KR20170012552A - 메틸화 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대체로 핵산 메틸화, 구체적으로 DNA 및 RNA 메틸화를 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 향상된 감도로, 부분 메틸화된 DNA 또는 RNA의 시토신 메틸화를 정성적으로 또는 정량적으로 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 제한없이, DNA 또는 RNA 메틸화 변화를 특징으로 하는 발달성 표현형의 모니터링 또는 병태의 진단을 포함한 다양한 응용 분야에서 유용하다.
Description
본 발명은 대체로 핵산 메틸화, 구체적으로 DNA 및 RNA 메틸화를 평가하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 향상된 감도로, 부분 메틸화된 DNA 또는 RNA의 시토신 메틸화를 정성적으로 또는 정량적으로 평가하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 제한없이, DNA 또는 RNA 메틸화 변화를 특징으로 하는 발달성 표현형의 모니터링 또는 병태의 진단을 포함한, 다양한 응용 분야에서 유용하다.
임의의 종래 출판물(또는 그로부터 유추된 정보), 또는 임의의 공지 사안에 관한 본 명세서에서의 참조는 그러한 종래 출판물(또는 그로부터 유추된 정보) 또는 공지 사안이 이 명세서가 관련된 노력 분야의 통상적인 일반 상식의 일부를 형성하는 임의 형태의 제안 또는 인정 또는 승인으로서 받아들이는 것이 아니고, 그렇게 해서도 안된다.
본 명세서에서 작가가 인용하는 출판물의 서지 사항은 설명의 끝부분에 알파벳 순으로 모아두었다.
DNA 메틸화은 포유동물에서 가장 열심히 연구되는 후성적 개질 중 하나이고 시토신(C) 또는 아데닌 뉴클레오티드에 메틸(CH3) 기의 부가를 의미한다. 이 메틸 기는 시토신 염기의 5번째 탄소 원자 또는 아데닌 염기의 6번째 질소 원자에 부가될 수 있다.
DNA 메틸화는 동물 세포의 유전자 조절에서 그 역할을 한다. 활성 유전자 전사와 저메틸화 간에 상관성이 있을 뿐만 아니라, 형질감염 실험은 메틸 모이어티의 존재가 생체 내 유전자 발현을 억제함을 보여주었다. 또한, 유전자 활성화는 강력한 탈메틸화제인, 5-아자시티딘으로 세포를 처리하여 유도시킬 수 있다. 메틸화는 크로마틴 단백질 및 특이적 전사 인자 둘다와 DNA의 상호작용에 작용해 유전자 발현에 영향을 미치는 것으로 보인다. 메틸화 패턴은 체세포에서 매우 안정하지만, 초기 배아는 DNA 메틸화의 거대 변경을 특징으로 한다.
따라서, DNA 메틸화는 건강한 성장 및 발생에 필수적이고 다양한 프로세스 예컨대 유전체 각인, 발암작용 및 반복 성분의 억제와 연관된다. 또한 숙주에 진입하여 그 숙주를 손상시킬 수 있는 DNA의 다른 잠재적으로 위험한 서열과 함께, 레트로바이러스 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다. 또한, DNA 메틸화는 암 발생에서 중요한 역할을 하고 유전자 전사의 핵심 조절인자이다. 연구들은 고농도로 5-메틸 시토신을 함유하는 프로모터 영역을 갖는 유전자가 전사적으로 침묵함을 보여주었다.
모든 CpG의 60% 내지 90%가 포유동물에서 메틸화된다. 메틸화된 시토신 잔기는 시간 경과에 따라 자발적으로 탈아민화되어 T 잔기를 형성하며, 그에 따라 메틸 화된 CpG 디뉴클레오티드는 꾸준히 TpG 디뉴클레오티드로 탈아민화되며, 이는 인간 게놈에서 CpG 디뉴클레오티드의 과소표시로 입증되었다(그들 예상 빈도의 오직 21%로 발생된다). CpG는 전형적으로 많은 유전자의 5' 조절 영역에 존재하는, CpG 섬이라고 불리는 클러스터로 종종 그룹화된다.
DNA 메틸화 수준 모니터링의 진단적 유용성에 관한 증거들의 증가로, DNA 메틸화를 신뢰할만하게 정확히 평가하기 위한 수단이 점차로 중요하게 되었다. 현재는, 메틸화-특이적 PCR이 바이설파이트-전환된 DNA에서 메틸화된 DNA를 검출하기 위해 일반적으로 사용되는 방법이다. 이 방법에서, PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머가 시토신-포스포디에스테르-구아니딘[CpG] 부위에서 메틸화된 시토신 잔기를 찾는다. MethyLight PCR은 메틸화 특이적 프라이머 이외에도, 메틸화된 CpG 부위의 탐색을 위해 5'-3' 가수분해 프로브를 사용하여, 정량화할 수 있는 실시간 PCR의 별법이다.
보다 최근에, RNA가 또한 메틸화된 시토신 잔기뿐만 아니라 메틸화된 아데닌 잔기를 함유하는 것이 확인되었다(Liu and Jia, 2014; J Genet Genomics. 41(1):21-33). RNA에서 메틸화된 시토신의 생물학적 역할은 불분명하지만, mRNA에 풍부한 개질로서, 아마도 RNA 후성 마커일 것으로 제안되었다. 본 발명에 이르게 한 작업에서 소정 유전자의 메틸화 패턴 변화의 스크리닝을 기반으로 하는 일부 진단 분야에서, 진단 결과의 정확성이 부분 메틸화가 관심 CpG-풍부 표적 영역에 걸쳐 존재하는 경우에 유의하게 감소되는 것으로 확인되었다. 이는 통용되는 메틸화 특이적 PCR이 모든 표적 CpG 부위가 메틸화되어진 것을 필요로 하는 올리고뉴클레오티드를 기반으로 한다는 점에 기인한다. 예를 들어, Methylight 등의 프로브-기반 방법은 소정의 메틸화된 DNA 또는 RNA 표적의 성공적인 검출을 위한 프로브의 혼성화를 위해 모든 탐색되는 CpG 부위가 메틸화되어 있는 것을 요구한다. 1 이상의 CpG 부위가 메틸화되지 않은 경우에, 프로브는 결합할 수 없어서, 얻어진 결과는 왜곡되고 진단 감도를 상당히 감소시킨다. 예를 들어, 본 발명의 일 측면에서, IKZF1 유전자의 프로모터 영역의 메틸화는 대장암(colorectal cancer) 조직에서 높은 빈도로 일어나고 혈액에 존재하는 세포 무함유 DNA에서 메틸화된 IKZF1 DNA의 검출은 대장암의 존재를 시사하는 것으로 확인되었다. 그러나, 추가 연구들은, 일부 대장암 환자는 모든 표적 CpG 부위가 메틸화되지 않은 순환 종양-유래 IKZF1 DNA를 함유하는 것을 확인하였다. 따라서, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 IKZF1 DNA 내 메틸화된 CpG 부위를 포괄하도록 설계된 가수분해 프로브는 부분 메틸화된 IKZF1 DNA의 검출이 가능하지 않다. 따라서, 부분 메틸화된 IKZF1 DNA를 갖는 대장암 환자는 결과적으로 음성으로 보고된다.
따라서, DNA 또는 RNA 메틸화의 정확하고 민감한 검출을 가능케 하여, 신생물성 질환의 진단 또는 모니터링 등과 같은, DNA 또는 RNA 메틸화 분석 분야의 감도를 향상시킬 수 있는 개선된 방법을 개발할 필요가 존재한다. 추가 작업에서, 거짓 음성 결과의 문제는 관심의 소정 DNA 또는 RNA 영역 내에서 2 이상의 다른 메틸화 패턴을 공동으로 검출하도록 설계된 1 이상의 프로브 및/또는 프라이머의 사용을 통해 감소시키거나 또는 제거시킬 수 있음을 확인하였다.
본 명세서 전반과 뒤이어 나오는 청구항에서, 달리 문맥에서 요구하지 않으면, 단어 "포함하다", 및 이의 변형 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수의 군 또는 단계의 군을 포함함을 의미하는 것으로 이해하며 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수의 군 또는 단계의 군의 배제를 암시하는 것으로 이해하지 않는다.
본원에서 사용시, 용어 "∼에서 유도되는"은 특정 정수 또는 정수의 군이 명기된 종들에서 기원하지만, 반드시 명기된 공급원에서 직접 획득되는 것은 아님을 의미한다. 또한, 본원에서 사용시, "한", "하나" 및 "그"는 명확하게 문맥에서 언급하지 않으면 복수 지시대상을 포함한다.
달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가 중 한 명이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
대상 명세서는 참고 문헌 목록 이후에 본원에서 제시한, PatentIn 버전 3.5 프로그램을 사용해 준비된 뉴클레오티드 서열 정보를 함유한다. 각각의 뉴클레오티드 서열은 서열 식별자가 후속되는 번호 표시 <210>(예를 들어, <210>1, <210>2 등)를 통해 서열 목록에서 식별된다. 서열의 길이, 유형(DNA 등) 및 각 서열의 공급 유기체는 각각 번호 식별 분야 <211>, <212> 및 <213>로 제공된 정보로 표시된다. 명세서에서 언급되는 뉴클레오티드 서열은 서열 식별자가 후속되는 표시 서열번호(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2 등)로 식별된다. 명세서에서 언급되는 서열 식별자는 서열 식별자가 후속되는, 서열 목록의 번호 표시 분야 <400>(예를 들어, <400>1, <400>2 등)으로 제공되는 정보와 상관된다. 명세서에서 서열번호 1로서 상세히 표기한 것은 서열 목록에서 <400>1로 표시된 서열과 상관있다.
본 발명의 일 측면은 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법에 관한 것이고, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제(agent)와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향(전방향) 및 역방향(후방향) 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로(collectively) 혼성화할 수 있고 상기 프로브는 검출 수단이 도입(포함)된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력(detection output)을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
다른 측면에서 본 발명은 관심 DNA 또는 RNA 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법에 관한 것이고, DNA 또는 RNA 표적은 부분 시토신 메틸화 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) DNA 또는 RNA 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 유전자 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 유전자 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 유전자 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고, 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 유전자 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 유전자 BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP, CAHM, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 유전자는 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) DNA 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 DNA 샘플을
(a) 개질된 유전자의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고, 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 유전자를 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 바이설파이트제(bisulfite agent)와 접촉시켜 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고, 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 DNA 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법으로서, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 메틸화 특이적 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하고, 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
추가 측면에서, 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법으로서, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 바이설파이트제와 접촉시켜 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 메틸화-특이적 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 가수분해 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하는 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 DNA 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
다른 추가 측면에서, 본 발명은 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법에 관한 것이고, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 모든 완전 및 부분 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 유전자 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 유전자 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) DNA 샘플을 나트륨 바이설파이트와 접촉시켜 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 DNA 샘플을
(a) 개질된 유전자의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 메틸화 특이적 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 가수분해 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 메틸화 패턴이 다른 2 이상의 영역에 공동으로 혼성화하는 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 DNA 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 병태를 진단하거나 또는 모니터링하기 위한 방법으로서, 병태는 DNA 또는 RNA 표적의 시토신 메틸화의 조절을 특징으로 하고, DNA 또는 RNA 표적은 부분 메틸화의 영역을 특징으로 하며, 상기 방법은
(i) 상기 환자 유래의 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 개질된 유전자의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
도 1A는 Chr7:50304271-50304365에 존재하는 표적화된 IKZF1 영역의 부분 메틸화된 형태의 예를 제공한다. 상단: 기준 완전 메틸화된 IZKF1 표적 서열(바이설파이트-전환 및 PCR 증폭 후)이고, 메틸화된 시토신을 붉은색으로 강조하였다. 정방향 프라이머(서열번호 3), 역방향 프라이머(서열번호 4) 및 3개의 완전한 메틸화 CpG 부위를 필요로 하는 프로브의 위치를 표시하였다. 동정된 부분 메틸화된 표적 서열은 아래에 녹색 T로 표시하였다.
도 1B는 IKZF1 메틸화 특이적 PCR(메틸화 특이적 프라이머)을 사용해 3종의 임상 혈장 샘플에서 추출한 바이설파이트 전환된 DNA에서 동정된 IKZF1 샘플 서열 트레이스(traces)의 대표도이다. 3개 트레이스는 완전 메틸화된 IKZF1(좌측 패널), 완전 비메틸화된 IKZF1(중간 패널) 및 부분 메틸화된 IKZF1(우측 패널)의 존재를 예시한다. 피크는 검출된 염기에 대해 색상-코드화하였다(적색 = T; 흑색 = G; 녹색 = A; 청색 = C). 프로브 하에서 메틸화된 CG 염기의 위치는 그들 피크 위에 "CG"로 표시하였고, 바이설파이트 전환 및 PCR 증폭 후 TG로 전환된 비메틸화된 CG는 "TG"로 표시하였다.
도 2는 바이설파이트-전환 및 후속 PCR 증폭을 상세하게 설명하는 흐름도이다.
도 1B는 IKZF1 메틸화 특이적 PCR(메틸화 특이적 프라이머)을 사용해 3종의 임상 혈장 샘플에서 추출한 바이설파이트 전환된 DNA에서 동정된 IKZF1 샘플 서열 트레이스(traces)의 대표도이다. 3개 트레이스는 완전 메틸화된 IKZF1(좌측 패널), 완전 비메틸화된 IKZF1(중간 패널) 및 부분 메틸화된 IKZF1(우측 패널)의 존재를 예시한다. 피크는 검출된 염기에 대해 색상-코드화하였다(적색 = T; 흑색 = G; 녹색 = A; 청색 = C). 프로브 하에서 메틸화된 CG 염기의 위치는 그들 피크 위에 "CG"로 표시하였고, 바이설파이트 전환 및 PCR 증폭 후 TG로 전환된 비메틸화된 CG는 "TG"로 표시하였다.
도 2는 바이설파이트-전환 및 후속 PCR 증폭을 상세하게 설명하는 흐름도이다.
