CN106687600B

CN106687600B - 用于甲基化分析的方法

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Publication number: CN106687600B
Application number: CN201580039261.7A
Authority: CN
Inventors: 苏珊·彼得森; 罗恩·贝克
Original assignee: Clinical Genomics Pty Ltd
Current assignee: Clinical Genomics Pty Ltd
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2015-06-01
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2035-06-01
Also published as: US20170145485A1; SG11201610113YA; WO2015184498A3; ZA201608367B; AU2015271641A1; DK3152332T3; WO2015184498A2; KR20170012552A; BR112016028442A2; AU2015271641B2; PH12016502411A1; IL249331A0; EP3152332B1; US10590468B2; CA2950953A1; EP3152332A2; JP6810612B2; MX2016016062A; CN106687600A; JP2017517262A

Abstract

本发明一般地涉及用于评估核酸甲基化(特别是DNA和RNA甲基化)的方法。更具体地，本发明涉及以改善的灵敏度定性或定量评估部分甲基化的DNA或RNA的胞嘧啶甲基化的方法。本发明的方法可用于一系列应用，所述应用包括但不限于病症的诊断或以DNA或RNA甲基化变化为特征的发育表型的监测。

Description

用于甲基化分析的方法

技术领域

背景技术

在本说明书中对任何现有出版物(或从其得到的信息)或任何已知的事物的引用不是并且不应被视为认可或承认或任何形式的暗示：该先前出版物(或从其获得的信息)或已知事物形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。

本说明书中作者提及的出版物的书目细节在说明书结尾以字母顺序汇总。

DNA甲基化是哺乳动物中研究最密集的表观遗传修饰之一，其是指在胞嘧啶(C)或腺嘌呤核苷酸处添加甲基(CH₃)。甲基可以添加到胞嘧啶碱基的第五个碳原子或腺嘌呤碱基的第六个氮原子处。

DNA甲基化在动物细胞中的基因调节中起作用。不仅活性基因转录和低甲基化(hypo-methylation)之间有相关性，而且转染实验显示甲基部分的存在抑制体内基因表达。此外，可以通过用5-氮杂胞苷(一种有效的去甲基化试剂)处理细胞诱导基因活化。甲基化似乎通过影响DNA与染色质蛋白和特异性转录因子的相互作用来影响基因表达。尽管甲基化模式在体细胞中非常稳定，但早期胚胎的特征在于DNA甲基化的大的改变。

因此DNA甲基化对健康生长和发育至关重要，并且与多种过程如基因组印记、致癌作用和重复元件的抑制相关。它还能够抑制逆转录病毒基因以及已经进入并可能损害宿主的其他潜在危险的DNA序列的表达。此外，DNA甲基化在癌症的发展中起重要作用，并且是基因转录的关键调节子。研究表明，具有含有高浓度5-甲基胞嘧啶之启动子区的基因是转录沉默的。

在哺乳动物中所有CpG中的60％至90％被甲基化。甲基化的胞嘧啶残基随时间自发地脱氨基以形成T残基；因此甲基化的CpG二核苷酸稳定地脱氨基成为TpG二核苷酸，这通过人类基因组中CpG二核苷酸的低存在(它们仅以预期频率的21％出现)来证明。CpG通常分组在称为CpG岛的簇中，其通常存在于许多基因的5’调节区域中。

随着监测DNA甲基化水平的诊断效用的证据越来越多，用于可靠和准确地评估DNA甲基化的手段变得越来越重要。目前，甲基化特异性PCR是用于检测经亚硫酸氢盐(bisulphite)转变的DNA中的甲基化DNA的常用方法。在该方法中，PCR寡核苷酸引物探查胞嘧啶-磷酸二酯-鸟嘌呤[CpG]位点中的甲基化胞嘧啶残基。MethyLight PCR是实时PCR变体，其除了甲基化特异性引物之外，还使用5’-3’水解探针来探查甲基化的CpG位点，从而使得能够进行定量。

最近，RNA也显示含有甲基化的胞嘧啶残基以及甲基化的腺嘌呤残基(Liu和Jia，2014；J Genet Genomics.41(1)：21-33)。虽然甲基化胞嘧啶在RNA中的生物学作用尚不清楚，但它是mRNA中的丰富修饰，表明其可能是RNA表观遗传标志物。在导向本发明的工作中，已经确定，在基于筛选给定基因的甲基化模式之变化的一些诊断应用的情况下，当在富含CpG的目的靶标区域上存在部分甲基化时，诊断结果的准确性显著降低。这是由于以下事实，即常用的甲基化特异性PCR基于需要所有被靶向的CpG位点被甲基化的寡核苷酸。例如，基于探针的方法(例如MethyLight)需要所有探查的CpG位点被甲基化以使探针杂交，从而成功检测给定的甲基化DNA或RNA靶标。当一个或更多个CpG位点未被甲基化时，探针不能结合，从而使得到的结果偏差并显著降低诊断灵敏度。例如，在本发明的一个方面，已经确定IKZF1基因的启动子区的甲基化在结直肠癌组织中以高频发生，并且在血液中存在的细胞游离DNA中检测到甲基化的IKZF1 DNA表明存在结直肠癌。然而，另一些研究已经证明某些结直肠癌患者含有来自于循环肿瘤的IKZF1 DNA，其中不是所有靶向的CpG位点都是甲基化的。因此，寡核苷酸，例如设计为跨越IKZF1 DNA内的甲基化CpG位点的水解探针，不允许检测部分甲基化的IKZF1 DNA。因此，具有部分甲基化的IKZF1 DNA的结直肠癌患者将因此报道为阴性。

