CN116042783A - 核酸扩增试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用在核酸扩增中的用途和核酸扩增试剂盒。本申请利用酵母蛋白同系物形成杂合二聚体，该二聚体具有保守的ATP结合域和催化ATP水解的能力，能促使酵母Rad蛋白置换与单链DNA结合的单链DNA结合蛋白，从而提高酵母Rad蛋白的链置换活性，介导引物与核酸模板间的链置换活性，提高酵母Rad蛋白对低丰度模板的亲和力，进而提高核酸等温扩增的特异性和灵敏度。

Description

核酸扩增试剂盒和应用

技术领域

本申请涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种核酸扩增试剂盒和应用。

背景技术

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是核酸扩增技术的典型代表。该技术是由美国PE～Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等于1985年发明的，它以线性DNA为模板进行复制反应。PCR反应通常在温度循环器(thermocycler)中进行，该装置可为PCR反应提供所需的高温、低温和中温环境。每次三个阶段构成一个循环。PCR反应每经过一个循环，目标基因的数目就扩增1倍。这样，在经过N次循环后，一个目标基因分子就可能被扩增到2^N个，由此对少量的目标基因进行指数式扩增放大后达到可检出的水平。PCR技术常被用于检测、鉴定传染性疾病、转基因鉴定及基因突变检测等各个方面。

由于PCR温度循环依赖性的特点，核酸扩增技术分为两大类：以PCR为代表的核酸非等温扩增技术，以及新一代核酸等温扩增技术。而核酸非等温扩增技术需要经过温度循环仪实现由高温变性-低温复性-中温延伸的三个基本反应步骤构成：模板DNA经90℃以上加热一段时间后，使得模板DNA双链变性而成为单链；模板DNA变成单链后，温度降至50～60℃，引物与模板单链互补配对；当温度升高至72℃左右，引物与模板单链的结合物在聚合酶的作用下以体系中的dNTPs为原料按照半保留复制原则进行链的延伸与合成。如此经过2～3小时即可实现目标基因片段的百万倍放大。

而区别于传统PCR技术，核酸等温扩增技术的特点是特定温度条件下即可实现靶核酸的指数式扩增，甚至可在45℃低温条件下也能实现核酸的高效扩增。核酸等温扩增反应的全过程均在同一温度下进行，对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备也能完成反应。因而，核酸等温扩增反应更能满足现代分子检测技术“快速简便”的需求，具有较大的实际应用价值。

近来，一系列新型的核酸等温扩增技术要么基于DNA/RNA生物合成机制研究的新发现，要么利用具有特殊功能的核酸酶，实现了核酸等温扩增目的。核酸等温扩增技术以DNA为扩增对象的“目标放大”技术为主，通过增加目标序列的拷贝数实现检测目的。典型的为发展较为的成熟的环介导的核酸等温扩增技术(LAMP)、单引物等温扩增技术(SPIA)、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HDA)、链替代扩增技术(SDA)、切刻内切酶核酸恒温扩增技术(NEMA)、以及参照了T4噬菌体DNA复制系统创建的一种新型的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、以及区别于RPA重组酶来源的重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)技术等。依赖于核酸序列的扩增技术(NASBA)是以RNA为扩增对象的“目标放大”技术，该技术扩增后产物同样为RNA。值得注意的是，滚环扩增技术(RCA)属于“信号放大”技术，该技术是通过检测到目标序列后获得的信号进行放大实现检测目的，滚环扩增技术(RCA)以DNA为扩增对象。

其中，LAMP技术作为一种新型的核酸扩增方法，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。

由于环介导等温扩增反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。但由于LAMP扩增时链置换合成，靶序列长度最好在300bp以内，大于500bp则较难扩增；由于其灵敏度高，操作过程中极易受到污染而产生假阳性结果；其在产物的回收、鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统PCR方法，扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断；虽然LAMP仪器更简单更便宜，但LAMP的引物设计难度高，试剂成本会相应高于qPCR；LAMP技术较难多重扩增；LAMP技术只能定性，不适合定量。

SPIA技术的核心是一条混合引物及可以切割DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由3'端DNA部分和5'端RNA部分组成。在反应过程中，RNaseH不断降解引物区DNA/RNA双链中的RNA部分，暴露出模板上与引物RNA部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。但SPIA的模板是单链核酸，如需进行双链核酸扩增，还需进行热变性处理，且引物设计复杂。

RCA技术虽然灵敏度高、扩增能力强，但RCA仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体的核酸扩增。

RPA/RAA技术虽在37～42℃反应温度下，通常只需少量核酸分子即可在3～10分钟内扩增至可检出水平，但这取决于靶标核酸的长度；而且该技术所需引物长度达到30～35bp，引物间更容易形成二聚体或产生非特异扩增；此外，由于该技术涉及的物料较多，用于RNA扩增时，RNA模板容易与体系中存在的物质形成复合物而影响RNA模板检测，亦或是部分逆转录酶与RPA中的辅助蛋白T4 UvsY相互抑制而影响逆转录的效率；另外，该技术反应体系较为粘稠，体系中物质分散不均匀，检测灵敏度受影响。

