CN112522370B - 一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法，属于核酸检测技术领域，该核酸免提取试剂是由海藻糖、PEG8000、Tris‑HCl、EDTA、Triton X‑100及核酸释放剂组成的混合液体；本发明通过Triton X‑100和核酸释放剂的协同作用，能够高效裂解病原微生物，快速释放其中的DNA或RNA。一方面，通过EDTA能够鳌和金属离子，降低DNase和RNase的酶活，另一方面，通过海藻糖和PEG8000在RNA和DNA表面形成保护层，使其能够在溶液中稳定存在。最后通过Tris稳定该试剂的pH，以确保RNA或DNA均可稳定保存。通过上述组份的协同作用，本发明的核酸免提取试剂能够在室温条件下直接完成核酸的释放，避免了加热、离心、洗涤等繁琐操作，所得产物可以直接用于PCR扩增。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法。
背景技术
基于PCR技术进行病原微生物检测具有特异性好、灵敏度高、简单快速的特点。其中，病原微生物核酸提取质量的高低是下游所有核酸检测的关键，所得核酸质量将直接影响研究或诊断结果。但是，传统的核酸提取方法，包括柱提取法、磁珠法等，均需要进行十分繁琐的裂解、多次洗涤、洗脱等过程，不仅耗时长，而且容易交叉污染。同时，在核酸提取过程中很容易造成核酸的大量丢失，尤其在微量样品的核酸提取过程中核酸的丢失比例更高，甚至导致漏检的发生。当检测样品为RNA病毒时，较长的提取过程也容易造成RNA的降解。这些因素对核酸检测结果的准确性造成了极大影响。
中国专利200910309980.2公开了一种一步法病原体核酸荧光定量PCR检测方法，针对待测病原菌管家基因，设计特异性引物，采用核酸快速释放剂提取病原体核酸，然后直接用于PCR扩增，实现PCR荧光定量检测，该方法操作简单快速，抗污染干扰能力强，提取的核酸无损失。但是，该核酸释放剂中含有一定量的SDS、Surfactin等，对PCR扩增存在较为严重的抑制作用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种核酸免提取试剂，是由海藻糖、PEG8000、Tris-HCl、EDTA、Triton X-100及核酸释放剂组成的混合液体；
其中，海藻糖的浓度为0.1～1M，Tris-HCl的浓度为1～10mM，EDTA的浓度为0.1～5mM；PEG8000占混合液体总质量的0.1％～2％，Triton X-100占混合液体总质量的0.1％～1％，核酸释放剂占混合液体总质量的0.001％～0.1％。
优选地，该核酸免提取试剂的pH值为6.5～7.5。
优选地，该核酸免提取试剂在-80℃～100℃能够稳定存在。
优选地，所述核酸释放剂采用十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵。
本发明还公开了上述的核酸免提取试剂的使用方法，将所述核酸免提取试剂与样品混匀，室温放置1-10min，然后取1-10μl作为模板进行核酸检测。
优选地，核酸检测选择PCR法、荧光定量PCR法、环介导等温扩增法或重组酶聚合酶扩增法。
本发明还公开了上述的核酸免提取试剂作为核酸检测试剂的应用。
优选地，所述核酸检测试剂用于检测口腔拭子、唾液、血清、脑脊液、生殖道分泌物或尿液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开的核酸免提取试剂，通过Triton X-100和核酸释放剂的协同作用，能够高效裂解病原微生物，快速释放其中的DNA或RNA。一方面，通过EDTA能够鳌和金属离子，降低DNase和RNase的酶活，另一方面，通过海藻糖和PEG8000在RNA和DNA表面形成保护层，使其能够在溶液中稳定存在。最后通过Tris稳定该试剂的pH，以确保RNA或DNA均可稳定保存。通过上述组份的协同作用，本发明的核酸免提取试剂能够在室温条件下直接完成核酸的释放，避免了加热、离心、洗涤等繁琐操作，所得产物可以直接用于PCR扩增。
进一步地，本发明核酸免提取试剂的热稳定性高，可以在-80℃低温和100℃高温条件下稳定存在。
进一步地，本发明的核酸酸释放剂可以是十二烷基二甲基苄基氯化铵(又名苯扎氯铵，DDBAC)或十二烷基二甲基苄基溴化铵(又名苯扎溴铵)。通过Triton X-100和十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵协同作用下，能够高效裂解病原微生物，快速释放其中的DNA或RNA。
本发明公开的上述核酸免提取试剂的检测方法，只需将上述核酸免提取试剂与样品混匀，室温放置1-10min，然后取1-10μl作为模板进行核酸检测即可，该方法不同于传统的核酸提取试剂盒需要对样品进行裂解、洗涤、洗脱等繁琐的操作，大大简化了检验流程，降低了可能存在的交叉污染和院内感染的风险。传统的病原微生物核酸提取需要进行繁琐的纯化步骤，而本发明的核酸免提取试剂可以在常温10min内完成模板制备。同时，该方法的使用使得病原微生物的核酸检测更加方便、快速、精准。
本发明核酸免提取试剂的适用性广，可以适应口腔拭子、唾液、血清、脑脊液、生殖道分泌物、尿液等多种样品。
附图说明
图1为不同方法处理高浓度样品后的扩增结果；
图2为不同方法处理低浓度Escherichia coli 16S rRNA后的扩增结果；
图3为不同方法处理低浓度Escherichia coli 16S rRNA(耐高温)后的扩增结果；
图4为不同方法处理唾液中高浓度样品后的扩增结果；
图5为不同方法处理血清中高浓度样品后的扩增结果；
