对象相当广泛，涵盖了离子、小分子、生物大分子以及细胞。应用目的则相对专一，主要是检测和分析。

与此同时，遗传变异、疾病诊断、治疗等与人类健康息息相关的问题受到越来越广泛的重视。致力于解决上述问题的生物小分子、生物大分子、细胞，特别是癌变细胞等的检测，也因此成为化学、生物医学等相关领域的研究热点。其中基于核酸适体的放大技术凭借其高分析灵敏度，在超痕量核酸序列检测中大放异彩，向着普及化、便携化、低污染等方向发展。目前有代表性的涉及核酸相关酶的分子生物学信号放大研究方向有以下几种：基于飞速发展的纳米生物技术的DNA的可视化检测、癌症检测等；应免疫学和癌症生物学发展要求涌现的新型诊断和治疗工具以及灵敏的系统监测技术；更有利于生物分析及临床诊断的对实际样品中小分子及蛋白质的检测；与基于核酸适体的免疫磁分离相结合的血液、血浆等各种体液中存在的疾病标志物的检测；多态效应的评估；应用于酶活性的表征的核酸放大技术、miRNA的定量分析及治疗研究；新的DNAzyme。

即时诊断是近年来日渐成熟的一项诊断技术。所谓即时诊断(Point of Care Test，POCTest)，是指在病人身旁迅速获得检测结果。该技术方便、快捷，不依赖昂贵的实验仪器设备或者专业的技术人员，亦不需借助复杂的样品处理步骤，依靠简单的设备读出信号或者通过观测试纸上条纹、斑点等的颜色变化来反映检测结果。除应用于医院、诊所中迅速获取病人信息外，即时诊断使疫情早期预警、家庭保健防护、贫困地区医疗乃至食物、水、环境等的现场监测等成为可能。

纸芯片(Microfluidic Paper-based Analytical Devices，μPADs)是微流控芯片中最新发展的领域，由Whitesides组(8、Martinez,A.W.,Phillips,S.T.,Butte,M.J.,Whitesides,G.M.,Patterned Paper as a Platform for Inexpensive,Low-Volume,Portable Bioassays,AngewandteChemie International Edition[J],2007,46,1318-1320)在2007年首次提出。纸芯片是以纸代替传统的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，在纸的表面加工出具有一定结构的微流体通道的微型分析器件，结合了微流控技术和纸的优点。与传统的微流控芯片相比，纸芯片的优势是:(1)纸来源丰富，可进行批量生产；(2)不需要外接泵，纸的主要成分是纤维素，流体在纸上通过毛细作用流动；(3)试样消耗量更低；(4)检测背景低，有利于光度法检测；(5)生物兼容性好，可通过化学修饰改变纸的性质；(6)一次性便携式分析，操作简便，甚至不需要专业的操作人员。纸芯片为临床诊断、环境监测以及食品安全分析中需要的便携式检测和现场实时监测提供了一个广阔的平台。此外，对于医护人员和医疗设备紧缺的欠发达地区，纸芯片是低成本、检测迅速的即时诊断。

发明内容

本发明针对现有仪器手段复杂、价格昂贵等问题，提出一种快速、廉价、特异性分析复杂体系中多靶标的可视化定性分析方法。

本发明的技术方案为：

一种针对多靶标的即时定性分析方法，包括如下步骤：

(1)根据靶标选择合适的核酸适体，并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A，以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B；在链A、链B上分别修饰水凝胶单体；

(2)将修饰单体的链A、链B聚合形成线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；

(3)将多靶标对应的PS-A、PS-B、包含有核酸适体的linker链和食用色素染料填充进各分路纸芯片亲水通道中，塑封成3D纸芯片；

(4)把多靶标样品加入3D纸芯片，靶标刺激对应的水凝胶瓦解从而保持样品溶液的流动；

(5)样品溶液在毛细作用的推动下流动并与食用色素混合形成有色溶液，最终致使纸芯片信号响应区染色，即可判断对应信号分子的存在；

(6)根据纸芯片响应区的颜色，记录检测结果。

其中，步骤(2)中，水凝胶中Linker链，链A和链B的终浓度分别为100μM-1mM。

其中，步骤(4)在缓冲液中进行，使用的缓冲液体系为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液或Tris-CH₃COOH缓冲液。

