KR20220083700A - 표적 핵산의 검출 방법, 핵산 결합 분자의 검출 방법 및 핵산 결합능의 평가 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 표적 핵산을 상기 표적 핵산의 일부와 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 비표적 핵산으로부터 식별하여 검출하는 방법으로서, 상기 비표적 핵산중에서 상기 표적 핵산과 다른 영역을 대응 표적 영역, 상기 표적 핵산중에서 상기 비표적 핵산과 다른 영역을 표적 영역으로 하고, 피험 핵산 시료를 주형으로 하고, 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역과 특이적으로 결합하는 분자의 존재하에서, 상기 표적 핵산 및 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여 상기 분자가 상기 비표적 핵산과 결합 가능한 온도 조건하에서 핵산 증폭 반응을 행하여, 증폭산물의 유무에 기초하여 표적 핵산을 검출하는 표적 핵산의 검출 방법이다.

Description

표적 핵산의 검출 방법, 핵산 결합 분자의 검출 방법 및 핵산 결합능의 평가 방법
본 발명은 유전자 변이나 유전자 다형, 핵산의 수식(modification)과 같은 염기 서열이나 구조가 유사한 복수의 핵산을 식별하여 목적하는 핵산을 검출하는 방법, 핵산 결합 분자를 검출하거나 그 핵산 결합능을 평가하는 방법 및 이러한 방법에 이용되는 키트에 관한 것이다.
본원은 2019년 10월 18일에 일본에 출원된 특허 출원 제2019-191409호에 근거해 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.
유전자의 염기 서열이 변화하는 유전자 변이의 대부분은 불과 1개 내지 여러 개의 염기가 삽입, 결실, 다른 염기로의 전환 등이 이루어지고 있다. 이 때문에, 유전자 변이의 검출은 1개 내지 여러 개의 염기의 변이 부위 이외에는 동일한 염기 서열로 이루어지는 야생형 핵산과 변이형 핵산을 식별하여 검출할 필요가 있다.
DNA나 RNA의 1개 내지 여러 개의 염기 변이를 검출하는 방법에는 여러가지 기술이 존재하고 있다. PCR(polymerase chain reaction)을 이용한 변이 검출 방법으로서는, 예를 들면, 형광 물질과 퀀처에 의한 수식 올리고뉴클레오티드(modified oligonucleotide) 프로브를 이용한 PCR법을 들 수 있다. 상기 방법에서는, 변이가 들어가 있는 것으로 예상되는 DNA 영역을 포함하는 DNA 단편을 PCR 증폭하는 반응을, 변이가 들어가 있는 것으로 예상되는 변이형 DNA 영역에 하이브리다이즈하여 형광 물질과 퀀처로 수식된 올리고뉴클레오티드 프로브의 존재하에서 행한다. 변이형 DNA에 대해서는 상기 프로브가 어닐링되고, PCR에 사용되는 DNA 폴리머레이즈의 엑소뉴클레이스 활성에 의해 프로브가 절단되어 형광 물질과 퀀처가 괴리되는 결과, 반응계에 형광이 생긴다. 야생형 DNA의 경우에는, 상기 프로브가 어닐링되지 않기 때문에 형광은 생기지 않는다. 다만, 야생형과 변이형 DNA가 혼재하는 샘플에서는 정량적인 평가를 하는 경우에는 번잡한 조작이 필요하기 때문에, 헤테로 변이의 검출에는 사용하기 어렵다.
또한, 서베이어 뉴클레이스를 이용한 서베이어 어세이도 있다(비특허문헌 1 참조). 상기 어세이는 PCR 증폭된 대조 DNA와 테스트 DNA를 시험관 내에서 혼합하고, 열변성·재 2중 가닥화를 행하여, 서베이어 뉴클레이스를 이용하여 미스매치 염기의 3＇측을 절단함으로써, 테스트 DNA가 대조 DNA와 다른 염기를 포함하고 있는 것을 검출한다. 상기 방법은 비교적 간편하며, 주로 게놈 편집을 행한 세포 집단으로부터 DNA를 추출하여 실시하고, 게놈 편집의 효율을 검정하기 위해서 사용되고 있다. 통상적으로는 게놈 편집 효율이 100%가 되지 않고, 게놈 편집이 행해지는 방법도 여러가지이기 때문에, 대조 DNA를 넣을 필요는 없다. 그러나, 개개의 게놈 편집 세포의 검출에서는, 호모의 변이를 검출하기 위해서는 야생형 세포 유래의 DNA를 혼합할 필요가 있다. 또한, 개개의 세포 유래의 해석을 행하는 경우에는, 생어 염기서열 분석법 등에 의해 염기 서열을 결정하는 방법이 보다 직접적이기 때문에, 통상 서베이어 어세이는 사용되지 않는다.
그 외, PCR 반응에서 증폭되는 DNA 영역에 상보적인 17~29 염기 정도의 단쇄 RNA(올리고리보뉴클레오티드, ORN)를 반응계에 첨가하는 ORNi-PCR법이 있다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조). 상기 방법에서는 ORN이 하이브리다이즈하는 DNA 영역의 PCR 증폭은 특이적으로 저해된다. 즉, ORN이 하이브리다이즈하지 않는 DNA만이 PCR 증폭된다.
일본 특허공개 제2011-103900호 공보
Zhu, et al, Scientific Reports, 2014, 4:6420, DOI: 10.1038/srep06420 Fujita, et al, DNA Research, 2018, vol. 25, p.395~407. Notomi, et al, Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28(12), e63. Dean, et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, vol. 99(8), p.5261~5266. Fujita, et al. Scientific Reports, 2016, 6:30485. Fujita, et al. PLoS One, 2015, 10(6), e0116579. Abudayyeh, et al. Science, 2016, 353(6299), aaf5573. Gootenberg, et al. Science, 2017, 356(6336), p.438~442. Rascle and Lees, Nucleic Acids Research, 2003, vol. 31(23), p.6882~6890. Abudayyeh, et al. Nature, 2017, vol. 550(7675), p.280~284.
본 발명은 주형이 되는 핵산에 결합하는 분자에 의해 핵산 증폭 반응이 저해되는 것을 이용함으로써, 핵산의 차이나 수식을 검출하거나, DNA 결합능을 가지는 분자를 검출하거나, DNA 결합능을 평가하는 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
본 발명자는, 예의 연구 결과, RPA(Recombinase Polymerase Amplification)법과 같은 등온 조건하에서 표적의 염기 서열을 가지는 핵산 단편을 증폭 가능한 방법에서, 반응계에 특정 염기 배열 또는 수식 상태인 핵산과 특이적으로 결합하는 분자를 존재시킴으로써, 해당 분자와 결합하지 않는 핵산 단편만을 특이적으로 검출할 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법, 핵산 결합 분자의 검출 방법 및 핵산 결합능의 평가 방법, 및 이들 방법에 사용되는 키트는, 하기와 같다.
[1] 표적 핵산을 상기 표적 핵산의 일부와 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 비표적 핵산으로부터 식별하여 검출하는 방법으로서,
상기 비표적 핵산에서 상기 표적 핵산과 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 영역을 표적 영역으로 하고,
상기 표적 핵산에서 상기 비표적 핵산과 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 영역을 대응 표적 영역으로 하고,
피험 핵산 시료를 주형으로 하고,
상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역과 특이적으로 결합하는 분자(단, 핵산으로만 이루어지는 분자를 제외함.)의 존재하에서,
상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여,
상기 분자가 상기 비표적 핵산과 결합 가능한 온도 조건하에서 핵산 증폭 반응을 행하고, 증폭산물의 유무에 기초하여 상기 표적 핵산을 검출하는, 표적 핵산의 검출 방법.
[2] 상기 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어진 경우, 상기 피험 핵산 시료에 상기 표적 핵산이 포함되어 있는, 상기 [1]의 표적 핵산의 검출 방법.
[3] 상기 핵산 증폭 반응을 65℃ 이하의 온도 조건하에서 행하는, 상기 [1] 또는 [2]의 표적 핵산의 검출 방법.
[4] 상기 핵산 증폭 반응이 등온 핵산 증폭 반응인, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법.
[5] 상기 핵산 증폭 반응이 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)법인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법.
[6] 상기 표적 핵산 중의 상기 대응 표적 영역과 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역은 염기 서열이 다른, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법.
[7] 상기 표적 영역이 유전자 변이의 변이 부위 또는 유전자 다형의 다형 부위인, 상기 [6]의 표적 핵산의 검출 방법.
[8] 상기 분자가 DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9 단백질과 gRNA의 복합체인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법.
[9] 상기 gRNA가 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA를 특이적으로 인식하여 결합하는, 상기 [8]의 표적 핵산의 검출 방법.
[10] 상기 피험 핵산 시료가 바이설파이트 처리된 것이며,
상기 대응 표적 영역과 상기 표적 영역의 메틸화 상태에 차이가 있고, 바이설파이트 처리에 의해 상기 대응 표적 영역과 상기 표적 영역 사이에서 차이가 생기는 염기를 포함하는, 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법.
[11] 상기 분자가 RNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas13a 단백질과 gRNA의 복합체인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법.
[12] 상기 gRNA가 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 RNA를 특이적으로 인식하여 결합하는, 상기 [11]의 표적 핵산의 검출 방법.
[13] 상기 표적 핵산 중의 상기 대응 표적 영역과 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역은 수식 상태가 다른, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법.
[14] 상기 표적 핵산 중의 상기 대응 표적 영역이 CpG 메틸화 수식되어 있지 않은 영역이고,
상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역이 CpG 메틸화 수식되어 있는 영역이며,
상기 분자가 CpG 메틸화 DNA 결합 단백질인, 상기 [13]의 표적 핵산의 검출 방법.
[15] 상기 [8] 내지 [10] 중 어느 하나의 표적 핵산의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머;
DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9 단백질; 및
gRNA를 가지는, 표적 핵산 검출용 키트.
[16] 상기 [14]의 표적 핵산의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머; 및
CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 가지는, 표적 핵산 검출용 키트.
[17] 리콤비네이즈, 단일 가닥 DNA 결합 단백질 및 DNA 폴리머레이즈를 더 포함하는, 상기 [15] 또는 [16]의 표적 핵산 검출용 키트.
[18] 상기 [11] 또는 [12]의 표적 핵산의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머;
RNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas13a 단백질; 및
gRNA를 가지는, 표적 핵산 검출용 키트.
[19] 핵산 결합 분자를 검출하는 방법으로서,
피험 시료, 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈 하는 프라이머를 이용하여 핵산 증폭 반응을 행하고,
상기 피험 시료 중에 상기 핵산 결합 분자가 포함되어 있는 경우에는, 상기 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어지지 않으며, 상기 피험 시료 중에 상기 핵산 결합 분자가 포함되어 있지 않은 경우에는, 상기 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어지는, 핵산 결합 분자의 검출 방법.
[20] 상기 핵산 결합 분자가 염기 서열 특이적으로 핵산에 결합하는 분자인, 상기 [19]의 핵산 결합 분자의 검출 방법.
[21] 상기 핵산 결합 분자가 CpG 메틸화 DNA 결합 단백질인, 상기 [19]의 핵산 결합 분자의 검출 방법.
[22] 상기 [19] 내지 [21] 중 어느 하나의 핵산 결합 분자의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
핵산; 및
상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 가지는, 핵산 결합 분자 검출용 키트.
[23] 피험 물질의 핵산에 대한 결합능을 평가하는 방법으로서,
피험 물질, 상기 피험 물질의 핵산 결합능을 평가하는 대상의 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈 하는 프라이머를 이용하여,
상기 피험 물질이 상기 핵산과 결합 가능한 온도 조건하에서 핵산 증폭 반응을 행하고,
증폭산물이 얻어진 경우에는 상기 피험 물질은 상기 핵산에 대한 결합능을 가지지 않으며, 증폭산물이 얻어지지 않은 경우에는 상기 피험 물질은 상기 핵산에 대한 결합능을 가지고 있다고 평가하는, 핵산 결합능의 평가 방법.
[24] 상기 피험 물질이 DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9 단백질과 gRNA의 복합체인, 상기 [23]의 핵산 결합능의 평가 방법.
[25] 상기 핵산이 CpG 메틸화 DNA인, 상기 [23]의 핵산 결합능의 평가 방법.
[26] 상기 [23] 내지 [25] 중 어느 하나의 핵산 결합능의 평가 방법에 이용되는 키트로서,
상기 피험 물질의 핵산 결합능을 평가하는 대상의 핵산; 및
상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 가지는, 핵산 결합능 평가용 키트.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에 의해 PCR에서 요구되는 온도 제어를 행하기 위한 서멀 사이클러를 필요로 하지 않고도, 표적 핵산을 핵산 증폭산물이라는 양성 시그널로서 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 표적 핵산 검출용 키트에 의해, 보다 간편하게 상기 표적 핵산의 검출 방법을 실시하여 표적 핵산을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법이나 핵산 결합능의 평가 방법에 의해, 핵산 결합능을 핵산 증폭산물의 감소량을 지표로 하여 검출하여 평가할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 핵산 결합 분자 검출용 키트 및 핵산 결합능의 평가용 키트에 의해, 보다 간편하게 상기 핵산 결합 분자의 검출 방법이나 핵산 결합능의 평가 방법을 실시할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법의 원리 중 표적 영역 특이적 결합 분자로서 DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9 단백질(dCas9)과 gRNA를 이용하여 유전자 변이를 검출하는 형태를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법의 원리 중 RNA를 표적 핵산으로 하여 RT-PCR에 의해 유전자 변이를 검출하는 경우의 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다. 표적 영역 특이적 결합 분자로서 RNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas13a 단백질(dCas13a)과 gRNA의 복합체를 이용하였다.
도 3은 실시예 1에서 사용한 293T세포의 KRAS 유전자의 부분 영역과 사용한 2종류의 gRNA의 염기 서열을 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 1에서 각종 gRNA와 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 5는 실시예 2에서 각종 gRNA와 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 6은 실시예 2에서 gRNA_KRAS#2를 첨가한 반응액 중에서 행해진 RPA 반응을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 2에서 gRNA_KRAS에 한 개의 염기 치환의 변이를 도입한 gRNA_KRAS_mut의 염기 서열을 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 2에서 gRNA_KRAS#2와 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 9는 실시예 3에서 사용한 HCT116 세포의 CDKN2A(p16) 유전자의 부분 영역과 사용한 gRNA_p16_Gx5#2의 염기 서열을 나타낸 도면이다.
도 10은 실시예 3에서 gRNA_KRAS 또는 gRNA_p16_Gx5#2와 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 11은 실시예 4에서 CDKN2A(p16) 유전자에 대해서 행한 게놈 편집을 모식적으로 나타낸 도면 및 gRNA_mid2를 첨가한 반응액 중에서 행해진 RPA 반응을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 12는 실시예 4에서 gRNA_mid2와 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 13은 실시예 5에서 gRNA_KRAS#2와 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 14는 실시예 5에서 gRNA_KRAS#2와 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 15는 실시예 6에서 MBD2 단백질과 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 16은 실시예 6에서 MBD2 단백질과 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 17은 실시예 6에서 MBD2 단백질과 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 18은 실시예 7에서 LexA 단백질 또는 dCas9와 함께 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 19는 실시예 8에서 사람 NEAT1 유전자의 mRNA(NEAT1-RNA)를 표적 핵산으로 하여 gRNA_NEAT1와 dCas13a와 함께 RT-PCR를 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 20은 실시예 8에서 사람 NEAT1 유전자의 mRNA(NEAT1-RNA)를 표적 핵산으로 하여 gRNA_NEAT1_2와 dCas13a와 함께 RT-PCR을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
도 21은 실시예 9에서 Cis 플라스미드 또는 CisM 플라스미드를 주형으로 하여, IL-3 처리 없음 또는 처리 완료의 핵 추출액의 존재하에서 RPA 반응을 행하고, 얻어진 반응액을 아가로스 전기 영동하여 분리한 밴드의 염색 이미지이다.
＜표적 핵산의 검출 방법＞
본 발명 및 본원 명세서에서 「표적 핵산」이란, 검출 대상의 핵산이다. 표적 핵산으로서는 프라이머와 폴리머레이즈를 이용한 핵산 증폭 반응에 제공하기 위한 프라이머의 설계가 가능한 정도로 염기 서열이 특정되어 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 단일 가닥 DNA, 2중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, RNA-DNA 하이브리드(단일 가닥 RNA와 단일 가닥 DNA가 2중 사슬을 형성하고 있는 핵산) 등을 표적 핵산으로 할 수 있다. 또한, 표적 핵산에는 특정 수식 상태를 가지는 핵산도 포함된다. 상기 수식 상태에는, 예를 들면, 메틸화, 불소화, 포스포로티오에이트화, 포스포로디티오에이트화, 당 부가, PEG(폴리에틸렌글리콜) 부가, 펩티드 부가 등을 들 수 있다.