因此，如何满足提高核酸扩增效率、灵敏度和多重扩增等多种性能需求是核酸等温扩增方法改进的难点。

发明内容

为了解决上述问题，兼顾提高核酸扩增效率、灵敏度和多重扩增等多种性能需求，本申请的第一目的在于提供一种酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用在非疾病诊断和/或治疗目的的核酸扩增中的用途，酵母Rad蛋白具有链置换活性，酵母Rad蛋白杂合体具有ATP结合域和催化ATP水解活性。

本申请利用酵母蛋白同系物形成杂合二聚体，该二聚体具有保守的ATP结合域和催化ATP水解的能力，能促使酵母Rad蛋白置换与单链DNA结合的单链DNA结合蛋白，从而提高酵母Rad蛋白的链置换活性，介导引物与模板间的链置换，以及增强酵母Rad蛋白对低丰度模板的亲和力，以此提高扩增效率和灵敏度。

其中一个实施例中，酵母Rad蛋白杂合体包括酵母Rad55蛋白和酵母Rad57蛋白组合形成的二聚体；和/或

酵母Rad蛋白包括酵母Rad51蛋白。

其中一个实施例中，在核酸扩增过程中，酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白还与酵母RecQ解旋酶、单链DNA结合蛋白、Bsu DNA聚合酶和逆转录酶中的至少一种联合使用。

其中一个实施例中，核酸扩增满足以下特征中(1)～(2)的至少一个：

(1)核酸扩增的对象包括DNA和RNA中的至少一种；

(2)核酸扩增的反应条件包括：扩增温度为20℃～45℃，扩增时间为10～40min。

其中一个实施例中，当核酸扩增的对象为DNA时，核酸扩增的反应条件包括：扩增温度为20℃～45℃，扩增时间为10～40min；

当核酸扩增的对象为RNA时，核酸扩增的反应条件包括：扩增温度为37℃～45℃，扩增时间为10～40min。

本申请的第二目的在于提供一种核酸扩增试剂盒，包括酵母Rad蛋白和酵母Rad蛋白杂合体，酵母Rad蛋白具有强链置换活性，酵母Rad蛋白杂合体具有ATP结合域和催化ATP水解活性。

其中一个实施例中，核酸扩增试剂盒满足以下特征(1)～(4)中的至少一个：

(1)酵母Rad蛋白杂合体包括酵母Rad55蛋白和酵母Rad57蛋白组合形成的二聚体；

(2)酵母Rad蛋白包括酵母Rad51蛋白；

(3)核酸扩增试剂盒包括酵母RecQ解旋酶、单链DNA结合蛋白、Bsu DNA聚合酶以及逆转录酶中的至少一种；

(4)核酸扩增试剂盒包括Tris缓冲液、氯化钾、氯化镁、氯化锌、聚乙二醇、DTT、ATP、磷酸肌酸、dNTPs、引物组合物、荧光探针或荧光染料、磷酸肌酸激酶以及RNA酶抑制剂中的至少一种。

其中一个实施例中，核酸扩增试剂盒中的各成分满足以下特征(1)～(25)中的至少一个：

(1)Tris缓冲液的pH值为8.2；

(2)Tris缓冲液的工作浓度为10mM～100mM；

(3)氯化钾的浓度为10mM～200mM；

(4)氯化镁2.5mM～20mM；

(5)氯化锌0.1mM～2mM；

(6)聚乙二醇质量体积分数为1％～10％；

(7)DTT的浓度为1mM～5mM；

(8)ATP的浓度为1mM～5mM；

(9)磷酸肌酸的浓度为10mM～100mM；

(10)dNTPs的浓度为0.1mM～1mM；

(11)引物组合物中每条引物的浓度为0.2μM～0.8μM；

(12)磷酸肌酸激酶的浓度10ng/μL～100ng/μL；

(13)逆转录酶的浓度为0.4U/μL～4U/μL；

(14)RNA酶抑制剂的浓度为0.1U/μL～1U/μL；

(15)酵母Rad蛋白的浓度为10ng/μL～300ng/μL；

(16)酵母Rad蛋白杂合体的浓度为10ng/μL～150ng/μL；

(17)单链DNA结合蛋白的浓度100ng/μL～1000ng/μL；

(18)酵母RecQ解旋酶的浓度10ng/μL～150ng/μL；

(19)Bsu DNA聚合酶的浓度30ng/μL～300ng/μL；

(20)聚乙二醇包括聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、聚乙二醇35000、聚乙二醇50000中至少一种；

(21)逆转录酶包括AMV逆转录酶和M-MLV逆转录酶中的至少一种；

(22)Bsu DNA聚合酶无5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性且具有5’-3’聚合酶活性和强链置换活性；