因此，需要开发能够精确和灵敏地检测DNA或RNA甲基化，从而提高用于DNA或RNA甲基化分析的应用(例如诊断或监测肿瘤疾病)之灵敏度的改进方法。在另一些工作中，已经确定可以通过使用一种或更多种探针和/或引物来降低或消除假阴性结果的问题，所述探针和/或引物设计成作为整体(collectively)检测给定的目的DNA或RNA区域内的至少两种不同的甲基化模式。

发明内容

在整个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包含”及其变体例如“包括”和“含有”将被理解为表示包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。

如本文所使用的，术语“源自”应当被认为是指示特定的整数或整数组来自所指定的物种，但不一定直接从指定的来源获得。此外，如本文所使用的，没有数量词修饰的单数形式包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。

除非另有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

本说明书包含在文献目录后出现的使用程序PatentIn Version 3.5制作的核苷酸序列信息。每个核苷酸序列在序列表中通过数字指示符＜210＞后的序列标识符来确定(例如＜210＞1，＜210＞2等)。每个序列的长度、序列类型(DNA等)和来源生物体分别由数字指示符字段(indicator field)＜211＞、＜212＞和＜213＞中提供的信息指示。本说明书中提及的核苷酸序列由指示符SEQ ID NO：后的序列标识符指示(例如SEQ ID NO：1，SEQID NO：2等)。在本说明书中提及的序列标识符与在序列表中的数字指示符字段＜400＞中提供的信息相关，其后面是序列标识符(例如＜400＞1，＜400＞2等)。即，本说明书中详述的SEQ ID NO：1与序列表中表示为＜400＞1的序列相关。

本发明的一个方面涉及用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，其中所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)所述核酸样品的DNA形式与以下接触：

(a)设计成扩增经修饰的部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物；和

(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针能够作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iii)扩增步骤(ii)所述的DNA样品，其中所述引物沿着所述目的靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

本发明的另一个方面涉及用于检测目的DNA或RNA靶标的胞嘧啶甲基化的方法，其中所述DNA或RNA靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使DNA或RNA样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)所述样品的DNA形式与以下接触：

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一个方面，提供了用于检测基因靶标的胞嘧啶甲基化的方法，其中所述基因靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)所述核酸样品的DNA形式与以下接触：

(a)设计成扩增经修饰的部分胞嘧啶甲基化的基因区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物；和

(iii)扩增步骤(ii)所述的DNA样品，其中所述引物沿着所述基因靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一方面，提供了用于检测基因BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2的胞嘧啶甲基化的方法，所述基因的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使DNA样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)的DNA样品与以下接触：

(a)设计成扩增经修饰基因的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物；和

(b)导向所述部分甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针能够作为整体与所述区域处的至少两种不同甲基化模式杂交，并且将其中所述探针并入有检测装置；

(iii)扩增步骤(ii)的DNA样品，其中所述引物沿着所述基因的延伸实现所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一方面，提供了用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与亚硫酸氢盐试剂接触以将未甲基化胞嘧啶残基转变为尿嘧啶；

(ii)使步骤(i)的核酸样品的DNA形式与以下接触：

(b)导向所述部分甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针能够在所述区域共同地与至少两种不同的甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iii)扩增步骤(ii)的DNA样品，其中所述引物沿着所述目的DNA靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)的样品的DNA形式与以下接触：

(a)设计成扩增经修饰的部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式的的甲基化特异性正向和反向引物；和

(b)导向所述部分甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iii)扩增步骤(ii)的DNA样品，其中所述引物沿着所述目的靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一方面，提供了用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述核酸靶标的特征可在于部分甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与将未甲基化胞嘧啶残基转变为尿嘧啶的亚硫酸氢盐试剂接触；

(ii)使步骤(i)的样品的DNA形式与以下接触：

(a)设计成扩增经修饰的部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式的甲基化特异性正向和反向引物；和

(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种水解探针，其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交；

(iii)扩增步骤(ii)的样品，其中所述引物沿着所述目的DNA靶标延伸实现所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一方面，本发明涉及用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)的样品的DNA形式与以下接触：

(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针在所述区域处作为整体与所有完全和部分甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iii)扩增步骤(ii)的DNA样品，其中所述引物沿着所述目的靶标延伸实现所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一方面，提供了检测基因靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述基因靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使DNA样品与亚硫酸氢钠接触以将未甲基化胞嘧啶残基转变为尿嘧啶；