본 발명은 증폭 반응이 관심 DNA 영역의 가능한 메틸화 패턴의 적어도 2, 바람직하게는 전부에 공동으로 혼성화하도록 설계된 1 이상의 검출 프로브 또는 프라이머를 사용하여 설계된 경우에 부분 시토신 메틸화를 나타내는 DNA 또는 RNA 샘플의 정량적 PCR 메틸화 분석의 감도가 유의하게 향상될 수 있다는 확인에 대해 부분적으로, 근거를 둔다. 이러한 방법의 개발은 그렇지 않으면, 프로브 또는 프라이머가 높은 서열 유사성 수준을 나타낸다는 점에도 불구하고, 관심의 메틸화된 DNA 영역에 대한 가수분해 프로브 및 프라이머가 DNA의 증폭된, 바이설파이트 전환된 완전-메틸화된 형태에만 혼성화하고, DNA의 증폭된, 바이설파이트-전환된 부분 메틸화된 형태에는 혼성화하지 않는다는 점으로 인해, 부분 메틸화의 존재가 정량적 PCR-기반 메틸화-검출 검정법의 감도를 현저하게 감소시킨다는 놀라운 확인으로 인하여 필요하였다. 사실, 일부 진단 검정법은 지금까지, DNA의 부분 메틸화된 형태의 검출이 진단 검정법의 특이성을 모호하게 한다고 여겨졌던 점을 고려하여, DNA의 완전 메틸화된 형태만을 검출하도록 설계되었다. 그러나, 이제 일부 진단의 메틸화된 유전자 마커, 예컨대 대장암 마커 IKZF1는 사실 부분 메틸화된 형태를 나타낸다고 확인되었다. 그러한 형태는 전통적인 정량적 PCR 기술로 검출되지 않고 종래 기술을 사용해 얻은 결과는 감도가 감소된다는 것이 상당 비율일 수 있다.
본 발명의 방법의 개발은 이제 이전에 획득될 수 있었던 것보다 유의하게 더 높은 감도를 나타내는 메틸화 특이적 증폭 검정법의 일상적 응용을 가능하게 한다. 보다 구체적으로, 관심 영역의 가능한 부분 메틸화 패턴 범위에 대한 프로브 또는 프라이머의 불균질 풀의 사용, 또는 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 혼성화할 수 있는 그 혼성화 기능성에 있어 난잡한 프로브 또는 프라이머의 사용이 샘플에 존재하는 증폭된 완전 및 부분 메틸화된 DNA 또는 RNA 분자 둘다를 효과적으로 검출할 수 있어서, 검사의 감도가 향상될 수 있음을 확인하였다. 암 진단에서, 부분 메틸화를 검출할 수 없는 종래 방법의 사용으로 인한, 거짓 음성 결과는 환자에게 극도로 심각한 결과를 가져올 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 DNA 메틸화를 평가할 때 고도의 감도를 보장하는 단순하지만 강력한 수단을 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이고, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
"관심 핵산 표적"에 대한 언급은 그의 메틸화 상태를 분석하고자 하는, DNA 또는 RNA의 임의의 영역 또는 형태에 대한 언급으로 이해해야 한다. 이는, 예를 들어 유전자, 유전자의 일부분, 유전자간 영역 또는 프로모터일 수 있다. 이러한 목적을 위해, "유전자"에 대한 언급은 전체 길이 단백질 또는 단백질 단편이건 간에, 단백질 생성물을 코딩하는 DNA 또는 RNA 분자에 대한 언급으로 이해해야 한다. 그러나, 반드시 단백질 생성물을 생성하는 것으로 알려지지 않은 동정된 일부 유전자들도 존재함을 이해해야 한다. 본원에서 "유전자"에 대한 언급은 따라서, 양쪽 유형의 유전자에 대한 언급을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 게놈 DNA 또는 그로부터 전사되는 RNA의 관점에서, 유전자는 일반적으로 인트론 및 엑손 영역 둘다를 포함하는 것으로 예상한다. 대상의 관심 핵산 영역은 또한 임의의 특이적 유전자와 회합된 것으로 알려지지 않은 게놈 DNA의 일부분(예컨대 통상 일컫는 "정크" DNA 영역)일 수 있다. 관심 핵산 표적은 또한 게놈 DNA가 2 영역 또는 게놈 DNA의 1 영역과 외래 DNA의 영역 예컨대 바이러스 또는 도입된 서열 간 재조합에 의해 생성된 게놈 DNA(또는 RNA 전사 생성물)의 임의 영역일 수 있다. 분석 대상인 DNA는, 대체로 재조합 발현된 DNA, 예컨대 cDNA는 메틸화되지 않는다고 이해되지만, 반드시 게놈 DNA일 필요는 없다. 그럼에도, 본 발명은 메틸화될 수 있는 DNA 또는 RNA의 임의 형태 또는 공급원의 분석으로 확대됨을 이해해야 한다. 예를 들어, RNA와 관련하여, 1차 RNA, mRNA, tRNA, rRNA, tmRNA, snRNA, snoRNA, miRNA, 비코딩 RNA 또는 바이러스 RNA를 분석할 수 있다.
따라서, 본 발명은 보다 구체적으로, 관심 DNA 또는 RNA 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법에 관한 것이고, DNA 또는 RNA 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) DNA 또는 RNA 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
본 발명을 임의의 한 가지 이론 또는 작용 방식에 국한하지 않고, RNA 메틸화는 tRNA, rRNA, mRNA, tmRNA, snRNA, snoRNA, miRNA 비코딩 RNA, 및 바이러스 RNA를 포함한, 많은 상이한 RNA 종에서 일어난다. 상이한 촉매 전략이 다양한 RNA-메틸트랜스퍼라제에 의한 RNA 메틸화에 대해 적용된다. 번역후 개질로서, RNA 메틸화는 후성적 기전으로서 유의한 역할을 한다. N6-메틸아데노신(m6A)은 진핵생물에 존재하는 RNA 분자에서 가장 일반적이고 풍부한 메틸화 개질이지만, 5-메틸시토신(5-mC)도 역시 다양한 RNA 분자에서 흔히 일어난다. 최근의 데이터는 m6A 및 5-mC RNA 메틸화가 다양한 생물학적 과정, 예컨대 RNA 안정성 및 mRNA 번역의 조절에 영향을 주고, 비정상 RNA 메틸화가 인간 질환의 병인론의 원인이 된다는 것을 시사한다. RNA에서 메틸화된 시토신의 생물학적 역할이 완전하게 이해되지 않았지만, mRNA 풍부한 개질이다.
여전히, 본 발명을 임의의 방식으로 국한하지 않고, DNA 메틸화는 박테리아, 식물, 및 동물에서 보편적이다. DNA 메틸화는 세포 분열 라운드 동안 안정하지만 유기체의 기본 DNA 서열 변화를 포함하지는 않는 DNA의 화학적 개질 유형이다. 크로마틴 및 DNA 개질은 후성유전학의 중요한 2개 특징이고 세포 분화 과정에서 그 역할을 하여 동일한 게놈 재료를 함유함에도 세포가 안정하게 다른 특징들을 유지할 수 있게 한다. 진핵생물 유기체에서, DNA 메틸화는 시토신 피리미딘 고리의 5번 탄소에서만 일어난다. 포유동물에서, DNA 메틸화는 주로 CpG 디뉴클레오티드의 시토신의 5번 탄소에서 일어난다. CpG 디뉴클레오티드는 인간 게놈의 대략 1%를 포함한다.
모든 CpG의 70-80%가 메틸화된다. CpG는 많은 유전자의 조절 영역의 5'-말단에 전형적으로 존재하는 "CpG 섬"이라고 하는 클러스터로 분류될 수 있다. 많은 질환 과정 예컨대 암에서, 유전자 프로모터 및/또는 CpG 섬은 유전성 전사 침묵과 연관된, 비정상적인 과메틸화를 획득한다. DNA 메틸화는 2가지 방식으로 유전자 전사에 영향을 줄 수 있다. 첫 번째, DNA의 메틸화는 그 자체로 물리적으로 유전자와 전사 단백질의 결합을 방해하여, 전사를 차단할 수 있다. 두 번째, 메틸화된 DNA는 메틸-CpG-결합 도메인 단백질(MBD)로 알려진 단백질이 결합될 수 있다. MBD 단백질은 다음으로, 유전자좌로 추가 단백질, 예컨대 히스톤 디아세틸라제 및 히스톤을 개질시킬 수 있는 다른 크로마틴 리모델링 단백질을 동원하여, 침묵 크로마틴이라고 하는, 조밀한, 불활성화된 크로마틴을 형성한다. DNA 메틸화와 크로마틴 구조 사이의 이러한 연결성은 매우 중요하다. 구체적으로, 메틸-CpG-결합 단백질 2(MeCP2)의 손실은 레트 증후군에 연루되어 있고 메틸-CpG 결합 도메인 단백질 2(MBD2)는 암에서 과메틸화된 유전자의 전사 침묵을 매개한다.
인간에서, DNA 메틸화 과정은 3개 효소, DNA 메틸트랜스퍼라제 1, 3a 및 3b(DNMT1, DNMT3a, DNMT3b)에 의해 수행된다. DNMT3a 및 DNMT3b는 발생 초기에 DNA 메틸화 패턴을 설정하는 신규의 메틸트랜스퍼라제로 여겨진다. DNMT1은 DNA 복제 동안 딸 가닥에게로 DNA 메틸화 패턴을 복제시키는 것을 책임진다고 제안된 유지 메틸트랜스퍼라제이다. DNMT3L은 다른 DNMT3과 상동성이지만 촉매 활성은 없는 단백질이다. 대신, DNMT3L은 DNA에 결합하는 그들 능력을 증가시키고 그들 활성을 자극하여 신규의 메틸트랜스퍼라제를 보조한다. 마지막으로, DNMT2는 모든 DNA 메틸트랜스퍼라제에 공통인 모든 10개 서열 모티프를 함유하는, "수수께기" DNA 메틸트랜스퍼라제 상동체로서 동정되었지만, DNMT2는 DNA를 메틸화하지 않지만 대신 소형 RNA를 메틸화하는 것으로 확인되었다.
용어 "메틸화"는 따라서 핵산 영역, 예를 들어 게놈 DNA 또는 RNA의 시토신 또는 아데노신 염기에 DNA 메틸 트랜스퍼라제 효소의 작용에 의해 부가된 메틸 기의 존재를 의미하는 것으로 이해해야 한다.
일 실시형태에서, 상기 관심 핵산 표적은 DNA 또는 RNA 유전자 또는 유전자 영역, 예컨대 프로모터 영역이다. 그러므로, "유전자 표적"에 대한 언급은 메틸화가 조사(질문)되어진다는 점에서 유전자 또는 유전자 영역에 대한 언급으로서 이해해야 한다.
"유전자의 영역"에 대한 언급은 전체 유전자가 아닌 유전자의 일부분에 상응하는 DNA 또는 RNA의 임의 구간에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 분석되는 DNA는 예컨대 그의 단리 동안 단편화될 수 있거나, 또는 본 발명의 방법에 의해 분석하기 전에 예비 단계로서 절단될 수 있다. 예를 들어, GlaI은 IKZF1이 메틸화되면 특별한 부위에서 절단된다. 다음으로, 생성된 GlaI 단편은 적절한 프라이머를 사용해 증폭될 수 있고 본 발명의 축퇴성 프로브가 메틸화를 평가하는데 사용될 수 있다.
이러한 실시형태에서, 유전자 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 그 유전자 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역으로 특징될 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 유전자 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화될 수 있고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계로서, 핵산 샘플이 DNA 형태인 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 유전자 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 유전자 또는 유전자 영역은 포유동물 유전자 또는 유전자 영역이다.
추가 실시형태에서, 상기 유전자는 대장 신생물 마커이고, 보다 구체적으로 BCAT1, IKZF1, CAHM, GRASP, IRF4, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2이다.
이들 유전자는 유전자 명칭 및 인간 염색체 좌표 세트 둘다를 참조하여 본원에 명기한다. 유전자 명칭과 염색체 좌표는 당업자에게 잘 알려져 있고, 잘 이해되어 있다. 대체로, 유전자는 그의 서열 및 염색체 위치가 일상적으로 얻어질 수 있는 그의 명칭을 인용하거나, 또는 유전자 명칭 및 그 서열이 또한 통상 얻어질 수 있는 그의 염색체 좌표를 참조하여 식별될 수 있다.
"유전자"에 대한 언급은 이들 분자의 모든 형태 및 이의 단편 또는 변이체에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 일부 유전자는 개별 또는 단일 뉴클레오티드 다형성 간 대립유전자 변이를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러한 변이는 다양한 크기 및 단순 서열 반복부, 예컨대 디뉴클레오티드 및 트리뉴클레오티드 반복부의 삽입 및 결실, SNP를 포함한다. 변이체는 적어도 90%, 95%, 98%, 99% 서열 동일성을 공유하는, 즉 본원에 기술된 유전자에 대해서, 1 이상의 결실, 부가, 치환, 반전 서열 등을 갖는, 동일한 영역에서 유래된 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 진단 분야 관점에서, 실제 핵산 서열 간에 소수의 유전자 변이가 개체 간에 존재할 수 있다는 사실에도 불구하고 동일한 결과를 획득하는 그러한 변이체까지 확대되는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 임의의 다른 돌연변이, 다형성 또는 대립유전자 변이로부터 발생되는 모든 DNA 또는 RNA 형태로 확대됨을 이해해야 한다.
상기 상술한 유전자에 상응하는 GRCh38/hg38 염색체 좌표는 다음과 같다:
(1) BCAT1: chr12: 24810024-24949459
(2) IKZF1: chr7:50304083-50405100
(3) IRF4: chr6: 391739-411443
(4) GRASP: chr12: 52006945-52015889
(5) CAHM: chr6: 163413065-163413950
(6) SOX21: chr13:94709625-94712135
(7) SLC6A15: chr12: 84859488-84912829
(8) NPY: chr7: 24284188-24291865
(9) ST8SIA1: chr12: 22193391-22334714
(10) ZSCAN18: chr19: 58083842-58098363
(11) COL4A2: chr13: 110307284-110513026
(12) DLX5: chr7: 97020390-97024831
(13) FGF5: chr4: 80266588-80291017
(14) FOXF1: chr16: 86510527-86514464
(15) FOXI2: chr10: 127737274-127741186
(16) SDC2: chr8: 96493654-96611809
이들 유전자의 언급은 이들 유전자 각각의 전사 개시 부위의 5 kb 상류(upstream)를 포함하는 것을 이해해야 한다. 본 발명을 임의의 한가지 이론이나 작용 방식에 국한하지 않고, IKZF1이 대체로 chr7:50304782-50405100(어셈블리 GRCh38/hg38)을 포괄한다는 것을 이해한다. 이는 전사 개시 부위에서 폴리아데닐화 부위로 이어진다. 그러나, IKZF1 유전자는 추가의 5' 전사 개시 부위를 가지며, 그 좌표는 이 출발 부위를 포함하며 Chr7:50304083-50405100이다. 상류 CpG 섬이 또한 포함되면 좌표는 50303300-50405100이다.
