CN107557459A - 一种联合使用DNA水凝胶和DNAzyme检测SNP的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医用诊断技术领域，涉及一种核酸的单核苷酸多态性(SNP)的检测方法，用于个体化医疗和疾病辅助诊断。本发明利用被检测DNA与探针DNA形成双链DNA时，单核苷酸错配的DNA与完全互补的DNA之间的双链解旋温度(T_m)的差异，通过DNAzyme的过氧化物酶活性以及显色染料来鉴别SNP。本发明的方法具有灵敏度高，检测限低的优点。

Description

一种联合使用DNA水凝胶和DNAzyme检测SNP的方法

技术领域：

本发明属于医用诊断技术领域，涉及一种核酸的单核苷酸多态性(SNP)的检测方法，用于个体化医疗和疾病辅助诊断。

背景技术：

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，即染色体基因组中单个核苷酸的突变而引起的DNA序列的多态性，根据研究发现一些致病型SNPs与很多遗传性疾病有着密切的联系，例如镰刀型细胞贫血症、乳糖不耐症、阿尔兹海默症、二型糖尿病等，因此，实现SNPs的快速灵敏的检测具有很重要的意义。有代表性的传统的SNPs检测手段是聚合酶链反应(PCR)，通常在分子生物学实验室中需要借助一个热循环仪进行检测，因此具有高成本、耗时长、选择性低、受限于耐热酶和实验室设备等缺点，这使得对开发其他方便快速检测方法的迫切需要。新型的检测SNPs方法一般分为均相法和表面固定化探针两类，均相的检测方法传感器和靶标都在相同的溶液中并且在没有分离步骤的情况下产生信号，因此操作简便而受到追捧。然而，因为没有分离的过程使得灵敏度受到背景信号的干扰，容易产生假阳性结果。而固定化探针具有严格的洗脱步骤，能将非特异性结合最小化，同时能通过信号放大机制实现灵敏度的提高，因而是比较理想的SNPs检测方法。

水凝胶作为一种具有网状交联结构的水溶性高分子，具有吸水性和低毒性，其内部引入一部分疏水基团和亲水基团，通过亲水基团将水分子连接在网状结构内部，因为体积大部分是水，生物分子可以保持其天然结构和功能，是固定生物分子的理想选择。并且根据研究发现凝胶体积受到许多环境因素的影响包括温度、pH、离子强度、溶剂作用等。因此利用它的这些特性可以用来制备智能水凝胶。迄今为止，已经利用功能性核苷酸水凝胶证明了各种领域的应用，包括生物传感、环境分析、受控药物释放、靶向癌症治疗等。

脱氧核酶(DNA酶)属于催化核酸的一类物质，通过体外选择被分离出来，具有对特定底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性、将DNA功能和结构信息编入模板序列的灵活性，以及属于核酸低的非特异结合性等优点，是生物应用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-血红素DNA酶的发现引起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子--氯化血红素，形成仿过氧化物酶DNA酶，进而将H₂O₂介导的2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS^2-)催化氧化成绿色的ABTS^·-，或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-血红素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。将DNA双链连接到G-四链体构象异构体的合适位点可有助于提高DNAzyme的催化效率。此外利用滚环扩增技术(RCA)可用于合成具有多聚体G-四链体：氯化血红素亚基的长DNAzyme，用于比色和发光检测中的催化信号扩增。这种多聚体效应类似于酶的四级结构，是由多个天然构象亚基和多价催化位点共同结果，有趣的是，据报道人类端粒串联重复G-四链体DNA序列显示酶样催化活性，其催化性能与G-四链体DNA的重复倍数有关。所有这些都表明，构建多价DNAzyme可以是加速H₂O₂催化的有效途径。

发明内容：

本发明所解决的第一个技术问题是联合使用DNAzyme和DNA水凝胶进行SNP比色检测。

本发明所解决的第二个技术问题是利用DNAzyme的串联效应进行高灵敏度、低背景噪声的SNP比色检测。

本发明利用被检测DNA与探针DNA形成双链DNA时，单核苷酸错配的DNA与完全互补的DNA之间的双链解旋温度(T_m)的差异，通过DNAzyme的过氧化物酶活性以及显色染料来鉴别SNP。

