JP2017517262A - メチル化分析のための方法 - Google Patents
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- C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
- C12Q2523/125—Bisulfite(s)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/161—Modifications characterised by incorporating target specific and non-target specific sites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/101—Taqman
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
Description
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)DNA又はRNA試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された遺伝子領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、前記遺伝子標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)DNA試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を
(a)修飾された遺伝子の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、前記遺伝子に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記DNA標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズする加水分解プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)の試料を増幅させ、対象の前記DNA標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の完全及び部分的メチル化パターンすべてにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)DNA試料を亜硫酸水素ナトリムに接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を
(a)修飾された遺伝子の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも2つの領域の異なるメチル化パターンにハイブリダイズする加水分解プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記DNA標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)前記患者由来の核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)修飾された遺伝子の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)DNA又はRNA試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)DNAの形態であるステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された遺伝子領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、前記遺伝子標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(1)BCAT1:chr12:24810024-24949459
(2)IKZF1:chr7:50304083-50405100
(3)IRF4:chr6:391739-411443
(4)GRASP:chr12:52006945-52015889
(5)CAHM:chr6:163413065-163413950
(6)SOX21:chr13:94709625-94712135
(7)SLC6A15:chr12:84859488-84912829
(8)NPY:chr7:24284188-24291865
(9)ST8SIA1:chr12:22193391-22334714
(10)ZSCAN18:chr19:58083842-58098363
(11)COL4A2:chr13:110307284-110513026
(12)DLX5:chr7:97020390-97024831
(13)FGF5:chr4:80266588-80291017
(14)FOXF1:chr16:86510527-86514464
(15)FOXI2:chr10:127737274-127741186
(16)SDC2:chr8:96493654-96611809
CCTGTAC mCGGAGCAG mCGATCmCGGGAGG
であり、mCはメチル化されたシトシンを表し、Cはメチル化されていないシトシンを表す。
CCTGTACCGGAGCAG mCGATCmCGGGAGG (配列番号80)
CCTGTAC mCGGAGCAGCGATCmCGGGAGG (配列番号81)
CCTGTAC mCGGAGCAGmCGATCCGGGAGG (配列番号82)
CCTGTACCGGAGCAGCGATCmCGGGAGG (配列番号83)
CCTGTACCGGAGCAG mCGATCCGGGAGG (配列番号84)
CCTGTAC mCGGAGCAGCGATCCGGGAGG (配列番号85)
CCTGTACCGGAGCAGCGATCCGGGAGG (配列番号86)
である。
(i)DNA試料をメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を