(ii)使步骤(i)的DNA样品与以下接触：

(a)设计成扩增经修饰基因的一种或更多种完全或部分甲基化形式的甲基化特异性正向和反向引物；和

(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种水解探针，其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的甲基化模式不同的至少两个区域杂交；

(iii)扩增步骤(ii)的DNA样品，其中所述引物沿着目的DNA靶标延伸实现所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在又一方面，本发明涉及用于诊断或监测患者之病症的方法，所述病症的特征在于调节DNA或RNA靶标的胞嘧啶甲基化，并且所述DNA或RNA靶标的特征在于部分甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使来自所述患者的核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)的样品的DNA形式与以下接触：

(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

附图说明

图1A提供了存在于Chr7：50304271-50304365中靶向的IKZF1区域的部分甲基化形式的实例。顶行：参考完全甲基化的IZKF1靶序列(在亚硫酸氢盐转变和PCR扩增后)，其中甲基化的胞嘧啶以红色突出显示。显示了正向引物(SEQ ID：3)、反向引物(SEQ ID：4)和需要三个完全甲基化的CpG位点的探针的位置。所鉴定的部分甲基化靶序列在下面显示为绿色T。

图1B是使用IKZF1甲基化特异性PCR(甲基化特异性引物)在从三个临床血浆样品提取的经亚硫酸氢盐转变的DNA中鉴定的IKZF1样品序列迹线的展示。这三个迹线例证了完全甲基化的IKZF1(左图)、完全未甲基化的IKZF1(中图)和部分甲基化的IKZF1(右图)的存在。对于所检测的碱基用颜色编码峰(红色＝T；黑色＝G；绿色＝A；蓝色＝C)。探针下的甲基化CG碱基的位置显示为那些峰之上的“CG”；在亚硫酸氢盐转变和PCR扩增后转变为TG的未甲基化的CG显示为“TG”。

图2是详述亚硫酸氢盐转变和随后的PCR扩增的流程图。

发明详述

本发明部分地基于以下确定：如果扩增反应设计为有一种或更多种检测探针或引物，且所述探针或引物设计为作为整体与目的DNA区域的至少两个，但优选全部的潜在甲基化模式杂交，则可显著改善显示部分胞嘧啶甲基化的DNA或RNA样品的定量PCR甲基化分析的灵敏度。由于以下原因，必须开发该方法：令人惊讶的确定部分甲基化的存在显著降低了基于定量PCR的甲基化检测测定的灵敏度；原因是尽管事实上探针或引物另外显示出高水平的序列相似性，但事实上导向目的甲基化DNA区域的水解探针和引物将仅与扩增的经亚硫酸氢盐转变的完全甲基化形式的DNA杂交，而不与扩增的经亚硫酸氢盐转变的部分甲基化形式的DNA杂交。事实上，考虑到认为检测部分甲基化形式的DNA掩盖了诊断测定的特异性，一些诊断测定迄今已被设计为仅检测完全甲基化形式的DNA。然而，现在已经确定一些诊断性甲基化基因标志物，例如结直肠癌标志物IKZF1，事实上显示部分甲基化形式。这种形式不能通过常规定量PCR技术检测，并且它们可以具有足够的比例使得使用现有技术获得的结果的灵敏度降低。

现在，本发明的方法的开发已经使得能够进行甲基化特异性扩增测定的常规应用，其表现出比先前可获得的显著更高的灵敏度。更具体而言，已经确定使用导向目的区域的潜在部分甲基化模式之范围的异源引物或探针的库，或使用在其杂交功能上混杂(promiscuous)从而能使其够与两种或更多种不同的甲基化模式杂交的探针或引物，可以有效地检测样品中存在的经扩增的完全和部分甲基化的DNA分子或RNA分子二者，从而提高测试的灵敏度。在癌症诊断的情况中，由使用不能检测部分甲基化的现有技术方法产生的假阴性结果可能对患者具有极其严重的后果。因此，本发明的方法提供了在评估DNA甲基化时确保高水平的灵敏度的简单但稳健的手段。

因此，本发明的一个方面涉及用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)所述核酸样品的DNA形式与以下接触：

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

提及“目的核酸靶标”应当理解为指其甲基化状态待分析的任何区域或形式的DNA或RNA。这可以是例如基因、基因的一部分、基因间区域或启动子。为此，提及“基因”应理解为指编码蛋白质产物的DNA或RNA分子，无论所述蛋白质产物是全长蛋白质还是蛋白质片段。然而，应当理解，存在已经鉴定的一些基因，而不知道其必然会产生蛋白质产物。因此，本文中提及“基因”应理解为包括提及两种类型的基因。就基因组DNA或从其转录的RNA而言，一般预期基因包含内含子区和外显子区。目的对象核酸区域也可以是尚未知道与任何特定基因相关的基因组DNA的一部分(例如通常称为“垃圾”DNA区域)。目的核酸靶标也可以是通过重组产生的基因组DNA(或RNA转录产物)的任何区域，所述重组在基因组DNA的2个区域之间或基因组DNA的1个区域和外源DNA的区域(例如病毒或引入的序列)之间进行。作为分析对象的DNA不需要一定是基因组DNA，尽管通常理解重组表达的DNA如cDNA不被甲基化。然而，本发明应当理解为扩展到任何来源或形式的可以被甲基化的DNA或RNA的分析。例如，关于RNA，可以分析初级RNA、mRNA、tRNA、rRNA、tmRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、非编码RNA或病毒RNA。