图6为不同方法处理脑脊液中高浓度样品后的扩增结果；
图7为不同方法处理尿液中高浓度样品后的扩增结果；
图8为不同方法处理金黄色葡萄球菌后的扩增结果；
图9为不同方法处理隐球菌后的扩增结果；
图10为不同方法处理慢病毒后的扩增结果；
图11不同方法处理慢病毒后的LAMP扩增结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明的核酸免提取试剂，包含0.1-1M海藻糖，0.1-2％PEG8000，1-10mM Tris-HCl(pH 6.5-7.5)，0.1-5mM EDTA，0.1-1％Triton X-100，0.001-0.1％核酸释放剂。其中的核酸释放剂可以是十二烷基二甲基苄基氯化铵(又名苯扎氯铵)或十二烷基二甲基苄基溴化铵(又名苯扎溴铵)。
所述核酸释放剂能够与Triton X-100共同作用，在极低的浓度下有效裂解病原微生物并释放核酸，该核酸释放剂的工作浓度极低，对PCR、RT-PCR、LAMP、RPA等核酸扩增技术均无干扰作用。其中的Tris-HCl(pH6.5-7.5)可以起到稳定pH的作用，而EDTA则可以鳌和金属离子，降低DNase和RNase的活性。另外，海藻糖和PEG8000在DNA和RNA表面形成保护层，也可以稳定DNA和RNA，使其在溶液中稳定存在。
上述核酸释放过程无需加热、离心等操作，避免了核酸在提取纯化过程中的损失，提高了核酸检测结果的阳性率。
实施例1
所述核酸免提取试剂包括：0.1M海藻糖，2％PEG8000，5mM Tris-HCl(pH 6.5-7.5)，5mM EDTA，0.5％Triton X-100，0.001％十二烷基二甲基苄基氯化铵。
检测样品的制备：用口腔拭子从口腔内侧颊粘膜处反复擦拭20次以上，分别置于1ml本发明的核酸免提取试剂中和1ml生理盐水中，作为干扰物质，然后分别加入0.1ml浓度为107copy/ml的Escherichia coli菌液。室温静置5min，取5μl作为检测模板。
反应体系为：12.5μl 2×PCR Mix，1μl 10μM引物F，1μl 10μM引物R，1μl 25×SYBRGreen I，4.5μl ddH2O，5μl裂解产物作为模板。反应条件为：95℃1min；95℃15s，55℃反应30s，35个循环；25℃10s。
其中的引物F：CGGATGTGCCCAGATGGGAT(如SEQ.ID.NO.1所示)；
引物R：GGGTAACGTCAATGAGCAAAGGTATTA(如SEQ.ID.NO.2所示)。
检测结果如附图1所示，图中，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.生理盐水处理后样品扩增结果，C.阴性对照。Escherichia coli置于本发明核酸免提取试剂中比置于生理盐水中的扩增时间明显缩短。生理盐水中的Escherichia coli也能够扩增是因为95℃高温可以使部分菌种变性，但扩增时间明显较晚。
实施例2 Escherichia coli 16S rRNA的检测(低浓度)
所述核酸免提取试剂包括：1M海藻糖，1％PEG8000，10mM Tris-HCl(pH 6.5-7.5)，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1％十二烷基二甲基苄基溴化铵。
检测样品的制备：用口腔拭子从口腔内侧颊粘膜处反复擦拭20次以上，分别置于1ml本发明的核酸免提取试剂中和1ml生理盐水中，作为干扰物质，然后分别加入0.1ml浓度为105copy/ml的Escherichia coli菌液。室温静置5min，取1μl作为检测模板。
反应体系为：12.5μl 2×PCR Mix，1μl 10μM引物F，1μl 10μM引物R，1μl 25×SYBRGreen I，8.5μl ddH2O，1μl裂解产物作为模板。反应条件为：95℃1min；95℃15s，55℃反应30s，40个循环；25℃10s。
其中的引物F：CGGATGTGCCCAGATGGGAT(如SEQ.ID.NO.1所示)；
引物R：GGGTAACGTCAATGAGCAAAGGTATTA(如SEQ.ID.NO.2所示)。
检测结果如附图2所示，图2中A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.生理盐水处理后样品扩增结果。Escherichia coli置于本发明核酸免提取试剂中的检测结果为阳性，而置于生理盐水中的Escherichia coli检测结果为阴性，其原因在于本发明试剂中Escherichia coli能够快速裂解释放核酸，而在生理盐水中的Escherichiacoli则无法释放核酸，同时由于样品浓度较低，加热过程并不能释放足够多的核酸。
实施例3 Escherichia coli 16S rRNA的检测(耐高温)
为验证本发明核酸免提取试剂的耐高温及反复冻融特性，将该试剂置于沸水浴中加热20min，然后置于-20℃30min，如此反复10次，然后验证其裂解效果。
所述核酸免提取试剂包括：0.5M海藻糖，1％PEG8000，5mM Tris-HCl(pH 6.5-7.5)，5mM EDTA，1％Triton X-100，0.05％十二烷基二甲基苄基氯化铵。
检测样品的制备：用口腔拭子从口腔内侧颊粘膜处反复擦拭20次以上，分别置于1ml经过10次反复冻融的本发明的核酸免提取试剂中、未经加热反复冻融处理的核酸免提取试剂中和1ml生理盐水中，作为干扰物质，然后分别加入0.1ml浓度为105copy/ml的Escherichia coli菌液。室温静置5min，取5μl作为检测模板。