이하에 보다 상세하게 설명하는 바와 같이, 본 발명은 한 유전자의 메틸화의 스크리닝에 적용되거나 그렇지 않으면 다중화 증폭 방법을 사용해 증폭된 단일 분취량으로 또는 본래 생물학적 샘플 유래의 DNA 또는 RNA의 개별 분취량의 증폭을 통해 1 초과의 유전자의 메틸화에 대해 소정 생물학적 샘플을 스크리닝하는데 적합화시킬 수 있다.
이하에 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 방법은 관심 부분 메틸화 DNA 또는 RNA 표적을 검출하기 위한 방법의 개발에 입각한다. "부분 메틸화"에 대한 언급은 그 DNA 표적의 완전 메틸화된 형태로 정상적으로 메틸화된 1 이상의 시토신이 부분 메틸화된 형태의 메틸화되지 않은 CpG-함유 DNA 표적을 언급하는 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시형태에 있어서, Chr7:50304323-50304349에서 유전자 IKZF1의 완전 메틸화된 형태는 다음과 같다;
CCTGTAC mCGGAGCAG mCGATC mCGGGAGG
여기서 mC는 메틸화된 시토신을 나타내고 C는 비메틸화 시토신을 나타낸다.
IKZF1 DNA 서열의 이러한 영역의 가능한 부분 메틸화된 형태의 범위는 다음과 같다:
임의의 소정 생물학적 샘플이 IKZF1의 이들 부분 메틸화된 형태의 전부 또는 오직 일부를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, IKZF1 실시형태에 있어서, 상기에 동정된 서열들은 IKZF1 유전자의 Chr7:50304323-50304349 영역의 이들 가능한 부분 메틸화된 형태를 나타낸다. 그러나, IKZF1 유전자의 다른 영역이 부분 메틸화, 예컨대 IKZF1 유전자에 존재하는 다른 CpG 섬(chr7:50303300-50304923 및 chr7:50399869-50400702)을 나타낼 수 있음을 또한 이해해야 한다. "부분 메틸화"의 해당 의미는 임의의 관심 표적, 예컨대 임의 유전자, 전사 생성물 또는 다른 DNA 또는 RNA 표적, 예컨대 mRNA에 적용되는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 분석을 위해 선택된 DNA 또는 RNA 영역은 아마도 부분 메틸화를 나타내는 DNA 또는 RNA 표적의 개별 영역을 반영하게 됨을 당업자는 이해할 것이다. DNA 또는 RNA 표적의 부분 메틸화의 모든 영역이 반드시 분석되어야 할 필요가 있는 경우는 아니다.
본 발명의 방법에 의해 조사되는 핵산 표적은 부분 메틸화의 영역이 특징"일 수도 있는" 것이다. "∼일 수도 있다"에 대한 언급은 검사 대상인 핵산 샘플이 실제로 부분 메틸화된 서열을 포함할 수도 또는 포함하지 않을 수도 있음을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 본 발명을 임의의 한 가지 이론 또는 작용 방식에 국한하지 않고, 소정 유전자가 부분 메틸화된 변이를 나타낼 수도 있다는 사실은 분석된 모든 생물학적 샘플에서 1 이상의 부분 메틸화된 형태가 관찰될 것임을 의미하지 않는다. 그 보다는, 부분 메틸화의 존재 및 정도는 분석되는 샘플의 성질, 쟁점 질환 상태의 성질, 병기의 중증도 등과 같은 요인들에 좌우될 수 있다. 그러나, 당업자가 쟁점 유전자의 부분 메틸화된 형태가 검사되는 핵산 샘플에 존재하는지 여부를 미리 반드시 결정할 필요는 없다. 그 보다는, 프로브가 지정되는 서열이 기지이고 따라서 이론적으로 가능한 부분 메틸화가 모든 과돌연변이에 혼성화하는 프로브 풀을 생성시킬 수 있으므로 임의 샘플에 본 발명의 방법을 단순하게 적용시킬 수 있다. 충분한 프라이머 및 프로브 분량이 사용되는 한 검사되는 DNA 샘플이 실제로 완전 메틸화되는지 또는 부분 메틸화되는지 여부에 있어서(그리고 존재할 수 있는 부분 메틸화된 형태의 범위에 무관하게), 혼성화되지 않은 과량의 프라이머 또는 프로브의 존재는 혼성화되어 측정된 프라이머 및 프로브에서 얻은 결과에 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 다른 실시형태에서, DNA 표적은 BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP, CAHM, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2이다.
이러한 실시형태에 따라서, 유전자 BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP, CAHM, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 유전자는 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있으며, 상기 방법은
(i) DNA 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 DNA 샘플을
(a) 개질된 유전자의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 유전자를 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 유전자는 IKZF1이다.
본 발명의 방법에 따라서 검사된 핵산은 생물학적 샘플에서 단리할 수 있다. "생물학적 샘플"에 대한 언급은 제한없이, 세포 물질, 생체유체(예를 들어, 혈액, 소변, 타액), 대변, 조직 생검 표본, 외과적 표본 또는 체내에 유입시켜 이후 제거되는 유체(예컨대, 예를 들어 관장 세척으로 회수되는 용액)를 포함하여, 임의 공급원, 예컨대 동물, 식물 또는 박테리아에서 유도되는 생물학적 물질의 임의 샘플에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 본 발명의 방법에 따라서 검사되는 생물학적 샘플은 직접 검사되거나 또는 검사 전에 일부 처리 형태를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 생검 또는 외과적 샘플은 검사전에 균질화를 필요로 할 수 있다. 대안적으로, 세포 샘플은 검사 전에 투과성을 필요로 할 수 있다. 또한, 생물학적 샘플이 액체 형태인 결과로, (만약 그러한 형태가 검사를 필요로 하면), 샘플을 이동시키기 위해, 시약, 예컨대 완충액의 부가를 필요로 할 수 있다.
관심 핵산 영역이 생물학적 샘플에 존재하는 경우에, 생물학적 샘플은 직접 검사되거나 또는 아니면 생물학적 샘플에 존재하는 핵산의 전부 또는 일부는 검사 전에 단리될 수 있다. 또 다른 예에서, 샘플은 부분적으로 정제되거나 또는 아니면 분석 전에 농축될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 매우 다양한 세포 개체군을 포함한다면, 특정 관심 하위 개체군으로 농축시키는 것이 바람직할 수 있다. 그로부터 유도된 표적 생물학적 샘플 또는 분자는, 검사 전에, 처리, 예를 들어 생바이러스의 불활성화가 본 발명의 범주에 속한다. 또한 생물학적 샘플은 신선하게 수확되거나 또는 검사 전에 저장(예를 들어, 냉동에 의함)되거나 또는 아니면 검사 전에 처리(예컨대 배양 과정에 의함)될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 개시된 방법에 따라 검사하는데 어떠한 유형의 샘플이 가장 적합한가의 선택은 그 상황의 성질에 따라 좌우된다. 대장 신생물의 개시 또는 그러한 개시 소인에 대해 스크리닝하고자 하는 경우, 예를 들어, 상기 샘플은 바람직하게 대변(분변) 샘플, 관장 세척액, 외과적 절제물, 조직 생검 또는 혈액 샘플(예를 들어, 전혈, 혈청 또는 혈장)이다.
보다 바람직하게, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 생검 샘플 또는 분변 샘플이다.
본 발명의 방법은 증폭 기반 방법론을 통해서, 핵산 표적, 예컨대 DNA 또는 RNA의 시토신 메틸화 특징을 정확하게 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 수단을 제공한다. 본 발명의 방법을 적용함으로써, 그 결과는 특히 증폭 프라이머 또는 검출 프로브가 완전 메틸화된 핵산 서열에만 혼성화하고 상응하는 부분 메틸화된 서열에는 혼성화하지 않는다는 사실로 인해 야기되는 거짓 음성 결과의 생성에 기인하여, 임의의 소정 생물학적 샘플에서 부분 메틸화의 잠재적 존재로 인해 왜곡되지 않는다. 이 방법을 적용하는데 있어서, 증폭 및 탐색의 조합을 통해, DNA 서열의 메틸화를 조사하기 위해 설계된 기존의 임의 증폭 방법이 본 발명의 방법에 따라 적합화될 수 있다는 것을 당업자는 이해해야 한다. 예를 들어, 메틸화 특이적 프라이머 또는 비메틸화 특이적 프라이머를 사용하는 증폭 방법(예컨대 PCR)을 설계할 수 있다. 예시된 실시형태에 따라서, 메틸화 특이적 프라이머가 사용된다(예를 들어, 메틸화-특이적 PCR). 그러나, 비메틸화 특이적 프라이머는 메틸화 조사가 오로지 프로브의 사용으로 얻은 결과에만 의존적인 경우더라도, 사용될 수 있다. 유사하게, 사용되는 프로브에 있어서, 예시적인 실시형태는 실시간 PCR 정량을 얻을 수 있는, 가수분해 프로브를 사용한다. 그러나, 그러한 프로브가 사용되는 경우에도, 획득된 판독치를 정성적으로 분석하는데 충분할 수 있다. 다르게, 오직 정성적 판독치만을 제공하고 정량적 분석은 할 수 없는 프로브를 사용하도록 선택할 수 있다.
제1 단계에서, 분석 대상인 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시킨다. 본원에서 사용시 용어 "개질하다(modify)"는 작용제에 의해 비메틸화 시토신을 다른 뉴클레오티드로 전환시키는 것을 의미하고, 상기의 전환은 본래 핵산 샘플 내 메틸화된 시토신을 비메틸화된 것과 구별한다. 임의의 적합한 작용제가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 작용제는 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시키는 것, 예컨대 나트륨 바이설파이트이다. 그러나, 메틸화된 시토신이 아닌 비메틸화 시토신을 선택적으로 개질시키는 다른 균등한 개질제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이설파이트의 임의의 다른 적합한 형태, 예컨대 암모늄 바이설파이트를 사용할 수 있다. 나트륨 바이설파이트는 시토신의 5,6-이중 결합과 쉽게 반응하지만, 메틸화된 시토신과는 반응하지 않아서, 설폰화된 시토신 중간체를 생성시키고 이는 알칼리 또는 고온 조건 하에서 탈아민화를 겪어 우라실이 생성된다. Taq 중합효소는 티민으로서 우라실을 인식하고 시토신으로서 5-메틸시토신(m5C)을 인식하기 때문에, 나트륨 바이설파이트 처리 및 PCR 증폭의 순차적 조합은 궁극적으로 비메틸화 시토신 잔기의 티민으로의 전환(C→U→T) 및 메틸화된 시토산 잔기("mC")의 시토신으로의 전환(mC→mC→C)을 일으킨다. 따라서, 게놈 DNA의 나트륨 바이설파이트 처리는 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시켜 메틸화-의존적 서열 편차를 야기시킨다. 단계 (i)의 핵산과 프라이머의 혼성화에서, 프라이머는 개질된(예를 들어, 바이설파이트-전환된) DNA, 또는 그로부터 증폭된 DNA에 혼성화되도록 설계된다는 것을 이해해야 한다.
이러한 실시형태에 따라서, 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시키는 바이설파이트제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있고, 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 바이설파이트제는 바이설파이트 염, 예컨대 나트륨 바이설파이트 또는 암모늄 바이설파이트이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 핵산 표적은 유전자이고, 보다 바람직하게는 BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP 또는 CAHM, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 핵산 표적은 게놈 IKZF1 DNA이다.
비메틸화 시토신 잔기의 전환이 실시되면, 샘플은 증폭을 위해 준비된다. 분석 대상인 핵산 샘플이 DNA 샘플, 예컨대 게놈 DNA 샘플인 경우, 증폭 반응은 바이설파이트-전환된 샘플에 대해 직접 수행될 수 있다. 그러나, 관심 핵산 샘플이 RNA 샘플, 예컨대 mRNA 샘플인 경우, 단계 (ii)의 증폭 전에 RNA를 DNA로 전환시키는 것이 필요하다. 이는 당업자에게 잘 알려진 임의의 편리한 방법, 예컨대 RT-PCR에 의해 수행될 수 있다. 본 발명을 임의의 한 가지 이론 또는 작용 방식에 국한하지 않고, 이는 "1단계" 반응(예를 들어, 역전사효소 및 DNA 중합효소 활성 둘다를 갖는 Tth 중합효소) 또는 2개의 개별 효소 예컨대 역전사효소 및 열안정성 DNA 중합효소를 사용하는, "2단계 반응"으로 수행될 수 있다. "1단계" 반응에서, 이 방법을 여전히 2개 단계로 수행할 수도 있음을 당업자는 이해한다. 대체로, 역전사 단계는 실온 및 이후 정상 PCR 단계로 수행될 수 있다. 이러한 실시형태에 따라서, 전형적으로 주제의 RNA 샘플은 무작위 프라이머를 포함할 수도 있는 적합한 상보성 프라이머(들), 역전사효소 활성을 갖는 효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스파타제 및 적합한 완충제와 접촉시키는 방법 및 상보성 DNA(cDNA)를 생성시키는 항온반응 조건을 설계할 수 있다. 따라서, "단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태"와의 접촉에 대한 언급은 단계 (ii)에서 증폭되는 핵산 샘플이 DNA 형태라는 사실의 언급임을 이해해야 한다. 이러한 목적을 위해서, 단계 (i)의 핵산이 본래는 DNA 샘플이고, 단계 (ii)에서 즉시 사용할 수 있는 경우이더라도, 그럼에도 샘플을 증폭시켜서, 증폭 단계 (ii)를 적용하기 전에 그 양을 증가시키는 것이 바람직할 수 있음을 이해해야 한다. 샘플이 RNA인 경우, 단계 (ii) 증폭 전에 그 RNA를 DNA 형태로 전환시키기 위한 단계 예컨대 RT-PCR을 수행할 수 있다.