본 발명 및 본원 명세서에서 「비표적 핵산」이란, 표적 핵산과 공통되는 구조를 가지지만, 부분적으로 염기 서열 또는 수식 상태가 표적 핵산과는 다른 핵산을 의미한다. 비표적 핵산으로서는, 표적 핵산과의 염기 서열이나 수식 상태와 같은 구조의 차이가 분명하고, 표적 핵산과 식별 가능한 핵산이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 표적 핵산을 CpG 메틸화 수식된 핵산으로 하고, 표적 핵산과 동일한 염기 서열로 이루어지지만 CpG 메틸화 수식이 이루어지지 않은 핵산을 비표적 핵산으로 할 수 있다.
본 발명 및 본원 명세서에서 「대응 표적 영역」이란, 표적 핵산 중의 비표적 핵산과의 구조가 다른 영역을 의미하며, 「표적 영역」이란, 비표적 핵산 중의 표적 핵산과의 구조가 다른 영역을 의미한다. 표적 핵산 중의 대응 표적 영역이 존재하는 위치는 비표적 핵산 중의 표적 영역이 존재하는 위치에 상당한다. 예를 들면, 표적 핵산과 비표적 핵산의 구조의 차이가 염기 서열의 차이인 경우에는, 표적 핵산 중의 비표적 핵산과는 염기 서열이 다른 부위(차이 부위)가 대응 표적 영역이며, 비표적 핵산 중의 표적 핵산과는 염기 서열이 다른 부위(차이 부위)는 표적 영역이다. 마찬가지로, 표적 핵산과 비표적 핵산의 구조의 차이가 수식 상태의 차이인 경우에는, 표적 핵산 중의 비표적 핵산과는 수식 상태가 다른 부위(차이 부위)가 대응 표적 영역이며, 비표적 핵산 중의 표적 핵산과는 수식 상태가 다른 부위(차이 부위)는 표적 영역이다. 표적 핵산에 포함되는 대응 표적 영역은 하나일 수 있으며, 둘 이상일 수도 있다.
본 발명 및 본원 명세서에서, 「표적 염기 서열」이란, 표적 핵산 중의 대응 표적 영역을 포함하는 영역의 염기 서열을 의미한다. 표적 염기 서열은 대응 표적 영역으로만 이루어지는 염기 서열일 수 있으며, 대응 표적 영역을 포함하는 표적 핵산의 부분 영역의 염기 서열일 수도 있고, 표적 핵산의 전체 길이의 염기 서열일 수도 있다.
한편, 본 발명 및 본원 명세서에서, 「염기 서열이 상동(相同)이다」란, 「염기 서열이 동일하다」를 의미하며, 「염기 서열이 상보이다」란, 「염기 서열이 서로 상보적이다」를 의미한다.
특정 염기 서열을 포함하는 핵산의 검출에서는, 해당 염기 서열을 포함하는 영역을 핵산 증폭 반응에 의해 증폭시키고, 증폭산물을 검출함으로써 검출 감도를 높일 수 있다. 이러한 핵산 증폭 반응을 이용한 검출 방법에서는, 검출 대상의 염기 서열로 이루어지는 핵산 단편 뿐만 아니라, 그 염기 서열과 유사한 염기 서열의 핵산 단편도 증폭되는 경우가 있다. 핵산 증폭 반응에서는, 검출 대상의 염기 서열과 유사한 염기 서열의 핵산 단편의 증폭을 억제함으로써, 검출 대상의 염기 서열로 이루어지는 핵산 단편의 검출 정밀도가 높아진다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법은, 피험 핵산 시료를 주형으로 하고, 프라이머와 폴리머레이즈를 이용한 핵산 증폭 반응을 행하여, 상기 피험 핵산 시료 중의 표적 핵산을 핵산 증폭산물로서 검출한다. 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서는, 이 핵산 증폭 반응을, 비표적 핵산 중의 표적 영역에 결합하며 표적 핵산 중의 대응 표적 영역에는 결합하지 않는 분자(단, 핵산으로만 이루어지는 분자를 제외함.)의 존재하에서 행한다. 이하, 「비표적 핵산 중의 표적 영역에 결합하며 표적 핵산 중의 대응 표적 영역에는 결합하지 않는 분자(단, 핵산으로만 이루어지는 분자를 제외함.)」를 「표적 영역 특이적 결합 분자」라고 할 수 있다. 표적 영역 특이적 결합 분자가 결합한 비표적 핵산을 주형으로 한 핵산 증폭 반응은, 표적 영역에 결합한 표적 영역 특이적 결합 분자에 의해 주형 핵산에 대한 프라이머의 어닐링이나 폴리머레이즈에 의한 핵산 신장 반응이 저해된다. 이에 따라, 비표적 핵산의 핵산 증폭이 저해되어 증폭산물 중에 차지하는 표적 핵산의 증폭산물의 비율이 증대되어, 표적 핵산의 검출 정밀도가 향상된다.
구체적으로는, 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법은 표적 핵산을 비표적 핵산으로부터 식별하여 검출하는 방법으로서, 피험 핵산 시료를 주형으로 하고, 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하에서, 표적 핵산 및 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여 핵산 증폭 반응을 행하고, 증폭산물의 유무에 기초하여 표적 핵산을 검출한다. 상기 핵산 증폭 반응에 의해 표적 핵산은 증폭되기 때문에, 피험 핵산 시료에 표적 핵산이 포함되어 있는 경우에는, 상기 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어진다. 즉, 피험 핵산 시료 중의 표적 핵산은 상기 핵산 증폭 반응의 증폭산물로서 검출할 수 있다.
본 발명에서, 표적 핵산과 비표적 핵산은 공통되는 구조 안에 서로 구조가 다른 영역을 가지는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법은 핵산 구조의 작은 차이도 검출 가능하므로, 표적 핵산과 비표적 핵산의 구조의 차이가 염기 서열의 차이인 경우에는, 표적 핵산 중의 대응 표적 영역은 20염기 이하의 영역인 것이 바람직하고, 10염기 이하의 영역인 것이 보다 바람직하고, 1~5염기의 영역인 것이 더 바람직하고, 1 또는 2염기의 영역인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명 및 본원 명세서에서, 「피험 핵산 시료」란, 핵산이 포함되어 있는 시료로서, 표적 핵산의 검출에 제공되는 것이다. 본 발명에서는 피험 핵산 시료 중의 핵산에 대해서 표적 핵산이 포함되어 있는지 아닌지를 검출한다. 피험 핵산 시료는 핵산을 포함하는 시료이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 동물, 식물, 미생물, 바이러스, 배양 세포 등으로부터 추출된 핵산을 피험 핵산 시료로 할 수 있다. 또한, 화학 합성한 핵산이나, 의도적으로 수식 처리를 행한 핵산도 피험 핵산 시료로 할 수 있다. 세포 등으로부터의 핵산의 추출은, 페놀/클로로포름법 등의 공지의 수법에 의해 행할 수 있다.
피험 핵산 시료 중에 포함되어 있는 핵산은, 제공되는 핵산 증폭 반응의 주형이 될 수 있는 핵산이면 특별히 한정되지 않는다. 범용되고 있는 DNA를 주형으로 한 핵산 증폭 반응을 이용할 수 있으므로, 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에 제공되는 피험 핵산 시료 중의 핵산은 DNA가 바람직하고, 2중 가닥 DNA가 보다 바람직하다. 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에 제공되는 피험 핵산 시료 중의 핵산은 RNA여도 된다. 피험 핵산 시료 중의 핵산이 RNA인 경우에는 그 RNA를 주형으로 한 역전사 반응을 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서의 핵산 증폭 반응으로 할 수 있으며, 또한 미리 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성한 후 핵산 증폭 반응에 제공할 수도 있다.
본 발명에서, 핵산 증폭 반응에 사용하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머는, 표적 핵산 및 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈한다. 이 때문에, 표적 영역 특이적 결합 분자 비존재하에서는 상기 프라이머를 이용한 핵산 증폭 반응에 의해, 피험 핵산 시료 중에 포함되어 있는 비표적 핵산도 증폭된다. 본 발명에서는 핵산 증폭 반응을 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하에서 행함으로써, 비표적 핵산의 핵산 증폭을 저해한다. 한편, 본 발명에서 핵산 증폭 반응에 사용하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머는, 핵산 증폭 반응을 행하는 조건하에서 표적 핵산 및 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 것일 수 있으며, 표적 핵산 중의 비표적 핵산과 염기 서열 및 수식 상태가 공통되는 부분 영역과 하이브리다이즈하는 프라이머일 수도 있고, 표적 핵산 중의 비표적 핵산과는 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 부분 영역과 하이브리다이즈하는 프라이머여도 무방하다.
본 발명에서, 핵산 증폭 반응에 사용하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머는 뉴클레오티드가 인산 디에스테르 결합한 올리고뉴클레오티드 또는 그 수식체이다. 이러한 프라이머는, DNA나 RNA와 같은 천연형 뉴클레오티드(천연에 존재하는 뉴클레오티드)로만 이루어지는 것일 수 있으며, 천연형 뉴클레오티드를 개변시켜 천연형 뉴클레오티드와 인산 디에스테르 결합 가능한 인공 뉴클레오티드로만 이루어지는 것일 수 있으며, 천연형 뉴클레오티드와 인공 뉴클레오티드 양쪽 모두를 포함하는 키메라 분자일 수도 있다. 인공 뉴클레오티드로서는 천연형 뉴클레오티드의 측쇄 등이 아미노기 등의 관능기에 의해 수식된 것, 리보스 골격의 2' 위치의 히드록실기가 메톡시기, 플루오르기, 메톡시에틸기 등에 의해 치환된 것, 포스포로티오에이트형 뉴클레오티드(인산기의 산소 원자가 유황 원자로 치환된 것), 모르폴리노(Morpholino) 형 뉴클레오티드(리보스, 디옥시리보스가 모르폴린 고리로 치환된 것), BNA(Bridged nucleic acid), HNA(Hexitol NucleicAcid), LNA(Locked Nucleic Acid), PNA(Peptide Nucleic Acid), TNA(Threose nucleic acid), GNA(Glycerol nucleic acid), CeNA(Cyclohexenyl nucleic acid) 등을 들 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 수식체로서는, 예를 들면, 증폭산물의 검출에 도움이 되는 표식 물질로 수식된 것을 들 수 있다. 상기 표식 물질로서는, 형광 물질, 방사성 동위체, 화학 발광체, 효소, 항체 등을 들 수 있다. 표식 물질은 프라이머의 핵산 사슬 신장 반응을 저해하지 않도록 결합시킨다.
본 발명에서, 핵산 증폭 반응에 사용하는 프라이머는 한 종류일 수 있으며, 2종류일 수도 있고, 3종류 이상일 수도 있다. 실시하는 핵산 증폭 반응에 따라 적절히 결정할 수 있다.
예를 들면, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 예를 들면, 표적 염기 서열은 표적 핵산의 전체 길이 또는 그 부분 영역의 염기 서열로서, 대응 표적 영역의 5＇측과 3＇측의 양쪽 모두에, 비표적 핵산과 구조가 공통되는 영역, 구체적으로는 염기 서열 및 수식 상태가 공통되는 영역이 존재하도록 설정할 수 있다. 표적 염기 서열의 5＇말단으로서, 비표적 핵산과 구조가 공통되는 영역과 하이브리다이즈하는 포워드 프라이머와, 표적 염기 서열의 3＇말단으로서, 비표적 핵산과 구조가 공통되는 영역과 하이브리다이즈하는 상기 표적 염기 서열의 핵산 단편을 증폭하는 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서, 핵산 증폭 반응은 표적 영역 특이적 결합 분자가 비표적 핵산과 결합 가능한 온도 조건하에서 행한다. 상기 핵산 증폭 반응은 반응 공정 전체에서 표적 영역 특이적 결합 분자가 비표적 핵산과 결합 가능한 온도 조건하에서 행하는 것일 수 있으며, PCR법 등의 온도 사이클을 구비하고 있을 수 있다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서는, 상기 핵산 증폭 반응은 65℃ 이하의 온도 조건하에서 행하는 것이 바람직하다. 65℃ 이하의 온도 조건하에서 행함으로써, 단백질 등의 비교적 내열성이 낮은 분자를 표적 영역 특이적 결합 분자로서 사용할 수 있다. 한편, 내열성 단백질로 이루어지는 표적 영역 특이적 결합 분자를 이용하고 내열성 폴리머레이즈 등을 이용함으로써, 65℃ 초과, 예를 들면, 65℃ 초과 95℃ 이하 정도의 온도 영역에서 핵산 증폭 반응을 행할 수도 있다.
PCR에서 요구되는 온도 제어를 행하기 위한 서멀 사이클러가 불필요한 점에서, 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서의 핵산 증폭 반응은 등온 조건하에서 행하는 것이 바람직하다. 한편, 「등온 조건하」란, 반응 중에 설정한 온도에 대해서±3℃ 또는±1℃의 온도 범위내로 유지하는 것을 의미한다.
등온 조건으로서는, 핵산 증폭 반응이 진행될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, DNA 폴리머레이즈의 최적 온도에 포함되는 일정한 온도이다. 등온 조건으로서는, 예를 들면, 10℃ 이상, 15℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상 또는 30℃ 이상의 일정한 온도, 및 65℃ 이하, 60℃ 이하, 50℃ 이하, 45℃ 이하 또는 40℃ 이하의 일정한 온도를 들 수 있다. 또한, 등온 조건은, 예를 들면 10℃~65℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 15℃~50℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 20℃~45℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 20℃~45℃의 범위에 포함되는 일정한 온도, 또는 30℃~45℃의 범위에 포함되는 일정한 온도일 수 있다. 본 명세서에서 「등온으로 인큐베이트한다」, 「등온 조건하에서 보온한다」, 「등온으로 반응시킨다」 등의 용어는, 반응중에 설정한 온도에 대해서 ±7℃, ±5℃, ±3℃ 또는 ±1℃의 온도 범위내로 유지하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서, 등온 조건하에서 행해지는 핵산 증폭 반응은 특별히 한정되지 않으며, 공지의 등온 핵산 증폭 반응이나 그 개변 반응을 행할 수 있다. 공지의 등온 핵산 증폭 반응으로서는, RPA법(특허문헌 1), LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)법(비특허문헌 3), MDA(Multiple displacement amplification)법(비특허문헌 4), 역전사 효소를 사용한 역전사 반응, NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based amplification)법 등을 들 수 있다.
RPA법은 표적 염기 서열의 일방의 말단 영역과 하이브리다이즈하는 프라이머와 타방의 말단 영역과 하이브리다이즈하는 프라이머를, 각각 리콤비네이즈와 복합체를 형성시켜서 이를 주형 핵산과 접촉시켜, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(single-strand binding protein, SSB)과 함께 복제 포크를 형성한 후, DNA 폴리머레이즈에 의해 2중 가닥 핵산을 합성하는 방법이다. 사용하는 프라이머는 PCR용 프라이머와 동일하게 하여 설계할 수 있다. 사용하는 SSB나 DNA 폴리머레이즈, 반응액을 조제하는 버퍼 등은 RPA법에서 일반적으로 사용되고 있는 것이나 그 개변체로부터 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 또한, 「TwistAmp(등록상표)」(TwistDx사) 등의 시판하는 RPA용 키트를 이용할 수도 있다. 반응 조건은 RPA법에서 일반적으로 사용되고 있는 조건 또는 그것을 개변한 조건으로 적절하게 행할 수 있다.
LAMP법은 표적 염기 서열로부터 6개의 영역을 선택해 조합한 4종류의 프라이머(FIP 프라이머, F3 프라이머, BIP 프라이머 및 B3 프라이머)를 이용하여, 사슬 치환 반응을 이용하여 증폭시키는 방법이다. F3 프라이머가 본 발명의 「표적 염기 서열의 5＇말단 영역과 하이브리다이즈하는 포워드 프라이머」에 상당하고, B3 프라이머가 본 발명에서의 「표적 염기 서열의 3＇말단 영역과 하이브리다이즈하는 리버스 프라이머」에 상당한다. 이러한 프라이머는, 예를 들면, LAMP법 프라이머 설계 지원 소프트웨어 「PrimerExplorer」(에이켄 화학사)을 사용하여 설계할 수 있다. 사용하는 사슬 치환형 DNA 폴리머레이즈나 반응액을 조제하는 버퍼 등은 LAMP법에서 일반적으로 사용되고 있는 것이나 그 개변체로부터 적절히 선택하여 이용할 수 있으며, 반응 조건도 LAMP법에서 일반적으로 사용되고 있는 조건 또는 그것을 개변한 조건으로 적절히 행할 수 있다.