(23)荧光染料包括SYBR Green I、SYTO-9和SYTO-13荧光染料中至少一种；

(24)荧光探针包括exo荧光探针；

(25)引物组合物用于特异性扩增新冠病毒、甲型流感病毒H3N2、猴痘病毒、副流感病毒1型中的至少一种病原体的核酸。

其中一个实施例中，荧光探针满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：

(1)荧光探针含有寡核苷酸骨架，寡核苷酸骨架包含：

脱碱基核苷酸基团；

侧翼dT-荧光基团；和

dT-淬灭基团；

其中，dT-荧光基团与dT-淬灭基团之间连接有1～3个核苷酸且脱碱基核苷酸基团位于dT-荧光基团与dT-淬灭基团之间；荧光探针的3’端含有修饰基团以阻断荧光探针的延伸；

(2)荧光探针包括46-52个核甘酸，至少30个核苷酸位于脱碱基核苷酸基团的5’端，至少15个位于脱碱基核苷酸基团的3’端。

本申请的第三目的在于提供一种酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用在制备上述核酸扩增试剂盒中的用途。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例2中核酸扩增试剂盒对不同核酸的扩增结果；

图2为本申请实施例3中核酸扩增试剂盒的多重扩增结果；

图3为本申请实施例4中核酸扩增试剂盒的灵敏度检测结果。

具体实施方式

现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实施例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。

为了解决上述技术问题，本申请的第一方面提供了一种酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用在核酸扩增中的用途，所述酵母Rad蛋白具有链置换活性，所述酵母Rad蛋白杂合体具有ATP结合域和催化ATP水解活性。

本申请创造性发现，酵母蛋白同系物形成的杂合二聚体具有保守的ATP结合域和催化ATP水解，能促使具有强链置换活性的酵母Rad蛋白置换与单链DNA结合的单链DNA结合蛋白，从而通过克服单链DNA结合蛋白的抑制作用而刺激或催化酵母Rad蛋白的链置换活性，进而增强酵母Rad蛋白高效介导引物/模板的链置换活性，以及增强酵母Rad蛋白对低丰度模板的亲和力，以此提高扩增效率和灵敏度。

一些具体实施方案中，酵母Rad蛋白包括酵母Rad51蛋白。具体地，酵母Rad51蛋白是酵母Rad51基因编码，全长440氨基酸，是一种可与单链DNA形成核蛋白丝的ATP酶，与大肠杆菌RecA蛋白类似，具有重组酶活性和链置换活性，能入侵同源DNA序列。酵母Rad51蛋白可通过依赖ATP和单链DNA结合蛋白催化DNA链交换反应。在体外PCR扩增中，酵母Rad51蛋白可与单链的寡核苷酸引物结合形成Rad51-ssDNA细丝，并寻找同源DNA序列，然后入侵同源DNA序列，并将断裂的DNA末端与ssDNA配对，产生置换环(D-Loop)接头，实现引物序列与DNA双链间的链交换。断裂的DNA末端然后通过DNA聚合酶进行延申产生新的DNA产物。酵母Rad51蛋白与DNA结合的平均位点仅为3个核苷酸，可以从3’-5和5’-3’双向催化DNA链转移。

一些具体实施方案中，酵母Rad蛋白杂合体包括酵母Rad55蛋白和酵母Rad57蛋白组合形成的二聚体，该二聚体具有保守的ATP结合域和催化ATP水解的能力，能促进Rad51蛋白置换与单链DNA结合的单链DNA结合蛋白。

酵母Rad55蛋白和Rad57蛋白是酵母Rad51蛋白的同系物，基因序列上与酵母Rad51蛋白或RecA蛋白中Walker A和B的核心结构域序列相似，氨基酸序列上与酵母Rad51蛋白的ATP酶活性中心序列有20-30％相似性。酵母Rad55蛋白与Rad57蛋白相互作用形成高度稳定性的异源二聚体，该二聚体具有保守的ATP结合域和催化ATP水解的能力，通过克服单链DNA结合蛋白的抑制作用而刺激或催化Rad51的链置换活性，增强Rad51蛋白高效介导引物/模板的链置换和Rad51对低丰度模板的亲和力，以此提高扩增效率和灵敏度。

本申请发现在Rad55/Rad57蛋白杂合体的辅助作用下，酵母Rad51蛋白的链置换催化活性得到大大提升，可促进Rad51蛋白更高效地介导引物/模板的链置换，同时提高Rad51蛋白对低丰度模板的亲和力，而Rad51蛋白介导的发生于同源DNA链间的链置换具有高度特异性，从而使扩增结果更准确。相比于传统的PCR扩增技术，本申请的核酸扩增方法具有更高的扩增特异性、更高的扩增效率以及更高的灵敏度，还能满足多重扩增的需求。此外，本申请的核酸扩增方法不需要专业操作人员，也不受场地的限制，且操作简单、方便、反应时间短。

一些实施方案中，酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白还与酵母RecQ解旋酶、单链DNA结合蛋白、Bsu DNA聚合酶和逆转录酶中的至少一种联合使用。