反应体系为：12.5μl 2×PCR Mix，1μl 10μM引物F，1μl 10μM引物R，1μl 25×SYBRGreen I，8.5μl ddH2O，1μl裂解产物作为模板。反应条件为：95℃1min；95℃15s，55℃反应30s，40个循环；25℃10s。
其中的引物F：CGGATGTGCCCAGATGGGAT(如SEQ.ID.NO.1所示)；
引物R：GGGTAACGTCAATGAGCAAAGGTATTA(如SEQ.ID.NO.2所示)。
检测结果如附图3所示，图中A.经过反复加热冷冻处理后的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.未经反复加热冷冻处理后的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，C.生理盐水处理后样品扩增结果。Escherichia coli置于本发明核酸免提取试剂中的检测结果为阳性，而置于生理盐水中的Escherichia coli检测结果为阴性。
本实施例除核酸免提取试剂的组成与实施例2不同外，本发明的核酸免提取试剂经过了10次的反复冻融，说明该试剂具有较高的热稳定性。
本实施例除核酸免提取试剂的组成与实施例1不同外，样品中Escherichia coli浓度仅为实施例1的1％，说明使用本发明的核酸免提取试剂能够显著提高低浓度样品检测结果阳性率。
实施例4不同干扰样品
本实施例与实施例1的区别在于样品制备过程中干扰物质的种类为唾液，且不再验证生理盐水处理样品的效果。结果如图4所示，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。使用本发明的核酸免提取试剂处理Escherichia coli后的检测结果为阳性，阴性对照未扩增。
实施例5
实施例与实施例1的区别在于样品制备过程中干扰物质的种类为大鼠血清，且不再验证生理盐水处理样品的效果。结果如图5所示，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。使用本发明的核酸免提取试剂处理Escherichia coli后的检测结果为阳性，阴性对照未扩增。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于样品制备过程中干扰物质的种类为兔子脑脊液，且不再验证生理盐水处理样品的效果。结果如图6所示，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。使用本发明的核酸免提取试剂处理Escherichia coli后的检测结果为阳性，阴性对照未扩增。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于样品制备过程中干扰物质的种类为尿液，且不再验证生理盐水处理样品的效果。结果如图7所示，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。使用本发明的核酸免提取试剂处理Escherichia coli后的检测结果为阳性，阴性对照未扩增。
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于待检测病原微生物为金黄色葡萄球菌，且不再验证生理盐水处理样品的效果。
所用引物为F：GCGCAAGCTATGATCAATTTGGAC(如SEQ.ID.NO.3所示)；
R：CCAGGCTTTGCACCATCACC(如SEQ.ID.NO.4所示)。
检测结果如图8所示，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。经过本发明核酸免提取试剂处理的金黄色葡萄球菌的检测结果为阳性，阴性对照未扩增。说明本发明的核酸免提取试剂对革兰氏阳性菌也有较强的裂解能力。
实施例9
本实施例与实施例1的区别在于待检测病原微生物为隐球菌，且不再验证生理盐水处理样品的效果。所用引物为F：GGGGTGTGTGCTGTGCGA(如SEQ.ID.NO.5所示)，R：GGCGTCTTACCCCAAGTCCC(如SEQ.ID.NO.6所示)。检测结果如图9所示，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。经过本发明核酸免提取试剂处理的隐球菌的检测结果为阳性，阴性对照的检测结果为阴性。说明本发明的核酸免提取试剂对真菌也有较强的裂解能力。
实施例10
本实施例与实施例1的区别在于待检测病原微生物为含有SARS-CoV2 E基因的慢病毒，且不再验证生理盐水处理样品的效果。
所用引物为：
F：GGGGTGTGTGCTGTGCGA(如SEQ.ID.NO.7所示)；
R：GGCGTCTTACCCCAAGTCCC(如SEQ.ID.NO.8所示)。
检测结果如图10所示，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。经过本发明核酸免提取试剂处理的慢病毒的检测结果为阳性，阴性对照的检测结果为阴性。说明本发明的核酸免提取试剂对慢病毒也有较强的裂解能力。而慢病毒与冠状病毒结构相似，间接说明本发明试剂对冠状病毒也具有较强的裂解能力。
实施例11
本实施例与实施例10的区别在于使用环介导等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)进行病原微生物检测，具体反应体系为：20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mM KCl，8mM MgSO4，0.1％Tween-20，0.8M甜菜碱，1.4mM dNTP，1×SYBR Green I，0.8μM FIP和BIP，0.4μM LF和LB，0.2μM F3和B3，0.32U/μlBst DNAPolymerase，0.2U/μl AMV。