MDA법은, 일반적으로는 랜덤 프라이머를 이용하여, 프라이머가 결합한 위치로부터 Phi29 DNA Polymerase에 의해 단일 가닥 핵산을 합성하는 방법이다. Phi29 DNA 폴리머레이즈는 그 자체가 헬리케이스 활성을 가지고 있으며, 핵산 합성중에 2중 가닥 핵산(예: 주형 DNA와 프라이머의 회합체)에 조우한 경우에도, 그 2중 가닥을 풀면서 DNA 합성 반응을 진행시킬 수 있다. 30℃, 12시간의 반응으로 70,000 염기 길이 이상이 합성되는 것으로 알려져 있다. 랜덤 프라이머나 표적 염기 서열 근방의 프라이머를 이용함으로써, 표적 염기 서열을 증폭시킬 수 있다. 사용하는 프라이머나 DNA 폴리머레이즈, 반응액을 조제하는 버퍼 등은 MDA법에서 일반적으로 사용되고 있는 것이나 그 개변체로부터 적절히 선택하여 이용할 수 있으며, 반응 조건도 MDA법에서 일반적으로 사용되고 있는 조건 또는 그것을 개변한 조건으로 적절히 행할 수 있다.
NASBA법은, RNA를 주형으로 하고, AMV 역전사 효소, RNase H 및 T7 RNA 폴리머레이즈와 2종류의 프라이머(F 프라이머와 5＇측에 T7 프로모터 배열을 가지는 R 프라이머)를 이용하여 행하는 등온 핵산 증폭 반응이다. 우선, 주형의 RNA에 R 프라이머(본 발명의 「표적 염기 서열의 3＇말단 영역과 하이브리다이즈하는 리버스 프라이머」에 상당)를 어닐링하여 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성하고, 얻어진 RNA/DNA 사슬의 RNA 사슬 부분을 RNase H가 소화한다. 남은 cDNA에 F 프라이머(본 발명의 「표적 염기 서열의 5＇말단 영역과 하이브리다이즈하는 포워드 프라이머」에 상당)를 어닐링하여 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성하고, 얻어진 2중 가닥 cDNA를 주형으로 하여 T7 RNA 폴리머레이즈의 전사 반응에 의해 안티센스의 단일 가닥 RNA를 합성한다. 이 단일 가닥 RNA에 F프라이머를 어닐링하여 역전사 효소에 의해 RNA/DNA 사슬을 얻은 후, RNA사슬 부분을 RNase H가 소화한다. 남은 cDNA에 R 프라이머를 어닐링하여 역전사 효소에 의해 2중 가닥 cDNA를 얻고, 이를 주형으로 하여 T7 RNA 폴리머레이즈의 전사 반응에 의해 안티센스의 단일 가닥 RNA를 합성한다. 이를 반복함으로써, 표적 핵산인 RNA의 안티센스의 단일 가닥 RNA가 증폭된다. 사용하는 프라이머나 역전사 효소, RNase H 및 T7 RNA 폴리머레이즈, 반응액을 조제하는 버퍼 등은, NASBA법에서 일반적으로 사용되고 있는 것이나 그 개변체로부터 적절히 선택하여 이용할 수 있으며, 반응 조건도 NASBA법에서 일반적으로 사용되고 있는 조건 또는 그것을 개변한 조건으로 적절히 행할 수 있다.
역전사 반응은 RNA를 주형으로 하여 역전사 효소에 의해 주형 RNA의 안티센스의 cDNA 사슬을 합성하는 반응이다. 얻어진 cDNA를 주형으로 한 PCR과 조합한 RT-PCR법을 행함으로써, 표적의 RNA를 고감도로 검출할 수 있다. 사용하는 프라이머나 역전사 효소, DNA 폴리머레이즈, 반응액을 조제하는 버퍼 등은, 역전사 반응에서 일반적으로 사용되고 있는 것이나 그 개변체로부터 적절히 선택하여 이용할 수 있다.
RPA법, LAMP법, MDA법, NASBA법 및 역전사 반응에서의 반응 온도는, 사용하는 효소가 효소 활성을 나타내는 온도 영역내이면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 등온 핵산 증폭 반응에서는, 얻어지는 증폭산물은 반응 시간에 의존한다. 이 때문에, 반응 시간은 목적으로 하는 증폭산물의 양에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, RPA법과 LAMP법에서는 5분 내지 6시간으로 할 수 있으며, 5분 내지 1시간으로 하는 것이 바람직하고, 5분 내지 30분간 하는 것이 보다 바람직하다. MDA법에서는, 5분 내지 32시간으로 할 수 있으며, 5분 내지 24시간으로 하는 것이 바람직하고, 5분 내지 16시간으로 하는 것이 더 바람직하다. NASBA법에서는, 5분 내지 6시간으로 할 수 있으며, 5분 내지 3시간으로 하는 것이 바람직하고, 5분 내지 1.5시간으로 하는 것이 보다 바람직하다. 역전사 반응에서는, 5분 내지 3시간으로 할 수 있으며, 5분 내지 1시간으로 하는 것이 바람직하고, 5분 내지 30분간 하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서, 핵산 증폭 반응의 반응계에 함유 시키는 표적 영역 특이적 결합 분자는, 표적 핵산의 증폭에 사용되는 프라이머를 이용한 핵산 증폭 반응으로 증폭 가능한 표적 핵산 이외의 핵산, 즉 비표적 핵산과 특이적으로 결합하고, 핵산 증폭을 저해할 수가 있는 분자이면 특별히 한정되지 않는다.
표적 핵산과 비표적 핵산의 구조의 차이가 염기 서열의 차이인 경우, 표적 영역 특이적 결합 분자로서는 비표적 핵산의 표적 영역의 염기 서열을 특이적으로 인식하여 결합하는 분자를 이용할 수 있다. 표적 핵산이 DNA인 경우의 상기 분자로서는, 예를 들면, DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9(dCas9) 단백질과 gRNA(guide RNA)와의 복합체(CRISPR 복합체)를 들 수 있다. 표적 핵산이 RNA인 경우의 상기 분자로서는, 예를 들면, RNA와 결합하는 CRISPR 복합체를 구성하는 Cas13a(Cas13a)(비특허문헌 7)의 RNA 사슬 절단 활성 결손형(dCas13a) 단백질과 gRNA의 복합체(CRISPR 복합체)를 들 수 있다. 특히, Cas13a/gRNA 복합체는 RNA의 1개의 염기의 차이를 식별할 수 있는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 8). 이 때문에, 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서 표적 영역 특이적 결합 분자로서 Cas13a/gRNA 복합체를 이용함으로써, 1개의 염기만이 다른 표적 핵산과 비표적 핵산을 구별하여, 표적 핵산을 검출할 수 있다.
dCas9 단백질로서는, 예를 들면, Cas9 단백질 중의 뉴클레이스 도메인에 변이를 도입하여, DNA 결합능은 유지한 채로 뉴클레이스 활성을 상실시킨 단백질을 들 수 있다. 상기 단백질로서는, 예를 들면, 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 유래의 야생형 Cas9 단백질에서의 RuvC 뉴클레이스 도메인 중의 D10A(10번째의 아스파라긴산을 알라닌으로 치환한 점 돌연변이)와 HNH 뉴클레이스 도메인 중의 H840A(840번째의 히스티딘을 알라닌으로 치환한 점 돌연변이)의 2개의 점 돌연변이 중 적어도 하나의 점 돌연변이가 도입된 변이체를 들 수 있다. 또한, 각종 Cas9 단백질에, 화농성 연쇄상구균 유래 Cas9 단백질의 D10A 및 H840A에 상당하는 2개의 점 돌연변이를 도입한 변이체도 사용할 수 있다. dCas9 단백질로서는, 「EnGen Spy dCas9(SNAP-tag)」(New England Biolabs사) 등의 시판하는 단백질을 사용할 수도 있다.
Cas13a는, C2c2라고도 불리는 RNA를 표적으로 하는 CRISPR 복합체를 구성하는 단백질이며, 2개의 HEPN 도메인(Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding domain)과 1개의 뉴클레이스 도메인을 갖는다. dCas13a로서는, 예를 들면, Cas13a 단백질 중의 뉴클레이스 도메인에 변이를 도입하여, RNA 결합능은 유지한 채로 뉴클레이스 활성을 상실시킨 단백질을 들 수 있다. 상기 단백질로서는, 예를 들면, 렙토트리키아 와데이(Leptotrichia wadei) 유래의 야생형 Cas13a 단백질에서의 뉴클레이스 도메인 중의 R474A(474번째의 아르기닌을 알라닌으로 치환한 점 돌연변이)와 R1046A(1046번째의 아르기닌을 알라닌으로 치환한 점 돌연변이)의 2개의 점 돌연변이 중 적어도 하나의 점 돌연변이가 도입된 변이체(비특허문헌 10)를 들 수 있다. 또한, 각종 Cas13a 단백질에, 렙토트리키아 와데이 유래 Cas13a 단백질의 R474A 및 R1046A에 상당하는 2개의 점 돌연변이를 도입한 변이체도 사용할 수 있다.
Cas9를 이용하는 경우의 gRNA는, 세균 유래의 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)를 포함한다. crRNA는 tracrRNA의 일부와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역(tracrRNA와의 결합 영역)과 특이적으로 인식하여 결합하는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역(표적 핵산 결합 영역)을 포함하는 단일 가닥 RNA이다. 표적 핵산 결합 영역은 표적 핵산이 DNA의 경우는 DNA 결합 영역이며, 표적 핵산이 RNA의 경우는 RNA 결합 영역이다. tracrRNA는 crRNA의 일부와 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역(crRNA와의 결합 영역)을 가지고 있으며, 상기 영역에서 crRNA와 하이브리다이즈하여 헤어핀 구조를 형성하는 단일 가닥 RNA이다. crRNA와 tracrRNA는 각각 독립적인 단일 가닥 RNA일 수 있으며, 양쪽 둘다 적당한 RNA 링커를 개재하여 연결된 단일 가닥 RNA(sgRNA)일 수도 있다. 이들은 게놈 편집에서 일반적으로 행해지고 있는 것과 동일한 방법으로 설계할 수 있다. 한편, Cas13a는 tracrRNA를 필요로 하지 않으며, crRNA만으로 gRNA로서 기능한다. 그 때문에, 단일 가닥 RNA를 gRNA로서 이용해도 된다.
본 발명에서 이용되는 gRNA 중의 표적 핵산 결합 영역(DNA 결합 영역 또는 RNA 결합 영역)은 비표적 핵산 중의 표적 영역과 결합하는 영역이며, 상기 표적 영역의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 영역이다. 비표적 핵산의 표적 영역에 CRISPR 복합체, 즉, 표적 핵산이 DNA인 경우는 dCas9 단백질과 gRNA의 복합체이며, 표적 핵산이 RNA인 경우는 dCas13a 단백질과 gRNA의 복합체가 결합함으로써, 주형 핵산에 대한 프라이머의 어닐링이나 폴리머레이즈에 의한 핵산 사슬 신장 반응이 저해되어 비표적 핵산의 증폭이 억제된다.
Cas9를 이용하는 경우의 gRNA 중의 표적 핵산 결합 영역(DNA 결합 영역)은 통상, PAM 배열이 그 바로 뒤에 오는 영역의 염기 서열을 선택한다. PAM 배열은 dCas9 단백질로 인식되는 배열이며, 이용되는 Cas9 단백질 등에 의존하여 결정된다. dCas9 단백질이 결합하는 DNA 결합 영역의 염기 길이는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 15~30 염기 길이 정도로 할 수 있고, 18~23 염기 길이가 바람직하다.
Cas13a를 이용하는 경우의 gRNA 중의 표적 핵산 결합 영역(RNA 결합 영역)은 통상, PFS 배열이 그 바로 뒤에 오는 영역의 염기 서열을 선택한다. PFS 배열은 dCas13a 단백질로 인식되는 배열이며, 이용되는 Cas13a 단백질 등에 의존하여 결정된다. dCas13a 단백질이 결합하는 RNA 결합 영역의 염기 길이는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 15~40 염기 길이 정도로 할 수 있고, 20~30 염기 길이가 바람직하다.
반응액 중의 dCas9 단백질 또는 Cas13a 단백질의 양은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 20μL의 반응액당 200ng 이하로 할 수 있고, 10~80ng가 바람직하다. 또한, 반응액 중의 gRNA의 양은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 50nM 이하로 할 수 있고, 2.5~20nM가 바람직하다.
표적 영역 특이적 결합 분자로서는 CRISPR 복합체 이외에도, 표적 핵산 중의 대응 표적 영역과는 결합하지 않고, 비표적 핵산 중의 표적 영역과는 특이적으로 결합하는 DNA 배열 특이적 결합능을 구비하는 단백질이나 RNA 배열 특이적 결합능을 구비하는 단백질 등의 분자를 이용할 수 있다. 이러한 단백질로서는, 예를 들면, 특정 DNA 배열을 인식하여 특이적으로 결합하는 징크 핑거(zinc finger) 단백질, TAL 이펙터(transcription-activator like effector: TALE), LexA 단백질 등의 전사 제어 인자 등을 들 수 있다. 또한, 예를 들면, 특정 RNA 배열을 인식하여 특이적으로 결합하는 PPR(pentatricopeptide repeat) 단백질 등을 들 수 있다.
비표적 핵산이 표적 핵산과 수식 상태가 다른 핵산인 경우 중, 비표적 핵산 중의 표적 영역은 특정 수식이 이루어져 있는 상태이고, 표적 핵산 중의 대응 표적 영역은 상기 수식이 이루어져 있지 않은 상태인 경우에는, 상기 수식이 이루어진 핵산과 특이적으로 결합하는 분자를 표적 영역 특이적 결합 분자로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 비표적 핵산 중의 표적 영역이 CpG 메틸화되어 있고, 표적 핵산 중의 대응 표적 영역은 CpG 메틸화되어 있지 않은 경우, CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 표적 영역 특이적 결합 분자로서 이용할 수 있다. CpG 메틸화 DNA 결합 단백질로서는, MBD(Methyl-CpG-binding domain)를 가지는 단백질(MBD 단백질)이나, 메틸화된 CpG를 인식하는 항체 등의 공지의 단백질을 적절히 이용할 수 있다. 반응액 중의 MBD2 단백질의 양은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 20μL의 반응액당 10μg 이하로 할 수 있고, 0.05~2μg가 바람직하다.
비표적 핵산이 표적 핵산과 수식 상태가 다른 핵산인 경우 중, 비표적 핵산 중의 표적 영역은 특정 수식이 이루어지지 않은 상태이며, 표적 핵산 중의 대응 표적 영역은 상기 수식이 이루어져 있는 상태인 경우에는, 상기 수식이 이루어지지 않은 핵산과 특이적으로 결합하며 상기 수식이 이루어지고 있는 핵산과는 결합하지 않는 분자를 표적 영역 특이적 결합 분자로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 비표적 핵산 중의 표적 영역이 CpG 메틸화되어 있지 않고, 표적 핵산 중의 대응 표적 영역은 CpG 메틸화되어 있는 경우, CpG 메틸화되어 있지 않은 DNA에 특이적으로 결합하고 CpG 메틸화되어 있는 핵산과는 결합하지 않는 단백질을 표적 영역 특이적 결합 분자로서 이용할 수 있다. CpG 메틸화되어 있지 않은 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질로서는, 예를 들면, 효소 활성을 상실시킨 CpG 메틸트랜스퍼레이즈 변이체를 들 수 있다. 또한, 반응액 중에 메틸기의 도너가 될 수 있는 물질이 존재하고 있지 않으면, CpG 메틸트랜스퍼레이즈의 야생형 단백질도 상기 단백질로서 사용할 수 있다. 반응액 중의 CpG 메틸화되어 있지 않은 DNA에 특이적으로 결합하는 단백질의 양은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 20μL의 반응액당 10μg 이하로 할 수 있고, 0.05~2μg가 바람직하다.