(a)修飾された遺伝子の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、前記遺伝子に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的メチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を亜硫酸水素塩薬剤に接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズする加水分解プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の完全及び部分的メチル化パターンすべてにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)DNA試料を亜硫酸水素ナトリムに接触させてメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換するステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA試料を
(a)修飾された遺伝子の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたメチル化特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数の加水分解プローブであって、一括して、前記領域の少なくとも2つの領域の異なるメチル化パターンにハイブリダイズする、加水分解プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記DNA標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法が提供される。
配列番号3(フォワードプライマー):Chr7: 50304271 GACGACGTAT TTTTTTCGTG TTTC 50304294
配列番号4(リバースプライマー):Chr7: 50304365 GCGCACCTCT CGACCG 50304350
又は実質的に類似した配列を含み、前記プローブは配列:
配列番号5:Chr7:50304323 TTTGTATCGG AGTAGCGATT CGGGAGG50304349
配列番号6:Chr7:50304323 TTTGTATCGG AGTAGCGATT TGGGAGG50304349
配列番号7:Chr7:50304323 TTTGTATCGG AGTAGTGATT CGGGAGG50304349
配列番号8:Chr7:50304323 TTTGTATTGG AGTAGCGATT CGGGAGG50304349
配列番号9:Chr7:50304323 TTTGTATCGG AGTAGTGATT TGGGAGG50304349
配列番号10: Chr7:50304323 TTTGTATTGGAGTAGCGATT TGGGAGG 50304349
配列番号11: Chr7:50304323 TTTGTATTGGAGTAGTGATT CGGGAGG 50304349
配列番号12: Chr7:50304323 TTTGTATTGGAGTAGTGATT TGGGAGG 50304349
又は実質的に類似した配列を含む。
配列番号1(IKZF1診断用領域−野生型DNA):
Chr7: 50304271 GACGACGCACCCTCTCCGTG TCCCGCTCTG CGCCCTTCTG CGCGCCCCGC
TCCCTGTACC GGAGCAGCGA TCCGGGAGGC GGCCGAGAGGTGCGC 50304365
という文脈では、以下のシトシンは結腸由来新生物DNA(Chr7、GRCh38/Hg38座標):50304273、50304276、50304287、50304294、50304301、50304311、50304313、50304318、50304330、50304338、50304343、50304350、50304354、50304363、50304365において高頻度でメチル化されていることが確定されている。本発明のこの実施形態は、シトシン残基50304330、50304338及び50304343上での部分的メチル化を求めてスクリーニングすることを目的とする。血漿から単離され回収された亜硫酸水素塩変換DNAにおけるIKZF1遺伝子座のこれら3つのCpG部位にわたるメチル化の任意の組合せを検出することを使用すれば、結腸直腸がんに対する診断感度を高めることが可能である。この実施形態に従って、DNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理するとシトシンはウラシルに変換されるが、5’メチルシトシン残基は影響を受けないままである。その疾患特異的メチル化がシトシン残基50304273、50304276、50304287、50304294、50304350、50304354、50304363及び50304365すべてに必要とされる配列番号2に特異的にプライムするPCRオリゴヌクレオチドプライマーが設計される(配列番号3及び4)。3つのシトシン残基50304330、50304338及び50304343のいずれか(又はいずれでもない)のメチル化は縮重加水分解プローブ混合物(配列番号5〜12)(例えば、TaqMan縮重プローブ混合物)を使用して検出される。
(i)1つの合成における8倍重複(合成中にCとTを混ぜることにより);
(ii)3つの異なる2倍重複プローブ及び混合された;
(iii)1つの2倍及び1つの4倍重複プローブ及び混合された;又は
(iv)8つの異なる独特のプローブ及び混合された
として合成することができる(IKZF1例という文脈において)。
(i)前記患者由来の核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)修飾された遺伝子の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む方法を対象とする。
(i)部分的シトシンメチル化を受けた前記核酸領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態のDNA形態であって、メチル化されていないシトシン残基が修飾されているDNA形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、
(ii)少なくとも2つの異なるメチル化パターンに一括してハイブリダイズすることができる、部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられた1つ又は複数のプローブ
を含むキットが提供される。
(i)配列番号3及び配列番号4配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号49〜62及び配列番号63〜76配列若しくは実質的に類似した配列、又は
(iii)配列番号77及び配列番号78配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプライマーが含まれる。
(i)配列番号5〜12配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号19配列若しくは実質的に類似した配列、