其中，3D纸芯片包括顺次接触的至少五个区，储样区、linker-apt填充区、PS-A和PS-B填充区、食用色素填充区和流动区。

其中，3D纸芯片上设至少两个用于检测不同靶标的通道。

其中，不同通道之间设置颜色不同的色素。

前述的针对多靶标的即时定性分析方法，用于可卡因，腺苷和Pb²⁺的多靶标同时检测，包括如下步骤：(1)将多靶标对应的两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子和食用色素分别填充进纸芯片亲水通道中，塑封成3D纸芯片；(2)将含有不同已知浓度混合的分析物溶液加入3D纸芯片中，反应6min读取不同颜色的响应信号；(3)利用3D纸芯片响应区信号颜色的差异，得到对响应分析物的定性判断；

在步骤(1)中采用修饰有丙烯酸亚磷酰胺单体的DNA和丙烯酰胺的自由基聚合反应制备聚合物链。

优选方法如下：

(1)合成丙烯酸亚磷酰胺单体

(2)甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1；合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水＝1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清；向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min；酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min，弃上清；将得到的粗产物纯化；定量后真空浓缩；

(3)链A和链B的聚合

将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液，分别配制10％的过硫酸铵和5％的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5ml超纯水和25μL TEMED溶解于0.5mL超纯水；将DNA与终浓度为4％的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10min，加入终浓度为1.4％的新鲜配制的引发剂过硫酸铵和加速剂TEMED，混匀后将反应体系置于真空干燥器中，30℃条件下抽真空反应15min，得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；

(4)制作多靶标响应3D纸芯片

(5)多靶标响应DNA水凝胶可视化定性检测

滴加含有多靶标的样品液到3D纸芯片储样槽中，毛细作用驱动样品流动至各通道响应区；6min后，观测其他通道响应区颜色变化，若仅有绿色响应信号，则说明无任何待测分析物存在；若出现绿色以外的其他颜色响应，则说明对应分析物存在，从而来实现对多靶标的同时定性检测。

本发明的优点在于：首先，该方法在设计上符合ASSURED(Martinez A.，Phillips S.，Whitesides G.，et.al.，Diagnostics for the Developing World:Microfluidic Paper-BasedAnalytical Devices,Analytical Chemistry[J].2010,82.3-10.)的国际标准，同时它选择性好，微型便携，检测结果可靠的；其次，纸芯片的设计和加工生产及其简便，易于量产和推广；另外，由于SELEX技术的飞速发展，现在已经有很多可用的核酸适体，此外还可以通过SELEX筛选得到更广泛的靶标的核酸适体，而本发明只需简单的将水凝胶中特异性的核酸适体序列替换掉就能够将该方法用于更多其它靶标的快速、定性分析。鉴于成本低廉，检测快速，用户友好以及纸芯片的广泛可用性，该基于DNA水凝胶调控的可视化定性检测方法有可能发展成为公众用于广泛的多靶标定性检测工具。

本发明方法具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点，且通用性好，可用于复杂体系，包括生物小分子、重金属离子、蛋白质等各种物质的快速检测。另外，采用色素，可以直观判断结果。