비표적 핵산이 2종 이상 있는 경우에는, 각각에 대한 표적 영역 특이적 결합 분자를 핵산 증폭 반응의 반응계에 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서는, 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어진 경우에는, 표적 핵산이 검출되어 피험 핵산 시료에는 표적 핵산이 포함되어 있다고 판단된다. 한편, 증폭산물이 얻어지지 않은 경우에는, 표적 핵산은 검출되지 않으며, 피험 핵산 시료에 표적 핵산은 포함되어 있지 않다고 판단된다. 표적 핵산은 증폭산물이라는 양성 시그널로서 검출되기 때문에, 충분한 검출 감도로 표적 핵산을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법은, 예를 들면, 유전자 변이의 검출 등에 적합하다. 대응 표적 영역을, 검출하는 목적의 변이 부위로 하고, 핵산 증폭 반응에 이용하는 프라이머를, 표적 핵산 또는 비표적 핵산을 주형으로 한 경우에 상기 변이 부위를 포함하는 영역의 핵산 증폭산물이 얻어지도록 설계한다. 예를 들면, 변이 부위가 변이형인 핵산(변이형 핵산)을 표적 핵산으로 하고, 변이 부위가 야생형인 핵산(야생형 핵산)을 비표적 핵산으로 하여, 변이 부위가 야생형인 염기 서열의 핵산과 특이적으로 결합하며, 변이 부위가 변이형인 염기 서열의 핵산과는 결합하지 않는 분자(단, 핵산으로만 이루어지는 분자를 제외함.)를 표적 영역 특이적 결합 분자로 한다. 상기 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하이며, 상기 표적 영역 특이적 결합 분자의 야생형 핵산과의 결합 활성을 잃지 않는 온도 조건하에서, 핵산 증폭 반응을 행한다. 제공된 피험 핵산 시료에 변이형 핵산이 포함되어 있는 경우에는 증폭산물이 얻어지고, 피험 핵산 시료에 변이형 핵산이 포함되어 있지 않은 경우에는 증폭산물은 얻어지지 않는다. 증폭산물의 유무에 따라 표적 핵산인 변이형 핵산을 검출할 수 있다. 이 때문에, 상기 방법에서는 호모 변이뿐만 아니라, 헤테로 변이도 검출할 수 있다.
도 1은 표적 영역 특이적 결합 분자로서 dCas9 단백질과 gRNA를 이용하여, 유전자 변이를 검출하는 경우의 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다. 도면에서, 좌측이 야생형 핵산을 주형으로 하는 증폭 반응이며, 우측이 변이형 핵산을 주형으로 하는 증폭 반응이다.
도 2는, RNA를 표적 핵산으로 하여 RT-PCR에 의해 유전자 변이를 검출하는 경우의 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다. 표적 영역 특이적 결합 분자로서 야생형 RNA와 결합하는 dCas13a 단백질/gRNA 복합체를 이용하였다. 도면에서, 좌측이 변이형 RNA를 주형으로 하는 증폭 반응이며, 우측이 야생형 RNA를 주형으로 하는 증폭 반응이다. 야생형 RNA에는 dCas13a 단백질/gRNA 복합체가 결합하기 때문에 역전사 효소에 의한 cDNA 사슬 신장이 저해되는 결과, PCR의 증폭산물은 얻어지지 않는다. 변이형 RNA는 RT-PCR에 의해 증폭산물이 얻어진다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법은, 예를 들면, 유전자 다형의 검출에도 적합하다. 표적 영역을, 검출하는 목적의 다형 부위로 하고, 핵산 증폭 반응에 이용하는 프라이머를, 표적 핵산 또는 비표적 핵산을 주형으로 한 경우에 상기 다형부위를 포함하는 영역의 핵산 증폭산물이 얻어지도록 설계한다. 예를 들면, 다형부위가 표적의 유전자형인 핵산을 표적 핵산으로 하고, 다형 부위가 표적의 유전자형 이외의 유전자형인 핵산을 비표적 핵산으로 하여, 다형 부위가 표적의 유전자형 이외의 유전자형인 핵산과 특이적으로 결합하는 분자(단, 핵산으로만 이루어지는 분자를 제외함.)를 표적 영역 특이적 결합 분자로 한다. 상기 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하이며, 상기 표적 영역 특이적 결합 분자의 비표적 핵산과의 결합 활성을 잃지 않는 온도 조건하에서, 핵산 증폭 반응을 행한다. 제공된 피험 핵산 시료에 검출하는 목적의 유전자형 핵산이 포함되어 있는 경우에는 증폭산물이 얻어지며, 피험 핵산 시료에 상기 유전자형 핵산이 포함되어 있지 않은 경우에는 증폭산물은 얻어지지 않는다. 증폭산물의 유무에 따라 표적 핵산인 특정 유전자형의 유전자 다형을 검출할 수 있다. 상기 방법에서도 마찬가지로 호모 다형뿐만 아니라, 헤테로 다형도 검출할 수 있다.
DNA의 메틸화 해석에는, 바이설파이트 처리를 이용하는 방법이 있다. 해석 대상의 DNA에 대하여, 메틸화 염기는 탈아미노화되지 않으며, 비메틸화 염기는 탈아미노화되는 적절한 반응 시간에 바이설파이트 처리를 행한 후, 폴리머레이즈에 의한 핵산 증폭 반응을 행하면, 메틸화 염기는 본래의 염기이며, 비메틸화 염기는 탈아미노화되어 다른 염기로 변환된 증폭산물이 얻어진다. 예를 들면, 사이토신은 탈아미노화에 의해 우라실로 변환되기 때문에, 증폭산물 중에서는 메틸화 사이토신은 사이토신이며, 비메틸화 사이토신은 타이민이다.
대응 표적 영역과 표적 영역의 메틸화 상태에 차이가 있는 경우, 바이설파이트 처리에 따라 대응 표적 영역과 표적 영역 사이에 염기에 차이가 생긴다. 따라서, 피험 핵산 시료로서 바이설파이트 처리한 핵산을 이용함으로써, 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에 의해 핵산 중의 특정 염기의 메틸화의 유무를 해석할 수 있다. 해석 대상의 염기가 메틸화되어 있는 핵산을 표적 핵산으로 할 수 있으며, 해석 대상의 염기가 메틸화되어 있지 않은 핵산을 표적 핵산으로 할 수도 있다.
예를 들면, 특정 사이토신의 메틸화의 유무를 해석하는 경우, 해석 대상의 사이토신이 메틸화되어 있는 핵산을 바이설파이트 처리한 것을 표적 핵산으로 한 경우에는, 표적 핵산 중의 해석 대상의 사이토신(메틸화 사이토신)을 포함하는 부분 영역을 대응 표적 영역으로 하고, 상기 해석 대상의 사이토신이 메틸화되어 있지 않은 핵산을 바이설파이트 처리한 것을 비표적 핵산으로 한다. 이 경우, 비표적 핵산 중의 해석 대상의 사이토신은 바이설파이트 처리에 의해 우라실로 변환되어 있다. 이 우라실을 포함하는 부분 영역을 표적 영역으로 한다. 피험 핵산 시료에 해석 대상의 사이토신이 메틸화 사이토신인 핵산이 포함되어 있는 경우에는, 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하에서 핵산 증폭 반응을 행함으로써, 상기 염기가 사이토신인 핵산 증폭산물이 얻어진다. 피험 핵산 시료에 포함되어 있는 핵산이 전부, 해석 대상의 사이토신이 비메틸화 사이토신이었던 경우에는, 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하에서의 핵산 증폭 반응에서는 증폭산물은 얻어지지 않는다.
또한, 해석 대상의 사이토신이 메틸화되어 있지 않은 핵산을 바이설파이트 처리한 것을 표적 핵산으로 한 경우에는, 표적 핵산 중의 해석 대상의 사이토신(비메틸화 사이토신)을 포함하는 부분 영역을 대응 표적 영역으로 하고, 상기 해석 대상의 사이토신이 메틸화되어 있는 핵산을 바이설파이트 처리한 것을 비표적 핵산으로 한다. 이 경우, 비표적 핵산중의 해석 대상의 사이토신은 메틸화되어 있기 때문에 바이설파이트 처리후에도 메틸화 사이토신인 상태로 유지된다. 이 메틸화 사이토신을 포함하는 부분 영역을 표적 영역으로 한다. 피험 핵산 시료에 해석 대상의 사이토신이 비메틸화 사이토신인 핵산이 포함되어 있는 경우에는, 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하에서 핵산 증폭 반응을 행함으로써, 상기 염기가 타이민인 핵산 증폭산물이 얻어진다. 피험 핵산 시료에 포함되어 있는 핵산이 모두, 해석 대상의 사이토신이 메틸화 사이토신이었던 경우에는, 표적 영역 특이적 결합 분자의 존재하에서의 핵산 증폭 반응에서는 증폭산물이 얻어지지 않는다.
한편, 이러한 각 방법에서, 표적 영역에 특이적으로 결합하며 대응 표적 영역에는 결합하지 않는 표적 영역 특이적 결합 분자로서는, 예를 들면, gRNA의 표적 핵산 결합 영역(DNA 결합 영역 또는 RNA 결합 영역)이 표적 영역에 상보적인 염기 서열인 CRISPR 복합체 등을 이용할 수 있다.
핵산 증폭 반응에 의해 얻어진 표적 핵산의 증폭산물은, PCR 등의 핵산 증폭 반응의 증폭산물의 검출에 일반적으로 사용되고 있는 각종 방법에 의해 검출할 수 있다. 상기 검출 방법으로서는, 예를 들면, 아가로스 겔 전기 영동으로 분획한 밴드를 에티디움브로마이드 등에 의해 염색하는 방법, 인터칼레이터법, 융해 곡선 분석법을 들 수 있다. 인터칼레이터법은 사이버 그린 등의 형광성 인터칼레이터가, 생성된 2중 가닥 DNA에 결합항 형광을 발하는 것을 이용한 방법이며, 증폭산물의 증가와 함께 형광 강도가 증대된다. 반응액에 여기광을 조사하여 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 모니터링할 수 있다. 또한, 표식 물질로 수식한 프라이머를 이용한 경우에는, 상기 표식 물질을 지표로서 검출할 수 있다. 형광 물질로 표식된 프라이머를 사용한 경우에는, 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 핵산 증폭 반응 후의 반응액으로부터 미반응의 프라이머를 제외한 후, 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물을 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에 이용되는 시약 등을 키트화함으로써, 상기 방법을 보다 간편하게 행할 수 있다. 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법 중 표적 영역 특이적 결합 분자로서 dCas9 단백질 및 gRNA를 이용하는 방법을 위한 키트로서는, 표적 핵산 및 비표적 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머, dCas9 단백질 및 gRNA를 가지는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법 중 표적 영역 특이적 결합 분자로서 dCas13a 단백질 및 gRNA를 이용하는 방법을 위한 키트로서는, 표적 핵산 및 비표적 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머, dCas13a 단백질 및 gRNA를 가지는 것이 바람직하다. 또한, 표적 영역 특이적 결합 분자로서 CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 이용하는 방법을 위한 키트로서는, 표적 핵산 및 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머 및 CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 가지는 것이 바람직하다. 또한, 표적 영역 특이적 결합 분자로서 전사 제어 인자를 이용하는 방법을 위한 키트로서는, 표적 핵산 및 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머 및 전사 제어 인자를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 표적 핵산 검출용 키트에는, 핵산 증폭 반응을 위한 효소, 반응액을 조제하기 위한 농축 버퍼, dNTP 등도 포함되어 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 핵산 증폭 반응을 RPA법으로 행하는 방법에 이용되는 키트의 경우에는, 리콤비네이즈, SSB 및 DNA 폴리머레이즈를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 표적 핵산 검출용 키트는, 상기 키트를 이용하여 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법을 행하기 위한 프로토콜이 기재된 서면을 더 포함하는 것도 바람직하다. 상기 프로토콜은 상기 키트를 수용한 용기의 표면에 기재되어 있을 수 있다.
＜핵산 결합 분자의 검출 방법＞
주형이 되는 핵산에 어떠한 물질을 결합시킴으로써, 주형 핵산에 대한 프라이머의 어닐링이나 폴리머레이즈에 의한 핵산 사슬 신장 반응을 저해하는 반응을 이용하여, 핵산 결합 분자(핵산 결합능을 가지는 분자)를 검출할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법은, 피험 시료, 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여 핵산 증폭 반응을 행한다. 피험 시료 중에 주형으로서 이용한 핵산과 결합하는 핵산 결합 분자가 포함되어 있는 경우에는, 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어진다. 한편, 피험 시료 중에 상기 핵산과 결합하는 핵산 결합 분자가 포함되어 있지 않은 경우에는, 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어진다. 즉, 핵산 증폭 반응 후의 핵산 증폭산물의 양에 기초하여 상기 피험 시료 중에 존재하고 있는 핵산 결합 분자를 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법에 제공되는 피험 시료로서는, 핵산 결합 분자의 존재가 기대되는 시료이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 동물이나 식물의 조직이나 세포의 추출액(lysate), 배양 세포의 세포 추출액, 토양 등의 자연계로부터 채취된 시료나 그 대략적인 정제물 등을 이용할 수 있다. 한편, 조직이나 세포의 추출액은 통상의 방법에 의해 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법에서 검출되는 핵산 결합 분자는 특별히 한정되지 않으나, 펩티드, 단백질 또는 저분자 화합물인 것이 바람직하고, 핵산과 단백질 등의 다른 분자와의 복합체일 수 있다. 또한, 상기 핵산 결합 분자는 분류되어 있지 않은 물질일 수 있다. 예를 들면, 각종 세포의 세포 추출액이나 핵 추출액과 같이 여러가지 물질이 함유되어 있는 것을 피험 시료로 함으로써, 상기 피험 시료에 핵산 결합 분자가 포함되어 있는지 조사할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법에서 검출되는 핵산 결합 분자의 핵산 결합능은 특별히 한정되지 않으며, 특정 염기 서열을 인식하여 특이적으로 결합하는 염기 서열 특이적인 핵산 결합 분자일 수 있고, 특정 수식 상태를 인식하여 결합하는 핵산 결합 분자일 수도 있으며, 염기 서열이나 수식 상태에 영향을 받지 않고, 널리 일반적으로 결합하는 핵산 결합 분자일 수도 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법에 이용되는 핵산은 핵산 증폭 반응의 주형으로서 이용하는 것이며, 핵산 증폭 반응의 주형이 될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으나, DNA 또는 RNA가 바람직하다. 상기 핵산은 염기 서열이 특정되어 있는 것일 수 있으며, 염기 서열이 특정되지 않은 것일 수도 있다. 또한, 상기 핵산은 한 종류의 핵산으로만 이루어지는 것일 수 있으며, 세포로부터 추출·정제된 DNA와 같이 다종의 다양한 핵산의 혼합물일 수도 있다. 예를 들면, 염기 서열을 인식하지 않고 핵산에 결합하는 핵산 결합 분자를 검출하는 경우에는, 주형으로 하는 핵산은 염기 서열이 불명확한 것이나 다종의 다양한 핵산의 혼합물일 수도 있다.
예를 들면, 특정 염기 서열을 인식하여 결합하는 배열 특이적인 핵산 결합 분자를 검출하는 경우에는, 상기 특정 염기 서열을 가지는 핵산을 주형으로 하고, 핵산 증폭 반응에서 주형 핵산 중의 상기 특정 염기 서열을 포함하는 영역이 증폭되도록, 주형 핵산 중의 상기 특정 염기 서열의 상류(5＇측)와 하이브리다이즈하도록 설계된 프라이머를 이용한다. 프라이머는 주형으로 하는 핵산의 염기 서열에 기초하여 통상의 방법에 의해 설계하고 합성할 수 있다.
특정 수식 상태에 있는 핵산과 특이적으로 결합하는 핵산 결합 분자를 검출하는 경우에는, 상기 특정 수식 상태에 있는 핵산을 주형으로 한다. 상기 수식 상태에는, 예를 들면, 메틸화, 불소화, 포스포로티오에이트화, 포스포로디티오에이트화, 당 부가, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 부가, 펩티드 부가 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법에서 행해지는 핵산 증폭 반응으로서는, 상기의 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서 행해지는 핵산 증폭 반응과 동일한 것을 들 수 있다. 검출하는 목적의 핵산 결합 분자가 단백질 등의 내열성이 비교적 낮은 분자인 경우, 핵산 증폭 반응은 65℃ 이하의 온도 영역에사 행해지는 것이 바람직하다. 반대로, 내열성의 핵산 결합 분자의 검출을 목적으로 하는 경우에는, 내열성 폴리머레이즈를 이용하여 65℃ 초과 100℃ 이하의 온도 영역에서 핵산 증폭 반응을 행한다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법에서 행해지는 핵산 증폭 반응으로서는, PCR에서 요구되는 온도 제어를 행하기 위한 서멀 사이클러가 불필요한 점에서, RPA법, LAMP법, MDA법, NASBA법 등의 등온 조건하에서 행해지는 핵산 증폭 반응이 바람직하다.