단계 (ii)의 증폭은 수많은 적합한 기술 중 임의의 하나를 사용해 달성할 수 있다. 예를 들어, 2 이상의 개별 유전자 또는 메틸화 영역을 표적으로 하는, 정방향/역방향 프라이머의 1쌍 이상이 사용되는 경우에, 모든 이들 프라이머를 단일 샘플에 도입시켜서 다중화 증폭 기술을 사용해 샘플을 증폭시킬 수 있다. 다르게, 단계 (i)의 샘플을 1 이상의 분취량으로 분배하도록 선택할 수 있고, 각 분취량은 개별 프라이머쌍을 사용해 증폭된다. 당업자는 오직 메틸화 영역만을 증폭시키도록 지정한, 프라이머의 복수 세트를 사용하지만 그 다중 프라이머가 네스티드 PCR 반응의 적용을 반영하도록 이 방법을 적합화하는데 선택될 수 있음을 이해해야 한다.
"프라이머"에 대한 언급은 뉴클레오티드의 서열, 그의 기능적 유도체 또는 유사체로서, 그 기능은 관심 메틸화 영역에 측접하는 상보성 DNA 서열과의 어닐링 및 어닐링 영역 하류의 DNA 서열의 증폭을 포함하는 것인 임의의 분자에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 프라이머는 비핵산 성분을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 프라이머는 또한 비핵산 태그 예컨대 형광 또는 효소 태그 또는 분자의 사용 또는 검출을 촉진하는 일부 다른 비핵산 성분을 포함할 수도 있다. 다른 예에서, 프라이머는 핵산 측쇄를 나타내는 펩티드 골격을 포함하는 단백질 핵산일 수 있다. 바람직하게, 상기 프라이머는 단일 가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에서 사용하기 적합한 프라이머의 디자인 및 합성은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일 실시형태에서, 대상 프라이머는 길이가 4 내지 60개 뉴클레오티드이고, 다른 실시형태에서는 길이가 10 내지 50개 뉴클레오티드이며, 또 다른 실시형태에서는 길이가 15 내지 45개 뉴클레오티드이고, 여전히 다른 실시형태에서는 길이가 20 내지 40개 뉴클레오티드이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머의 개수에 있어서, 이는 당업자가 결정할 수 있다. 프라이머의 총 개수와 관련하여, 고려가 필요한 변수는 증폭시키려는 핵산 영역의 크기 및 수 및 프라이머가 혼성화되는 서열 간 거리이다. 약 1 kb 보다 큰 PCR 단편을 증폭하기 위해서, 프라이머는 네스티드 PCR 방법에서 기능하고 대략 500 염기 간격에서 혼성화되도록 설계될 수 있다.
일 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 핵산의 상보성 가닥과 서열-특이적 혼성화할 수 있는 선형의, 단일 가닥 올리고머 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 분자이다. 프라이머는 바람직하게는 DNA이다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정 동안 특이적이고 효과적인 중합 개시(프라이머 연장)를 제공하기에 충분한 길이이다. 정확한 길이는 온도(증폭 동안), 완충액, 및 뉴클레오티드 조성을 포함한 복수의 요인들에 의존적이다. 바람직하게, 프라이머는 단일 가닥이지만 그 가닥이 처음에 분리되면 이중 가닥 프라이머를 사용할 수 있다. 프라이머는 임의의 적합한 방법, 예컨대 통상의 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법 또는 당분야에 공지인, 자동화 실시형태 등을 사용해 제조될 수 있다.
본원에서 사용시 특이적 프라이머는 바람직하게 관심 게놈 핵산의 각 가닥에 실질적으로 상보적이도록 설계된다. 전형적으로 하나의 프라이머는 유전자의 음(-)의 가닥(수평적으로 놓여진 이중 가닥 DNA 분자의 "아래" 가닥)이고 다른 것은 양(+)의 가닥("위" 가닥)에 상보적이다. 본 발명의 방법은 관심 유전자 표적이 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 관련 영역을 증폭하도록 설계될 수 있음을 이해해야 한다. 이와 관련된 예시들은 IKZF1의 내용에서 본원에 제공한다.
이하 본원에서 상세하게 설명하는 바와 같이, 본 발명의 방법에서 이용되는 프라이머는 관심 핵산 표적을 증폭하는 임의의 적합한 프라이머일 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 메틸화-특이적 프라이머 또는 비메틸화 특이적 프라이머일 수 있다. "메틸화-특이적" 프라이머는 메틸화된 DNA 및 비메틸화된 DNA, 예컨대 바이설파이트 전환된 메틸화된 DNA 대비 비메틸화된 DNA 사이를 구분할 수 있는 프라이머를 의미한다. 그러한 메틸화 특이적 프라이머는 메틸화된 DNA 및 비메틸화된 DNA를, 예를 들어, 오직 미전환된 5-메틸시토신과 혼성화(즉, 프라이머가 바이설파이트-전환된 메틸화된 DNA와 혼성화)하거나, 또는 반대로 비메틸화 시토신에서 전환된 티미딘에 혼성화(즉, 프라이머가 바이설파이트-전환된 비메틸화된 DNA와 혼성화)하여 구별할 수 있도록 설계될 수 있다. 그리하여 메틸화는 증폭을 달성할 수 있는 특이적 프라이머의 능력에 의해 확인된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 메틸화-특이적 구별을 성취하기 위해서, 프라이머는 바람직하게, DNA 메틸화의 잠재적 부위(CpG 디뉴클레오티드)가 중복되고 개질된 비메틸화된 DNA를 메틸화된 DNA와 특이적으로 구별하도록 설계된다. 예를 들어, 프라이머는 1개 내지 몇개의 CpG 서열, 바람직하게는 1 내지 5개 CpG 서열 또는 1 내지 4개 CpG 서열이 중복되도록 설계될 수 있다. 본원에서 예시하는 IKZF1 증폭에 있어서, 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 4개 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 IKZF1 서열의 영역에 혼성화되도록 설계된다. 바람직한 일 실시형태에서, 프라이머는 메틸화 특이적이다.
따라서, "부분 시토신 메틸화의 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된" 상기 프라이머의 언급은 프라이머가 대상 영역의 메틸화된 형태의 전부 또는 단지 일부를 증폭할 수 있고, 이후 이들 앰플리콘은 프로브에 의해 조사됨을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 프라이머가 비메틸화 특이적이면, 메틸화의 존재 또는 메틸화의 임의 정도와 무관하게 대상 영역의 모든 형태를 증폭하게 된다. 예를 들어, 프라이머는 그들이 부분 시토신 메틸화의 영역의 일부를 형성하는 CpG의 상류 및 하류에 위치하는 비메틸화된 DNA 영역에 혼성화되도록 설계될 수 있다. 이러한 상황에서, 프라이머는 그 프라이머가 비메틸화되었지만 시토신의 메틸화된 영역에 근접하여 위치하는 DNA 부위에 혼성화하도록 설계되었기 때문에 샘플에 존재하는 모든 핵산 분자의 이 영역을 증폭하게 된다. 이러한 경우에서, 방법의 메틸화 특이성은 프로브에 의해서만 제공되며 프로브 풀이 표적 영역의 완전하게 비메틸화된 형태에 대해 지정된 프로브를 포함하지 않음을 보장하는 것이 중요하다. 다른 실시형태에서, 1 이상의 프라이머는 메틸화 특이적일 수 있고 완전 메틸화되고 부분 메틸화 영역의 상류 및/또는 하류에 위치되는 시토신 잔기 중 1 이상에 혼성화하도록 설계된다. 메틸화-특이적 프라이머를 설계하여, 메틸화 특이적 증폭을 달성할 수 있다. 또 다른 예에서, 프라이머 중 하나 또는 둘다는 그들 자체가 부분 메틸화된 잔기에 대해 지정될 수 있다. 이러한 상황에서, 양호한 감도를 얻기 위해, 난잡하게 혼성화하는 프라이머, 또는 가능한 DNA 표적의 많은 상이한 부분 메틸화된 형태에 혼성화하여 증폭할 수 있는, 프라이머 풀을 설계하여, 특이성을 개선시키는 것이 바람직하다. 이는 예를 들어, 다중화 검정법의 적용으로 달성될 수 있다. 적합한 혼성 프라이머 또는 프라이머 풀의 디자인면에서, 프로브 서열 디자인과 관련되어 이하에 제공하는 설명은 이들 프라이머의 디자인에 적용될 수 있고, 양쪽 분자는 표적 DNA 영역에 혼성화하도록 설계된 올리고뉴클레오티드이다.
비메틸화 특이적 프라이머가 사용되는 경우, 이용되는 프로브 패널이 비메틸화된 DNA를 검출하는 프로브를 포함하지 않는 것이 바람직함을 이해한다. 관심 핵산 영역에 대한 2 이상의 메틸화 패턴을 검출하지만 비메틸화된 DNA를 검출하지는 않는, 본 발명에 따른 프로브 세트를 디자인하는 것은 충분히 당업자의 기술에 속한다. 사용되는 프라이머가 메틸화 특이적인 경우, 프로브 세트가 관심 핵산 표적의 비메틸화된 형태에 대해 지정된 프로브를 포함하는지 여부의 문제는 덜 중요하다.
이러한 실시형태에 따라서, 본 발명은 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 메틸화 특이적 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 관심 표적은 DNA 유전자 표적이고 보다 바람직하게는 BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP, CAHM, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2이고, 바람직하게는 IKZF1이다.
또 다른 실시형태에서, 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 상기 작용제는 나트륨 바이설파이트이다.
본 발명의 방법에 의해 증폭되는 DNA 영역의 크기는 당업자가 결정할 수 있고 인자들 예컨대 프로브가 결합해야만 하는 영역의 크기 및 DNA 표적 서열을 따라서, 프라이머가 지정된 CpG 디뉴클레오티드 클러스터의 분포 등에 좌우된다. 이러한 목적을 위해 본 발명의 증폭 방법은 프로브가 프라이머들 사이의 DNA 서열 영역(즉, 프라이머간 서열)에 대해 지정되도록 설계되며 따라서 증폭 결과로서 생성된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화하게 된다.
관심 표적"에 대한" 정방향 및 역방향 프라이머에 대한 언급은 프라이머가 대상 표적의 전부 또는 일 부분에 혼성화하여 증폭됨을 의미하는 것으로 이해해야 함을 이해해야 한다. 예를 들어, 관심 표적이 유전자 표적인 경우, 프라이머는 유전자의 보다 작은 부문 하위영역, 예컨대 프로모터 영역의 전부 또는 일부분에 혼성화하여 증폭되도록 설계할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 대체로 거대 앰플리콘보다는 작은 크기의 앰플리콘을 생성시키고 분석하는 것이 바람직하다.
이하에 상세하게 설명하는 바와 같이, 본 발명은 부분 메틸화가 존재하는 메틸화된 DNA 표적을 정량적으로(또는 정성적으로) 스크리닝하는 신뢰할만하고 정확한 수단을 제공한다. 이는 관심의 소정 영역에 대한 모든 잠재하는 부분 메틸화 패턴을 검출하도록 설계된 프로브 또는 프로브 풀의 디자인 및 적용 덕분에 가능하다. 이러한 유형의 불균질 프로브 풀의 사용은 스크리닝하려는 DNA 샘플에 존재하는 DNA의 부분 메틸화된 형태의 전체 범위에 효과적으로 혼성화하여 검출할 수 있다는 것을 더욱 확인하였다.
따라서, "프로브"에 대한 언급은 그 기능이 표적 핵산 분자와 상기 뉴클레오티드 서열의 적어도 한 영역, 구체적으로 잠재적인 부분 메틸화의 영역의 혼성화를 포함하는, 뉴클레오티드의 서열, 또는 이의 기능적 유도체 또는 유사체를 포함하는 임의 분자에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 핵산 프로브는 비핵산 성분을 포함할 수도 있다. 구체적으로, 핵산 프로브는 또한 검출 수단, 예컨대 형광성 태그 또는 분자의 기능, 예컨대 분자의 검출 또는 고정을 촉진시키는 일부 다른 성분을 포함한다. "검출 수단"에 대한 언급은 프로브를 검출할 수 있는 임의 수단의 도입에 대한 언급으로 이해해야 한다. 검출 수단은, 정량이 특히 유용하지만, 정량적 또는 정성적 검출을 촉진할 수 있다. 검출 수단은 검출가능한 모이어티 또는 작용제의 형태, 예컨대 형광단 또는 방사성동위원소일 수 있다. 대안적으로, 검출 수단은 예컨대 자성 비드 또는 바이오틴-스트렙타비딘 시스템 등을 통한, 분석을 위해, 반응 혼합물로서, 프로브의 물리적 단리를 가능하게 할 수 있다.