因此，本发明更具体地涉及用于检测目的DNA或RNA靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述DNA或RNA靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使DNA或RNA样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)所述样品的DNA形式与以下接触：

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

不将本发明限于任何一种理论或作用模式，RNA甲基化发生在许多不同的RNA种类中，包括tRNA、rRNA、mRNA、tmRNA、snRNA、snoRNA、miRNA、非编码RNA和病毒RNA。通过多种RNA-甲基转移酶利用不同的催化策略进行RNA甲基化。作为翻译后修饰，RNA甲基化作为表观遗传机制起着重要作用。N6-甲基腺苷(m⁶A)是存在于真核生物中的RNA分子中最常见和丰富的甲基化修饰，尽管5-甲基胞嘧啶(5-mC)也通常存在于各种RNA分子中。最近的数据表明m⁶A和5-mC RNA甲基化影响多种生物过程(如RNA稳定性和mRNA翻译)的调节，而且异常RNA甲基化则导致人类疾病的病因。虽然在RNA中甲基化胞嘧啶的生物学作用尚未完全了解，但它是mRNA中的丰富修饰。

仍然不以任何方式限制本发明，DNA甲基化在细菌、植物和动物中是普遍的。DNA甲基化是DNA的一种类型化学修饰，其在细胞分裂的周期中是稳定的，但不涉及生物体的根本性DNA序列的改变。染色质和DNA修饰是表观遗传学的两个重要特征，并在细胞分化的过程中发挥作用，其使得尽管包含相同的基因组物质的细胞稳定地保持不同的特性。在真核生物体中，DNA甲基化仅发生在胞嘧啶嘧啶环的5号碳处。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶的5号碳处。CpG二核苷酸占人类基因组的约1％。

所有CpG中的70-80％被甲基化。CpG可以分组在称为“CpG岛”的簇中，其通常存在于许多基因的调节区域的5’端。在许多疾病过程如癌症中，基因启动子和/或CpG岛获得与可遗传转录沉默相关的异常高甲基化。DNA甲基化可能以两种方式影响基因的转录。首先，DNA的甲基化本身可以物理上阻碍转录蛋白与基因的结合，从而阻断转录。第二，甲基化的DNA可以与被称为甲基-CpG结合结构域蛋白(Methyl-CpG-binding domain protein，MBD)的蛋白质结合。然后MBD蛋白募集另外的蛋白质到基因座，例如组蛋白脱乙酰酶和可修饰组蛋白的其他染色质重塑蛋白，从而形成称为沉默染色质的紧凑的无活性染色质。DNA甲基化和染色质结构之间的这种联系是非常重要的。具体而言，甲基CpG结合蛋白2(Methyl-CpGbinding protein 2，MeCP2)的丧失已牵连Rett综合征并且甲基CpG结合结构域蛋白2(Methyl-CpG binding domain protein 2，MBD2)介导癌症中超甲基化基因的转录沉默。

在人中，DNA甲基化的过程由三种酶(DNA甲基转移酶1、3a和3b(DNMT1，DNMT3a，DNMT3b))进行。认为DNMT3a和DNMT3b是从头(de novo)甲基转移酶，其在发育早期建立DNA甲基化模式。提出DNMT1为维持甲基转移酶，即负责在DNA复制过程中将DNA甲基化模式复制到子链。DNMT3L是与其他DNMT3同源但不具有催化活性的蛋白质。相反，DNMT3L通过提高从头甲基转移酶结合DNA的能力和刺激从头甲基转移酶的活性来对其进行协助。最后，DNMT2已经被鉴定为“神秘的”DNA甲基转移酶同源物，其含有对所有DNA甲基转移酶常见的所有10个序列基序；然而，DNMT2可能不甲基化DNA，而是显示为使小RNA甲基化。

因此，术语“甲基化”应理解为表示通过DNA甲基转移酶作用添加至核酸区域(例如基因组DNA或RNA)中的胞嘧啶或腺苷碱基处的甲基的存在。

在一个实施方案中，所述目的核酸靶标是DNA或RNA基因或基因区域；例如启动子区。因此提及“基因靶标”应当理解为提及将要研究其甲基化方面的基因或基因区域。

提及“基因区域(region of a gene)”应理解为指对应于基因的一部分的任何DNA或RNA区段(stretch)而不是整个基因。例如，通过本发明的方法分析的DNA可以被片段化(例如在其分离期间)，或者其可以在通过本发明的方法分析之前按照预备步骤被切割。例如，如果IKZF1被甲基化，则GlaI会在特定位点切割。然后可以使用合适的用于评估甲基化的本发明的引物和简并探针来扩增所产生的GlaI片段。