예를 들면, 피험 시료, 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여 핵산 증폭 반응을 행하여, 얻어진 핵산 증폭산물의 양을, 피험 시료를 첨가하지 않는 것 이외에는 동일한 조건으로 핵산 증폭 반응을 행하여 얻어진 핵산 증폭산물의 양과 비교한다. 피험 시료에 주형으로서 이용한 핵산에 결합하는 핵산 결합 분자가 포함되어 있는 경우에는, 상기 피험 시료의 존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양은 상기 피험 시료의 비존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양보다 적어진다. 반대로, 피험 시료의 존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양이 피험 시료의 비존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양과 동등하거나 그 이상인 경우에는, 상기 피험 시료 중에는 주형으로서 이용한 핵산에 결합하는 핵산 결합 분자는 존재하지 않는다.
본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법에 이용되는 시약 등을 키트화함으로써 상기 방법을 보다 간편하게 행할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법을 사용하기 위한 핵산 결합 분자 검출용 키트로서는, 주형으로 하는 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 함유하는 것이 바람직하다. 그 외, 핵산 증폭 반응을 위한 효소, 반응액을 조제하기 위한 농축 버퍼, dNTP 등도 포함되어 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 핵산 증폭 반응을 RPA법으로 행하는 방법에 이용되는 키트의 경우에는, 리콤비네이즈, SSB 및 DNA 폴리머레이즈를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산 결합 분자 검출용 키트는, 상기 키트을 이용하여 본 발명에 따른 핵산 결합 분자의 검출 방법을 행하기 위한 프로토콜이 기재된 서면을 더 포함하는 것도 바람직하다. 상기 프로토콜은 상기 키트를 수용한 용기의 표면에 기재되어 있을 수 있다.
＜핵산 결합능의 평가 방법＞
주형이 되는 핵산에 어떠한 물질을 결합시킴으로써, 주형 핵산에 대한 프라이머의 어닐링이나 폴리머레이즈에 의한 핵산 사슬 신장 반응을 저해하는 반응을 이용하여, 핵산 결합 분자의 핵산 결합능을 평가할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법은 피험 물질, 상기 피험 물질의 핵산 결합능을 평가하는 대상의 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여 핵산 증폭 반응을 행한다. 피험 물질이 주형으로서 이용한 핵산에 대한 결합능을 구비하고 있는 경우에는, 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어지지 않는다. 한편, 피험 물질이 상기 핵산에 대한 결합능을 구비하지 않은 경우에는, 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어진다. 즉, 핵산 증폭 반응 후의 핵산 증폭산물의 양에 기초하여 상기 피험 물질의 주형으로서 이용한 핵산에 대한 결합능을 평가할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법에서 평가 대상이 되는 피험 물질은 특별히 한정되지 않지만, 펩티드, 단백질 또는 저분자 화합물인 것이 바람직하다. 그 외, 핵산과 단백질 등의 다른 분자와의 복합체일 수 있다. 또한, 상기 피험 물질은 정제된 것 이외에도, 피험 물질 이외의 물질을 포함하는 조성물일 수 있다. 또한, 상기 피험 물질은 분류되어 있지 않은 물질일 수 있다. 예를 들면, 각종 세포의 세포 추출액이나 핵 추출액과 같이 여러가지 물질이 함유되어 있는 것도 피험 물질로 할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법에서 평가되는 핵산 결합능은 특별히 한정되지 않으며, 특정 염기 서열을 인식하여 결합하는 배열 특이적인 핵산 결합능일 수 있고, 특정 수식 상태를 인식하여 결합하는 핵산 결합능일 수도 있으며, 염기 서열이나 수식 상태에 영향을 받지 않고, 널리 일반적으로 결합하는 핵산 결합능일 수도 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법에서 이용되는 핵산은, 피험 물질이 결합하는지 아닌지를 평가하는 대상의 핵산이며, 핵산 증폭 반응의 주형이 될 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, DNA 또는 RNA가 바람직하다. 상기 핵산은 염기 서열이 특정되어 있는 것일 수 있으며, 염기 서열이 특정되어 있지 않은 것일 수도 있다. 또한, 상기 핵산은 한 종류의 핵산으로만 이루어지는 것일 수 있고, 다종의 다양한 핵산의 혼합물일 수도 있다.
예를 들면, 특정 염기 서열을 인식하여 결합하는 배열 특이적인 핵산 결합능을 평가하는 경우에는, 상기 특정 염기 서열을 가지는 핵산을 주형으로 하고, 핵산 증폭 반응에서 주형 핵산 중의 상기 특정 염기 서열을 포함하는 영역이 증폭되도록 주형 핵산 중의 상기 특정 염기 서열의 상류(5＇측)와 하이브리다이즈하도록 설계된 프라이머를 이용한다. 프라이머는 주형으로 하는 핵산의 염기 서열에 기초하여 통상의 방법에 의해 설계하고 합성할 수 있다.
특정 수식 상태에 있는 핵산과 특이적으로 결합하는 핵산 결합능을 평가하는 경우에는, 상기 특정 수식 상태에 있는 핵산을 주형으로 한다. 상기 수식 상태에는, 예를 들면, 메틸화, 불소화, 포스포로티오에이트화, 포스포로디티오에이트화, 당 부가, PEG(폴리에틸렌글리콜) 부가, 펩티드 부가 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법에서 행해지는 핵산 증폭 반응으로서는, 상기의 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에서 행해지는 핵산 증폭 반응과 동일한 것을 들 수 있다. 피험 물질이 단백질등의 내열성이 비교적 낮은 분자의 경우, 핵산 증폭 반응은 65℃ 이하의 온도 영역에서 행해지는 것이 바람직하다. 반대로, 피험 물질이 내열성이 높은 분자이며, 고온 환경하에서의 핵산 결합능을 평가하는 경우에는, 내열성 폴리머레이즈를 이용하여 65℃ 초과 100℃ 이하의 온도 영역에서 핵산 증폭 반응을 행한다. 또한, 본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법에서 행해지는 핵산 증폭 반응으로서는, PCR에서 요구되는 온도 제어를 행하기 위한 서멀 사이클러가 불필요한 점에서, RPA법, LAMP법, MDA법, NASBA법 등의 등온 조건하에서 행해지는 핵산 증폭 반응이 바람직하다.
예를 들면, 피험 물질, 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여 핵산 증폭 반응을 행하고, 얻어진 핵산 증폭산물량을 피험 물질을 첨가하지 않는 것 이외에는 동일한 조건으로 핵산 증폭 반응을 행하여 얻어진 핵산 증폭산물의 양과 비교한다. 피험 물질이 핵산 증폭 반응을 행한 온도 조건 등에서 주형 핵산에 대한 핵산 결합능을 가지고 있는 경우에는, 상기 피험 물질의 존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양은 상기 피험 물질의 비존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양보다 적어진다. 즉, 피험 물질의 존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물량이 피험 물질의 비존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양보다 적은 경우에는, 상기 피험 물질은 핵산 증폭 반응을 행한 온도 조건 등에서 주형으로서 이용한 핵산에 대한 핵산 결합능을 가지고 있다고 평가된다. 반대로, 피험 물질의 존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양이 피험 물질의 비존재하에서 얻어진 핵산 증폭산물의 양과 동등하거나 그 이상인 경우에는, 상기 피험 물질은 주형으로서 이용한 핵산에 대한 핵산 결합능을 가지지 않았다고 평가된다.
본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법에 이용되는 시약 등을 키트화함으로써, 상기 방법을 보다 간편하게 행할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법을 사용하기 위한 핵산 결합능의 평가용 키트로서는, 피험 물질의 핵산 결합능을 평가하는 대상의 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 함유하는 것이 바람직하다. 그 외, 핵산 증폭 반응을 위한 효소, 반응액을 조제하기 위한 농축 버퍼, dNTP 등도 포함되어 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 핵산 증폭 반응을 RPA법으로 행하는 방법에 이용되는 키트의 경우에는, 리콤비네이즈, SSB 및 DNA 폴리머레이즈를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가용 키트는, 상기 키트을 이용하여 본 발명에 따른 핵산 결합능의 평가 방법을 행하기 위한 프로토콜이 기재된 서면을 더 포함하는 것도 바람직하다. 상기 프로토콜은 상기 키트를 수용한 용기의 표면에 기재되어 있을 수 있다.
실시예
다음으로, 실시예 등에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 예에 의해 한정되지 않는다.
［RNA 및 프라이머］
이하의 실험에서 이용한 RNA는 FASMAC사에 위탁하여 화학 합성한 것을 사용하였다. 사용한 RNA를 표 1에 나타내었다.
Figure pct00001
이하의 실험에서 이용한 프라이머는 eurofin사에 위탁하여 화학 합성한 것을 사용하였다. 사용한 프라이머를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00002
［gRNA의 제작］
1μL의 10μM　crRNA, 1μL의 10μM　tracrRNA 및 2μL의 Nuclease-free water를 혼합하여 98℃에서 2분간 인큐베이트함으로써 gRNA(crRNA/tracrRNA 복합체)를 형성하였다.
［RPA 반응］
RPA 반응은 이하와 같이 행하였다. 우선, RPA 시약(제품명 「TwistAmp(등록상표) Basic kit」, TwistDx사)의 한 개의 튜브(동결건조 시약 내장)에 29.5μL의 rehydration buffer, 2.5μL의 10μM　포워드 프라이머, 2.5μL의 10μM　리버스 프라이머를 첨가하여 혼합하였다. 계속해서, 조제된 용액 중 13.6μL를 다른 튜브에 나누어 담고, 20ng의 주형 DNA와 Nuclease-free water를 첨가함으로써 19μL의 RPA 반응 준비 용액을 조제하였다. 이 RPA 반응 준비 용액에 1μL의 280mM　MgOAc 용액을 첨가한 후 37℃에서 30분간 인큐베이트하여 RPA 반응을 행하였다.
dCas9 단백질과 gRNA를 이용한 RPA 반응은 이하와 같이 행하였다. 한편, dCas9는 화농성 연쇄상구균 유래의 Cas9에 D10A 및 H840A의 점 돌연변이를 도입한 것을 시스멕스사(ProCube, 제조번호 14M_029)에 위탁하여 합성한 것을 사용하였다. 우선, 0.8μL의 gRNA, 0.4μg의 dCas9 단백질 및 Nuclease-free water를 혼합하여 10μL로 만들고, 이를 CRISPR 용액으로 하였다. RPA 반응 시에는 상기에서 조제한 RPA 반응 준비 용액에 1μL의 CRISPR 용액을 첨가하고(첨가 후의 용액 중 dCas9 단백질은 40ng, gRNA는 10nM), 37℃에서 5분간 인큐베이트하였다. 그 후, 반응액에 1μL의 280mM　MgOAc 용액을 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이트 하고 RPA 반응을 행하였다.
반응 종료 후, 「PCR/Gel DNA purification kit」(니혼 제네틱스사)을 이용하여 각 반응액으로부터 핵산을 정제하였다. 정제 산물은 「SYBR(등록상표) Safe DNA Gel Stain」(ThermoFisher Scientific사)을 포함하는 아가로스 겔을 이용하여 전기 영동하였다.
［실시예 1］
배양 세포주 293T 세포의 KRAS 유전자에 대해서 2종류의 gRNA를 제작하고, dCas9와 함께 반응계에 첨가하여 RPA 반응을 행하였다.
주형으로서 293T 세포로부터 추출 및 정제한 게놈 DNA(293T gDNA)를 이용하고, gRNA로서 gRNA_KRAS(서열번호 1 및 6) 및 gRNA_KRAS#2(서열번호 2 및 6)를 이용하였다. 프라이머 세트로서 KRAS 유전자의 게놈 DNA 중 gRNA_KRAS 및 gRNA_KRAS#2의 표적 영역을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 포워드 프라이머(서열번호 7)와 리버스 프라이머(서열번호 8)를 이용하였다. 293T 세포의 KRAS 유전자의 부분 영역과 사용한 2종류의 gRNA의 게놈 DNA와 상보적 배열 부분을 도 3에 나타낸다. 또한, 대조군으로서 CDKN2A(p16) 유전자에 대한 gRNA(gRNA_p16_Gx5#2, 서열번호 3 및 6)를 이용하였다.
전기 영동의 결과를 도 4에 나타낸다. gRNA_p16_Gx5#2를 첨가한 반응액에서는, gRNA와 dCas9를 첨가하고 있지 않는 반응액과 마찬가지로 증폭산물의 밴드가 검출되었다. 한편, gRNA_KRAS 및 gRNA_KRAS#2를 첨가한 반응액은 모두 증폭산물의 밴드가 검출되지 않고, 포워드 프라이머와 리버스 프라이머에 의한 KRAS 유전자의 핵산 증폭이 저해되었다. 이러한 결과로부터, 핵산 증폭을 저해하고자 하는 DNA에 대한 gRNA와 dCas9를 반응액에 함유시킴으로써 RPA 반응에 의한 핵산 증폭을 저해할 수 있음이 확인되었다.
[실시예 2］
배양 세포주 HCT116 세포의 KRAS 유전자에서는, 한쪽의 대립 유전자에만 1개의 염기 치환의 변이(GGC→GAC)가 있고, 13번째의 글리신이 아스파라긴산으로 치환되어 있다. 이 1개의 염기 치환에 의해, 도 3에 나타내는 gRNA_KRAS#2에서의 PAM 배열(TGG)이 TGA가 되고, PAM 배열(NGG)이 아니게 되어 있다.
주형 핵산으로서 HCT116 세포로부터 추출 및 정제한 게놈 DNA(HCT116　gDNA)를 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다.
전기 영동의 결과를 도 5에 나타낸다. 야생형 KRAS 유전자만을 가지는 293T　gDNA를 주형으로 한 실시예 1과 마찬가지로, gRNA_p16_Gx5#2를 첨가한 반응액에서는 핵산 증폭산물이 확인되고, gRNA_KRAS를 첨가한 반응액에서는 증폭산물은 확인되지 않았다. 즉, gRNA_KRAS는 gRNA와 주형 핵산에 1개 염기의 미스매치가 있어도 gRNA로서 기능하고 있었다. 한편, 실시예 1과는 달리, gRNA_KRAS#2를 첨가한 반응액에서는 핵산 증폭산물이 확인되었다.
시퀀스 해석에 의해 각 반응액에서 얻어진 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, gRNA 무첨가의 반응액과 gRNA_p16_Gx5#2를 첨가한 반응액의 증폭산물에는 HCT116　gDNA에 원래 포함되어 있는 야생형 KRAS와 변이형 KRAS(G13D) 양쪽 모두가 포함되어 있었다. 한편, gRNA_KRAS#2를 첨가한 반응액의 증폭산물에는 변이형 KRAS(G13D)만이 포함되어 있고 야생형 KRAS의 핵산 증폭은 확인할 수 없었다. 도 6에 gRNA_KRAS#2를 첨가한 반응액 중에서 행해진 RPA 반응을 모식적으로 나타낸다. 야생형 KRAS에서는 gRNA_KRAS#2가 dCas9와 함께 PAM 배열 부근에 결합하기 때문에 DNA 폴리머레이즈에 의한 증폭 반응이 저해되었지만, 변이형 KRAS에서는 gRNA_KRAS#2가 결합할 예정의 영역 부근에 PAM 배열이 없기 때문에 dCas9가 리크루트되지 않고 증폭 반응은 정상적으로 진행되었다. 즉, PAM 배열에 변이 부위가 오도록 gRNA를 설계함으로써 1개의 염기 변이를 매우 높은 정밀도로 검출할 수 있음이 확인되었다.
계속해서, 도 7에 나타낸 바와 같이 gRNA_KRAS에 1개의 염기 치환의 변이를 도입하였다. 이 gRNA_KRAS_mut(서열번호 4 및 6)는 야생형 KRAS와는 1개 염기가 상이하고, 변이형 KRAS(G13D)와는 2개 염기가 상이하였다. 주형 핵산으로서 HCT116　gDNA 또는 293T　gDNA를 이용하고 gRNA로서 gRNA_KRAS_mut를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다.