所述引物序列为：
F3：GTACTCATTCGTTTCGGAAGA(如SEQ.ID.NO.9所示)；
B3：CTCTAGAAGAATTCAGATTTTTAA(如SEQ.ID.NO.10所示)；
FIP：TGGCTAGTGTAACTAGCAAGAATCAGGTACGTTAATAGTTAATAGC(如SEQ.ID.NO.11所示)；
BIP：TGCGCTTCGATTGTGTGCGTAGAGTAAACGTAAAAAGAAGGTTT(如SEQ.ID.NO.12所示)；
LF：CACGAAAGCAAGAAAAAGAAGT(如SEQ.ID.NO.13所示)；
LB：GCTGCAATATTGTTAACGTGAGT(如SEQ.ID.NO.14所示)。
结果参见图11，A.使用本发明的核酸免提取试剂处理后的扩增结果，B.阴性对照。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西师范大学
<120> 一种核酸免提取试剂及其在核酸检测中的应用和使用方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggatgtgcc cagatgggat 20
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggtaacgtc aatgagcaaa ggtatta 27
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgcaagcta tgatcaattt ggac 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaggctttg caccatcacc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggtgtgtg ctgtgcga 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcgtcttac cccaagtccc 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggggtgtgtg ctgtgcga 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcgtcttac cccaagtccc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtactcattc gtttcggaag a 21
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctctagaaga attcagattt ttaa 24
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggctagtgt aactagcaag aatcaggtac gttaatagtt aatagc 46
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcgcttcga ttgtgtgcgt agagtaaacg taaaaagaag gttt 44
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacgaaagca agaaaaagaa gt 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctgcaatat tgttaacgtg agt 23
Claims (6)
1.一种核酸免提取试剂，其特征在于，是由海藻糖、PEG8000、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100及核酸释放剂组成的混合液体；该核酸免提取试剂的pH值为6.5～7.5；
其中，海藻糖的浓度为0.1～1M，Tris-HCl的浓度为1～10mM，EDTA的浓度为0.1～5mM；PEG8000占混合液体总质量的0.1％～2％，Triton X-100占混合液体总质量的0.1％～1％，核酸释放剂占混合液体总质量的0.001％～0.1％；
所述核酸释放剂采用十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵。
2.根据权利要求1所述的核酸免提取试剂，其特征在于，该核酸免提取试剂在-80℃～100℃能够稳定存在。
3.权利要求1～2中任意一项所述的核酸免提取试剂的使用方法，其特征在于，将所述核酸免提取试剂与样品混匀，室温放置1-10min，然后取1-10μl作为模板进行核酸检测。
4.根据权利要求3所述的核酸免提取试剂的使用方法，其特征在于，核酸检测选择PCR法、荧光定量PCR法、环介导等温扩增法或重组酶聚合酶扩增法。
5.权利要求1～2中任意一项所述的核酸免提取试剂作为核酸检测试剂的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸检测试剂用于检测口腔拭子、唾液、血清、脑脊液、生殖道分泌物或尿液。
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