本发明采用了两种技术方案来检测溶液中靶标DNA是否存在SNP：

方案一，制备并使用水凝胶中固定的支链DNA作为探针来检测被检测DNA中的SNP位点，包括如下步骤：

(1)制备DNA水凝胶：该水凝胶是以甲叉双丙烯酰胺(MBAAm)为交联剂，丙烯酰胺(AAm)与甲基丙烯酰胺修饰探针DNA(probe1)的共聚物为骨架的高分子水凝胶。其中甲基丙烯酰胺修饰探针DNA是通过DNA固相合成仪将甲基丙烯酰胺单体接入到下述探针DNA序列末端制备而得的(制备方法参见中国专利申请2013107110031)。

具体的制备方案如下：

在凝胶单体溶液中(AAm与MBAAm的物质的量之比为2～50:1)，加入甲基丙烯酰胺修饰探针DNA，在引发剂过硫酸铵(APS)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)的作用下，交联成含有探针DNA的AAm含量为2～25％的DNA水凝胶。

(2)靶标DNA的杂交：将(1)中制备的DNA水凝胶分别加入到含有完全互补DNA(F-DNA1)的缓冲液和含有单碱基变异的被检测靶标DNA(M1-DNA1)缓冲液(含有SNP)中，在5-70℃下孵育2-60min，进行分子杂交。此过程中的缓冲液是HEPES缓冲液(pH＝7.0)。根据所形成的双链DNA的解链温度(T_m)的差异，使完全互补DNA与含有SNP的靶标DNA在凝胶中组成双链数目形成显著差异。

(3)肉眼可视化显色反应：在步骤2)中已形成不同双链数目的水凝胶中均加入1～20μL的20μM浓度的DNAzyme D11溶液，将反应体系置于恒温器中，在5-70℃下反应2-90min。随后每隔5-30min洗脱一次，用HEPES缓冲液共洗脱1-5次。之后在室温下分别加入染料，、2-50μL的6mM的H₂O₂溶液，室温下反应2–300min后观察并记录胶块颜色变化。所述染料3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液或者2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液，其加入量为2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液或者2-50μL的20mM的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液。

所述的DNAzyme D11中含有DNAzyme序列和与被检测DNA互补的序列。

可以选自：CACCATTAGATGACCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTCCGCTGC(5’-3’)

(4)胶块外部缓冲溶液的定量：分别取步骤3)中得到的胶块反应体系中胶块外部缓冲溶液进行紫外吸光度值测定，测其在TMB氧化产物吸收波长λ＝652nm(或者ABTS氧化产物吸收波长λ＝414nm)处的吸光度值，记录并进行定量比较。

方案二，制备内部含有支链DNA的水凝胶用于被检测DNA的固定，利用DNAzyme的连接臂来鉴别被检测靶标DNA中的SNP位点：

(1)制备DNA水凝胶：该水凝胶是以甲叉双丙烯酰胺(MBAAm)为交联剂，丙烯酰胺(AAm)与甲基丙烯酰胺修饰DNA的共聚物为骨架的高分子水凝胶。其中甲基丙烯酰胺修饰探针DNA是通过DNA固相合成仪将甲基丙烯酰胺单体接入到下述探针DNA序列末端制备而得的(制备方法参见中国专利申请2013107110031)。

具体的制备方案如下：

在凝胶单体溶液中(AAm与MBAAm的物质的量之比为2～50:1)，加入甲基丙烯酰胺修饰DNA(probe2)，在引发剂过硫酸铵(APS)和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)的作用下，交联成含有DNA的AAm含量为2～25％的DNA水凝胶。