酵母RecQ解旋酶是一类可解开核苷酸双链的酶，其氨基酸序列由多个同源序列构成。由N端向C端方向分别为解旋酶核心结构域、RecQ C端结构域、解旋酶RNase D保守结构域。结构域间相互协调共通执行解旋酶的运作机制。解旋酶核心结构域由高度保守氨基酸序列组成、含有7个保守区域，负责结合NTP、NTP水解和DNA结合。RecQ C端结构域中存在一个锌指结构，可特异性结合锌离子，该结构主要负责酶与核酸的结合、酶自身的折叠等作用。解旋酶RNase D结构域位于氨基酸序列的C端，可增强解旋酶对NTP的水解和解链活性。

单链结合蛋白(SSB，single strand DNA-binding protein)，又称DNA结合蛋白，是DNA复制所必须的。单链结合蛋白不属于酶，大肠杆菌细胞中的单链结合蛋白由4个相同的亚基组成，相对分子质量为74000，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位；DNA解旋后，DNA分子只要碱基配对，就有结合成双链的趋向。SSB结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区，防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质。SSB作用时表现协同效应，保证SSB在下游区段的继续结合。单链结合蛋白不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动，而是不停的结合、脱离单链DNA。

Bsu DNA聚合酶为缺失了5’-3’核酸外切酶结构域和3’-5’核酸外切酶结构域的大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，具有5’-3’聚合酶活性，链置换活性，但缺失5’-3’核酸外切酶活性和3’-5’核酸外切酶活性。

由于酵母Rad55/Rad57二聚体以ATP依赖性的方式介导Rad51实现DNA的链置换反应，该过程容易受到单链DNA模板的二级结构的强烈抑制。虽然单链DNA结合蛋白可以解除这种抑制，但也会竞争性结合单链DNA模板上的结合位点从而抑制Rad51的链置换活性。本申请利用Rad51蛋白及酵母Rad蛋白同系物的杂合体本身就具有单链DNA结合活性和单链DNA刺激性ATP酶活性的原理，在使用Rad55和Rad57同系物时，额外使用酵母RecQ解旋酶，并在体系中加入锌离子，有效增强酵母RecQ解旋酶的活性，并促进DNA模板二级结构的解链，以进一步促进Rad51蛋白的链置换活性，以此提高核酸等温扩增效率。

进一步，除了使用Rad51蛋白及其同系物实现了DNA的高效率扩增外，一些实施方案中，本申请在PCR扩增体系中加入了逆转录酶，且逆转录酶的加入不影响酵母Rad蛋白及酵母Rad蛋白同系物的活性，进而增加了对RNA的扩增能力。因此，本申请的方法既可用于DNA的扩增又可用于RNA的扩增。

相应的，本申请提供了一种核酸扩增方法，包括：获取核酸样本，通过酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用实现对核酸样本的等温扩增，所述酵母Rad蛋白具有链置换活性，所述酵母Rad蛋白杂合体具有ATP结合域和催化ATP水解活性。其中核酸样本的获取可以是已提取的核酸样本也可以是根据常规技术手段提取的核酸样本。

一些具体实施方案中，核酸样本包括DNA样本和RNA样本的至少一种。本申请的核酸扩增方法利用酵母Rad蛋白及其同系物实现了DNA样本的等温高效率扩增，此外，本申请通过在PCR扩增体系中加入逆转录酶，还可以增加对RNA样本的扩增能力。

一些实施方案中，当核酸样本为DNA样本时，扩增温度为20℃～45℃，扩增时间为10～40min；当核酸样本为RNA样本时，扩增温度为37℃～45℃，扩增时间为10～40min。本申请的扩增方法既可用于DNA的等温快速扩增又可用于RNA的等温快速扩增，并提高其扩增效率。

相应的，本申请的第二方面提供了一种核酸扩增试剂盒，包括酵母Rad蛋白和酵母Rad蛋白杂合体。

一些具体实施方案中，酵母Rad蛋白杂合体包括酵母Rad55蛋白和酵母Rad57蛋白组合形成的二聚体。

一些具体实施方案中，酵母Rad蛋白包括酵母Rad51蛋白。

一些具体实施方案中，核酸扩增试剂盒包括酵母RecQ解旋酶、单链DNA结合蛋白、Bsu DNA聚合酶以及逆转录酶中的至少一种。

一些具体实施方案中，核酸扩增试剂盒包括Tris缓冲液、氯化钾、氯化镁、氯化锌、聚乙二醇、DTT、ATP、磷酸肌酸、dNTPs、引物组合物、荧光探针或荧光染料、磷酸肌酸激酶以及RNA酶抑制剂中的至少一种。

一些实施方案中，聚乙二醇包括聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、聚乙二醇35000、聚乙二醇50000中至少一种。其中，聚乙二醇10000是指平均分子量为10000的聚乙二醇，其他聚乙二醇同理。

一些实施方案中，逆转录酶包括AMV逆转录酶和M-MLV逆转录酶中的至少一种。

一些实施方案中，Bsu DNA聚合酶无5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性且具有5’-3’聚合酶活性和强链置换活性，用于对链置换后的核酸进行延伸。