(iii)配列番号20配列若しくは実質的に類似した配列、又は
(iv)配列番号23〜30配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプローブが含まれる。
(i)配列番号21配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号22配列若しくは実質的に類似した配列、
(iii)配列番号31〜38配列若しくは実質的に類似した配列、及び/又は配列番号39〜46配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプローブが含まれる。
血漿は、134人のがん患者を含む2,109人の結腸内視鏡検査被検者から採取した。無細胞DNAはQS CNA 4mL血漿キット(Qiagen)を使用して製造業者が推奨する通りにQIASymphony上で抽出した。こうして得られたDNAは亜硫酸水素塩変換され、EpiTect Fast及びEpiTect Plusキットを使用して製造業者(Qiagen)が推奨する通りにQIACubes上で精製した。回収した亜硫酸水素塩変換DNAを多重化リアルタイムPCRアッセイにおいて、BCAT1亜硫酸水素塩変換及びメチル化特異的オリゴ(chr12:24949058〜24949159上に存在する102nt増幅産物を標的とする配列番号13、14及び15)及び第7染色体上の対照DNA遺伝子、ACTBを標的とした亜硫酸水素塩変換特異的オリゴヌクレオチド配列番号16、17、18に加えて、オリゴヌクレオチド配列番号3、配列番号4及び配列番号5を含むマスターミックスQuantiTect NoROXを使用して製造業者が推奨する通りに3連で入力として分析した。
配列番号1(IKZF1診断領域−野生型DNA)
Chr7: 50304271 GACGACGCACCCTCTCCGTG TCCCGCTCTG CGCCCTTCTG CGCGCCCCGCTCCCTGTACC GGAGCAGCGA TCCGGGAGGC GGCCGAGAGGTGCGC 50304365
配列番号2(PCR増幅後、亜硫酸水素塩変換され完全にメチル化されたバージョンの配列番号1)
Chr7: 50304271 GACGACGTATTTTTTTCGTG TTTCGTTTTG CGTTTTTTTG CGCGTTTCGC
TTTTTGTATC GGAGTAGCGA TTCGGGAGGC GGTCGAGAGGTGCGC(G) 50304365
配列番号3 Chr7: 50304271 GACGACGTATTTTTTTCGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号4 Chr7: 50304365 GCGCACCTCTCGACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号5 Chr7: 50304323 TTTGTATCGGAGTAGCGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブA)
配列番号6 Chr7: 50304323 TTTGTATCGGAGTAGCGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブB)
配列番号7 Chr7: 50304323 TTTGTATCGGAGTAGTGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブC)
配列番号8 Chr7: 50304323 TTTGTATTGGAGTAGCGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブD)
配列番号9 Chr7: 50304323 TTTGTATCGGAGTAGTGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブE)
配列番号10 Chr7: 50304323 TTTGTATTGGAGTAGCGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブF)
配列番号11 Chr7: 50304323 TTTGTATTGGAGTAGTGATT CGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブG)
配列番号12 Chr7: 50304323 TTTGTATTGGAGTAGTGATT TGGGAGG 50304349 (IKZF1プローブH)
配列番号13: Chr12:24949058 GTTTTTTTGTTGATGTAATT CGTTAGGTC 24949086 (BCAT1 FWD)
配列番号14: Chr12:24949159 CAATACCCGAAACGACGACG 24949140 (BCAT1 REV)
配列番号15: Chr12:24949094 TTCGTCGCGAGAGGGTCGGTT 24949114 (BCAT1プローブ)
配列番号16: Chr7:5532633 GGAGTTTTTGTTTTTTGGTT AGTTG 5532609 (ACTB FWD)
配列番号17: Chr7:5532545 CAAAATAAAATACAAAACAA ACCTAATCC 5532573 (ACTB REV)
配列番号18: Chr7:5532607 ATGGAGGTTTAGTGGTAATA TAGGTTTTGT TTGG 5532574 (ACTBプローブ)
134個のがんのうち、74個及び62個はそれぞれBCAT1及びIKZF1メチル化について陽性であった。BCAT1メチル化陽性であるがIKZF1メチル化陰性であったPCR反応由来のPCR産物は希釈し、配列番号3及び配列番号4プライマーのみを含むSYBR−グリーンIKZF1アッセイを使用して再増幅した。生じたPCR産物は、約100bpのPCR産物が生成されたかどうかを明らかにするためにアガロースゲル上に流し、これが生成されていればメチル化されたIKZF1 DNAが存在することが確認されると考えられ、しかし、その存在は、「完全にメチル化された」IKZF1プローブ(配列番号5)の下で3つのCpG部位を含めて、完全にメチル化されたIKZF1標的を必要とする多重化PCRアッセイのせいで最初は検出されなかったと考えられる。実施例1において生じたアガロース分離されたPCR産物は精製され塩基配列決定され、メチル化されていないCpG残基50304330、50304338及び50304343の2つの場合を含めていくつかのPCR産物において部分的メチル化の証拠が明らかになり、これは「完全メチル化」を必要とするIKZF1プローブ(配列番号5)が他の点では結腸内視鏡検査で確認されたがんにおいて偽陰性IKZF1結果を生じた理由を説明すると考えられる。部分的メチル化はIKZF1増幅産物において他のCpG部位でも観察された、図1。