(2)靶标DNA的固定：将1)中制备的DNA水凝胶分别加入到含有完全互补DNA(F-DNA2)的缓冲液和被检测靶标DNA(M1-DNA2)缓冲液(含有SNP)中，在5-70℃下孵育2-60min，进行分子杂交，使靶标DNA固定在DNA水凝胶上。此过程中的缓冲液是HEPES缓冲液(pH＝7.0)。

(3)肉眼可视化显色反应：向步骤(2)中的水凝胶中均加入1～20μL的20μM浓度的DNAzyme GD1溶液，将反应体系置于恒温器中，在5-70℃下反应2-90min。随后每隔5-30min洗脱一次，共洗脱1-5次。之后继续加入1～20μL的一端连接臂与DNAzyme GD1另一端连接臂互补的20μM浓度的DNAzyme GG2溶液，重复洗脱之后再继续加入1～20μL的一端连接臂与DNAzyme GG2另一端连接臂互补的20μM浓度的DNAzyme GG3溶液，重复洗脱步骤，最后在室温下分别加入染料，、2-50μL的6mM的H₂O₂溶液，室温下反应2–300min后观察并记录胶块颜色变化。所述染料3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液或者2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液，其加入量为2–50μL的10mM的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液(或者2-50μL的20mM的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液)

所述DNAzyme GD1序列由DNAzyme序列和两个连接臂组成，其中一个连接臂可以和权利要求6中所述被检测DNA中含SNP位点的单链部分杂交形成双链。

可以选自：CCGCTGCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTACGCACAAACAC(5’-3’)；

DNAzyme GD1上可串联的DNAzyme包括DNAzyme GG2，DNAzyme GG3，其个数为1-100个。

所述的DNAzyme GG2的序列可以为：GG2：GCGCACCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTGCAGCGG(5’-3’)

所述的DNAzyme GG3的序列可以为：GG3：TTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTGGTGCGC(5’-3’)

(4)胶块外部缓冲溶液的定量：分别取步骤3)中得到的胶块反应体系中胶块外部缓冲溶液进行紫外吸光度值测定，测其在TMB氧化产物吸收波长λ＝652nm(或者ABTS氧化产物吸收波长λ＝414nm)处的吸光度值，记录并进行定量比较。

本发明的方法具有灵敏度高，检测限低的优点。

附图说明：

图1为方案一实施例1的基于DNA水凝胶和显色染料的SNP比色检测原理示意图；

图2为方案一实施例2中用ABTS为染料的SNP比色检测灵敏度结果；

图3为方案一实施例2吸光度值检测结果；

图4为方案一实施例3中用TMB为染料的SNP比色检测灵敏度结果；

图5为方案一实施例3吸光度值检测结果；

图6为方案二实施例4的基于DNA水凝胶和显色染料以及DNAzyme串联信号放大效应进行SNP比色检测原理示意图；

图7为方案二实施例5中用ABTS为染料的SNP比色检测灵敏度结果；

图8为方案二实施例5吸光度值检测结果；

图9为方案二实施例6中用TMB为染料的SNP比色检测灵敏度结果；

图10为方案二实施例6吸光度值检测结果。

具体实施方式：

本发明所用到的DNA序列如下所示：

Probe1：

F-DNA1：

M1-DNA1：

D11：

Probe2：

F-DNA2：

M1-DNA2：

GD1：

GG2：

GG3：

粗体表示互补配对序列，下划线表示错配碱基

方案一

实施例1：

用于检测SNP的基于DNA水凝胶和显色染料的比色检测设计

本实施例中，首先利用DNA杂合水凝胶技术以及热变性原理实现对完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的检测，利用洗脱步骤实现不同靶标之间的数目差异，然后再利用碱基互补配对原则，将DNAzyme结合在靶标DNA上，因为之前一步中已经实现了完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的数目差异，因此DNAzyme数目也产生差异，随后利用DNAzyme的过氧化物酶活性分别结合不同的底物ABTS以及TMB进行显色信号放大效应，根据催化显色反应可以实现SNPs比色检测。(如图1)