一些实施方案中，荧光染料包括SYBR Green I、SYTO-9和SYTO-13荧光染料中至少一种。

一些实施方案中，本申请的核酸扩增试剂盒含有用于特异性扩增新冠病毒、甲型流感病毒H3N2、猴痘病毒、副流感病毒1型中的至少一种病原体的核酸的引物组合物和荧光探针，以实现对上述病原体的检测。

一些实施方案中，本申请的核酸扩增试剂盒可以实现对不同病原体的多重扩增，特异性好，具体地，可以是对新冠病毒ORF1ab基因、甲型流感病毒H3N2的MP基因、猴痘病毒F3L基因进行多重特异性扩增。

一些实施方案中，荧光探针包括exo荧光探针，具体地，荧光探针含有寡核苷酸骨架，寡核苷酸骨架包含：

脱碱基核苷酸基团；侧翼dT-荧光基团；和

dT-淬灭基团；

其中，dT-荧光基团与dT-淬灭基团之间连接有1～3个核苷酸且脱碱基核苷酸基团连接于dT-荧光基团与dT-淬灭基团之间。具体地，脱碱基核苷酸基团是指核苷酸脱去碱基后形成的基团或核苷酸脱去碱基后形成的基团的类似物。

一些实施方案中，荧光探针的3’端含有修饰基团以阻断荧光探针的延伸。

一些实施方案中，荧光探针包括46-52个核甘酸，至少30个核苷酸位于脱碱基核苷酸基团的5’端，至少15个位于脱碱基核苷酸基团的3’端。一些实施方案中，Tris缓冲液的pH值为8.2，以维持扩增反应体系pH值的稳定性。

一些实施方案中，Tris缓冲液的工作浓度为10mM～100Mm。进一步为30mM～100Mm。更进一步为50mM～100Mm。更进一步为70mM～100Mm。

一些实施方案中，氯化钾的浓度为10mM～200mM。进一步为50mM～200Mm。更进一步为50mM～150Mm。更进一步为80mM～100Mm。

一些实施方案中，氯化镁的浓度为2.5mM～20mM。进一步为5mM～20mM。更进一步为10mM～20mM。更进一步为15mM～20mM。

一些实施方案中，氯化锌的浓度为0.1mM～2mM。进一步为0.2mM～1.8mM。更进一步为0.5mM～1.5mM。更进一步为0.8mM～1.2mM。

一些实施方案中，聚乙二醇质量体积分数为1％～10％。进一步为2％～10％。更进一步为5％～10％。更进一步为8％～10％。

一些实施方案中，DTT的浓度为1mM～5mM。进一步为2mM～5mM。更进一步为3mM～5mM。更进一步为4mM～5mM。

一些实施方案中，ATP的浓度为1mM～5mM。进一步为2mM～5mM。更进一步为3mM～5mM。更进一步为4mM～5mM。

一些实施方案中，磷酸肌酸的浓度为10mM～100mM。进一步为30mM～100Mm。更进一步为50mM～100Mm。更进一步为70mM～100Mm。

一些实施方案中，dNTPs的浓度为0.1mM～1mM。进一步为0.3mM～1mM。更进一步为0.5mM～1mM。更进一步为0.8mM～1mM。

一些实施方案中，引物组合物中每条引物的浓度为0.2μM～0.8μM。进一步为0.4μM～0.8μM。更进一步为0.6μM～0.8μM

一些实施方案中，磷酸肌酸激酶的浓度10ng/μL～100ng/μL。进一步为30ng/μL～100ng/μL。更进一步为50ng/μL～100ng/μL。更进一步为80ng/μL～100ng/μL。

一些实施方案中，逆转录酶的浓度为0.4U/μL～4U/μL。进一步为1U/μL～4U/μL。更进一步为2U/μL～4U/μL。更进一步为3U/μL～4U/μL。

一些实施方案中，RNA酶抑制剂的浓度为0.1U/μL～1U/μL。进一步为0.3U/μL～1U/μL。更进一步为0.5U/μL～1U/μL。更进一步为0.8U/μL～1U/μL。

一些实施方案中，酵母Rad蛋白的浓度为10ng/μL～300ng/μL。进一步为50ng/μL～300ng/μL。更进一步为100ng/μL～300ng/μL。更进一步为150ng/μL～300ng/μL。

一些实施方案中，酵母Rad蛋白杂合体的浓度为10ng/μL～150ng/μL。进一步为30ng/μL～150ng/μL。更进一步为80ng/μL～150ng/μL。更进一步为100ng/μL～150ng/μL。更进一步为120ng/μL～150ng/μL。

一些实施方案中，单链DNA结合蛋白的浓度100ng/μL～1000ng/μL。进一步为300ng/μL～1000ng/μL。更进一步为500ng/μL～1000ng/μL。更进一步为800ng/μL～1000ng/μL。