IKZF1加水分解プローブ領域における部分的メチル化の明確な証拠は、塩基配列決定された増幅産物の3つについて得られた。これらのうちの2つは結腸内視鏡検査で確認されたがんであり、完全にメチル化されたIKZF1 DNAを検出するように設計されたプローブを用いた最初のIKZF1リアルタイムPCRアッセイでは陰性であった。
標的IKZF1増幅産物配列(配列番号2)に包埋された部分的にメチル化されたCpG部位の検出に続いて、ゲノム座標Chr7:50304330、Chr7:50304338及びChr7:50304343に対応する3つの残基位置のそれぞれにシトシン又はチミジン塩基のどちらかを有する8つの異なるオリゴヌクレオチド配列(配列番号5〜12)からなる「縮重」IKZF1 5’−加水分解プローブ混合物を作製した。オリゴヌクレオチド混合物は、2つの塩基の等しい混合物をそれぞれの位置に組み込むことによりオリゴヌクレオチドプローブ作製において得られた。
臨床患者試料で8倍縮重プローブを試験すると、結腸内視鏡検査で確認されたがん試料においてBCAT1に類似した陽性率が得られ、部分的メチル化に起因する患者偽陰性呼出しの問題が克服されていることを示している、表1。
修飾された塩基/塩基類似体を有する「縮重」プローブ
上記実施例2において使用された8つのプローブは、8つの不定にメチル化されたIKZF1プローブ標的領域すべてを検出するように設計された単一「無差別」オリゴヌクレオチドで置き換えることができた。配列番号19はプライマーとしての配列番号3及び配列番号4と一緒に使用し、配列番号5〜12に取って代わると考えられる。配列番号19は配列番号2の不定にメチル化されたバージョンの相補鎖にアニールすると考えられる。配列番号20も配列番号5〜12に代わって使用することができ、配列番号2として示される鎖の不定にメチル化されたバージョンに結合すると考えられる。当業者であれば、メチル化特異的PCRアッセイは、配列番号1として示される鎖の相補体である亜硫酸水素塩変換DNA鎖から設計することができることも理解すると考えられる。そのようなアッセイは異なる「無差別な」オリゴヌクレオチドプローブを必要とすると考えられ、これら2つの選択肢は配列番号21及び配列番号22として示される。
配列番号19: Chr7: 50304323 TTTGTATZGGAGTAGZGATT ZGGGAGG 50304349
配列番号20: Chr7: 50304348 CTCCCXAATC XCTACTCCXATACAAAAAG 50304320
配列番号21: Chr7: 50304349 TTTTTZGGATZGTTGTTTZG GTATAGGG 50304322
配列番号22: Chr7: 50304322 CCCTATACCXAAACAACXAT CCXAAAAA 50304349
Zはイノシン、脱塩基スペーサー、又は6H,8H−3,4−ジヒドロピリミド[4,5−c][1,2]オキサジン−7−オン(又は、その機能的類似体)のいずれかであり、Xはイノシン、脱塩基スペーサー、又はN6−メトキシ−2,6−ジアミノプリン(又は、その機能的類似体)のいずれかである。
実施例1(配列番号5)又は実施例2(配列番号5〜12)において使用されるIKZF1プローブは、配列番号2の相補鎖にアニールするように設計される。当業者であれば、配列番号2に結合すると考えられる類似プローブを設計できることも理解するであろう。これらのプローブは配列番号3及び配列番号4を用いたメチル化特異的PCRアッセイにおいて使用されると考えられ、配列番号23〜30として下に収載されている。
配列番号23: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCGCTACTCCGA TACAAAAAG 50304320
配列番号24: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCGCTACTCCGA TACAAAAAG 50304320
配列番号25: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCACTACTCCGA TACAAAAAG 50304320
配列番号26: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCGCTACTCCAA TACAAAAAG 50304320
配列番号27: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCACTACTCCGA TACAAAAAG 50304320
配列番号28: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCGCTACTCCAA TACAAAAAG 50304320
配列番号29: Chr7: 50304348 CTCCCGAATCACTACTCCAA TACAAAAAG 50304320
配列番号30: Chr7: 50304348 CTCCCAAATCACTACTCCAA TACAAAAAG 50304320
実施例1及び実施例2において使用されるメチル化特異的PCRアッセイは、配列番号1に対応する亜硫酸水素塩変換DNA鎖に対して設計される。当業者であれば、メチル化特異的PCRアッセイは配列番号1として示される鎖の相補体である亜硫酸水素塩変換DNA鎖から設計することができることも理解すると考えられる。これは配列番号2の相補体ではないであろう。配列番号1として示される鎖の相補体である亜硫酸水素塩変換DNA鎖から設計されるそのようなアッセイは、8つの考えうる不定にメチル化された形態のIKZF1すべてを検出するためには異なるプローブが必要だと考えられる。これらのプローブは増幅されているDNAのどちらの鎖が検出されているのかに応じて、上の配列番号20及び21に示される単一の「無差別な」オリゴヌクレオチドプローブであっても可能であり、又は下の配列番号31〜38、及び配列番号39〜46に示される8つのプローブの2セットでも可能である。そのようなアッセイは追加のメチル化特異的PCRプライマーも必要になると考えられ、それは配列番号47及び48として示されている。
配列番号31: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATCGTTGTTTCG GTATAGGG 50304322
配列番号32: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATCGTTGTTTTG GTATAGGG 50304322