根据该实施方案提供了用于检测基因靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述基因靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)所述核酸样品的DNA形式(所述核酸样品为DNA的形式)与以下接触：

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一个实施方案中，所述基因或基因区域是哺乳动物基因或基因区域。

在另一个实施方案中，所述基因是大肠肿瘤标志物，更具体地是BCAT1、IKZF1、CAHM、GRASP、IRF4、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2。

这些基因在本文中通过引用基因名称和一组人染色体坐标来指定。基因名称和染色体坐标都是本领域技术人员公知的和理解的。一般，可以通过引用其名称常规地鉴别基因，通过其可常规获得其序列和染色体位置；或通过引用其染色体坐标来常规地鉴别基因，通过其可以常规获得基因名称及其序列。

提及“基因”应理解为指这些分子的所有形式及其片段或变体。如本领域技术人员将理解的，已知一些基因在个体之间或单核苷酸多态性之间表现出等位基因变异。这样的变异包括SNP、不同大小的插入和缺失以及简单序列重复，例如二核苷酸和三核苷酸重复。变体包括来自共享至少90％、95％、98％、99％序列同一性的相同区域的核酸序列，即相对于本文所述的基因具有一个或更多个缺失、添加、取代、倒置序列等。因此，本发明应当理解为扩展到这样的变体，即，就本诊断性应用而言，尽管在个体之间可能存在实际核酸序列之间的微小遗传变异，但是仍实现相同的结果。因此，本发明应理解为扩展到由任何其他突变、多态性或等位基因变异产生的所有形式的DNA或RNA。

对应于上文详述的基因的GRCh38/hg38染色体坐标如下：

(1)BCAT1：chr12：24810024-24949459

(2)IKZF1：chr7：50304083-50405100

(3)IRF4：chr6：391739-411443

(4)GRASP：chr12：52006945-52015889

(5)CAHM：chr6：163413065-163413950

(6)SOX21：chr13：94709625-94712135

(71SLC6A15：chr12：84859488-84912829

(8)NPY：chr7：24284188-24291865

(9)ST8SIA1：chr12：22193391-22334714

(10)ZSCAN18：chr19：58083842-58098363

(11)COL4A2：chr13：110307284-110513026

(12)DLX5：chr7：97020390-97024831

(13)FGF5：chr4：80266588-80291017

(14)FOXF1：chr16：86510527-86514464

(15)FOXI2：chr10：127737274-127741186

(16)SDC2：chr8：96493654-96611809

提及这些基因应理解为包括这些基因中的每一个的转录起始位点上游的5kb。不将本发明限于任何一种理论或作用模式，IKZF1一般理解为跨越chr7：50304782-50405100(Assembly GRCh38/hg38)。这从转录起始位点一直到多聚腺苷酸位点。然而，IKZF1基因具有另外的5’转录起始位点，其坐标(包括这个起始位点)是Chr7：50304083-50405100。如果还包括上游CpG岛，则坐标为50303300-50405100。

如下文将更详细地讨论的，本发明的方法可以应用于筛选一个基因的甲基化，或者其可以适于筛选给定的生物样品中的多于一种基因的甲基化，所述筛选通过扩增来自原始生物样品的单独的DNA或RNA等分试样进行或在单个等分试样的情况下使用多重扩增方法对其扩增进行。

如上所详述，本发明的方法基于用于检测部分甲基化的目的DNA或RNA靶标的方法的开发。提及“部分甲基化”是指含有CpG的DNA靶标，其中在DNA靶标的完全甲基化形式中正常甲基化的一个或更多个胞嘧啶在部分甲基化的形式中为被甲基化。例如，在本发明的一个实施方案中，在Chr7：50304323-50304349中的基因IKZF1完全甲基化形式是：

CCTGTAC ^mCGGAGCAG ^mCGATC ^mCGGGAGG

其中^mC表示甲基化的胞嘧啶，且C表示未甲基化胞嘧啶。

IKZF1 DNA序列的这一区域的潜在部分甲基化形式的范围是：

应当理解，任何给定的生物样品可以包含IKZF1的这些部分甲基化形式的全部或仅一些。此外，在IKZF1实施方案的情况下，上述鉴定的序列代表IKZF1基因的Chr7：50304323-50304349区域的这些潜在的部分甲基化形式。然而，还应当理解，IKZF1基因的其他区域可以显示部分甲基化，例如存在于IKZF1基因中的其他CpG岛(chr7：50303300-50304923和chr7：50399869-50400702)。“部分甲基化”的相应含义应理解为应用于任何目的靶标，例如任何基因、转录产物或其他DNA或RNA靶标，例如mRNA。本领域技术人员应当理解，就实施本发明的方法而言，选择的用于分析的DNA或RNA的区域很可能反映出显示部分甲基化的DNA或RNA靶标的离散区域。并非必须分析DNA或RNA靶标的每一个部分甲基化的区域。