본 발명을 임의 방식으로 국한하지 않고, 개별 프로브 성분은 모두 동일한 검출제(예를 들어, 형광단)로 표지되거나 또는 각 프로브 성분은 상이한 작용제(예를 들어, 상이한 발광 파장 형광단)으로 표지될 수 있다. 개시된 예는 모든 프로브 성분이 동일한 형광단으로 표지되어 결합하는 (8) 축퇴성 프로브 중 어느 하나 또는 그 이상이 실시간 PCR에서 양성 신호를 제공하도록 축퇴성 프로브 혼합물을 사용한다. 표적 영역 전체에서 부분 메틸화의 정확한 정도는 조사하지 않는다. 다른 접근법은 상이한 형광단을 각각의 (8) 프로브에 부착시키고 검출되는 파장(들)을 기반으로 메틸화(또는 비메틸화)된 염기들을 구별하는 것이다. 이러한 접근법은 예를 들어 부분 메틸화가 초기 단계 암의 특징이고 완전 메틸화가 후기 단계 암의 특징이면 암 병기화에 유용할 수 있다. 존재하는 실시간 PCR 장비는 최대 6종의 상이한 형광단을 검출할 수 있지만, 다른 기술이 한 샘플 내 다수 특징을 조사하는데 이용될 수 있다(예를 들어, 비드-기반 형광성 분류법). 그러한 경우에서, 각각의 프로브는 독립적으로 분류할 수 있는 비드에 부착시킬 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 이러한 실시형태를 수행하기 위해, PCR의 실시간 정량적 형태의 사용, 예컨대, 예를 들어 TaqMan을 포함한다(Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7276-7280, 1991; Lee et al., Nucleic Acid Res. 21, 3761-3766, 1993). 예를 들어, 문헌 [Eads et al., Nucl. Acids Res. 28: E32, 2000]의 MethyLight 방법은 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화를 검출하는 개질된 TaqMan 가수분해-프로브 검정법을 사용한다. 필수적으로 이러한 방법은 핵산 샘플을 바이설파이트로 처리하는 단계 및 증폭 반응, 예를 들어 PCR을 사용하여 대조군 샘플에서는 아니고 신생물 세포에서는 메틸화된 1 이상의 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다. 증폭 반응은 3개 올리고뉴클레오티드, 관심 영역에 측접한 정방향 및 역방향 프라이머 및 1 이상의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드의 부위에 2개 프라이머 사이에서 혼성화하는 프로브의 존재 하에서 수행된다. 프로브는 5' 형광성 리포터 및 3' 소광제(또는 그 반대)로 이중 표지된다. 프로브가 온전한 경우, 소광제 염료는 그들 근접성에 기인해 리포터의 형광을 흡수한다. PCR 생성물에 어닐링 후, 프로브는 예를 들어 Taq DNA 중합효소의 5'에서 3'으로의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단된다. 이러한 절단은 소광제로부터 리포터를 방출시켜 초기 주형 메틸화 수준을 추정하기 위해 사용될 수 있는 형광 신호의 증가를 야기시킨다. 비돌연변이된 핵산(즉, 메틸화된 핵산)에 선택적으로 혼성화하는 프로브 또는 프라이머를 사용하여, 메틸화 수준을 예를 들어 표준 곡선을 사용해 결정한다.
대안적으로, 절단을 필요로 하는 표지된 프로브를 사용하기 보다는, 프로브, 예컨대, 예를 들어 분자 비콘이 사용된다(예를 들어, 문헌 [Mhlanga and Malmberg, Methods 25:463-471, 2001]을 참조함). 분자 비콘은 스텝과 루프 구조의 단일 가닥 핵산 분자이다. 루프 구조는 대조군 샘플이 아닌 신생물 샘플에서 메틸화된 1 이상의 CpG 디뉴클레오티드 주변 영역에 상보적이다. 스템 구조는 프로브(루프)의 양 측면 상에 있는, 서로에게 상보적인 2개의 "팔"을 어닐링하여 형성된다. 형광성 모이어티는 한쪽 팔에 결합되고 분자 비콘이 표적 서열에 결합하지 않을 때 임의의 검출가능한 형광을 억제하는 소광 모이어티는 다른 팔에 결합된다. 그 표적 핵산에 루프 영역의 결합시, 팔이 분리되고 형광이 검출가능하다. 그러나, 단일 염기 미스매치더라도 샘플에서 검출되는 형광 수준을 상당히 변경시킨다. 따라서, 특정 염기의 부재 또는 존재는 검출되는 형광 수준에 의해 결정된다. 그러한 검정법은 핵산에서 1 이상의 비돌연변이된 부위(즉, 메틸화된 뉴클레오티드)의 검출을 촉진한다.
형광 표지된 잠금 핵산(LNA) 분자 또는 형광 표지된 단백질-핵산(PNA) 분자는 뉴클레오티드 차이의 검출을 위해 유용하다(예를 들어, 문헌 [Simeonov and Nikiforov, Nucleic Acids Research, 30(17): 1-5, 2002). LNA 및 PNA 분자는 높은 친화성으로, 핵산, 구체적으로 DNA에 결합한다. LNA 또는 PNA 프로브에 접합된 형광단(구체적으로, 로도민 또는 헥사클로로플루오레세인)은 표적 핵산에 프로브의 혼성화시 유의하게 더 높은 수준으로 형광을 방출한다. 그러나, 형광의 증가 수준은 단일한 뉴클레오티드 미스매치가 일어나는 경우에도 동일한 수준으로 증강되지 않는다. 따라서, 샘플에서 검출되는 형광도는 예컨대 CpG 디뉴클레오티드에 메틸화된 시토신이 존재하는, 표적 핵산과 LNA 또는 PNA 프로브 간 미스매치의 존재에 대한 지표이다. 바람직하게, 형광 표지된 LNA 또는 PNA 기술은 예를 들어, 당분야에 공지 및/또는 본원에 기술된 증폭 방법을 사용해 미리 증폭된 핵산에서 적어도 단일한 염기 변화를 검출하는데 사용된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, LNA 또는 PNA 검출 기술은 문헌 [Orum et al., Clin. Chem. 45: 1898-1905, 1999]에 기술된 바와 같이, 고형 지지체에 LNA 또는 PNA 프로브를 고정시켜서 1 이상의 마커의 고속 처리 검출을 가능하게 한다.
바람직하게, 메틸화-의존적 서열 차이는 형광 기반 정량 PCR을 기반으로 하는 방법에 의해 검출된다(실시간 정량 PCR, Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001, 1996)(예를 들어, "TaqMan®", 및 "Lightcycler®" 기술). TaqMan® 및 Lightcycler® 기술의 경우, 서열 구별은 다음의 2 단계 중 하나 또는 둘다로 수행될 수 있다: (1) 증폭 단계, (2) 형광 검출 단계. FRET 혼성화의 경우에, Lightcycler®에 대한 프로브 형식, FRET 올리고뉴클레오티드 중 하나 또는 둘다 서열 차이를 구별하는데 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는 본원의 모든 발명 실시형태에서 적용시, 증폭 과정은 형광-기반 실시간 정량 PCR(Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996)이고 이중-표지된 형광성 올리고뉴클레오티드 프로브를 적용한다(TaqMan® PCR, ABI Prism 7700 서열 검출 시스템 사용, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California).
일 실시형태에서, 검출 수단은 형광성 리포터 분자, 보다 바람직하게는 가수분해 프로브이다. "가수분해 프로브"에 대한 언급은 이중 표지된 TaqMan® 올리고뉴클레오티드에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 본 발명을 임의의 한 가지 이론 또는 작용 방식에 국한하지 않고, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 형광성 리포터 분자로 표지되는 한편 3' 말단은 소광제 분자로 표지된다. 프로브의 서열은 증폭되는 표적 분자의 관심 영역에 특이적이다. 가수분해 프로브는 서열의 길이가 5' 형광단에 놓이고 3' 소광제는 형광을 억제하도록 충분한 근접성으로 가깝게 놓이도록 설계된다.
가수분해 프로브는 PCR 증폭 프라이머의 결합 부위 사이에서 관심 영역에 결합되도록 설계된다. PCR 사이클의 연장기 동안, Taq DNA 중합효소는 PCR 프라이머의 하류에서 상보적 가닥을 합성한다. 연장이 결합된 가수분해 프로브에 도착하면 Taq DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성은 가수분해 프로브를 분해한다. 프로브의 절단은 프로브의 나머지(따라서 소광제)로부터 형광성 리포터 분자를 분리시켜 리포터 분자가 형광을 방출하도록 한다. Taq DNA 중합효소는 초기 가닥의 나머지를 계속 합성하여, 프로브의 혼성화가 PCR 반응을 억제하지 않는다. 후속 PCR 사이클에서, 방출되는 형광성 리포터의 양, 따라서 형광은 누적되어 증가된다. 적합한 리포터 및 소광제 분자의 예는 5' 형광성 리포터 염료 6FAM ("FAM"; 2,7 디메톡시-4,5-디클로로-5-카복시-플루오레세인), 및 TET(6-카복시-4,7,2',7'-테트라클로로플루오레세인); 및 3' 소광제 염료 TAMRA(6-카복시테트라메틸로다민)이다(Livak et al., PCR Methods Appl. 4:357-362, 1995; Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001, 1996; Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996).
따라서, 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시키는 바이설파이트제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 메틸화-특이적 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 가수분해 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴과 공동으로 혼성화하는 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 핵산은 DNA이다.
다른 실시형태에서, 상기 바이설파이트제는 바이설파이트 염, 예컨대 나트륨 바이설파이트 또는 암모늄 바이설파이트이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 DNA는 IKZF1 유전자이다.
본 발명의 프로브는 단일 반응에서, 2 이상의 상이한 메틸화 패턴을 나타내는 DNA 서열에 혼성화할 수 있도록 설계된다. 예를 들어, 프로브는 완전 메틸화된 서열 및 1 이상의 부분 메틸화된 서열에 혼성화할 수 있다. 다른 예에서, 프로브는 DNA 서열의 2 이상의 상이한 부분 메틸화된 형태를 검출할 수 있다. 본 발명의 방법이 완전 및 부분 메틸화된 형태 둘다를 나타내는 DNA 표적의 메틸화를 검출하는 정확하고 재현가능한 수단을 제공하기 위한 것이므로, 이러한 검출 방법은 부분 메틸화된 형태를 나타내거나, 또는 나타낼 것으로 여겨지는 DNA 서열의 하나의 별개 영역에 프로브가 집중되도록 설계된다. 그러나, 당업자는 DNA 표적이 프로브에 의해 표적이 되는 영역이외의 DNA 서열 영역에서 부분 메틸화 패턴을 나타낼 수도 있음을 이해한다. 따라서, 본 발명은 DNA 표적의 임의의 다른 영역이 아닌 프로브가 지정되는 DNA 영역에서의 부분 메틸화를 검출하고 평가하는 것에 제한되는 것을 이해해야 한다. 따라서, 특정 유전자 표적을 스크리닝하기 위해, 본 발명의 방법은 프로브가 지정되는 부위에서 부분 메틸화를 나타내는 유전자의 부분 메틸화된 형태 전부를 검출하도록 설계된다. 그러나, 대상 유전자가 또한 그의 서열을 따라서 다른 부위에서 부분 메틸화를 나타낼 수도 있으므로, 이들 부분 메틸화된 형태는 프로브가 이들 메틸화 부위를 지정하지 않으면 검출되지 않는다. 그러나, 잠재적인 부분 메틸화의 1 이상의 영역이 관심있으면, 이 방법은 이들 영역이 증폭 프라이머 쌍 사이에 위치하는 한, 복수의 그러한 영역에 대해 지정된 프로브의 사용을 포함하도록 적합화될 수 있음을 당업자는 또한 이해한다.
"상기 영역에서 상이한 메틸화 패턴" 2 이상에 혼성화하는 대상 프로브 또는 프로브들에 대한 본원의 언급은 본 발명의 방법에서 사용되는 프로브가 모두 동일한 DNA 서열 영역에 혼성화하도록 설계된다는 것을 의미함을 이해해야 한다. 그러나, 메틸화된 이러한 DNA 서열 영역은 완전 메틸화 또는 부분 메틸화된 형태의 범위를 나타낼 수 있고, 이를 "상이한 메틸화 패턴" 또는 "차등적 메틸화"라고 한다. 이 영역에 존재하는 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드의 수가 증가하면, 잠재적으로 상이한 부분 메틸화된 패턴의 수가 증가된다. 예를 들어, 앞서 기술한 바와 같이, Chr7:50304323-50304349에서 IKZF1의 완전 메틸화된 형태이외에도, 6부분의 메틸화된 형태 및 완전 비메틸화된 형태를 포함하여 증폭 프라이머 사이에 7개의 상이한 메틸화 패턴이 존재한다. 본 발명의 방법은 관심 DNA 표적의 모든 차등적으로 메틸화된 형태의 검출이 가능하도록 설계되지만, 그 환경 상황에 따라서, 특정 DNA 표적의 전부가 아닌, 일부 부분 메틸화 형태를 스크리닝하는 것만을 추구할 수 있다. 예를 들어, 2개의 주된 부분 메틸화된 형태가 존재한다고 알려져 있다면, 단지 이들 둘에 대한 스크리닝은 진단 정확도를 충분히 향상시킬 수 있다. 이러한 평가를 하고 프로브 세트를 적절하게 설계하는 것은 당분야의 기술 범위에 충분히 속한다.
따라서, 다른 실시형태에서, 본 발명은 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법에 관한 것이고, 이러한 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 모든 완전 및 부분 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
일 실시형태에서 상기 DNA 표적은 유전자 표적이고, 바람직하게 BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP, CAHM, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2이고, 바람직하게는 IKZF1이다.
다른 실시형태에서 상기 작용제는 바이설파이트 염 예컨대 나트륨 바이설파이트 또는 암모늄 바이설파이트이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 프라이머는 메틸화 특이적 프라이머이다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 상기 프로브는 가수분해 프로브이다.
따라서, 유전자 표적의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 이러한 유전자 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있으며, 상기 방법은
(i) DNA 샘플을 나트륨 바이설파이트와 접촉시켜 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 전환시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 DNA 샘플을
(a) 개질된 유전자의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 메틸화 특이적 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 가수분해 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하는 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 DNA 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 유전자는 IKZF1이고 상기 프라이머는 다음의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다:
그리고 상기 프로브는 하기 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다:
또 다른 실시형태에서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하고, 상기 프로브는 서열번호 19의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
여전히 다른 실시형태에서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하고 상기 프로브는 서열번호 20의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 상기 메틸화 특이적 증폭 검정법은 서열번호 1에 상보적인 바이설파이트 전환된 DNA 가닥에 대한 것이고 상기 프로브는 서열 서열번호 21 또는 서열번호 22 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
여전히 다른 실시형태에서, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하고 프로브 세트는 서열번호 23-30 중 1 이상 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.
추가 실시형태에서, 상기 메틸화 특이적 증폭 검정법은 서열번호 1에 상보적인 바이설파이트 전환된 DNA 가닥에 대한 것이고, 상기 프라이머 세트는 서열번호 47 및 서열번호 48의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고, 상기 프로브 세트는 서열번호 31-38의 서열 및/또는 서열번호 39-46의 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 프로브는 상기 영역에서 모든 완전 및 부분 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화된다. 또 다른 추가 실시형태에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 49-62 및 서열번호 63-76 서열 중 1 이상 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 77 및 서열번호 78의 서열 중 1 이상 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
대상 프라이머는 상기에 개시된 서열에 상응할 수 있거나 또는 실질적으로 유사할 수 있음을 이해해야 한다. 다르게, 이들 서열 또는 실질적으로 유사한 서열은 보다 큰 프라이머 분자 내 하위영역을 나타낼 수 있다. "실질적으로 유사한 서열"에 대한 언급은 서열에 일부 소수의 차이를 나타낼 수 있지만 그럼에도 실질적으로 유사한 서열과 동일한 DNA 표적을 증폭시키는 기능을 하는 서열에 대한 언급으로 이해해야 한다.