配列番号33: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATTGTTGTTTCG GTATAGGG 50304322
配列番号34: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATCGTTGTTTCG GTATAGGG 50304322
配列番号35: Chr7: 50304349 TTTTTCGGATTGTTGTTTTG GTATAGGG 50304322
配列番号36: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATCGTTGTTTTG GTATAGGG 50304322
配列番号37: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATTGTTGTTTCG GTATAGGG 50304322
配列番号38: Chr7: 50304349 TTTTTTGGATTGTTGTTTTG GTATAGGG 50304322
配列番号39: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACGAT CCGAAAAA 50304349
配列番号40: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACGAT CCGAAAAA 50304349
配列番号41: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACAAT CCGAAAAA 50304349
配列番号42: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACGAT CCAAAAAA 50304349
配列番号43: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACAAT CCGAAAAA 50304349
配列番号44: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACGAT CCAAAAAA 50304349
配列番号45: Chr7: 50304322 CCCTATACCGAAACAACAAT CCAAAAAA 50304349
配列番号46: Chr7: 50304322 CCCTATACCAAAACAACAAT CCAAAAAA 50304349
配列番号47: Chr7: 50304366 CGCGTATTTTTCGGTC 50304351
配列番号48: Chr7: 50304273 CGACGCACCCTCTCCG 50304288
配列番号49 Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTCGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号50 Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTCGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号51 Chr7: 50304271 GACGACGTAT TTTTTTTGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号52 Chr7: 50304271 GACGACGTATTTTTTTCGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号53 Chr7: 50304271 GATGATGTAT TTTTTTCGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号54 Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTTGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号55 Chr7: 50304271 GACGACGTAT TTTTTTTGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号56 Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTTGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号57 Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTCGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号58 Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTCGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号59 Chr7: 50304271 GATGATGTATTTTTTTTGTG TTTC 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号60 Chr7: 50304271 GATGATGTAT TTTTTTCGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号61 Chr7: 50304271 GATGACGTAT TTTTTTTGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号62 Chr7: 50304271 GACGATGTAT TTTTTTTGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号63 Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CGACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号64 Chr7: 50304365 GCACACCTCT CGACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号65 Chr7: 50304365 GCGCACCTCT CAACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号66 Chr7: 50304365 GCGCACCTCT CGACCA 