通过本发明的方法探查的核酸靶标是特征“可”在于部分甲基化的区域的核酸靶标。提及“可”应当理解为是指作为测试对象的核酸样品可以或可以不实际包括部分甲基化序列。不将本发明限制为任何一种理论或作用方式，给定基因可能表现出部分甲基化变异的事实并不意味着在每个所分析的生物样品中，均将观察到一种或更多种部分甲基化形式的存在。相反，部分甲基化的存在和程度可取决于诸如所分析的样品的性质、所讨论的疾病状况的性质、疾病阶段的严重性等因素。然而，本领域技术人员不需要预先确定所讨论的基因的部分甲基化形式是否存在于所测试的核酸样品中。相反，可以简单地将本发明的方法应用于任何样品，由于探针所导向的序列是已知的，因此可以产生探针库以与理论上可能的部分甲基化的每个排列杂交。关于被测试的DNA样品是否实际上完全甲基化或部分甲基化(并且不考虑可能存在的部分甲基化形式的范围)的方面，假如使用足够的引物和探针量，未杂交的过量引物或探针的存在不会影响从已杂交的引物和探针所获得并得到测量的结果。

在本发明的另一个实施方案中，DNA靶标是BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2。

根据该实施方案，提供了用于检测基因BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2的胞嘧啶甲基化的方法，所述基因的特征在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使DNA样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)的DNA样品与以下接触：

(b)导向所述部分甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针能够作为整体与所述区域处的至少两种不同甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iii)扩增步骤(ii)所述的DNA样品，其中所述引物沿着所述基因的延伸实现所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一个实施方案中，所述基因是IKZF1。

根据本发明的方法测试的核酸可以从生物样品中分离。提及“生物样品”应理解为是指来源自任何来源(例如动物、植物或细菌)的生物材料的任何样品，包括但不限于细胞材料、生物流体(例如血液、尿液、唾液)、粪便、组织活检标本、外科标本或已经被引入体内并随后被取出的流体(例如，从灌肠清洗液回收的溶液)。根据本发明的方法测试的生物样品可以直接测试或可以在测试之前需要某种形式的处理。例如，活检或手术样品可能需要在测试之前进行均质化。或者，细胞样品可能需要在测试之前进行透化。此外，就生物样品不是液体形式的情况而言(如果测试需要这种形式)，可能需要添加试剂(如缓冲液)以赋予样品流动性。

就目的核酸区域存在于生物样品中的情况而言，可以直接测试生物样品，或者可以在测试之前分离生物样品中存在的其他所有或一些核酸。在另一个实例中，样品可以在分析之前被部分纯化或富集。例如，就生物样品包含非常多样化的细胞群体的情况而言，可能需要富集特别感兴趣的亚群。在测试之前对靶生物样品或由其衍生的分子进行处理(例如活病毒灭活)在本发明的范围内。还应当理解的是，生物样品可以是新鲜收获的，或者其可以在测试之前储存(例如通过冷冻)或者在测试之前处理(例如通过进行培养)。

根据本文公开的方法选择哪种类型的样品最适合于测试将取决于情况的性质。例如，就筛选大肠肿瘤的发作或易患发作的情况而言，所述样品优选是排泄物(粪便)样品、灌肠清洗、手术切除、组织活检或血液样品(例如全血、血清或血浆)。

更优选地，所述生物样品是血液样品、活检样品或粪便样品。

本发明的方法提供了通过基于扩增的方法准确地定性或定量分析核酸靶标(例如DNA或RNA)的胞嘧啶甲基化特征的方法。通过应用本发明的方法，结果不会由于任何给定的生物样品中部分甲基化的潜在存在而偏离，特别是不会由于事实上由扩增引物或检测探针仅能与完全甲基化的核酸序列而不与相应的部分甲基化序列杂交所引起的假阴性结果的产生而偏离。在应用该方法方面，本领域技术人员应当理解，根据本发明的方法可对任何现有的扩增方法进行调整，将其设计成通过扩增和探测的组合来探查DNA序列的甲基化。例如，可以设计出使用甲基化特异性引物或非甲基化特异性引物的扩增方法(例如PCR)。根据一些示例性实施方案，使用了甲基化特异性引物(例如甲基化特异性PCR)。然而，也可以使用非甲基化特异性引物，尽管在这种情况下甲基化探查将仅依赖于使用探针获得的结果。类似地，就所使用的探针而言，示例性实施方案使用水解探针，其使得能够实现实时PCR定量。然而，即使在使用这种探针的情况下，也可能足以定性分析所获得的读出。或者，可以选择使用仅提供定性读出而不能进行定量分析的探针。