전기 영동의 결과를 도 8에 나타낸다. 이 결과, 293T　gDNA를 첨가한 반응액에서는 gRNA_KRAS_mut에 의해 핵산 증폭이 저해되어 있었다. HCT116　gDNA를 첨가한 반응액에서는 gRNA_KRAS_mut를 첨가한 경우에서도 증폭산물의 밴드가 검출되었다. HCT116　gDNA를 첨가한 반응액 중의 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, gRNA_KRAS_mut를 첨가하지 않은 경우는 야생형 KRAS와 변이형 KRAS(G13D) 양쪽 모두가 포함되어 있었다. 한편, gRNA_KRAS_mut를 첨가한 경우는 변이형 KRAS(G13D)만이 포함되어 있었다. 즉, gRNA와 주형 핵산에 1개 염기의 미스매치가 있어도 gRNA로서 기능하고 RPA 반응에 의한 핵산 증폭을 저해할 수 있었지만, gRNA와 주형 핵산에 2개 염기의 미스매치가 있으면, gRNA로서 기능하지 못하고 RPA 반응에 의한 핵산 증폭이 정상적으로 진행되었다. 이러한 결과로부터, 변이가 PAM 배열상에 존재하지 않는 경우에서도 인위적으로 gRNA에 변이를 도입하고, 표적 염기 서열과 미스매치를 증가시킴으로써 1개 염기의 변이를 구별할 수 있음이 확인되었다.
[실시예 3］
도 9에 나타낸 바와 같이, HCT116 세포의 CDKN2A(p16) 유전자에서는 한쪽의 대립 유전자에만 1개의 G가 삽입되어 있다(Gx5). 이 때문에, gRNA_p16_Gx5#2는 Gx5 대립 유전자과는 염기 서열이 동일하지만, 한쪽의 대립 유전자(Gx4)와는 일치하지 않는다.
주형 핵산으로서 HCT116 세포로부터 추출 및 정제한 게놈 DNA(HCT116　gDNA)를 이용하여 프라이머 세트로서 CDKN2A(p16) 유전자의 게놈 DNA 중 gRNA_p16_Gx5#2의 표적 영역을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 포워드 프라이머(서열번호 9)와 리버스 프라이머(서열번호 10)를 이용하여 gRNA로서 gRNA_p16_Gx5#2 또는 gRNA_KRAS를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다.
전기 영동의 결과를 도 10에 나타낸다. gRNA_p16_Gx5#2를 첨가한 반응액에서도, gRNA_KRAS를 첨가한 반응액이나 gRNA를 첨가하고 있지 않는 반응액의 증폭산물보다 적었으나, 증폭산물은 확인되었다.
시퀀스 해석에 의해, 각 반응액에서 얻어진 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, gRNA 무첨가의 반응액과 gRNA_KRAS를 첨가한 반응액의 증폭산물에는, HCT116　gDNA에 원래 포함되어 있는 Gx5형 p16과 Gx4형 p16 양쪽 모두가 포함되어 있었다. 한편, gRNA_p16_Gx5#2를 첨가한 반응액의 증폭산물에는 Gx4형 p16만이 포함되어 있고 Gx5형 p16의 핵산 증폭은 확인할 수 없었다. 이는, Gx5형 p16 배열에 gRNA_p16_Gx5#2가 dCas9와 함께 리크루트되어 DNA 폴리머레이즈에 의한 증폭 반응이 저해되었지만, Gx4형 p16 배열에는 dCas9가 리크루트되지 않고, 증폭 반응은 정상적으로 진행되었다. 즉, 본 발명에 따른 표적 핵산의 검출 방법에 의해 1개 염기가 삽입 또는 결손된 변이를 매우 높은 정밀도로 검출할 수 있음이 확인되었다.
［실시예 4］
293T 세포의 CDKN2A(p16) 유전자에 게놈 편집을 행하고, 편집 후의 게놈에 대해서 야생형 핵산을 표적으로 하는 gRNA(gRNA_mid2, 서열번호 5 및 6)와 dCas9의 존재하에서 RPA 반응을 행하고, 게놈 편집이 이루어진 핵산만을 증폭하여 검출하였다. 도 11에 CDKN2A(p16) 유전자에 대해서 행한 게놈 편집을 모식적으로 나타내었다.
게놈 편집이 이루어지지 않은 경우에는, 야생형의 염기 서열인 상태이기 때문에, gRNA_mid2와 dCas9에 의해 RPA 증폭은 억제된다. 한편, 게놈 편집이 이루어져 염기 서열이 변화한 경우, gRNA_mid2와 dCas9에 의한 증폭 저해 효과는 일어나지 않고, RPA 증폭이 보여진다.
우선, 게놈 편집을 이하와 같이 행하였다. 2μg의 Cas9 발현 플라스미드(Addgene사, #41815) 및 2μg의 사람 CDKN2A(p16) 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 발현 플라스미드(sgRNA-mid2)(비특허문헌 5)를 트랜스펙션 시약 「Lipofectamine 3000」(ThermoFisher Scienticif사)을 이용하여 293T 세포(4×105 세포)에 트랜스펙트 하였다. 2일간 배양 후 세포를 회수하고 게놈 DNA를 추출 및 정제하였다.
계속해서, 주형으로서, 얻어진 게놈 DNA를 총량 100ng로 하고, 293T 세포의 CDKN2A(p16) 유전자의 게놈 DNA 중 gRNA_mid2가 표적으로 하는 염기 서열을 포함하는 영역을 RPA 증폭하기 위한 포워드 프라이머(서열번호 9)와 리버스 프라이머(서열번호 10)를 사용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다. 한편, 게놈 편집을 행하지 않은 293T　gDNA에 게놈 편집을 행한 293T　gDNA를 소량 혼합시킴으로써, 게놈 편집된 게놈 DNA의 비율을 저하시켰다.
전기 영동 결과를 도 12에 나타낸다. 게놈 편집을 행하지 않은 293T　gDNA만을 주형으로 한 반응액에서는 증폭산물이 확인되지 않고, gRNA_mid2에 의해 핵산 증폭 반응이 저해되어 있었다. 한편, 게놈 편집을 행하지 않은 293T　gDNA(80ng)와 게놈 편집을 행한 293T　gDNA(20ng)의 혼합물을 주형으로 한 반응액에서는 증폭산물이 확인되었다. 각 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, 게놈 편집을 행하지 않은 293T　gDNA를 주형으로 한 반응액의 증폭산물은 CDKN2A(p16) 유전자의 야생형 핵산 배열과 동일하였다. 게놈 편집을 행하지 않은 293T　gDNA와 게놈 편집을 행한 293T　gDNA를 혼합한 것을 주형으로 한 반응액의 증폭산물은, 그 대부분은 야생형 핵산 배열이었지만, 게놈 편집된 배열로 생각되는 다양성이 풍부한 염기 서열도 약간 포함되어 있었다. 한편, 게놈 편집을 행하지 않은 293T　gDNA와 게놈 편집을 행한 293T　gDNA를 혼합한 것을 주형으로 하고 dCas9와 gRNA_mid2를 첨가한 반응액의 증폭산물에는, 다양성이 풍부한 염기 서열만이 검출되고, 야생형 핵산 배열은 증폭되어 있지 않았다.
［실시예 5］
293T　gDNA에 소량의 HCT116　gDNA를 혼합하여, 변이형 KRAS(G13D)의 존재 비율(［변이형 KRAS(G13D)를 가지는 세포 유래의 gDNA의 함유량］/(［변이형 KRAS(G13D)를 가지는 세포 유래의 gDNA의 함유량］＋［야생형 KRAS만을 가지는 세포 유래 gDNA의 함유량］)×100%)를 저하시킨 핵산을 주형으로 하여 gRNA_KRAS#2와 dCas9에 의해 야생형 KRAS의 RPA 증폭을 억제할 수 있는지 아닌지를 조사하였다.
HCT116　gDNA를 20ng으로 일정하게 하고, 변이형 KRAS(G13D)의 존재 비율이 도 13에 나타낸 바와 같이 293T　gDNA와 HCT116　gDNA를 혼합한 것을 주형으로 하고, gRNA로서 gRNA_KRAS#2를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동했다.
전기 영동의 결과를 도 14에 나타낸다. 변이형 KRAS(G13D)를 가지는 세포 유래의 gDNA의 존재 비율이 2%밖에 없는 반응액에서도 핵산 증폭산물이 확인되었다. 각 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, 변이형 KRAS(G13D)를 가지는 세포 유래의 gDNA의 존재 비율이 5~100%인 반응액의 증폭산물에는 변이형 KRAS(G13D) 밖에 검출되지 않았지만, 변이형 KRAS(G13D)를 가지는 세포 유래의 gDNA의 존재 비율이 2%인 반응액의 증폭산물에는, 변이형 KRAS(G13D)와 야생형 KRAS 양쪽 모두가 확인되었다.
계속하여, 293T　gDNA를 400ng로 일정하게 하고, 변이형 KRAS(G13D)의 존재 비율이 도 14에 나타낸 바와 같이 293T　gDNA와 HCT116　gDNA를 혼합한 것을 주형으로 하고, gRNA로서 gRNA_KRAS#2를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다.
전기 영동의 결과를 도 14에 나타낸다. 변이형 KRAS(G13D)를 가지는 세포 유래의 gDNA의 존재 비율이 1%밖에 없는 반응액에서도, 핵산 증폭산물이 확인되었다. 각 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, 변이형 KRAS(G13D)를 가지는 세포 유래의 gDNA의 존재 비율이 1~100%의 반응액의 증폭산물에는 변이형 KRAS(G13D) 밖에 검출되지 않았다. 이러한 결과로부터, 표적 핵산(본 실험에서는, 변이형 KRAS(G13D))의 존재 비율이 불과 1%여도 표적 핵산을 검출할 수 있음이 나타났다.
［실시예 6］
HCT116 세포의 CDKN2A(p14ARF) 유전자에서는, 한쪽 대립 유전자에서만 1개의 G가 결손되어 있다(Gx4). 또한, HCT116 세포의 CDKN2A(p14ARF) 유전자 중, Gx4 대립 유전자 중의 Gx4 위치 주변의 사이토신은 메틸화 수식을 받지 않지만, Gx5 대립 유전자 중의 Gx5 위치 주변의 사이토신은 메틸화 수식을 받는다. 따라서, CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 RPA 반응의 반응액에 첨가하고 Gx5 대립 유전자를 주형으로 한 RPA 증폭을 억제하여, Gx4 대립 유전자를 검출하였다. CpG 메틸화 DNA 결합 단백질로서는 MBD2 단백질(「EpiXplore(등록상표) Methylated DNA Enrichment Kit」, 다카라 바이오사)를 이용하였다.
gRNA와 dCas9 대신 0.25μg의 MBD2 단백질을 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다. 한편, 프라이머 세트로서 CDKN2A(p14ARF) 유전자의 Gx4·Gx5 위치를 증폭하기 위한 포워드 프라이머(서열번호 11)와 리버스 프라이머(서열번호 12)를 이용하였다. 두 프라이머 모두 CpG를 포함하지 않았다.
전기 영동의 결과를 도 15에 나타낸다. MBD2를 첨가하고 있지 않는 반응액에서는 핵산 증폭산물이 확인되었다. MBD2를 첨가한 경우도 증폭산물이 보였다. 각 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, MBD2를 첨가하고 있지 않는 반응액의 증폭산물에는 Gx4형 p14ARF와 Gx5형 p14ARF 양쪽 모두가 포함되어 있었다. 한편, MBD2를 첨가한 반응액의 증폭산물에는 Gx4형 p14ARF만이 포함되어 있고 Gx5형 p14ARF의 핵산 증폭은 확인할 수 없었다. 이러한 결과로부터, CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 RPA 반응의 반응액에 존재시킴으로써 CpG 메틸화된 핵산을 주형으로 하는 핵산 증폭을 저해하여, CpG 메틸화되어 있지 않은 표적 핵산을 검출할 수 있음이 나타났다.
HCT116 세포의 CDKN2A(p16) 유전자 중, Gx5 대립 유전자 중의 Gx5 위치 주변의 사이토신은 메틸화 수식을 받지 않지만, Gx4 대립 유전자 중의 Gx4 위치 주변의 사이토신은 메틸화 수식을 받는다. 따라서, CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 RPA 반응의 반응액에 첨가하여 Gx4 대립 유전자를 주형으로 한 RPA 증폭을 억제하고 Gx5 대립 유전자를 검출하였다. CpG 메틸화 DNA 결합 단백질로서는 MBD2를 이용하였다.
gRNA와 dCas9 대신 0.5μg의 MBD2 단백질을 이용한 것 이외에는, 실시예 3과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다. 한편, 프라이머 세트로서 CDKN2A(p16) 유전자의 Gx4·Gx5 위치를 증폭하기 위한 포워드 프라이머(서열번호 13)와 리버스 프라이머(서열번호 14)를 이용하였다. 상기 리버스 프라이머(서열번호 14)는 1개소에 CpG를 포함하고 있었다.
전기 영동의 결과를 도 16에 나타낸다. MBD2를 첨가하고 있지 않는 반응액에서는 핵산 증폭산물이 확인되었다. MBD2를 첨가한 경우도 증폭산물이 보였다. 각 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, MBD2를 첨가하고 있지 않는 반응액의 증폭산물에는 Gx5형 p16와 Gx4형 p16 양쪽 모두가 포함되어 있었다. 한편, MBD2를 첨가한 반응액의 증폭산물에는 Gx5형 p16만이 포함되어 있고, Gx4형 p16의 핵산 증폭은 확인할 수 없었다. 이러한 결과로부터도, CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 RPA 반응의 반응액에 존재시킴으로써, CpG 메틸화된 핵산을 주형으로 하는 핵산 증폭을 저해하여 CpG 메틸화되어 있지 않은 표적 핵산을 검출할 수 있음이 나타났다.
다음으로, 시험관 내에서 인공적으로 CpG 메틸화한 DNA에 대해서도 본 방법에 따라 핵산 증폭이 억제되는지 아닌지 조사하였다. 우선, CDKN2A(p14ARF) 유전자의 Gx4·Gx5 위치를 사이에 두는 포워드 프라이머(서열번호 15)와 리버스 프라이머(서열번호 16)를 이용하여, PCR로 양 프라이머에 끼워지는 염기 서열을 증폭하였다. 한편, PCR은 「AmpliTaq Gold(등록상표) 360 Master Mix」(ThermoFisher Scientific사)를 이용하여, 10μL 중에 10ng의 HCT116 게놈 DNA, 0.5μM의 각 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 조제하였다. 반응은, 최초에 95℃에서 10분간의 변성에 이어, 95℃에서 15초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 30초간을 30사이클 행하고, 그 후 72℃에서 1분간 처리하였다. 증폭산물은 「PCR/Gel DNA purification kit」(니혼 제네틱스사)로 정제한 후, T-Vector pMD20(다카라 바이오사)에 클로닝하고, Competent Quick DH5a(도요보사)로 증폭하였다. 증폭한 플라스미드는 「NucleoBond(등록상표) Xtra Midi Plus」(다카라 바이오사)을 이용하여 정제하였다. 정제한 플라스미드는 Gx4를 포함하는 것(p14_Gx4 플라스미드)과 Gx5를 포함하는 것(p14_Gx5 플라스미드)의 2종류를 준비하였다.
HCT116 세포 내에서는, CDKN2A(p14ARF) 유전자의 Gx4 위치 주변의 사이토신은 메틸화 수식을 받지 않고, Gx5 위치 주변의 사이토신이 메틸화 수식을 받고 있다. 그러나, 대장균으로부터 정제한 플라스미드는 이러한 수식을 받고 있지 않다. 따라서, 의도적으로 Gx5 위치 주변이 아니라 Gx4 위치 주변의 사이토신을 시험관 내에서 메틸화 수식하였다. 구체적으로는, 정제한 1μg의 p14_Gx4 플라스미드를 6유닛의 CpG 메틸트랜스퍼레이즈 M.SssI(New England BioLabs사) 및 160μM의 S-아데노실메티오닌과 함께, 37℃에서 1시간 반응시킴으로써 메틸화 처리하였다. 메틸화한 p14_Gx4 플라스미드 및 메틸화 처리를 하지 않은 p14_Gx5 플라스미드는 「PCR/Gel DNA purification kit」(니혼 제네틱스사)를 이용하여 정제하였다.
게놈 DNA 대신 1pg의 플라스미드 DNA를 이용하여 실시예 1과 동일하게 하여, RPA 반응 준비 용액을 조제하였다. 0.5μg의 MBD2 단백질을 RPA 반응 준비 용액에 첨가한 후, 37℃에서 10분간 인큐베이트 하고, 그 후 1μL의 280mM의 MgOAc 용액을 첨가하여 37℃에서 10분간 인큐베이트 하여 RPA 반응을 행하였다. 한편, 프라이머 세트로서 CDKN2A(p14ARF) 유전자의 Gx4·Gx5 위치를 증폭하기 위한 포워드 프라이머(서열번호 11)와 리버스 프라이머(서열번호 12)를 이용하였다. 반응 후, 반응액은 정제하지 않고 2μL를 전기 영동하였다.