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号67 Chr7: 50304365 ACACACCTCT CGACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号68 Chr7: 50304365 GCACACCTCT CAACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号69 Chr7: 50304365 GCGCACCTCT CAACCA 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号70 Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CAACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号71 Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CGACCA 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号72 Chr7: 50304365 GCACACCTCT CGACCA 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号73 Chr7: 50304365 ACACACCTCT CAACCG 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号74 Chr7: 50304365 ACACACCTCT CGACCA 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号75 Chr7: 50304365 ACGCACCTCT CAACCA 50304350 (IKZF1 REV)
配列番号76 Chr7: 50304365 GCACACCTCT CAACCA 50304350 (IKZF1 REV)
完全にメチル化されていないプライマー:
配列番号77 Chr7: 50304271 GATGATGTAT TTTTTTTGTG TTTT 50304294 (IKZF1 FWD)
配列番号78 Chr7: 50304365 ACACACCTCT CAACCA 50304350 (IKZF1 REV)
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Claims (36)
- 対象の核酸標的のシトシンメチル化を検出するための方法であって、前記核酸標的は部分的シトシンメチル化を受けた領域により特徴付けることができ、前記方法が、
(i)核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)部分的シトシンメチル化を受け修飾された領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズすることができ、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む、方法。 - 患者における状態を診断する又はモニターするための方法であって、前記状態は対象の核酸標的のシトシンメチル化の調節により特徴付けられ、前記標的は部分的メチル化を受けた領域により特徴付けられ、前記方法が、
(i)前記患者由来の核酸試料を、メチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤に接触させるステップと、
(ii)ステップ(i)のDNA形態の核酸試料を
(a)修飾された遺伝子の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(b)部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられている1つ又は複数のプローブであって、前記1つ又は複数のプローブは、一括して、前記領域の少なくとも2つの異なるメチル化パターンにハイブリダイズし、前記プローブに検出手段が組み込まれている、プローブ
に接触させるステップと、
(iii)ステップ(ii)のDNA試料を増幅させ、対象の前記標的に沿った前記プライマーの伸長が前記ハイブリダイズしたプローブの検出を成し遂げるステップと、
(iv)ステップ(iii)の検出出力を定性的に又は定量的に分析するステップと
を含む、方法。 - 前記状態が新生物状態である、請求項2に記載の方法。
- 対象の前記核酸標的がDNA若しくはRNA遺伝子又は遺伝子領域である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAがゲノムDNAである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子領域がプロモーター領域である、請求項4又は請求項5に記載の方法。
- 前記遺伝子が哺乳動物遺伝子である、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子が大腸新生物マーカーである、請求項4〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記大腸新生物マーカーが遺伝子BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2又はSDC2であり、前記遺伝子は転写開始部位の5kb上流を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記遺伝子がIKZF1である、請求項9に記載の方法。
- IKZF1遺伝子のChr7:50304323〜50304349、Chr7:50303300〜50304923又はChr7:50399869〜50400702領域のうちの1つ又は複数のメチル化を検出することを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記薬剤がメチル化されていないシトシン残基をウラシルへと修飾する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤が亜硫酸水素塩である、請求項12に記載の方法。
- 前記亜硫酸水素塩が亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムである、請求項13に記載の方法。