实施例2：

使用ABTS为染料的SNP肉眼检测限的测定：

取在内径1.5mm的塑料管中制备的DNA水凝胶(制备方法参见中国专利申请2013107110031)，将胶块切成10块等质量的2mg的小圆柱状。首先均依次加入靶标溶液，配成F-DNA与M1-DNA靶标终浓度依次为10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM的非均相检测体系，放置在干式恒温器中于50℃下加热30min后，然后均在50℃下用HPESE①缓冲液洗脱(20μL×3)，随后向每管洗脱好的胶块中加入5μL由D11序列制备的DNAzyme11溶液和15μL的HEPES②缓冲液，在18℃下反应1h，随后在18℃下用HEPES②缓冲液洗脱(20μL×3)，最后再向洗脱好的胶块中加入12.5μL的20mM的ABTS溶液，25μL的HEPES②缓冲液以及12.5μL的6mM的H₂O₂，混匀，在室温下观察胶块颜色变化(如图2)。随后在紫外分光光度计中测λ＝414nm处的F-DNA与M1-DNA胶块外部缓冲液吸光度值差异，进行定量对比(如图3)。

从图2可以看出，从10μM到0.5μM时的靶标浓度均能明显分辨出完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的差异，并且颜色变化均富集在胶块上，实现了信号的有效富集。从图3对于胶块外部缓冲液的紫外吸收值的测定，也能反映出相应的完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的差异，然而胶块实际的富集信号差异会比缓冲液中的要更加明显。

实施例3：

使用TMB为染料的SNP肉眼检测限的测定：

取在内径1.5mm的塑料管中制备的胶10-6％DNA水凝胶，将胶块切成10块等质量的2mg的小圆柱状。首先均依次加入靶标溶液，配成F-DNA与M1-DNA靶标终浓度依次为10μM、5μM、1μM、0.5μM和0.1μM的非均相检测体系，在50℃下反应然后洗脱，随后加入DNAzyme11溶液，在18℃下反应后洗脱，最后再向洗脱好的胶块中加入2.5μL的10mM的TMB溶液，39.2μL的C-P缓冲液以及8.3μL的6mM的H₂O₂，混匀，在室温下观察胶块颜色变化(如图4)。随后在紫外分光光度计中测F-DNA与M1-DNA组胶块外部缓冲液中TMB氧化产物在λ＝652nm处4h后吸光度值差异，进行定量对比(如图5)。

从图4可以看出，对于SNP的检测灵敏度也能达到0.5μM，肉眼可视化结果中完全互补配对与单碱基错配的差异很明显，并且溶液颜色很清楚直观的反映了SNPs的差异，通过DNAzyme的不断催化效应，能对实验起到放大效果，同时染料氧化后的产物具有很好的稳定性。从图5对于胶块外部缓冲液的紫外吸收值的测定，也能反映出相应的完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的差异，然而胶块实际的富集信号差异会比缓冲液中的要更加明显。

方案二：

实施例4：

用于检测SNP的基于DNA水凝胶和显色染料以及DNAzyme串联信号放大效应的比色检测设计本实施例中，将SNPs位点设计在由GD1序列制备的DNAzymeGD1的一端臂上，首先通过碱基互补配对原理固定靶标在DNA水凝胶上，然后再将具有SNPs位点的拟酶臂与靶标DNA结合，如此我们就可以再利用热变性杂交原理将同完全互补配对的靶标与单碱基错配的靶标结合上的DNAzyme数目区分开，利用洗脱步骤实现不同靶标结合DNAzyme之间的数目差异，然后再利用碱基互补配对原则，将由GG2序列制备的DNAzymeGG2及由GG3序列制备的DNAzymeGG3依次结合在DNAzymeGD1的另一端臂上，形成多价串联酶，因为之前一步中已经实现了完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的数目差异，因此DNAzyme数目也产生差异，随后利用DNAzyme的过氧化物酶活性分别结合不同的底物ABTS以及TMB进行显色信号放大效应，根据催化显色反应可以实现SNPs比色检测。(如图6)