본 발명을 임의의 한 가지 이론 또는 작용 방식에 국한하지 않고, 다음의 IKZF1의 DNA 영역에 있어서,
하기의 시토신이 높은 빈도로 결장 유도된 신생물 DNA에서 메틸화된다는 것을 확인한다(Chr 7, GRCh38/Hg38 좌표): 50304273,50304276,50304287, 50304294, 50304301, 50304311, 50304313, 50304318, 50304330, 50304338, 50304343, 50304350, 50304354, 50304363, 50304365. 이러한 본 발명의 실시형태는 시토신 잔기 50304330, 50304338 및 50304343에서 부분 메틸화에 대해 스크리닝하는 것에 관한 것이다. 혈장에서 단리되어 회수된 바이설파이트 전환된 DNA의 IKZF1 유전자좌 내 이들 3개 CpG 부위에 걸쳐 메틸화의 임의 조합의 검출은 직결장암에 대한 진단 감도를 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에 따라서, 나트륨 바이설파이트로 DNA의 처리는 시토신을 우라실로 전환시키지만, 5'메틸시토신 잔기는 영향받지 않은 채로 남는다. PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 3 및 4)는 질환 특이적 메틸화가 모든 시토신 잔기 50304273, 50304276, 50304287, 50304294, 50304350, 50304354, 50304363 및 50304365를 요구하는 서열번호 2에 특이적으로 프라이밍되게 설계된다. 3개 시토신 잔기 50304330, 50304338 및 50304343 중 임의(또는 어느 것도 아님)의 메틸화는 축퇴성 가수분해 프로브 혼합물(서열번호 5-12)(예를 들어, TaqMan 축퇴성 프로브 혼합물)을 사용해 검출한다.
본 발명의 프로브는 검출하려는 부분 및 완전 메틸화된 서열의 범위에 "공동으로" 결합된다. "공동으로"는 사용을 위해 선택되는 프로브의 코호트가 개별적으로 또는 개개 프로브의 혼성화의 난잡성(promiscuity)으로 인해, 검출하고자 하는 DNA 표적의 부분 메틸화된 형태의 범위에 결합할 수 있음을 의미한다. 본 발명을 임의의 한 가지 이론 또는 작용 방식에 국한하지 않고, 프로브에 의해 조사되는 DNA 영역의 서열은 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드의 위치에 따라, 당업자가 알게 된다. 이러한 서열 정보를 기반으로 하고, IKZF1에 관하여 초기에 예시한 바와 같이, 가능한 완전 및 부분 메틸화 패턴의 완전한 범위를 예상할 수 있다. 다음으로, 프로브는 각각 개별적으로 고유한 메틸화 패턴에 결합하거나 또는 난잡성을 나타내고 1 이상의 메틸화 패턴에 결합할 수 있게 설계될 수 있다. 확인된 바와 같이, 완전 메틸화된 서열에 대한 프로브는 완전 메틸화된 서열과 부분 메틸화된 서열 간 차이가 1개 시토신 잔기의 메틸화 결여정도로 작은 경우더라도, 부분 메틸화된 서열에 결합하지 않는다. 그러나, 메틸화된 시토신 및 비메틸화 시토신 둘다에 걸쳐 난잡하게 결합되도록 설계된 프로브 또는 메틸화 특이적 프로브의 불균질 풀이 증폭 검정법에 사용되면, 관심 표적의 메틸화에 관하여 정확한 결과를 얻을 수 있음을 또한 확인하였다.
하나의 특이적 완전 또는 부분 메틸화된 서열 패턴에 혼성화하도록 설계된 프로브는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 생성시킬 수 있다. 그들이 1 이상의 메틸화 패턴에 결합할 수 있다는 점에서, 난잡성을 나타내는 프로브와 관련하여, 이 디자인은 또한 당업자에게 알려진 몇몇 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 프로브(예컨대 5'-가수분해 프로브)의 1 이상의 염기 위치는 고유하지 않지만, 2개 염기, 즉 시토신 또는 티미딘의 혼합물이다. 오직 하나의 CpG 부위가 메틸화(또는 비메틸화)에 대해 조사되면, 그러한 축퇴성 올리고뉴클레오티드는 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열의 혼합물, 예를 들어 --atCGat-- 및 --atTGat--이다. 2개의 CpG 부위가 조사되면, 축퇴성 올리고뉴클레오티드 칵테일은 4개의 상이한 서열의 혼합물이다. 본원에서 제공하는 IKZF1 예는 3개 CpG의 부분 메틸화가 8개의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 5-12)로 이루어진 축퇴성 5'-가수분해 올리고뉴클레오티드 프로브 혼합물을 사용하여 조사된다. 이 혼합물은 Chr7 좌표 50304330, 50304338 및 50304343에 존재하는 3개 CpG 부위 내에 모든 가능한 메틸화 조합을 검출할 수 있다. 이러한 예는 IKZF1 메틸화 검정법의 진단 감도를 향상시킨다.
앞서 상세히 설명한 바와 같이, 프로브는 검출 프로브의 임의의 이형 예컨대 TaqMan, Scorpions, Beacons 등일 수 있다. 프로브 혼합물은 (IKZF1 예의 경우에서) 다음과 같이 합성된다:
(i) (합성 동안 C 및 T를 블렌딩하여) 1회 합성에서 8배 중복(redundant);
(ii) 3개의 상이한 2배 중복 프로브 및 혼합;
(iii) 하나의 2배 및 하나의 4배 중복 프로브 및 혼합; 또는
(iv) 8개의 상이한 고유 프로브 및 혼합.
프로브는 또한 각각 조사되는 C/T 염기에서 무염기 스페이서(예를 들어, 5-니트로-인돌 또는 3-니트로-피롤), 또는 각각 조사되는 C/T 염기에 이노신을 갖는 단일 서열일 수 있다. 1 이상의 무염기 스페이서(들)를 함유하는 단일 서열 "난잡성" 프로브는 오직 한 가지 어닐링 온도를 갖지만, 무염기 스페이서(들)를 함유하는 프로브의 용융 온도는 모든 조사되는 CpG 부위 상에서 메틸화를 검출하는 프로브보다 현저하게 낮다. 따라서, 무염기 스페이서(들)를 갖는 난잡한 프로브는 오직 메틸화된 CpG 부위를 표적화하는 프로브보다 상당히 더 길 필요가 있다. 이노신은 임의 염기와의 염기 쌍형성을 허용하지만, C>A>G>T의 순서로 선호도를 갖는다. 이 서열은 프로브에 대한 반대 가닥이므로, 프로브는 이 경우에 A(= T, 비메틸화) 또는 G(= C, 메틸화)에 어닐링한다. 이들 2가지 선택안은 혼합 프로브보다 덜 특이적이다. 그들이 3 위치에서 4개 염기 중 하나와 쌍을 형성할 수 있으므로, 사실 64배 축퇴성(대비 8배)이고, 따라서 프라이머의 메틸화 특이성에 보다 심하게 의존적이다. 무염기 스페이서 또는 이노신 함유 프로브는 8개 올리고뉴클레오티드 성분의 혼합물보다는, 단일 올리고뉴클레오티드 성분인 것이 이득이다.
프로브는 또한 각각의 잠재적인 부분 메틸화된 C 위치에서 피리미딘(C 또는 T) 유사체를 가질 수 있다. 예를 들어, 유사체, 6H,8H-3,4-디히드로피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온은 G 및 A(반대 가닥의 2가지 선택안)와 염기 쌍을 이루게 되는 단일 "염기"이다. 한 연구에서, A(= T = 비메틸화)에 대해 69% 선호도 및 G(= C = 메틸화)에 40% 선호도를 가진다(Hill et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 95:4258-4263, 1998). 여기서 이러한 프로브는 적절하게 균등한 친화성으로 모든 8가지 가능한 메틸화 조합에 결합하는 단일 올리고뉴클레오티드라는 것이 이득이다. 개별 프로브 서열의 일부가 어닐링 온도를 낮추는, 시토신 대신 티미딘을 함유하므로, 프로브 서열(들) 중 일부는 낮아진 어닐링 온도를 보상하도록 길이를 연장할 필요가 있을 수 있음을 이해한다. 대체 접근법은 어닐링 온도를 증가시키는 화학적 개질(예컨대 주요 그루브 결합 염기)을 포함하는 것이다. 또한 프로브의 축퇴성 위치(들)에서 각 염기가 반드시 50/50일 필요는 없다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 특이적 C 잔기가 진짜 암의 80%에서 메틸화되었지만 진짜 암 사례의 20%에서는 메틸화되지 않았음을 확인하였다면, 메틸화 발생률을 일치시키기 위해 이 위치에 80% C 및 20% T를 갖는 프로브를 만들 수 있다.
당업자가 이해하고, 이전에 상세하게 기술한 바와 같이, 프로브 서열(들)은 반대 가닥과 충분히 잘 혼성화되도록 설계될 수 있다. 반대 가닥에 대한 이들 프로브 서열 디자인은 부분 메틸화를 조사하기 위해 축퇴성 위치에 G 또는 A(또는 상기 기술된 바와 같은 이노신 또는 무염기 스페이서)를 가지게 된다. 상기에 언급된 피리미딘 유사체는 이제 T 및 C에 결합하는, 퓨린 유사체, N6-메톡시-2,6-디아미노퓨린으로 변화된다.
본 발명의 프로브 및/또는 프라이머는 또한 그들이 자가 프라이밍하지 않거나 또는 프라이머 이량체(검출 검정에서 사용되는 다른 프로브 또는 프라이머와)를 형성하지 않음을 확인하기 위해 평가된다. 또한, 프로브 또는 프라이머(또는 이의 서열)은 종종 표적 핵산으로부터 변성되는 온도(즉, 프로브 또는 프라이머의 용융 온도, 또는 Tm)를 결정하기 위해 평가된다. Tm을 추정하기 위한 방법은 당분야에서 공지이고, 예를 들어, 문헌 [Santa Lucia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1460-1465, 1995] 또는 [Breslauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 3746-3750, 1986]에 기술되어 있다.
본 발명의 프로브 또는 프라이머를 생성/합성하기 위한 방법은 당분야에 공지이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 합성은 문헌 [Gait (Ed) (In: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1984)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 프로브 또는 프라이머는 생물학적 합성(예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제로 핵산의 분해) 또는 화학 합성으로 얻을 수 있다. 짧은 서열(최대 약 100개 뉴클레오티드)의 경우, 화학 합성이 바람직하다.
보다 긴 서열의 경우, 분자 생물학에서 적용되는 표준 복제 방법이 유용하며, 예컨대, 예를 들어, 문헌 [Messing, Methods Enzymol, 101, 20-78, 1983]에 기술된 바와 같은 단일 가닥 DNA를 위한 M13의 사용 등이 있다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 다른 방법은 예를 들어, 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법(Narang, et al. Meth. Enzymol 68: 90, 1979) 및 지지체 상의 합성(Beaucage, et al. Tetrahedron Letters 22: 1859-1862, 1981)을 비롯하여, 포스포르아미데이트 기술(Caruthers, M. H., et al., "Methods in Enzymology," Vol. 154, pp. 287-314 (1988)), 및 문헌 ["Synthesis and Applications of DNA and RNA," S. A. Narang, editor, Academic Press, New York, 1987], 및 이에 인용된 문헌에 기술된 다른 기술들을 포함한다. 잠금 핵산(LNA)을 포함하는 프로브는 예를 들어, 다음의 문헌들에 기술된 바와 같이 합성된다: Nielsen et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1:3423, 1997; Singh and Wengel, Chem. Commun. 1247, 1998. 반면, 펩티드-핵산(PNA)을 포함하는 프로브는 예를 들어, 다음의 문헌들에 기술된 대로 합성된다: Egholm et al., Am. Chem. Soc., 114: 1895, 1992; Egholm et al., Nature, 365: 566, 1993; 및 Orum et al., Nucl. Acids Res., 21: 5332, 1993.
본 발명의 DNA 또는 RNA 샘플은 관심 메틸화 영역에 측접한 프라이머를 사용해 증폭된다. 앞서 상세하게 설명한 바와 같이, 이 "영역"은 유전자 길이의 작은 부분 또는 실질적인 부분을 포함하도록 선택될 수 있다. 후자의 경우에서 생성된 앰플리콘은 꽤 길다. 그러나, 특정 실시형태에서, 그 영역은 1 이상의 CpG 디뉴클레오티드가 모여있는 경우 유전자의 훨씬 더 짧은 구간에 상응할 수 있다. 이 경우, 생성된 앰플리콘은 현저하게 더 짧다.
프라이머 및 프로브와 표적 DNA의 상호작용 촉진은 임의의 적합한 방법으로 수행할 수 있다. 그러한 방법들은 당업자에게 알려져 있다. 이러한 목적을 위해, 프라이머 및 프로브는 임의의 적합한 시점에 반응 튜브에 도입될 수 있음을 이해해야 한다. 도입은 대체로 초기 증폭 사이클의 개시 전인데 반해, 1 이상의 추가 프라이머의 도입은 초기 증폭 사이클에 후속하여 수행될 수 있다. 프라이머의 도입 방식은 당업자가 증폭 반응을 어떻게 수행하고자 하는지에 의존적이지만 대체로 사용 편이성 및 오염 회피를 위해, 일반적으로 단일 튜브에서 전체 반응을 수행할 수 있는 것이 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 단계를 달성하기 위한 임의의 다른 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 프라이머 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 샘플의 "접촉"에 대한 언급은 상호작용(예를 들어, 혼성화)이 일어날 수 있도록 샘플과 프라이머의 혼합을 촉진시키는 것에 대한 언급으로서 이해해야 한다. 이러한 목적을 달성하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다.