一些实施方案中，酵母RecQ解旋酶的浓度10ng/μL～150ng/μL。进一步为30ng/μL～150ng/μL。更进一步为80ng/μL～150ng/μL。更进一步为100ng/μL～150ng/μL。更进一步为120ng/μL～150ng/μL。

一些实施方案中，Bsu DNA聚合酶的浓度30ng/μL～300ng/μL。进一步为50ng/μL～300ng/μL。更进一步为100ng/μL～300ng/μL。更进一步为100ng/μL～300ng/μL。

为了得到上述核酸扩增试剂盒，本申请的第三方面提供了一种酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用在制备上述核酸扩增试剂盒中的用途，以提高核酸等温扩增的特异性和扩增效率。

具体地，核酸扩增试剂盒的扩增对象包括DNA和RNA中的至少一种。核酸扩增试剂盒的扩增反应条件包括：扩增温度为20℃～45℃，扩增时间为10～40min。本申请的核酸扩增试剂盒既可用于DNA的等温快速扩增又可用于RNA的等温快速扩增，并提高其扩增效率。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但本申请不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料，试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本实施例提供一种核酸扩增试剂盒，包括10mM-100mM Tris-HCl缓冲液、10mM-200mM氯化钾、2.5mM-20mM氯化镁、0.1mM-2mM氯化锌、1％-10％聚乙二醇、1mM-5mM DTT、1mM-5mM ATP、10mM-100mM磷酸肌酸、0.1mM-1mM dNTPs、0.2μM-0.8μM引物、10ng/μL-100ng/μL磷酸肌酸激酶、0.4U/μL-4U/μL逆转录酶、0.1U/μL-1U/μL RNA酶抑制剂、10ng/μL-300ng/μL酵母Rad51蛋白、10ng/μL-150ng/μL酵母Rad55蛋白、10ng/μL-150ng/μL酵母Rad57蛋白、100ng/μL-1000ng/μL单链DNA结合蛋白、10ng/μL-150ng/μL酵母RecQ解旋酶、30ng/μL-300ng/μL Bsu DNA聚合酶，其中，引物是指每条引物的浓度。各成分的购买途径如表1所示：

实施例2

本实施例以新型冠状病毒SARS-CoV-2为例，具体阐述了商业化恒温扩增试剂与本申请的核酸扩增试剂盒对RNA和DNA的扩增能力差异。本申请可以但不限于新型冠状病毒SARS-CoV-2的扩增检测。其他病毒性病原体也可用相似的方法进行扩增检测，针对不同的病原体，仅需根据对应病原体的核酸序列设计特异性引物即可实现。本实施例中的引物均由申请人设计，委托上海生工生物工程有限公司合成。

本实施例的扩增检测具体通过如下步骤实现：

基于新型冠状病毒N基因设计特异性引物，引物序列如下：

nCoVd-2019-N-F1：GCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTA

nCoVd-2019-N-R1：CTGTCAAGCAGCAGCAAAGCAAGAGCAGCATCA

在生物安全柜中使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0(Takara:9766)核酸提取试剂盒提取含新型冠状病毒基因全序列的假病毒(购自上海翌圣，货号为11900ES03)RNA。并同时以含新冠病毒N基因的质粒为模板进行链置换快速扩增反应。

用购自杭州众测生物的RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)进行RNA和DNA的扩增，该试剂包括A buffer和B buffer，利用A buffer和B buffer配置复溶液，复溶液体系包括如表2所示的组分：

表2

体系配制好后，每个冻干反应管中加入48μL复溶液，复溶后再加入2μL核酸模板构成复溶液反应体系。

本实施例的核酸扩增试剂盒和核酸模板混合后构成的反应体系，其成分和浓度如表3所示：

表3

在荧光定量PCR仪上同时进行加入有模板的两种反应体系的反应，反应温度为39℃，反应时间30min，每30sec采集一次荧光。

扩增结果具体如图1所示，商业化RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)和本申请的核酸扩增试剂盒对质粒和RNA模板均有扩增信号。如图1中所示的1号扩增曲线、2号扩增曲线、3号扩增曲线和4号扩增曲线，本申请的核酸扩增试剂盒对质粒的扩增(图1中1号扩增曲线)起峰时间早于商业化的RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)对质粒扩增的起峰时间(图1中2号扩增曲线)，本申请的核酸扩增试剂盒对RNA的扩增(图1中3号扩增曲线)起峰时间早于商业化的RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)对RNA扩增的起峰时间(图1中4号扩增曲线)。上述实验结果说明不论是对质粒还是RNA，本申请的核酸扩增试剂盒均较RAA试剂扩增效率高。

实施例3

本实施例以新冠病毒、甲型流感病毒H3N2、猴痘病毒的检测为例，具体阐述多重链置换常温核酸快速扩增的过程。本申请可以实现但不限于对这三个病原体的检测，其他的病原体也可以用相似的方法进行检测。在本实施例中，既包括了RNA病毒新冠病毒和甲型流感病毒H1N1-2009，也包括了DNA病毒猴痘病毒。针对不同的微生物病原体，只需针对病原体的基因序列设计特异性引物和探针即可，本实施例的引物由申请人设计，委托上海生工合成。