전기 영동의 결과를 도 17에 나타낸다. MBD2를 첨가하지 않은 반응액에서는 핵산 증폭산물이 확인되었다. MBD2를 첨가한 경우, 메틸화되지 않은 p14_Gx5 플라스미드로부터는 핵산 증폭이 보이나, 메틸화된 p14_Gx4 플라스미드로부터의 핵산 증폭은 억제되어 있었다. 이러한 결과로부터, 인공적으로 CpG 메틸화한 DNA도 주형으로 이용할 수 있는 것, 또한 CpG 메틸화가 직접적으로 핵산 증폭 저해에 관여하고 있음이 나타났다.
［실시예 7］
RPA 반응이 dCas9/gRNA나 MBD2 이외의 다른 DNA 결합 단백질에 의해 억제되는지 아닌지를 검토하였다. 닭 DT40#205-2 세포주는, Pax5 유전자 프로모터 영역에 세균의 DNA 결합 단백질인 LexA 단백질이 결합하는 LexA 결합 배열을 가지고 있다(비특허문헌 6). 따라서, DT40#205-2 세포 게놈 DNA를 주형으로 하고, RPA 반응의 반응액에 LexA 단백질을 첨가한 경우, LexA 결합 배열의 RPA 증폭이 억제되는지 아닌지를 조사하였다.
gRNA와 dCas9 대신 20ng의 LexA 단백질을 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 RPA 반응을 행하고, 정제 후에 전기 영동하였다. 한편, LexA 단백질로서는, LexA 단백질의 DNA 결합 도메인을, 시스멕스사(ProCube, 제조번호 13T_0170)에 위탁하여 합성한 것을 이용하였다. 음성 대상 단백질에는 20ng의 dCas9 단백질을 이용하였다. 프라이머 세트로서 LexA 결합 배열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 포워드 프라이머(서열번호 17)와 리버스 프라이머(서열번호 18)를 이용하였다.
전기 영동의 결과를 도 18에 나타낸다. LexA 단백질을 첨가하지 않은 반응액에서는 핵산 증폭이 보였다. LexA 단백질을 첨가한 경우, 게놈 DNA로부터의 핵산 증폭이 억제되었다. 음성 대상 단백질로서 dCas9를 첨가한 경우는, 게놈 DNA로부터의 핵산 증폭은 억제되지 않았다. 이러한 결과로부터, CRISPR 복합체나 MBD2 단백질 이외여도, DNA 결합 단백질이면 표적으로 하는 핵산 증폭을 저해할 수 있음이 나타났다. 본 기술을 이용함으로써, 특정 DNA 결합 분자가 특정 염기 서열에 대해서 결합능을 가지는지 아닌지를 평가할 수 있다. 또한, 분자 집단 중에 특정 염기 서열에 대해서 결합능을 가지는 분자가 존재하는지 아닌지의 검출에도 이용할 수 있다.
[실시예 8］
RT-PCR에 의해, 피험 핵산 시료 중의 단일 가닥 RNA를 표적 핵산으로서 검출하였다. 사람 NEAT1 유전자의 mRNA(NEAT1-RNA)를 표적 핵산으로 하였다.
［gRNA 및 프라이머］
본 실험에서는, 표 3에 기재의 염기 서열로 이루어지는 단일 가닥 RNA를 gRNA로서 이용하였다. 표 3의 gRNA의 염기 서열 중 대문자의 영역이 표적 핵산 NEAT1-RNA의 부분 영역과 상보적인 영역(RNA 결합 영역)이다. gRNA는 진 디자인사에 위탁하여 화학 합성한 것을 이용하였다. gRNA는 미리, 1μL의 10μM　gRNA 및 3μL의 Nuclease-free water를 혼합하여 100℃에서 2분간 인큐베이트 후, 실온에서 냉각한 것을 실험에 이용하였다.
Figure pct00003
본 실험에서는, 표 4에 기재의 염기 서열로 이루어지는 프라이머를 이용하였다. 포워드 프라이머(Human NEAT1-F2)와 리버스 프라이머(Human NEAT1-R2)는 dCas13a/gRNA_NEAT1가 표적으로 하는 RNA 배열에 상보적인 cDNA 배열을 사이에 두도록 설계된 프라이머이다. 포워드 프라이머(MY-0119)와 리버스 프라이머(MY-0129)는 dCas13a/gRNA_NEAT1_2가 표적으로 하는 RNA 배열에 상보적인 cDNA 배열을 사이에 두도록 설계된 프라이머이다. 대조군으로서 사람 GAPDH 유전자의 mRNA의 cDNA를 주형으로 하여 증폭하기 위해, 포워드 프라이머(hGAPDH-dCas13a-F3)와 리버스 프라이머(hGAPDH-dCas13a-R3)를 이용하였다. 프라이머는 eurofin사에 위탁하여 화학 합성한 것을 이용하였다.
Figure pct00004
［피험 핵산 시료의 조제］
사람 유래 배양 세포 MRC-5 세포로부터 추출된 토탈 RNA를 피험 핵산 시료로 하였다. MRC-5 세포는, 10%　FBS(소태아 혈청), 페니실린-스트렙토마이신(시그마사)을 포함하는 E-MEM(와코사) 배양지에서 배양하였다. MRC-5 세포의 RNA는 시판의 RNA 추출용 시약 「Isogen　II」(닛폰 진사)을 이용하여 추출 및 정제하였다.
［dCas13a］
dCas13a 단백질은 렙토트리키아 와데이 유래의 야생형 Cas13a에 R474A 및 R1046A의 점 돌연변이를 도입한 변이형 단백질을, 시스멕스사(ProCube, 제조번호 17T_042)에 위탁하여 합성한 것을 이용하였다.
［gRNA_NEAT1를 이용한 RT-PCR］
0.46μL의 gRNA, 0.24μg의 dCas13a 단백질 및 Nuclease-free water를 혼합하여 5μL로 만들고, 이를 dCas13a/gRNA 용액으로 하였다.
우선, 역전사 반응(RT)은 「ReverTraAce qPCR RT Master　Mix　with　gDNA　Remover」(TOYOBO사)을 이용하여 행하였다. 우선, 2μL의 「4×DN Master Mix」(gDNA Remover 첨가가 완료), 1ng의 RNA, 5μL의 dCas13a/gRNA 용액 및 Nuclease-free water를 혼합하여 8μL로 만들고, 37℃에서 5분간 인큐베이트 하였다. 그 후, 상기 반응액에 2μL의 「5×RT Master Mix II」를 첨가하고 37℃에서 30분간, 이어서 50℃에서 5분간, 계속해서 98℃에서 5분간 인큐베이트 하고, 역전사 반응을 행하였다. 역전사 반응 후의 용액에 10μL의 Nuclease-free water를 혼합하여 20μL의 cDNA 용액으로 만들었다.
계속해서, PCR은 「EmeraldAmp(등록상표) MAX PCR Master Mix」(다카라 바이오사)을 이용하여 행하였다. 10μL 중에 1μL의 cDNA, 0.5μM의 Human NEAT1-F2 프라이머 및 Human NEAT1-R2 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 조제하였다. 반응은, 최초에 94℃에서 1분간의 변성에 이어, 94℃에서 15초간, 60℃에서 15초간 및 72℃에서 1분간을 35사이클 행하고, 그 후 72℃에서 1분간 처리하였다.
［gRNA_NEAT1_2를 이용한 RT-PCR］
dCas13a/gRNA 용액의 조제 및 RT는 gRNA_NEAT1을 이용한 RT-PCR와 동일하게 하여 행하였다.
계속해서, PCR은 「AmpliTaq Gold(등록상표) 360 Master Mix」(ThermoFisher Scientific사)을 이용하여 행하였다. 10μL 중에 1μL의 cDNA, 0.5μM의 MY-0119 프라이머 및 MY-0129 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 조제하였다. 반응은, 최초에 95℃에서 10분간의 변성에 이어, 95℃에서 15초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 30초간을 38사이클을 행하고, 그 후 72℃에서 1분간 처리하였다.
［GAPDH의 RT-PCR］
GAPDH의 증폭은 「EmeraldAmp(등록상표) MAX PCR Master Mix」(다카라 바이오사)를 이용하여 행하였다. 10μL 중에 1μL의 cDNA, 0.5μM의 hGAPDH-dCas13a-F3 프라이머 및 hGAPDH-dCas13a-R3 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 조제하였다. 반응은 최초에 94℃에서 1분간의 변성에 이어서, 94℃에서 15초간, 60℃에서 15초간 및 72℃에서 1분간을 28 또는 32사이클 행하고, 그 후 72℃에서 1분간 처리했다.
［전기 영동］
각 증폭 반응에서 얻어진 증폭산물은 「SYBR(등록상표) Safe DNA Gel Stain」(ThermoFisher Scientific사)을 포함하는 아가로스 겔을 이용하여 전기 영동하였다.
gRNA_NEAT1를 이용한 RT-PCR의 증폭산물의 결과를 도 19에, gRNA_NEAT1_2를 이용한 RT-PCR의 증폭산물의 결과를 도 20에 각각 나타낸다. 도 19에 나타낸 바와 같이, dCas13a 무첨가 및 dCas13a만 첨가한 반응액에 비해, dCas13a/gRNA_NEAT1 복합체 용액을 첨가한 반응액에서는 PCR에 의한 NEAT1의 증폭이 감약되었다. 한편, dCas13a/gRNA_NEAT1 복합체가 표적으로 하지 않는 GAPDH를 증폭한 경우에는, 이러한 DNA 증폭의 감약은 보이지 않았다. 도 20에서도 동일한 것이 확인되었다. 이러한 결과로부터, dCas13a/gRNA_NEAT1 복합체가 NEAT1의 역전사 반응을 특이적으로 저해한 것이 나타나, dCas13a/gRNA 복합체를 반응액에 존재시킴으로써 배열 특이적인 역전사 반응을 저해할 수 있음이 확인되었다.
［실시예 9］
Ba/F3 세포 내에서, Stat5가 IL-3 자극(10ng/mL)으로부터 30분후에 Cis 프로모터에 결합하는 것은 이미 보고되어 있다(비특허문헌 9). 따라서, Stat5 결합 부위(TTCNNNGAA)를 가지는 2중 가닥 DNA와 그 2중 가닥 DNA의 Stat5 결합 부위를 포함하는 영역을 RPA 증폭하기 위한 프라이머 세트를 이용하여, Ba/F3세포의 핵추출액 중의 Stat5를 검출하였다.
[주형 핵산］
마우스 Cis 유전자 프로모터 내의 Stat5 결합 부위를 사이에 두는 영역(표 5중의 Cis 영역: 서열번호 27)을 주형 핵산으로 하고, 이를을 삽입한 플라스미드(Cis 플라스미드)를 조제하였다. 상기 영역에는 4개의 Stat5 결합 부위가 포함되어 있다. 표 5의 서열번호 27 중의 탈색 개소가 Stat5 결합 부위이다. 또한, 음성 대조군으로서 Stat5 결합 부위에 변이를 넣어 Stat5 결합능을 결손시킨 변이 배열(표 5 중의 CisM 영역: 서열번호 28)을 주형 핵산으로 하고, 이를 삽입한 플라스미드(CisM 플라스미드)를 조제하였다. 표 5의 서열번호 28 중의 탈색 지점이 변이를 넣은 Stat5 결합 부위이다.
Figure pct00005
우선, Ba/F3 세포의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 마우스 Cis 유전자 프로모터 내의 상기 Cis 영역을 사이에 두는 포워드 프라이머(mCis_-259/-199_F)와 리버스 프라이머(mCis_-188/-104_R)를 이용하여, PCR로 양 프라이머에 끼워지는 염기 서열을 증폭하였다. PCR은 「EmeraldAmp(등록상표) MAX PCR Master Mix」(다카라 바이오사)을 이용하여, 10μL 중에 10ng의 Ba/F3 게놈 DNA, 0.5μM의 각 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 조제하였다. 반응은, 최초에 94℃에서 1분간의 변성에 이어, 94℃에서 15초간, 60℃에서 15초간 및 72℃에서 1분간을 35사이클 행하고, 그 후 72℃에서 1분간 처리하였다.
얻어진 증폭산물을, 「PCR/Gel DNA purification kit」(니혼 제네틱스사)로 정제한 후, T-Vector pMD20(다카라 바이오사)으로 클로닝하고, 「Competent Quick DH5a」(도요보사)로 증폭하였다. 증폭된 플라스미드는 「NucleoSpin(등록상표) Plasmid QuickPure」(다카라 바이오사)을 이용하여 정제하였다(Cis 플라스미드).
CisM 플라스미드는 이하와 같이 하여 제작하였다. Cis 플라스미드를 주형으로 하고, Stat5 결합 부위를 사이에 두는 포워드 프라이머(mCis_-259/-199_mut_F)와 리버스 프라이머(mCis_-188/-104_mut_R)를 이용하여, PCR로 양 프라이머에 끼워지는 염기 서열을 증폭하였다. 한편, PCR은 「EmeraldAmp(등록상표) MAX PCR Master Mix」(다카라 바이오사)를 이용하여, 10μL 중에 1pg의 Cis 플라스미드, 0.5μM의 각 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 조제하였다. 반응은, 최초에 94℃에서 1분간의 변성에 이어, 94℃에서 15초간, 55℃에서 15초간 및 72℃에서 1분간을 30사이클 행하고, 그 후 72℃에서 1분간 처리하였다. 증폭산물은 Cis 영역의 증폭산물과 동일하게 하고, 정제 후에 T-Vector　pMD20에 넣고, 증폭한 후에 더 정제함으로써 CisM 플라스미드를 얻었다. DNA 시퀀스 해석 결과, CisM 플라스미드에는 리버스 프라이머측에서 예상 외의 변이가 보였으나, Stat5 결합 부위에 표 5에 나타내는 변이가 도입되어 있음을 확인할 수 있었다.
Figure pct00006
［Ba/F3 세포의 핵추출액의 조제］
IL-3 자극 없음의 Ba/F3 세포 및 IL-3 자극 처리 후의 Ba/F3 세포의 핵추출액은, 이하와 같이 조제하였다.
Ba/F3 세포는, 10% FBS, 10mM HEPES 버퍼(pH7.2)(나카라이 테스크사), 1×비필수 아미노산, 1mM 피루빈산 나트륨(나카라이 테스크사), 5μM 2-메르캅토에탄올(Sigma-Aldrich사), 1ng/mL IL-3(ThermoFisher　Scientific사) 및 페니실린-스트렙토마이신(나카라이 테스크사)을 포함하는 RPMI-1640(와코사) 배양지에서 배양하였다.
IL-3 자극 없음 및 IL-3 자극 처리 후의 핵추출액을 조정은 우선, Ba/F3 세포를 PBS로 3회 세정한 후 IL-3을 제외한 배양지에서 6시간 배양하였다(IL-3 자극 없음). 그 후, 10ng/mL가 되도록 IL-3을 배양지에 첨가하고, 37℃에서 30분간 배양하였다(IL-3 자극 처리). IL-3 자극 없음 및 IL-3 자극 처리 후의 Ba/F3 세포를 회수하고, 핵추출액을 「NE-PER(등록상표) Nuclear　and　Cytoplasmic　Extraction　Reagents」(ThermoFisher　Scientific사)를 이용하여 조제하였다.
［RPA 반응］
RPA 반응은 이하와 같이 행하였다. 우선, RPA 시약(제품명 「TwistAmp(등록상표) Basic kit」, TwistDx사)의 1개의 튜브(동결 건조 시약 내장)에 29.5μL의 rehydration buffer, 2.5μL의 10μM　포워드 프라이머(M13 Primer RV), 2.5μL의 10μM　리버스 프라이머(M13 Primer M4) 및 Nuclease-free water를 첨가하여 50μL로 만들어 혼합하였다. 계속해서, 조제된 용액 중 10μL를 다른 튜브에 나누어 담고, 1pg의 플라스미드 DNA(Cis 플라스미드 또는 CisM 플라스미드)와 3ng의 핵추출액을 첨가한 후 10mM Tris(pH8.0)를 첨가함으로써 11.3μL의 반응액을 조제하였다. 상기 반응액을 37℃에서 5분간 인큐베이트 하고, 그 후 1μL의 280mM의 MgOAc 용액을 첨가하여 37℃에서 30분간 인큐베이트 하여 RPA 반응을 행하였다. 반응 후, 해당 반응액은 정제하지 않고 2μL를 전기 영동하였다.