附图说明

图1为丙烯酸亚磷酰胺单体合成路线。

图2为3D纸芯片结构示意图

图3为纸芯片用于可卡因，腺苷和Pb²⁺的定性检测。

图4为实施例6中纸芯片用于尿样中可卡因的定性检测。

具体实施方式

实施例1丙烯酸亚磷酰胺单体的合成

参见图1，丙烯酸亚磷酰胺单体的合成分为三个步骤：1)将6-氨基-1-己醇(1g，8.53mmol)，三乙胺(2.36mL，17mmol)加入100mL二氯甲烷中冰浴，在无水无氧条件下逐滴加入甲基丙烯酰氯(2.67g，2.55mmol)，之后整个体系在室温条件下搅拌反应2小时。2)将溶剂旋干，向产物中加入10mL乙醇和15％NaOH(4mL)将产物选择性水解成N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide。将N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide用乙酸乙酯在硅胶柱分离之后进行下一步反应。3)将纯化后的N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide(0.50g，2.70mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，在0℃条件下逐滴加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，0.98g，7.5mmol)，再逐滴加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.87mL，3.25mmol)，在室温反应2小时。将溶剂旋干后，将产物用乙酸乙酯:石油醚:三乙胺40:60:3的洗脱液在硅胶柱上洗脱。得到的终产物为无色油状液体。终产物的核磁表征数据如下：¹H NMR(CDCl₃):δ5.92(br,1H),5.63(m,1H),5.27(m.1H),3.86-3.72(m,2H),3.66-3.49(m,4H),3.30-3.23(m,2H),2.61(t,2H),1.92(m,3H),1.58-1.50(m,4H)1.37-1.32(m,4H)1.17-1.13(m,12H).¹³C NMR(CDCl₃):δ168.6,140.4,119.3,118.0,63.8,63.6,58.6,58.3,43.2,43.1,39.8,31.3,29.7,26.8,25.8,24.9,24.8,24.7,19.0.31P(CDCl3):δ148.

实施例2甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化

以普通CPG作为固相载体，以DNA单体碱基为原料，在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体，最后在两条链A和B的5′端修饰(在合成仪上修饰)上实施例1中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1。合成结束后，将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水＝1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清，并用少量超纯水清洗CPG，合并上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min。酒精沉淀完毕后，在14,000rpm的转速下离心10min，弃上清。将得到的粗产物溶解在0.1mol/L的醋酸三乙胺(TEAA)中，使用反相高效液相色谱仪进行纯化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥，溶于超纯水后使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度，根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩。

表1实施例2中所用DNA序列

实施例3链A和链B的聚合

将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液。分别配制10％的过硫酸铵和5％的TEMED，即0.05g过硫酸铵溶解至0.5mL超纯水和25μl TEMED溶解于0.5mL超纯水。将DNA与终浓度为4％的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除气10min。加入终浓度为1.4％的新鲜配制的引发剂(过硫酸铵)和加速剂(TEMED)，混匀后将反应体系置于真空干燥器中，30℃条件下抽真空反应15min，得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B。

实施例4DNA水凝胶集成3D纸芯片的制作

使用Coreldraw软件画出芯片的二维结构，用Xerox Colorqube 8570石蜡打印机将芯片结构打印在whatman No.1滤纸上。如图2所示：所设计3D纸芯片共有5层，黑色部分为石蜡打印疏水区，非黑色部分为亲水区。第一层亲水区图形为“叉形”储样槽，即中心为6mm直径圆形连接四条(2.5mm×7mm,夹角30°)矩形分路通道和四个3mm直径圆形；第二、三、式层亲水区图形一样，均为与第一层对应位置的四个3mm直径圆形；底层亲水区图形为“哑铃”形四分路亲水通道，内侧圆形(3mm直径)与上层对应一致，“哑铃”形通道为2mm×15mm的矩形，外侧圆形为3mm直径圆形。然后，将打印上石蜡纹路的滤纸放进150℃的烘箱加热2分钟。冷却至室温后，通过美工刀切割成纸芯片二维结构。对各通道层进行PS-A，PS-B，Linker链和食用色素的填充，具体填充体积和浓度见表2。待填充样自然干燥后，折叠纸芯片二维结构成3D纸芯片多层结构，利用塑封膜对纸芯片进行封装。最终得到DNA水凝胶集成的3D纸芯片。