在第一步中，将作为分析对象的核酸样品与试剂接触以修饰未甲基化胞嘧啶残基。本文所用的术语“修饰”是指通过试剂将未甲基化胞嘧啶转变为另一核苷酸，所述转变将原始核酸样品中未甲基化胞嘧啶和甲基化胞嘧啶区分开。可以使用任何合适的试剂。在一个实施方案中，所述试剂是将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂，例如亚硫酸氢钠。然而，在本发明的方法中可以使用选择性修饰未甲基化胞嘧啶，而不修饰甲基化胞嘧啶的其他等效修饰剂。例如，可以使用任何其他合适形式的亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢铵。亚硫酸氢钠容易与胞嘧啶的5，6-双键反应以产生磺化的胞嘧啶中间体，但不与甲基化的胞嘧啶反应，所述磺化的胞嘧啶中间体在碱性或高温条件下发生脱氨作用产生尿嘧啶。因为Taq聚合酶识别尿嘧啶为胸腺嘧啶并识别5-甲基胞嘧啶(m5C)为胞嘧啶，所以亚硫酸氢钠处理和PCR扩增的顺序组合导致未甲基化胞嘧啶残基向胸腺嘧啶(C→U→T)的最终转化和甲基化胞嘧啶残基(“mC”)向胞嘧啶(mC→mC→C)的最终转化。因此，对基因组DNA的亚硫酸氢钠处理通过将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶而产生甲基化依赖性序列差异。应当理解，在引物与步骤(i)的核酸杂交方面，将引物设计成与经修饰的(例如经亚硫酸氢盐转变的)DNA或从其扩增的DNA杂交。

根据该实施方案，提供了用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与亚硫酸氢盐试剂接触以将未甲基化胞嘧啶残基转化为尿嘧啶；

(ii)使步骤(i)的核酸样品的DNA形式与以下接触：

(a)设计成扩增经修饰基因的一种或更多种完全或部分甲基化形式正向和反向引物；和

(b)导向所述部分甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针能够共同地与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一个实施方案中，所述亚硫酸氢盐试剂(bisulfite agent)是亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵。

在另一个实施方案中，所述核酸靶标是基因，更优选是BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP或CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2。

在另一个实施方案中，所述核酸靶标是基因组IKZF1 DNA。一旦未甲基化胞嘧啶残基的转变已经实现，则将所述样品已经准备好用于扩增。当作为分析对象的核酸样品是DNA样品，例如基因组DNA样品时，可以直接对经亚硫酸氢盐转变的样品进行扩增反应。然而，在目的核酸样品是RNA样品，例如mRNA样品的情况下，在步骤(ii)的扩增之前将RNA转化为DNA是必要的。这可以通过本领域技术人员公知的任何方便的方法进行，例如RT-PCR。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，这可以在“一步”反应(例如，使用具有逆转录酶和DNA聚合酶两种活性的Tth聚合酶)或“两步”反应(其中使用两种单独的酶，例如逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶)中完成。技术人员应当理解，在“一步”反应的情况中，仍然可以分两个阶段进行这一方法。通常，逆转录步骤可以在室温下进行，然后进行正常的PCR步骤。根据该实施方案，通常可以设计这样一种方法，其中使所讨论的RNA样品与合适的互补引物(其可以包括随机引物)、具有逆转录酶活性的酶、脱氧核苷酸三磷酸和适当的缓冲液和孵育条件接触，以产生互补DNA(complementary DNA，eDNA)。因此，提及接触“步骤(i)的核酸样品的DNA形式”应理解为是指在步骤(ii)中经历扩增的核酸样品是DNA形式的事实。为此，应当理解，即使步骤(i)的核酸原本是DNA样品，并且可以立即用于步骤(ii)，但是在应用扩增步骤(ii)之前，可能期望扩增样品，从而增加其量。当样品是RNA时，使其经历诸如RT-PCR的步骤，以在步骤(ii)扩增之前将RNA转化为DNA形式。

步骤(ii)的扩增可以使用许多合适的技术中的任何一种来实现。例如，当使用超过一对正向/反向引物，导向两个或更多个单独的基因或甲基化区域时，可以将所有这些引物引入单个样品，并使用多重扩增技术扩增样品。或者，可以选择将步骤(i)的样品分成多于一个等分试样，其中每个等分试样使用单独的引物对扩增。还应当理解，本领域技术人员可以选择适应该方法，以便使用多组引物，其导向仅扩增一个甲基化区域，但其中多个引物反映了巢式PCR反应的应用。

提及“引物”应理解为指包含核苷酸序列或其功能衍生物或类似物的任何分子，其功能包括与位于目的甲基化区域侧翼的互补DNA序列退火和对退火区域下游的DNA序列进行扩增。应当理解，引物可以包含非核酸成分。例如，引物还可以包含非核酸标签，例如荧光或酶标签或一些促进分子的使用或检测的其它非核酸组分。在另一个实例中，引物可以是包含表现出核酸侧链的肽主链的蛋白质核酸。优选地，所述引物是单链DNA寡核苷酸。