- 前記プライマーがメチル化特異的プライマーである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブが加水分解プローブである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブが、一括して、前記領域の完全及び部分的メチル化パターンすべてにハイブリダイズする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子がIKZF1であり、前記プライマーセットには
(i)配列番号3及び配列番号4配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号49〜62及び配列番号63〜76配列若しくは実質的に類似した配列、又は
(iii)配列番号77及び配列番号78配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプライマーが含まれる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子がIKZF1であり、前記プローブセットには
(i)配列番号5〜12配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号19配列若しくは実質的に類似した配列、
(iii)配列番号20配列若しくは実質的に類似した配列、又は
(iv)配列番号23〜30配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプローブが含まれる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。 - 前記遺伝子がIKZF1であり、前記方法が配列番号1領域の相補体である亜硫酸水素塩変換DNA鎖を増幅させることを目的とし、前記プライマーセットには配列番号47及び配列番号48配列又は実質的に類似した配列のうちの1つ又は両方を含むプライマーが含まれる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子がIKZF1であり、前記方法が配列番号1領域の相補体である亜硫酸水素塩変換DNA鎖を増幅させることを目的とし、前記プローブセットには、
(i)配列番号21配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号22配列若しくは実質的に類似した配列、
(iii)配列番号31〜38配列若しくは実質的に類似した配列、及び/又は配列番号39〜46配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプローブが含まれる、請求項1〜17又は20のいずれか一項に記載の方法。 - 対象の核酸標的の領域のシトシンメチル化を検出するための診断キットであって、
(i)部分的シトシンメチル化を受けた前記核酸領域の、1つ又は複数の完全に又は部分的にメチル化された形態のDNA形態であって、メチル化されていないシトシン残基が修飾されているDNA形態を増幅させるように設計されたフォワード及びリバースプライマー、並びに
(ii)少なくとも2つの異なるメチル化パターンに一括してハイブリダイズすることができる、部分的シトシンメチル化を受けた前記領域に向けられた1つ又は複数のプローブ
を含む診断キット。 - 前記プライマーがメチル化特異的プライマーである、請求項22に記載のキット。
- 前記プローブが加水分解プローブである、請求項22又は23に記載のキット。
- 前記プローブが前記領域の完全及び部分的メチル化パターンのすべてに一括してハイブリダイズする、請求項22〜24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記キットがメチル化されていないシトシン残基を修飾する薬剤をさらに含む、請求項22〜25のいずれか一項に記載のキット。
- 前記薬剤が亜硫酸水素塩である、請求項26に記載のキット。
- 前記亜硫酸水素塩が亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素アンモニウムである、請求項27に記載のキット。
- 前記キットがDNA増幅及び/又は検出を成し遂げる試薬をさらに含む、請求項22〜28のいずれか一項に記載のキット。
- 対象の前記核酸標的がBCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2又はSDC2のうちの1つ又は複数である、請求項22〜29のいずれか一項に記載のキット。
- 対象の前記核酸標的がIKZF1である、請求項22〜30のいずれか一項に記載のキット。
- 前記プライマー及びプローブがIKZF1遺伝子のChr7:50304323〜50304349、Chr7:50303300〜50304923又はChr7:50399869〜50400702領域のうちの1つ又は複数のメチル化を検出することを目的とする、請求項31に記載のキット。
- プライマーセットが、
(i)配列番号3及び配列番号4配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号49〜62及び配列番号63〜76配列若しくは実質的に類似した配列、又は
(iii)配列番号77及び配列番号78配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプライマーを含む、請求項31又は32に記載のキット。 - プローブセットが、
(i)配列番号5〜12配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号19配列若しくは実質的に類似した配列、
(iii)配列番号20配列若しくは実質的に類似した配列、又は
(iv)配列番号23〜30配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプローブを含む、請求項31〜33のいずれか一項に記載のキット。 - 前記遺伝子がIKZF1であり、前記方法が配列番号1領域の相補体である亜硫酸水素塩変換DNA鎖を増幅させることを目的とし、前記プライマーセットには配列番号47及び配列番号48配列又は実質的に類似した配列のうちの1つ又は両方を含むプライマーが含まれる、請求項31又は32に記載のキット。
- 前記遺伝子がIKZF1であり、前記方法が配列番号1領域の相補体である亜硫酸水素塩変換DNA鎖を増幅させることを目的とし、前記プローブセットには、
(i)配列番号21配列若しくは実質的に類似した配列、
(ii)配列番号22配列若しくは実質的に類似した配列、
(iii)配列番号31〜38配列若しくは実質的に類似した配列、及び/又は配列番号39〜46配列若しくは実質的に類似した配列
のうちの1つ又は複数を含むプローブが含まれる、請求項31〜32又は35のいずれか一項に記載のキット。
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