本实施例的核酸检测具体通过如下步骤实现：

选择新冠病毒ORF1ab基因、甲型流感病毒H3N2的MP基因、猴痘病毒F3L基因，进行BLAST分析并分别设计特异性链置换引物。所设计的引物仅对相应的基因进行有效的链置换扩增。

引物序列如下：

检测新冠病毒ORF1ab引物序列：

nCovd-ORF1ab-F:GTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCT

nCovd-ORF1ab-R:ACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAGCATGGGTT

nCovd-ORF1ab-Probe:CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTG[[FA M-dT]]A[THF]T[BHQ1-dT]GTGATCAACTCCGCG[C3 Spacer]

检测甲型流感病毒H3N2的引物序列：

H3N2-F:TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGA

H3N2-R:ACCCTAAAATCCCCTTAGTCAGAGGTGACAGA

H3N2-Probe:TCTTTGCTGGGAAAAACACAGATCTTGAGGC[VIC-dT][TH F][BHQ1-dT]CATGGAATGGCTAAAG[C3 spacer]

检测猴痘病毒的引物序列：

MPXV-F:CTAATGATGACATAACTAAGAAGTTTATCTACA

MPXV-R:TAACTCTCCTACATTTTATGCCTGTGTAGACAT

MPXV-Probe:CCAATTTAGCTGCATTATTTTTAGCATCTCG[CY5-dT][THF][BHQ2-dT]AGATTTTCCATCTGCC[C3 spacer]

在生物安全柜中使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0(Takara:9766)核酸提取试剂盒提取含新型冠状病毒基因全序列的假病毒(上海翌圣：11900ES03)、甲型H3N2流感病毒核糖核酸(H3N2 RNA)液体室内质控品(广州邦德盛：BDS-IQC-342)RNA以及猴痘病毒脱氧核糖核酸液体室内质控品(广州邦德盛：BDS-IQC-373)的DNA。

本实施例的核酸扩增试剂盒和待测核酸模板混合后形成的反应体系，其成分和浓度如下表4所示：

表4

反应体系配制好后，盖上PCR管盖放入荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应温度为42℃，反应时间为30min，每30sec采集一次荧光。

多重扩增结果如图2所示，除NTC没有起峰以外，新冠病毒、甲型流感病毒H3N2、猴痘病毒均有扩增信号，这说明本申请的试剂可进行多重链置换扩增反应。

实施例4

本实施例以副流感病毒1型质粒的检测为例，具体阐述了链置换常温核酸快速扩增与对比试剂的分析灵敏度差异。本申请可以实现但不限于副流感病毒1型病原体的检测，其他的病原体也可以使用相似的方法进行分析。在本实施例中，副流感病毒1型靶基因的质粒由1ng/μL按照10倍浓度梯度往下稀释成10^-1ng/μL、10^-2ng/μL、10^-3ng/μL、10^-4ng/μL、10^{- 5}ng/μL、10^-6ng/μL、10^-7ng/μL作为扩增反应的样本进行对比分析。

本实施例对副流感病毒1型质粒的检测过程具体通过如下步骤实现：

选择副流感病毒1型的基因进行BLAST比对分析后设计特异性引物和exo探针。本实施例的引物由申请人设计，委托上海生工合成。

引物和探针序列如下：

HPIV1-F:CAATATATGCGTATTCATCAAACTTAATCACTC

HPIV1-R:CATGATTTCCTGTTGTCGTTGATGTCATAGGT

HPIV1-exoProbe:TTACAATTAGGTTACATATCCTTAAATTCAGA[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GTATCCTGATTTAAAC[C3 spacer]

用购自杭州众测生物的RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)添加exo III核酸外切酶质粒DNA的扩增，该试剂包括A buffer和B buffer，利用A buffer和B buffer配置复溶液体系配制如下：

表5

A buffer	29.4μL
		B buffer	2.5μL
10μM上游引物	2μL
		10μM下游引物	2μL
NF-Water	11.1μL
		Exo III	1μL
体积	48μL

体系配制好后，每个冻干反应管中加入48μL复溶液，复溶后在加入2μL核酸模板。

本实施例的核酸扩增试剂盒和模板混合后形成的反应体系，其成分和浓度如下表6所示：

表6

两种反应体系配制好后，盖上PCR管盖放入荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应温度为42℃，反应时间为30min，每30sec采集一次荧光。

本实施例的灵敏度分析结果如图3所示，商业化的RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)添加exo III核酸外切酶对质粒DNA进行扩增，仅能做到10^-6ng/μL的质粒浓度，具体如图3A所示，但本申请的核酸扩增试剂盒可做到10^-7ng/μL的浓度质粒，具体如图3B所示，这说明本申请的核酸扩增试剂盒优于某厂家的RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用在非疾病诊断和治疗目的的核酸扩增中的用途，所述酵母Rad蛋白具有链置换活性，所述酵母Rad蛋白杂合体具有ATP结合域和催化ATP水解活性。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述酵母Rad蛋白杂合体包括酵母Rad55蛋白和酵母Rad57蛋白组合形成的二聚体；和/或