앞서 상세하게 설명한 바와 같이, 복수의 메틸화된 DNA 영역을 증폭시키려는 경우, 당업자는 다중화 증폭 반응을 디자인할 수 있다. 대안적으로, 각각 하나의 고유한 프라이머 쌍을 사용하는 몇몇 개별 증폭 반응을 수행할 수 있다. 이들 방법은 2 이상의 개별 메틸화 영역을 증폭시키는 경우 또는 1 이상의 유전자의 메틸화를 분석하려는 경우 관련된다. 이러한 경우, 2개 유전자(예컨대 BCAT1 및 IKZF1)를 분석하고자 하는 경우라면, 예를 들어, 나트륨 바이설파이트 전환 후, 샘플을 2개 분취량으로 나누고, 각 분취량을 그 유전자의 관련 메틸화 서열 영역에 대한 정방향 및 역방향 프라이머의 1 이상의 세트를 사용해 증폭시킨다. 대안적으로, 다중화 반응이 단일 샘플에 대해 수행될 수 있으며, 그러한 반응은 한 유전자의 선택된 메틸화 서열 영역에 대한 프라이머쌍 및 가수분해 프로브 세트의 사용 및 다른 유전자의 선택된 메틸화 서열 영역에 대한 다른 프라이머 세트 및 가수분해 프로브 세트의 사용에 있어서 다중화된다. 당업자에게 친숙한 바와 같이, 다중화 반응은 2 이상의 메틸화 서열 영역 및/또는 2 이상의 유전자에 대해서 2, 3, 또는 그 이상의 프라이머 세트 및 가수분해 프로브를 사용해 수행되도록 설계될 수 있다. 다중화 또는 네스티드 증폭 반응을 적절하게 설계하는 것은 당업자의 기술에 충분히 속하는 것임을 이해해야 한다.
본 발명의 증폭 단계는 관심 DNA 표적을 따라서 혼성화된 프라이머의 연장을 야기한다. 이전에 상세하게 설명한 바와 같이, 혼성화된 이중-표지된 가수분해 프로브의 검출을 실시하는 것은 프라이머 연장 분자의 생성이다. 이를 실시할 수 있는 수단은 검출이 앰플리콘 생산시 생성되는, 산출량을 의미하고, 정성적으로 또는 정량적으로 분석될 수 있으며, 후자가 특히 바람직한 수단이라는 점으로서 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 목적을 위해서, 프로브의 검출은 프로브가 혼성화되는 DNA 서열을 따라서 프라이머가 연장되어 대체, 절단되거나 또는 아니면 그의 검출 수단이 기능화(즉, 활성화 또는 공개)되는 프로브에 대한 개질이 실시되어 정성적 또는 정량적 수단에 의해 검출가능해지는 경우에만 실행된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 바람직한 분야가 질환 개시(예컨대 신생물 발생 또는 그에 대한 소인)를 진단하는 목적을 위해 메틸화 수준을 평가하는 것이지만, 상기 메틸화 수준의 정반대 변화의 검출은 일정 상황 하에서, 예를 들어 신생물성 병태, 예컨대 선종 또는 선암종 발생을 조절하기 위한 치료적 또는 예방적 처치의 효율을 모니터링하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 메틸화 수준의 상승이 개체가 선종 또는 선암종 발생을 특징으로 하는 병태가 발생되었음을 시사하는 경우, 치료적 처치 계획의 개시에 후속하여 메틸화 수준의 감소를 스크리닝하는 것이 신생물성 세포의 성공적인 제거를 의미하는데 유용할 수 있다. 다른 예에서, 이 방법을 사용해 종양의 전체 주변부가 제거되었는지 여부를 결정하기 위해 종양 절제부의 가장자리에서 조직을 검사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 진단, 예후, 분류, 질환 위험성의 예측, 질환 재발의 검출, 수많은 유형의 신생물의 치료법의 선택 및 신생물의 모니터링에 사용될 수 있다. 임의 진행기의 암, 예컨대 원발성, 전이성 및 재발성 암을 검출할 수 있다. 또한, 이 방법은 DNA 및 RNA 메틸화 분석이 필수적인 임의의 다른 경우에 대한 적용성을 갖는다.
비제한적인 예로서 신생물 발생을 이용해, 본 발명은 포유동물(예를 들어, 인간)이 신생물을 갖는지 여부, 포유동물에서 채취된 생물학적 샘플이 신생물성 세포, 신생물성 세포에서 유도된 DNA를 포함하는지 여부를 확인하거나, 신생물이 발생될 포유동물의 위험성 또는 가능성을 추정하거나, 항암 치료의 효능을 모니터링하거나, 또는 암을 갖는 포유동물에서 적절한 항암 치료를 선택하기 위한 방법을 제공한다. 그러한 방법들은 많은 신생물성 세포가 정상 세포와는 상이한 상태를 갖는다는 확인을 기반으로 한다. 따라서, 세포가 차등적으로 메틸화된 서열을 함유하는지 여부를 확인하여, 세포가 신생물인지를 확인하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 신생물을 갖는 것으로 알려지거나 또는 의심되는 개체, 또는 통상의 임상 검사로서, 즉 신생물을 가질 것으로 반드시 의심되지 않는 개체에서, 평가하는데 사용될 수 있다. 추가의 진단 검정을 수행하여 개체에서 신생물의 상태를 확진할 수 있다.
또한, 본 발명은 치료 과정의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항암 치료의 효능은 암을 갖는 포유동물에서 시간 경과에 따라 DNA 메틸화를 모니터링하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 치료 전, 또는 초기에 포유동물에서 채취된 샘플 중 수준과 비교하여, 치료 후 포유동물에서 채취된 생물학적 샘플 중 임의의 관련 진단 서열에서 메틸화의 감소 또는 부재는 효율적인 치료를 시사한다.
따라서, 본 발명의 방법은 1회 검사로서 또는 질환 발병 위험성이 있는 개체의 지속적 추적관찰로서 또는 치료적 또는 예방적 처치 계획의 유효성 감시로서 유용하다. 이러한 상황에서, 생물학적 샘플의 임의의 1 이상의 부류에서 메틸화 수준 조절의 맵핑은 현재 사용되는 치료적 또는 예방적 계획의 유효성 또는 개체의 상태에 대한 소중한 지표이다. 따라서, 본 발명의 방법은 상기 개체의 생물학적 샘플로부터 결정된 1 이상의 초기 메틸화 수준에 비해, 또는 그들의 정상 수준에 비해 개체에서 메틸화 수준의 증가 또는 감소를 모니터링하는 것으로 확대됨을 이해해야 한다.
관련 측면에서, 완전 및 부분 메틸화 둘다를 정확하게 검출하기 위한 방법을 개발하는 것 이외에도, 본 발명자들은 진단 프로토콜에 있어서, 그리고 용인된 정설과 대조적으로, 환자 또는 다른 샘플에서 모든 형태의 메틸화의 스크리닝이 오직 완전 메틸화만을 스크리닝하는 것보다 사실 더 민감한 결과를 제공할 수 있음을 예상치 않게 확인하였다. 부분 메틸화의 스크리닝이 실제로 진단 결과를 모호하게 한다는 이전의 우려는 본 발명의 방법을 사용하는 경우 임의 문제를 생성시키지 않는다는 것을 확인하였다. 사실, 진단 결과의 감도는 향상된다.
따라서, 다른 측면에서 본 발명은 그 병태가 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화의 조절을 특징으로 하고 표적은 부분 메틸화의 영역을 특징으로 하는 환자에서 병태를 진단 또는 모니터링하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
(i) 상기 환자 유래의 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 개질된 유전자의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 표적은 DNA 또는 RNA, 바람직하게 프로모터 영역이다.
다른 실시형태에서 상기 병태는 신생물성 병태이다.
다른 실시형태에서 상기 DNA 또는 RNA 표적은 유전자, 예컨대 BCAT1, IKZF1, CAHM, GRASP, IRF4, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 제제는 바이설파이트 염, 예컨대 나트륨 바이설파이트 또는 암모늄 바이설파이트이다.
여전히 또 다른 실시형태에서, 상기 프로브는 가수분해 프로브이다.
추가 측면에서, 관심 핵산 표적의 영역의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 진단 키트를 제공하고, 상기 키트는
(i) 비메틸화 시토신 잔기가 개질된 부분 시토신 메틸화의 상기 핵산 영역의 DNA 형태의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머;
(ii) 프로브가 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있는 것인 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브
를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 프라이머는 메틸화 특이적 프라이머이다.
다른 실시형태에서 상기 프로브는 가수분해 프로브이다.
여전히 다른 실시형태에서, 상기 작용제는 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 작용제는 바이설파이트 염, 예컨대 나트륨 바이설파이트 또는 암모늄 바이설파이트이다.
추가 실시형태에서, 상기 키트는 부가적으로 DNA 증폭 및/또는 검출을 실시하기 위한 시약을 포함한다.
상기 관심 유전자가 IKZF1인 경우에, 상기 프라이머 및 프로브는 IKZF1 유전자의 Chr7:50304323050304349, Chr7:50303300-50304923 또는 Chr7:50399869-50400702 영역 중 1 이상에서 메틸화를 검출하기 위한 것이다.
추가 실시형태에서, 프라이머 세트는
(i) 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 49-62 및 서열번호 63-76의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 또는
(iii) 서열번호 77 및 서열번호 78의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프라이머를 포함한다.
다른 추가 실시형태에서, 프로브 세트는
(i) 서열번호 5-12의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 19의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(iii) 서열번호 20의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 또는
(iv) 서열번호 23-30의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프로브를 포함한다.
상기 키트가 서열번호 1 영역의 상보체인 바이설파이트 전환된 DNA 가닥을 증폭시키기 위한 것인 또 다른 실시형태에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 47 및 서열번호 48 중 하나 또는 둘다 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 키트는 서열번호 1 영역의 상보체인 바이설파이트 전환된 DNA를 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브 세트는
(i) 서열번호 21의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 22의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(iii) 서열번호 31-38의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 및/또는 서열번호 39-46의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프로브를 포함한다.
본 발명은 이하의 비제한적인 예를 참조하여 더욱 설명한다.
실시예 1
대장암 환자의 순환계에서 부분 메틸화된
IKZF1
DNA의 동정
혈장을 134 암 사례를 포함하는 2,109명의 결장경검사 피험체에서 추출하였다. 세포-무함유 DNA는 QIASymphony 상에서 제조사가 추천하는 대로 QS CNA 4 mL 혈장 키트(Qiagen)를 사용해 추출하였다. 얻어진 DNA를 바이설파이트 전환시키고 제조사(Qiagen)의 추천에 따라 QIACube 상에서 EpiTect Fast 및 EpiTect Plus 키트를 사용해 정제하였다. 회수된 바이설파이트 전환된 DNA를 BCAT1 바이설파이트-전환 및 메틸화 특이적 올리고(chr12: 24949058-24949159 상에 존재하는 102 nt 앰플리콘을 표적화화는, 서열번호 13, 14 및 15) 및 염색체 7 상의 대조군 유전자, ACTB를 표적화하는, 바이설파이트 전환 특이적 올리고뉴클레오티드 서열번호 16, 17, 18이외에도, 올리고뉴클레오티드 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5를 포함하여, 제조사의 추천에 따라서 마스터믹스 QuantiTect NoROX를 사용해 다중화 실시간 PCR 검정에서 삼중 투입으로 분석하였다.
메틸화된 BCAT1 및 IKZF1의 검출은 다음의 LC480 II 사이클링 조건을 사용해 30 ㎕의 총 PCR 반응으로 수행하였다: 1x[95℃, 15 분], 50x[95℃, 15초; 62℃, 40초(포착, FAM, HEX, TexRed)], 1x[40℃, 10초, 및 유지].
134 암 중에서, 74 및 62는 각각 BCAT1 및 IKZF1 메틸화에 양성이었다. PCR BCAT1 메틸화 양성이지만 IKZF1 메틸화 음성인 PCR 반응의 PCR 생성물을 희석하고 서열번호 3 및 서열번호 4 프라이머만을 포함하는 SYBR-green IKZF1 검정법을 사용해 재증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물은 ∼100 bp의 PCR 생성물이 생성되는지 여부를 아가로스 겔 상에서 흘려주었고, '완전 메틸화된' IKZF1 프로브(서열번호 5) 하에서 3개 CpG 부위를 포함하는 완전 메틸화된 IKZF1 표적을 요구하는 다중화 PCR 검정법으로 인해 본래는 검출되지 않았던 메틸화된 IKZF1 DNA의 존재를 확인시켜 주었다. 실시예 1에서 생성시킨 아가로스 분리된 PCR 생성물을 정제하고 서열분석하여, CpG 잔기 50304330, 50304338 및 50304343의 비메틸화의 2 사례를 포함하여, 몇몇 PCR 생성물에서 부분 메틸화의 증거를 밝혔고, 이는 왜 '완전-메틸화'-요구 IKZF1 프로브(서열번호 5)가 달리 결장경검사-확진 암에서 거짓-음성 IKZF1 결과를 야기하는지를 설명해준다. 부분 메틸화가 IKZF1 앰플리콘의 다른 CpG 부위에서 관찰되었다(도 1).
결론
IKZF1 가수분해 프로브 영역에서 부분 메틸화의 명백한 증거가 서열분석된 앰플리콘 중 3개에서 얻어졌다. 이들 중 2는 결장경검사-확진 암이었고, 완전-메틸화된 IKZF1 DNA를 검출하도록 설계된 프로브를 사용한 원래의 IKZF1 실시간 PCR 검정법에서 음성이었다.
실시예 2
대장암 환자에서 부분 메틸화된
IKZF1
의
검출
표적화된 IKZF1 앰플리콘 서열(서열번호 2)에 삽입된 부분 메틸화된 CpG 부위의 검출에 후속하여, 본 발명자들은 게놈 좌표 Chr7: 50304330, Chr7: 50304338 및 Chr7: 50304343에 상응하는 3개 잔기 위치 각각에서 시토신 또는 티미틴 염기를 갖는 8개의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열(서열번호 5-12)로 이루어진 '축퇴성' IKZF1 5'-가수분해 프로브 혼합물을 생성했다. 올리고뉴클레오티드 혼합물은 각 위치에 2개 염기의 균등 혼합물을 도입시켜 올리고뉴클레오티드 프로브 생산 동안 얻었다.