表2实施例4中所填充DNA用量和浓度

实施例5多靶标可视化定性检测步骤

滴加含有多靶标的样品液到3D纸芯片储样槽中，毛细作用驱动样品流动至各通道响应区；6min后，观测各通道响应区颜色变化。如图3说所示，若仅有绿色响应信号(通道I)，则说明无任何待测分析物存在；若出现红色响应信号(通道II)，则说明样品中含有200nM以上Pb²⁺离子；若出现黄色响应信号(通道III)，则说明样品中含有50μM以上的可卡因；若出现蓝色响应信号(通道IV)，则说明样品中含有100μM以上的腺苷；若同时有对应的多种颜色出现，则说明样品中同时含有两种待测物，以此类推。因此，通过对颜色响应区的变色响应来实现对多靶标的同时定性检测。

实施例6尿样检测

取尿液样品均分为两份，分别加入等体积的二次水和可卡因(终浓度50μM)。把两份实际样品分别加入双通道的3D纸芯片储样槽中，毛细作用驱动样品流动至各通道响应区；6min后，观测各通道响应区颜色变化。如图4所示，若仅有绿色响应信号，则说明尿液中无可卡因存在；若出现红色响应信号，则说明尿液中含有50μM以上的可卡因。因此，通过对颜色响应区的变色响应来实现靶标的实际样品定性检测。

Claims (8)

1.一种针对多靶标的即时定性分析方法，包括如下步骤：

(1)根据靶标选择合适的核酸适体，并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A，以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B；在链A、链B上分别修饰水凝胶单体；

(2)将修饰单体的链A、链B聚合形成线状高分子聚合产物PS-A、PS-B；

(3)将多靶标对应的PS-A、PS-B、包含有核酸适体的linker链和食用色素染料填充进各分路纸芯片亲水通道中，塑封成3D纸芯片；

(4)把样品加入3D纸芯片，靶标刺激对应的水凝胶瓦解从而保持样品溶液的流动；

(5)样品溶液在毛细作用的推动下流动并与食用色素混合形成有色溶液，最终致使纸芯片信号响应区染色，即可判断对应信号分子的存在；

(6)根据纸芯片响应区的颜色，记录检测结果。

2.如权利要求1所述的一种针对多靶标的即时定性分析方法，其特征在于：所述的靶标包括DNA、RNA、毒品分子、金属离子、有机小分子、蛋白质中的至少一种。

3.如权利要求1所述的一种针对多靶标的即时定性分析方法，其特征在于：步骤(2)中，水凝胶中Linker链，链A和链B的终浓度分别为100μM-1mM。

4.如权利要求1所述的一种针对多靶标的即时定性分析方法，其特征在于：步骤(4)在缓冲液中进行，使用的缓冲液体系为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液或Tris-CH₃COOH缓冲液。

5.如权利要求1所述的一种针对多靶标的即时定性分析方法，其特征在于：3D纸芯片包括顺次接触的至少五个区，储样区、linker-apt填充区、PS-A和PS-B填充区、食用色素填充区和流动区。

6.如权利要求1所述的一种针对多靶标的即时定性分析方法，其特征在于：3D纸芯片上设至少两个用于检测不同靶标的通道。

7.如权利要求6所述的一种针对多靶标的即时定性分析方法，其特征在于：不同通道之间设置颜色不同的色素。

8.如权利要求1所述的一种针对多靶标的即时定性分析方法，其特征在于，该方法用于可卡因，腺苷和Pb2+的多靶标同时检测，包括如下步骤：(1)将多靶标对应的两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子和食用色素分别填充进纸芯片亲水通道中，塑封成3D纸芯片；(2)将含有不同已知浓度混合的分析物溶液加入3D纸芯片中，反应读取不同颜色的响应信号；(3)利用3D纸芯片响应区信号颜色的差异，得到对响应分析物的定性判断。