所述酵母Rad蛋白包括酵母Rad51蛋白。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，在核酸扩增过程中，所述酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白还与酵母RecQ解旋酶、单链DNA结合蛋白、Bsu DNA聚合酶和逆转录酶中的至少一种联合使用。

4.根据权利要求1～3任一项所述的用途，其特征在于，所述核酸扩增满足以下特征中(1)～(2)的至少一个：

(1)所述核酸扩增的对象包括DNA和RNA中的至少一种；

(2)所述核酸扩增的反应条件包括：扩增温度为20℃～45℃，扩增时间为10～40min。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，核酸扩增的对象为DNA，核酸扩增的反应条件包括：扩增温度为20℃～45℃，扩增时间为10～40min；或

核酸扩增的对象为RNA，核酸扩增的反应条件包括：扩增温度为37℃～45℃，扩增时间为10～40min。

6.一种核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括酵母Rad蛋白和酵母Rad蛋白杂合体，所述酵母Rad蛋白具有链置换活性，所述酵母Rad蛋白杂合体具有ATP结合域和催化ATP水解活性。

7.根据权利要求6所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂盒满足以下特征(1)～(4)中的至少一个：

(1)所述酵母Rad蛋白杂合体包括酵母Rad55蛋白和酵母Rad57蛋白组合形成的二聚体；

(2)所述酵母Rad蛋白包括酵母Rad51蛋白；

(3)所述核酸扩增试剂盒还包括酵母RecQ解旋酶、单链DNA结合蛋白、Bsu DNA聚合酶以及逆转录酶中的至少一种；

(4)所述核酸扩增试剂盒还包括Tris缓冲液、氯化钾、氯化镁、氯化锌、聚乙二醇、DTT、ATP、磷酸肌酸、dNTPs、引物组合物、荧光探针、荧光染料、磷酸肌酸激酶以及RNA酶抑制剂中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂盒中的各成分满足以下特征(1)～(25)中的至少一个：

(1)Tris缓冲液的pH值为8.2；

(2)Tris缓冲液的工作浓度为10mM～100mM；

(3)氯化钾的浓度为10mM～200mM；

(4)氯化镁2.5mM～20mM；

(5)氯化锌0.1mM～2mM；

(6)聚乙二醇质量体积分数为1％～10％；

(7)DTT的浓度为1mM～5mM；

(8)ATP的浓度为1mM～5mM；

(9)磷酸肌酸的浓度为10mM～100mM；

(10)dNTPs的浓度为0.1mM～1mM；

(11)引物组合物中每条引物的浓度为0.2μM～0.8μM；

(12)磷酸肌酸激酶的浓度10ng/μL～100ng/μL；

(13)逆转录酶的浓度为0.4U/μL～4U/μL；

(14)RNA酶抑制剂的浓度为0.1U/μL～1U/μL；

(15)酵母Rad蛋白的浓度为10ng/μL～300ng/μL；

(16)酵母Rad蛋白杂合体的浓度为10ng/μL～150ng/μL；

(17)单链DNA结合蛋白的浓度100ng/μL～1000ng/μL；

(18)酵母RecQ解旋酶的浓度10ng/μL～150ng/μL；

(19)Bsu DNA聚合酶的浓度30ng/μL～300ng/μL；

(20)聚乙二醇包括聚乙二醇10000、聚乙二醇20000、聚乙二醇35000、聚乙二醇50000中至少一种；

(21)逆转录酶包括AMV逆转录酶和M-MLV逆转录酶中的至少一种；

(22)Bsu DNA聚合酶无5’-3’和3’-5’核酸外切酶活性且具有5’-3’聚合酶活性和强链置换活性；

(23)荧光染料包括SYBR Green I、SYTO-9和SYTO-13荧光染料中至少一种；

(24)荧光探针包括exo荧光探针；

(25)引物组合物用于特异性扩增新冠病毒、甲型流感病毒H3N2、猴痘病毒、副流感病毒1型中的至少一种病原体的核酸。

9.根据权利要求8所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光探针满足以下特征(1)～(2)中的至少一个：

(1)所述荧光探针含有寡核苷酸骨架，所述寡核苷酸骨架包含：

脱碱基核苷酸基团；

侧翼dT-荧光基团；和

dT-淬灭基团；

其中，dT-荧光基团与dT-淬灭基团之间连接有1～3个核苷酸且脱碱基核苷酸基团位于dT-荧光基团与dT-淬灭基团之间；荧光探针的3’端含有修饰基团以阻断荧光探针的延伸；

(2)所述荧光探针包括46-52个核甘酸，至少30个核苷酸位于脱碱基核苷酸基团的5’端，至少15个位于脱碱基核苷酸基团的3’端。

10.酵母Rad蛋白杂合体和酵母Rad蛋白联合使用在制备权利要求6～9任一项所述的核酸扩增试剂盒中的用途。

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