Figure pct00007
전기 영동의 결과를 도 21에 나타낸다. Cis 플라스미드를 주형으로 한 RPA 반응에서는, IL-3 자극 처리 후의 핵추출액을 첨가한 반응액에서는 IL-3 자극 없음 핵추출액을 첨가한 반응액과 비교하여, RPA에 의한 DNA 증폭이 감약되었다. 이는, IL-3 자극 처리 후의 핵추출액에 존재하는 Stat5가 Cis 플라스미드 중의 Stat5 결합 부위에 결합함으로써 DNA 증폭이 저해되었지만, IL-3 자극 없음 핵추출액에는 Stat5가 존재하지 않아, RPA 반응이 저해되지 않았기 때문이다. 한편, CisM 플라스미드를 주형으로 한 RPA 반응에서는, IL-3 자극 처리의 유무에 상관없이 동일한 정도의 DNA 증폭이 보였다. 이상의 결과로부터, RPA에 의한 핵산 증폭에 의해 표적 DNA에 결합하는 단백질이 세포 용해액 등의 용액 중에 존재하는지 평가할 수 있었다.
[실시예 10］
게놈 DNA 라이브러리를 주형으로 하고, CpG 메틸화 DNA 결합 단백질의 존재하에서 RPA 반응을 행하여, CpG 메틸화되어 있지 않은 DNA가 증폭되는지 아닌지를 조사하였다.
［게놈 DNA 라이브러리］
DNA 라이브러리는, HCT116 세포로부터 추출 및 정제된 게놈 DNA를 이용하여, 프로메가사에 의뢰하여 제작하였다(제품번호: KK0500). DNA 라이브러리 제작시에 부가한 어댑터 서열에는, illumina사의 차세대 시퀀스용을 위한 index15(ATGTCA)를 포함시켰다. 어댑터의 부가는 DNA 증폭 조작을 이용하지 않고 행하였다.
［RPA 반응］
RPA 반응은, 아답터 서열에 상보적인 프라이머를 이용하여, 이하와 같이 행하였다. 우선, RPA 시약(제품명 「TwistAmp(등록상표) Basic kit」, TwistDx사)의 1개 튜브(동결건조 시약 내장)에, 29.5μL의 rehydration buffer, 2.5μL의 10μM　포워드 프라이머(P5-NGS-Lib-Promega-RPA-F), 2.5μL의 10μM　리버스 프라이머(P7-NGS-Lib-Promega-RPA-R) 및 9.5μL의 Nuclease-free water를 첨가하여 혼합하였다. 계속해서, 조제된 용액 중 17.5μL를 다른 튜브에 나누어 담고, 0.5μL의 DNA 라이브러리, 0.5μg의 MBD2 단백질(「EpiXplore(등록상표) Methylated DNA Enrichment Kit」, 다카라 바이오사), Nuclease-free water를 첨가함으로써, 19μL의 RPA 반응 준비 용액을 조제하였다. 이 RPA 반응 준비 용액을 37℃에서 10분간 인큐베이트 하고, 그 후 1μL의 280mM MgOAc 용액을 첨가하여 37℃에서 10분간 인큐베이트 하여 RPA 반응을 행하였다. 반응 종료 후, 「PCR/Gel　DNA　purification　kit」(니혼 제네틱스사)를 이용하여 반응액으로부터 핵산을 정제하였다.
[RPA 반응의 증폭산물의 분석］
HCT116 세포의 CDKN2A(p14ARF) 유전자에서는, 한쪽 대립 유전자에서만 1개의 G가 결손되어 있다(Gx4). 또한, HCT116 세포의 CDKN2A(p14ARF) 유전자 중, Gx4 대립 유전자 중의 Gx4 위치 주변의 사이토신은 메틸화 수식을 받지 않지만, Gx5 대립 유전자 중의 Gx5 위치 주변의 사이토신은 메틸화 수식을 받는다. 따라서, RPA 반응의 반응액에 MBD2 단백질을 첨가한 경우, Gx5 대립 유전자를 주형으로 한 RPA 증폭이 억제되고 있는지 PCR로 확인하였다. 구체적으로는, CDKN2A(p14ARF) 유전자를 증폭시키도록, 포워드 프라이머(HP14ARF-Ex1-F)와 리버스 프라이머(HP14ARF-Ex1-R)를 이용하여 양 프라이머에 끼워지는 염기 서열을 PCR로 증폭하였다. PCR은 「AmpliTaq Gold(등록상표) 360 Master Mix」(ThermoFisher　Scientific사)를 이용하여 행하였다. 10μL 중에 0.5μL의 RPA 반응 후 DNA, 0.5μM의 HP14ARF-Ex1-F프라이머 및 HP14ARF-Ex1-R 프라이머를 포함하는 PCR 반응액을 조제하였다. PCR 반응은, 최초에 95℃에서 10분간의 변성에 이어, 95℃에서 15초간, 60℃에서 30초간 및 72℃에서 30초간을 30사이클 행하고, 그 후 72℃에서 1분간 처리하였다.
Figure pct00008
PCR 반응 후, 해당 반응액은 정제하지 않고 2μL를 전기 영동하였다. 이 결과, RPA 반응에서의 MBD2 단백질의 첨가의 유무에 관계없이 PCR 증폭산물이 확인되었다. 각 증폭산물의 염기 서열을 확인한 결과, MBD2 단백질을 첨가하지 않은 RPA 반응의 증폭산물인 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행한 경우에는, Gx4형 p14ARF와 Gx5형 p14ARF 양쪽 모두가 증폭되어 있었다. 한편, MBD2 단백질을 첨가하여 RPA 반응을 행하고, 얻어진 RPA 반응의 증폭산물인 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행한 경우에는, Gx4형 p14ARF가 우위로 증폭되어 있고, Gx5형 p14ARF의 증폭은 감소되어 있었다. 이러한 결과로부터, 게놈 DNA 라이브러리를 주형으로 하고, 라이브러리 전체를 증폭시키는 프라이머 세트를 이용한 경우, CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 RPA 반응의 반응액에 존재시킴으로써, CpG 메틸화된 DNA를 주형으로 하는 핵산 증폭이 저해되어 CpG 메틸화되어 있지 않은 DNA만을 증폭할 수 있음이 나타났다.
RPA 반응 후의 증폭산물을 주형으로 하고, PCR 증폭 및 DNA 시퀀스 해석(생어 시퀀스)에 의해 CpG 메틸화 DNA의 증폭의 유무를 확인하였으나, DNA 시퀀스 해석 대신 차세대 시퀀스 해석을 이용할 수도 있다. 즉, 게놈 DNA 라이브러리를 주형으로 하고 MBD2 단백질 존재하에서 행해진 RPA 반응의 증폭산물의 염기 서열을 차세대 시퀀스로 망라적으로 해석하여, 해당 게놈 DNA 도서관을 주형으로 하여 MBD2 단백질 비존재하에서 행해진 RPA 반응의 증폭산물의 염기 서열과 비교함으로써, 게놈상의 CpG 메틸화 사이트를 망라적으로 분류할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Epigeneron Inc. <120> PC-30396 <130> Method for detecting target nucleic acid, method for detecting molecule having nucleic acid binding ability, and method for evaluating nucleic acid binding ability <160> 38 <210> 1 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA_KRAS <400> 1 guaguuggag cugguggcgu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 2 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA_KRAS#2 <400> 2 cuugugguag uuggagcugg guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 3 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA_hp16_Gx5#2 <400> 3 acggccgcgg cccggggguc guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 4 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA_KRAS_mut <400> 4 guaguuggag cuggaggcgu guuuuagagc uaugcuguuu ug 42 <210> 5 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA_mid2 <400> 5 caccuccucu acccgacccc guuuuagagc uaugcuguuu 40 <210> 6 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 6 aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60 gucggugcu 69 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-RPA-G12-F primer <400> 7 tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc taat 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS-RPA-G12-R primer <400> 8 aaacaagatt tacctctatt gttggatcat attc 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16-RPA-F2 primer <400> 9 ggcggcgggg agcagcatgg agccttcggc tgac 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16-RPA-R2 primer <400> 10 ctacccacct ggatcggcct ccgaccgtaa ctat 34 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p14-RPA-F primer <400> 11 gtcccagtct gcagttaagg gggcaggagt 30 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p14-RPA-R primer <400> 12 gggcctttcc tacctggtct tctaggaa 28 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16-RPA-F primer <400> 13 gaggaagaaa gaggaggggc tggctggtca cc 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p16-RPA-R primer <400> 14 ctgcagaccc tctacccacc tggatcggcc tc 32 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p14ARF-CpG_island-F primer <400> 15 gtgggtccca gtctgcagtt aag 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p14ARF-CpG_island-R primer <400> 16 acttttcgag ggcctttcct ac 22 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax5-LexA-RPA-F primer <400> 17 gcatcagtcg cccttcgcct ccttctctcg 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax5-LexA-RPA-R primer <400> 18 gcgagggcgg aacgtgactt tgccctgcgg 30 <210> 19 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA_NEAT1 <400> 19 gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccauc aaucugcguu guggcaucaa 60 cguu 64 <210> 20 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA_NEAT1_2 <400> 20 gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuauc ucuaaccaac ccucuccccu 60 ucuuc 65 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NEAT1-F2 primer <400> 21 ctaaattgag cctccggtca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NEAT1-R2 primer <400> 22 acaagaaggc aggcaaacag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MY-0119 primer <400> 23 cactggtact gggagggatg 20 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MY-0129 primer <400> 24 cccttcaacc tgcatttcct ac 22 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH-dCas13a-F3 primer <400> 25 gagccaaaag ggtcatcatc tct 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH-dCas13a-R3 primer <400> 26 cacgatacca aagttgtcat gga 23 <210> 27 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cis region in mouse Cis gene promoter <400> 27 caactctagg agctcccgcc cagttttcct ggaaagttct tggaaatctg tcaaaggtgt 60 ttcctttctc ggtccaaagc actagacgcc tgcacccccg ttcccctccg ggccgccgca 120 aagcccgcgg ttctaggaag atgaggcttc cgggaa 156 <210> 28 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CisM region <400> 28 caactctagg agctcccgcc cagttggcct ggccagggct tggccatctg tcaaaggtgt 60 ttcctttctc ggtccaaagc actagacgcc tgcacccccg ttcccctccg ggccgccgca 120 aagcccgcgg ggctaggccg atgaggcggc caa 153 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCis_-259/-199_F primer <400> 29 caactctagg agctcccgcc 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCis_-188/-104_R primer <400> 30 ttcccggaag cctcatctt 19 <210> 31 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCis_-259/-199_mut_F primer <400> 31 caactctagg agctcccgcc cagttggcct ggccagggct tggccatctg tc 52 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCis_-188/-104_mut_R primer <400> 32 ggcccggccg cctcatcggc ctagccccgc gg 32 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 Primer RV primer <400> 33 caggaaacag ctatgac 17 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 Primer M4 primer <400> 34 gttttcccag tcacgac 17 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5-NGS-Lib-Promega-RPA-F primer <400> 35 atacggcgac caccgagatc tacactcttt ccc 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7-NGS-Lib-Promega-RPA-R primer <400> 36 caagcagaag acggcatacg agattctgac atg 33 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp14ARF-Ex1-F primer <400> 37 agtgagggtt ttcgtggttc ac 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hp14ARF-Ex1-R primer <400> 38 cctagacgct ggctcctcag ta 22

Claims (26)

  1. 표적 핵산을 상기 표적 핵산의 일부와 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 비표적 핵산으로부터 식별하여 검출하는 방법으로서,
    상기 비표적 핵산에서 상기 표적 핵산과 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 영역을 표적 영역으로 하고,
    상기 표적 핵산에서 상기 비표적 핵산과 염기 서열 또는 수식 상태가 다른 영역을 대응 표적 영역으로 하고,
    피험 핵산 시료를 주형으로 하고,
    상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역과 특이적으로 결합하는 분자(단, 핵산으로만 이루어지는 분자를 제외함.)의 존재하에서,
    상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머를 이용하여,
    상기 분자가 상기 비표적 핵산과 결합 가능한 온도 조건하에서 핵산 증폭 반응을 행하고, 증폭산물의 유무에 기초하여 상기 표적 핵산을 검출하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어진 경우, 상기 피험 핵산 시료에 상기 표적 핵산이 포함되어 있는, 표적 핵산의 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 반응을 65℃ 이하의 온도 조건하에서 행하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 반응이 등온 핵산 증폭 반응인, 표적 핵산의 검출 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 반응이 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)법인 것인, 표적 핵산의 검출 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 핵산 중의 상기 대응 표적 영역과 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역은 염기 서열이 다른, 표적 핵산의 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 표적 영역이 유전자 변이의 변이 부위 또는 유전자 다형의 다형 부위인, 표적 핵산의 검출 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자가 DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9 단백질과 gRNA의 복합체인, 표적 핵산의 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 gRNA가 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA를 특이적으로 인식하여 결합하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험 핵산 시료가 바이설파이트 처리된 것이며,
    상기 대응 표적 영역과 상기 표적 영역의 메틸화 상태에 차이가 있고, 바이설파이트 처리에 의해 상기 대응 표적 영역과 상기 표적 영역 사이에서 차이가 생기는 염기를 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자가 RNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas13a 단백질과 gRNA의 복합체인, 표적 핵산의 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 gRNA가 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 RNA를 특이적으로 인식하여 결합하는, 표적 핵산의 검출 방법.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 핵산 중의 상기 대응 표적 영역과 상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역은 수식 상태가 다른, 표적 핵산의 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 표적 핵산 중의 상기 대응 표적 영역이 CpG 메틸화 수식되어 있지 않은 영역이고,
    상기 비표적 핵산 중의 상기 표적 영역이 CpG 메틸화 수식되어 있는 영역이며,
    상기 분자가 CpG 메틸화 DNA 결합 단백질인, 표적 핵산의 검출 방법.
  15. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 표적 핵산의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
    상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머;
    DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9 단백질; 및
    gRNA를 가지는, 표적 핵산 검출용 키트.
  16. 제14항에 기재된 표적 핵산의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
    상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머; 및
    CpG 메틸화 DNA 결합 단백질을 가지는, 표적 핵산 검출용 키트.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    리콤비네이즈, 단일 가닥 DNA 결합 단백질 및 DNA 폴리머레이즈를 더 포함하는, 표적 핵산 검출용 키트.
  18. 제11항 또는 제12항에 기재된 표적 핵산의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
    상기 표적 핵산 및 상기 비표적 핵산 양쪽 모두와 하이브리다이즈하는 프라이머;
    RNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas13a 단백질; 및
    gRNA를 가지는, 표적 핵산 검출용 키트.
  19. 핵산 결합 분자를 검출하는 방법으로서,
    피험 시료, 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈 하는 프라이머를 이용하여 핵산 증폭 반응을 행하고,
    상기 피험 시료 중에 상기 핵산 결합 분자가 포함되어 있는 경우에는, 상기 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어지지 않으며, 상기 피험 시료 중에 상기 핵산 결합 분자가 포함되어 있지 않은 경우에는, 상기 핵산 증폭 반응에 의해 증폭산물이 얻어지는, 핵산 결합 분자의 검출 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 핵산 결합 분자가 염기 서열 특이적으로 핵산에 결합하는 분자인, 핵산 결합 분자의 검출 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 핵산 결합 분자가 CpG 메틸화 DNA 결합 단백질인, 핵산 결합 분자의 검출 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 결합 분자의 검출 방법에 이용되는 키트로서,
    핵산; 및
    상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 가지는, 핵산 결합 분자 검출용 키트.
  23. 피험 물질의 핵산에 대한 결합능을 평가하는 방법으로서,
    피험 물질, 상기 피험 물질의 핵산 결합능을 평가하는 대상의 핵산 및 상기 핵산과 하이브리다이즈 하는 프라이머를 이용하여,
    상기 피험 물질이 상기 핵산과 결합 가능한 온도 조건하에서 핵산 증폭 반응을 행하고,
    증폭산물이 얻어진 경우에는 상기 피험 물질은 상기 핵산에 대한 결합능을 가지지 않으며, 증폭산물이 얻어지지 않은 경우에는 상기 피험 물질은 상기 핵산에 대한 결합능을 가지고 있다고 평가하는, 핵산 결합능의 평가 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 피험 물질이 DNA 사슬 절단 활성 결손형 Cas9 단백질과 gRNA의 복합체인, 핵산 결합능의 평가 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 핵산이 CpG 메틸화 DNA인, 핵산 결합능의 평가 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 결합능의 평가 방법에 이용되는 키트로서,
    상기 피험 물질의 핵산 결합능을 평가하는 대상의 핵산; 및
    상기 핵산과 하이브리다이즈하는 프라이머를 가지는, 핵산 결합능 평가용 키트.
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