实施例5：

使用ABTS为染料的SNP肉眼检测限的测定：

取在内径1.5mm的塑料管中制备的Gel-10-6％DNA水凝胶，将胶块切成16块等质量的2mg的小圆柱状，记为A组。首先均依次加入靶标溶液，配成F-DNA与M1-DNA靶标终浓度依次为10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0.01μM、0.005μM和0.001μM的非均相体系，将每组不同浓度靶标的检测体系放在单碱基错配的T_m值温度上进行加热30min，然后均在各自温度下用HPESE①缓冲液洗脱(20μL×3)，随后向每管洗脱好的胶块中加入5μL制备的DNAzymeGD1溶液和15μL的HEPES②缓冲液，在各自温度下反应1h，随后在各自温度下用HEPES②缓冲液洗脱(20μL×3)，然后向洗脱好的胶块中加入5μL制备的DNAzymeGG2溶液和15μL的HEPES②缓冲液，在18℃下反应1h，随后在18℃下用HEPES②缓冲液洗脱(20μL×3)，之后向洗脱好的胶块中加入5μL制备的DNAzymeGG3溶液和15μL的HEPES②缓冲液，在18℃下反应1h，随后在18℃下用HEPES②缓冲液洗脱(20μL×3)，最后向A组洗脱好的胶块中加入12.5μL的20mM的ABTS溶液，25μL的HEPES②缓冲液以及12.5μL的6mM的H₂O₂，混匀，在室温下观察胶块颜色变化(如图7)。随后在紫外分光光度计中测反应3min后λ＝414nm处的F-DNA与M1-DNA组胶块外围溶液的吸光度值差异变化，进行定量对比(如图8)。

从图7可以看出，从10μM到0.01μM均能肉眼明显分辨出完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的差异，并且颜色变化均富集在胶块上，并且由于SNP位点设计在DNAzyme的一端连接臂上，使完全互补配对靶标DNA与单碱基错配靶标DNA上接上的DNAzyme数目直接出现差异，使得检测信噪比增大，并且因为DNAzyme的串联效应，差异更加明显，实现了传感信号的再次放大。从图8对于胶块外部缓冲液的紫外吸收值的测定，也能反映出相应的完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的差异，然而胶块实际的富集信号差异会比缓冲液中的要更加明显。

实施例6：

使用TMB为染料的SNP肉眼检测限的测定：

取在内径1.5mm的塑料管中制备的Gel-10-6％DNA水凝胶，将胶块切成14块等质量的2mg的小圆柱状,记为为B组。B组首先均依次加入靶标溶液，配成F-DNA与M1-DNA靶标终浓度依次为10μM、5μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0.01μM和0.005μM，在单碱基错配双链T_m值温度下反应然后洗脱，随后加入DNAzymeGD1溶液，在对应温度下反应后洗脱，然后加入DNAzymeGG2溶液，在18℃下反应后洗脱，之后再加入DNAzymeGG3溶液，在18℃下反应后洗脱，最后向洗脱好的胶块中加入2.5μL的10mM的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液，39.2μL的C-P缓冲液以及8.3μL的6mM的H₂O₂，混匀，在室温下观察胶块颜色变化(如图9)。随后在紫外分光光度计中测F-DNA与M1-DNA组胶块外围溶液中的TMB氧化产物λ＝652nm处4h后吸光度值差异，进行定量对比(如图10)。

从图9可以看出，SNP检测灵敏度达到0.1μM，肉眼可视化结果中完全互补配对DNA与单碱基错配的DNA差异很明显，并且溶液颜色很清楚直观的反映了SNPs的差异。从图10对于胶块外部缓冲液的紫外吸收值的测定，也能反映出相应的完全互补配对靶标与单碱基错配靶标的差异，然而胶块实际的富集信号差异会比缓冲液中的要更加明显。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> 一种联合使用DNA水凝胶和DNAzyme检测SNP的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttttttttag gcacaaacac gca 23