DNA는 실시예 1에 기술된 2,109명 환자 중 서브-코호트(n=308) 유래의 추가 4 mL 혈장에서 추출하였다. 회수된 바이설파이트 DNA는 올리고뉴클레오티드 서열번호 3-18을 포함하여 제조사가 추천하는 대로 마스터믹스 QuantiTect NoROX를 사용해 다중화 실시간 PCR 검정법에서 삼중 투입으로 분석하였다. 메틸화된 BCAT1 및 완전 메틸화/부분 메틸화된 IKZF1의 검출은 다음의 LC480 II 사이클 조건을 사용해 30℃의 전체 PCR 반응으로 수행하였다: 1×[95℃, 15 분], 50×[95℃, 15 초; 62℃, 40초(포획, FAM, HEX, TexRed)], 1×[40℃, 10초, 및 유지]. PCR 결과는 완전 메틸화된 BCAT1 및 IKZF1 앰플리콘만을 표적화하는 다중 PCR을 사용한 이전 데이터세트와 비교하였다.
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완전 메틸화된
앰플리콘이 필요한 IKZF1 qPCR |
부분 메틸화된
앰플리콘을 검출할 수 있는 IKZF1 qPCR |
완전 메틸화된
앰플리콘이 필요한 BCAT1 실시간 PCR |
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| 표현형 | n | +ve | % | +ve | % | +ve | % |
| 정상 | 196 | 2 | 1 | 9 | 4.6 | 15 | 8 |
| 선종 | 84 | 1 | 0 | 5 | 6.0 | 5 | 6 |
| 암 | 28 | 10 | 35.7 | 15 | 53.6 | 16 | 57.1 |
결론:
8배 축퇴성 프로브를 임상 환자 샘플에서 시험한 경우, 결장경-확진 암 샘플에 대해 유사한 양성 비율을 제공하여, 부분 메틸화로 인한 환자 거짓 음성 호출의 문제가 극복되었음을 시사한다(표 1).
실시예 3
대안적인 5'-가수분해 프로브
개질된 염기들/염기 유사체를 갖는 "축퇴성" 프로브
상기 실시예 2에서 사용된 8개 프로브는 모든 8개의 가변적으로-메틸화된 IKZF1 프로브 표적 영역을 검출하도록 설계된 단일한 "난잡" 올리고뉴클레오티드로 교체할 수 있다. 서열번호 19는 프라이머로서 서열번호 3 및 서열번호 4를 사용하고, 서열번호 5-12를 교체하였다. 서열번호 19는 서열번호 2의 가변적으로 메틸화된 형태의 상보성 가닥에 어닐링된다. 서열번호 20은 서열번호 5-12 대신 사용될 수 있고 서열번호 2로 도시된 가닥의 가변적으로 메틸화된 형태에 결합한다. 당업자는 또한 메틸화-특이적 PCR 검정은 서열번호 1에 도시된 것과 상보적인 바이설파이트-전환된 DNA 가닥으로부터 설계될 수 있음을 인지한다. 그러한 검정법은 상이한 "난잡" 올리고뉴클레오티드 프로브를 요구하고, 이들 2가지 선택안은 서열번호 21 및 서열번호 22로서 도시한다.
여기서 Z는 이노신; 무염기 스페이서; 또는 6H,8H-3,4-디히드로피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온(또는 이의 기능적 유사체)이고, X는 이노신; 무염기 스페이서; 또는 N6-메톡시-2,6-디아미노퓨린(또는 이의 기능적 유사체)이다.
서열번호 2의 센스 가닥의 검출을 위한 대안적인 '축퇴성' 5-가수분해 프로브
실시예 1(서열번호 5) 또는 실시예 2(서열번호 5-12)에서 사용된 IKZF1 프로브는 서열번호 2의 상보성 가닥에 어닐링되도록 설계된다. 당업자는 또한 서열번호 2에 결합되는 유사한 프로브를 설계할 수 있음을 인지한다. 이들 프로브는 서열번호 3 및 서열번호 4를 사용한 메틸화-특이적 PCR 검정에서 사용되고 서열번호 23-30으로 이하에 열거한다.
서열번호 1의 상보성 가닥의 바이설파이트 전환형의 검출을 위한 '축퇴성' 5'-가수분해 프로브
실시예 1 및 실시예 2에서 사용된 메틸화-특이적 PCR 검정법은 서열번호 1에 상응하는 바이설파이트-전환된 DNA 가닥에 대해 설계되었다. 당업자는 또한 메틸화-특이적 PCR 검정법이 서열번호 1에 도시된 것에 상보적인 바이설파이트-전환된 DNA 가닥으로부터 설계될 수 있음을 이해한다. 이는 서열번호 1에 상보적인 것이 아니다. 서열번호 1에 도시된 것에 상보적인 바이설파이트-전환된 DNA 가닥에서 설계된 그러한 검정법은 IKZF1의 모든 8종의 가능한 가변적으로 메틸화된 형태를 검출하기 위해 상이한 프로브가 필요하다. 이들은 증폭된 DNA의 어떤 가닥을 검출하려는지 여부에 따라, 상기 서열번호 20 및 21에 도시된 바와 같은 단일 "난잡" 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있거나, 또는 이하에 서열번호 31-38, 및 서열번호 39-46으로 도시한 8개 프로브의 2개 세트일 수 있다. 그러한 검정법은 또한 서열번호 47 및 48로서 나타낸, 추가의 메틸화-특이적 PCR 프라이머를 필요로 한다.
부분 메틸화된
IKZF1
을 증폭시키도록 설계된 "축퇴성" 프라이머의 예
완전 비메틸화된 프라이머:
당업자는 본원에 기술된 발명이 구체적으로 기술된 것들 이외에 변동 및 변형을 허용할 수 있음을 이해한다. 본 발명은 이러한 모든 변동 및 변형을 포함하는 것으로 이해한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 공동으로, 본 명세서에서 언급하거나 또는 표시한 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 어느 2 이상의 임의의 그리고 모든 조합을 포함한다.
참고 문헌 목록
SEQUENCE LISTING
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<212> DNA
<213> human
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<210> 2
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bisulfite converted and fully methylated version of diagnostic
IKZF1 amplicon
<400> 2
gacgacgtat ttttttcgtg tttcgttttg cgtttttttg cgcgtttcgc tttttgtatc 60
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<222> (8)..(8)
<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
6H,8H-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one (or a
functional analogue thereof)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
6H,8H-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one (or a
functional analogue thereof)
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
6H,8H-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one (or a
functional analogue thereof)
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<221> misc_feature
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N6-methoxy-2,6-diaminopurine (or a functional analogue thereof)
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<221> misc_feature
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N6-methoxy-2,6-diaminopurine (or a functional analogue thereof)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
N6-methoxy-2,6-diaminopurine (or a functional analogue thereof)
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ctcccnaatc nctactccna tacaaaaag 29
<210> 21
<211> 28
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<222> (6)..(6)
<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
6H,8H-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one (or a
functional analogue thereof)
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6H,8H-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one (or a
functional analogue thereof)
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
6H,8H-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one (or a
functional analogue thereof)
<400> 21
tttttnggat ngttgtttng gtataggg 28
<210> 22
<211> 28
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<222> (10)..(10)
<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
N6-methoxy-2,6-diaminopurine (or a functional analogue thereof)
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
N6-methoxy-2,6-diaminopurine (or a functional analogue thereof)
<220>
<221> misc_feature
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<223> n is either inosine; an abasic spacer; or
N6-methoxy-2,6-diaminopurine (or a functional analogue thereof)
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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<213> Artificial Sequence
<220>
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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<220>
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complementary strand of SEQ ID NO:1
<400> 43
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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<210> 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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complementary strand of SEQ ID NO:1
<400> 45
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<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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complementary strand of SEQ ID NO:1
<400> 46
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<212> DNA
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<220>
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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complementary strand of SEQ ID NO:1
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
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cctgtaccgg agcagcgatc cgggagg 27
Claims (36)
- 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화를 검출하는 방법으로서, 상기 핵산 표적은 부분 시토신 메틸화의 영역을 특징으로 할 수 있고, 상기 방법은
(i) 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제(agent)와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 부분 시토신 메틸화의 개질된 영역의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로(collectively) 혼성화할 수 있고, 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함하는 검출 방법. - 환자에서 병태를 진단하거나 또는 모니터링하는 방법으로서, 병태는 관심 핵산 표적의 시토신 메틸화의 조절을 특징으로 하고 표적은 부분 메틸화의 영역을 특징으로 하며, 상기 방법은
(i) 상기 환자 유래의 핵산 샘플을 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제와 접촉시키는 단계;
(ii) 단계 (i)의 핵산 샘플의 DNA 형태를
(a) 개질된 유전자의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(b) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 상기 1 이상의 프로브는 상기 영역에서 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화하고 상기 프로브는 검출 수단이 도입된 것인 프로브
와 접촉시키는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 DNA 샘플을 증폭시키는 단계로서, 상기 관심 표적을 따라서 상기 프라이머의 연장이 상기 혼성화된 프로브의 검출을 수행하는 것인 단계; 및
(iv) 단계 (iii)의 검출 출력을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하는 단계
를 포함하는 진단 또는 모니터링 방법. - 제2항에 있어서, 상기 병태는 신생물성 병태인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 핵산 표적은 DNA 또는 RNA 유전자 또는 유전자 영역인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA는 게놈 DNA인 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 유전자 영역은 프로모터 영역인 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 포유동물 유전자인 방법.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 대장 신생물 마커인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 대장 신생물 마커는 유전자 BCAT1 , IKZF1 , IRF4 , GRASP, CAHM , SOX21 , SLC6A15 , NPY , ST8SIA1 , ZSCAN18 , COL4A2 , DLX5 , FGF5 , FOXF1, FOXI2 또는 SDC2이고, 상기 유전자는 전사 개시 부위의 5 kb 상류를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 유전자는 IKZF1인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 방법은 IKZF1 유전자의 Chr7:50304323-50304349, Chr7:50303300-50304923 또는 Chr7:50399869-50400702 영역 중 1 이상에서 메틸화를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 비메틸화 시토신 잔기를 우라실로 개질시키는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 작용제는 바이설파이트 염인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 바이설파이트 염은 나트륨 바이설파이트 또는 암모늄 바이설파이트인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 메틸화 특이적 프라이머인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 가수분해 프로브인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 영역에서 완전 및 부분 메틸화 패턴 모두에 공동으로 혼성화하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 IKZF1이고 상기 프라이머 세트는
(i) 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 49-62 및 서열번호 63-76의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 또는
(iii) 서열번호 77 및 서열번호 78의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프라이머를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 IKZF1이고 상기 프로브 세트는
(i) 서열번호 5-12의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 19의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(iii) 서열번호 20의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 또는
(iv) 서열번호 23-30의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프로브를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 IKZF1이고, 상기 방법은 서열번호 1 영역의 상보체인 바이설파이트 전환된 DNA 가닥을 증폭시키기 위한 것이고, 상기 프라이머 세트는 서열번호 47 및 서열번호 48의 서열 중 하나 또는 둘다 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 IKZF1이고, 상기 방법은 서열번호 1 영역의 상보체인 바이설파이트 전환된 DNA 가닥을 증폭시키기 위한 것이고, 상기 프로브 세트는
(i) 서열번호 21의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 22의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(iii) 서열번호 31-38의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 및/또는
서열번호 39-46의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프로브를 포함하는 것인 방법. - 관심 핵산 표적 영역의 시토신 메틸화를 검출하기 위한 진단 키트로서, 상기 키트는
(i) 비메틸화 시토신 잔기가 증폭되어진 부분 시토신 메틸화의 상기 핵산 영역의 DNA 형태의 1 이상의 완전 또는 부분 메틸화된 형태를 증폭시키도록 설계된 정방향 및 역방향 프라이머; 및
(ii) 부분 시토신 메틸화의 상기 영역에 대한 1 이상의 프로브로서, 프로브가 2 이상의 상이한 메틸화 패턴에 공동으로 혼성화할 수 있는 것인 프로브
를 포함하는 것인 진단 키트. - 제22항에 있어서, 상기 프라이머는 메틸화 특이적 프라이머인 진단 키트.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 프로브는 가수분해 프로브인 진단 키트.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 영역의 완전 및 부분 메틸화 패턴 모두에 공동으로 혼성화하는 것인 진단 키트.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 비메틸화 시토신 잔기를 개질시키는 작용제를 부가적으로 포함하는 것인 진단 키트.
- 제26항에 있어서, 상기 작용제는 바이설파이트 염인 진단 키트.
- 제27항에 있어서, 상기 바이설파이트 염은 나트륨 바이설파이트 또는 암모늄 바이설파이트인 진단 키트.
- 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 증폭 및/또는 검출을 실시하기 위한 시약을 부가적으로 포함하는 것인 진단 키트.
- 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 핵산 표적은 BCAT1, IKZF1, IRF4, GRASP, CAHM, SOX21, SLC6A15, NPY, ST8SIA1, ZSCAN18, COL4A2, DLX5, FGF5, FOXF1, FOXI2 또는 SDC2 중 1 이상인 진단 키트.
- 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 핵산 표적은 IKZF1인 진단 키트.
- 제31항에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브는 IKZF1 유전자의 Chr7:50304323-50304349, Chr7:50303300-50304923 또는 Chr7:50399869-50400702 영역 중 1 이상에서 메틸화를 검출하기 위한 것인 진단 키트.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 프라이머 세트는
(i) 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 49-62 및 서열번호 63-76의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 또는
(iii) 서열번호 77 및 서열번호 78의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프라이머를 포함하는 것인 진단 키트. - 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브 세트는
(i) 서열번호 5-12의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 19의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(iii) 서열번호 20의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 또는
(iv) 서열번호 23-30의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프로브를 포함하는 것인 진단 키트. - 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 유전자는 IKZF1이고, 상기 방법은 서열번호 1 영역의 상보체인 바이설파이트 전환된 DNA 가닥을 증폭시키기 위한 것이고 상기 프라이머 세트는 서열번호 47 및 서열번호 48의 서열 중 하나 또는 둘다 또는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 것인 진단 키트.
- 제31항, 제32항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 IKZF1이고, 상기 방법은 서열번호 1 영역의 상보체인 바이설파이트 전환된 DNA 가닥을 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브 세트는
(i) 서열번호 21의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(ii) 서열번호 22의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열;
(iii) 서열번호 31-38의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열; 및/또는
서열번호 39-46의 서열 또는 실질적으로 유사한 서열
중 1 이상을 포함하는 프로브를 포함하는 것인 진단 키트.
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