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtgt ttgtgcct 48

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gtggtaatct actgggacgg aacagctttg aggtgcgtct ttgtgcct 48

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

caccattaga tgacctttgg gtagggcggg ttgggttccg ctgc 44

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ttttttttca ccattagatg accctg 26

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gtgtttgtgc gtggagtttc gacaaggcag ggtcatctaa tggtg 45

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gtgtttctgc gtggagtttc gacaaggcag ggtcatctaa tggtg 45

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ccgctgcttt gggtagggcg ggttgggtta cgcacaaaca c 41

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gcgcaccttt gggtagggcg ggttgggttg cagcgg 36

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tttgggtagg gcgggttggg ttggtgcgc 29

Claims (10)

1.一种联合使用DNA水凝胶和DNAzyme检测SNP的方法。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNA水凝胶是以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，丙烯酰胺与甲基丙烯酰胺修饰探针DNA的共聚物为骨架的高分子水凝胶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DNAzyme为具有过氧化酶活性的DNA。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备并使用水凝胶中固定的支链DNA作为探针来检测被检测DNA中的SNP位点，包括如下步骤：

(1)制备DNA水凝胶：以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，丙烯酰胺与甲基丙烯酰胺修饰探针DNA的共聚物为骨架的高分子水凝胶；

(2)靶标DNA的杂交：将(1)中制备的DNA水凝胶分别加入到含有完全互补DNA的缓冲液和含有单碱基变异的被检测靶标DNA缓冲液中，在5-70℃下孵育2-60min，进行分子杂交；其特征在于分子杂交后形成的双链DNA中含有SNP位点；

(3)肉眼可视化显色反应：在步骤(2)中已形成不同双链数目的水凝胶中均加入DNAzyme D11溶液，将反应体系置于恒温器中，在5-70℃下反应2-90min，随后用缓冲液共洗脱1-5次，之后在室温下分别加染料、H₂O₂溶液，室温下反应2–300min后观察并记录胶块颜色变化。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的DNAzyme D11的序列中含有DNAzyme序列和与被检测DNA互补的序列。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，制备内部含有支链DNA的水凝胶用于被检测DNA的固定，利用DNAzyme的连接臂来鉴别被检测靶标DNA中的SNP位点，包括如下步骤：

(1)制备DNA水凝胶：是以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，丙烯酰胺与甲基丙烯酰胺修饰DNA的共聚物为骨架的高分子水凝胶；

(2)靶标DNA的固定：将(1)中制备的DNA水凝胶分别加入到含有完全互补DNA的缓冲液和含有SNP的被检测靶标DNA缓冲液中，在5-70℃下孵育2-60min，进行分子杂交，分子杂交后形成的双链DNA中不含SNP位点；

(3)肉眼可视化显色反应：向步骤(2)中的水凝胶中均加DNAzyme GD1溶液，将反应体系置于恒温器中，在5-70℃下反应2-90min。随后洗脱1-5次。之后继续加入一端连接臂与DNAzyme GD1另一端连接臂互补的DNAzyme GG2溶液，重复洗脱之后再继续加入一端连接臂与DNAzyme GG2另一端连接臂互补的DNAzyme GG3溶液，重复洗脱步骤，最后在室温下分别加入染料、H₂O₂溶液，室温下反应2–300min后观察并记录胶块颜色变化。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNAzyme GD1序列由DNAzyme序列和两个连接臂组成，其中一个连接臂可以和权利要求6中所述被检测DNA中含SNP位点的单链部分杂交形成双链。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，DNAzyme GD1上可串联的DNAzyme包括DNAzyme GG2，DNAzyme GG3，其个数为1-100个。

9.如权利要求4或6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，甲基丙烯酰胺修饰探针DNA是通过DNA固相合成仪将甲基丙烯酰胺单体接入到下述探针DNA序列末端制备而得的。

10.如权利要求4或6所述的检测方法，其特征在于，所述的染料包括但不限于3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。