适用于本发明的引物的设计和合成是本领域技术人员公知的。在一个实施方案中，对象引物的长度为4至60个核苷酸，在另一个实施方案中长度为10至50个核苷酸，在另一个实施方案中长度为15至45个核苷酸，在另一个实施方案中长度为20至40个核苷酸。

在本发明的方法中使用的引物的数目方面，这可以由本领域技术人员确定。关于引物的总数，需要考虑的变量是被扩增的核酸区域的大小和数目以及引物杂交的序列之间的距离。为了扩增大于约1kb的PCR片段，可以将引物设计为在巢式PCR方法中起作用并且以约500个碱基的间隔杂交。

在一个实施方案中，寡核苷酸引物是能够与核酸的互补链进行序列特异性杂交的线性单链寡聚脱氧核糖核酸或核糖核酸分子。引物优选是DNA。本发明的引物具有足够的长度以在扩增过程中提供特异性和有效的聚合引发(引物延伸)。确切的长度将取决于多种因素，包括温度(扩增期间)、缓冲液和核苷酸组成。优选地，引物是单链的，尽管如果首先分离链，则可以使用双链引物。引物可以使用任何合适的方法制备，例如本领域通常已知的常规磷酸三酯和磷酸二酯方法或自动化实施方案。

如本文所用，特异性引物优选设计成与目的基因组核酸的每条链实质互补。通常，一个引物与基因座的负(-)链(水平位置的双链DNA分子的“下”链)互补，另一个与正(+)链(“上”链)互补。应当理解，本发明的方法可以设计成扩增目的基因靶标的有义链或反义链的相关区域。本文在IKZF1的情况中提供了这方面的示例。

如上文详述，用于本发明方法的引物可以是扩增目的核酸靶标的任何合适的引物。例如，引物可以是甲基化特异性引物或非甲基化特异性引物。“甲基化特异性”引物是指可以区分甲基化和非甲基化DNA(例如经亚硫酸氢盐转变的甲基化与非甲基化DNA)的引物。这种甲基化特异性引物可以设计成通过例如仅与未经转变的5-甲基胞嘧啶杂交(即引物与经亚硫酸氢盐转变的甲基化DNA杂交)，或者相反，通过与由未甲基化胞嘧啶转变的胸腺嘧啶(即引物与经亚硫酸氢盐转变的未甲基化的DNA杂交)杂交来区分甲基化DNA和非甲基化DNA。因此，甲基化由特异性引物实现扩增的能力确定。如本领域技术人员将理解的，为了实现甲基化特异性辨别，引物优选设计成与DNA甲基化的潜在位点(CpG二核苷酸)重叠，并且特异性地区分经修饰的未甲基化DNA和甲基化DNA。例如，引物可以设计成与一个至若干个CpG序列重叠，优选一个至五个CpG序列或一个至四个CpG序列。在本文示例的IKZF1扩增的情况中，正向和反向引物各自设计成与包含四个CpG二核苷酸的IKZF1序列的区域杂交。在一个优选的实施方案中，引物是甲基化特异性的。

因此，提及“设计成扩增部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式”的所述引物应理解为是指：引物将能够扩增目标区域的全部或仅一些甲基化形式，这些扩增子此后被探针探查。如果引物是非甲基化特异性的，则其将扩增目标区域的所有形式，而不管是否存在任何程度的甲基化。例如，可以设计引物使得它们与位于CpG上游和下游的非甲基化DNA区域杂交，所述CpG形成部分胞嘧啶甲基化区域的一部分。在这种情况下，引物将扩增样品中存在的所有核酸分子的该区域，因为引物已经设计成与未甲基化但位于胞嘧啶的甲基化区域附近的DNA位点杂交。在这种情况下，该方法的甲基化特异性将仅由探针提供，并且重要的是确保探针库不包括导向靶区域的完全未甲基化形式的探针。在另一个实施方案中，一个或更多个引物可以是甲基化特异性的，并且设计成与完全甲基化的并位于部分甲基化区域上游和/或下游的一个或更多个胞嘧啶残基杂交。通过设计甲基化特异性引物，可以实现甲基化特异性扩增。在另一个实例中，一个或两个引物可以导向部分甲基化的残基本身。在这种情况下，为了实现良好的灵敏度，期望设计出混杂地杂交的引物，或引物库，其将与尽可能多的DNA靶标的不同部分甲基化形式杂交并能够对其进行扩增，从而提高特异性。这可以例如在应用多路测定的情况下实现。就合适的混杂引物或引物库的设计而言，以下关于探针序列设计提供的描述也适用于这些引物的设计，其中两个分子都是设计成与靶DNA区杂交的寡核苷酸。

应当理解，当使用非甲基化特异性引物时，优选所使用的探针组(panel)不包括检测非甲基化DNA的探针。设计根据本发明的探针组并且使其检测感目的核酸区域的两个或更多个甲基化模式但不检测未甲基化的DNA是本领域技术人员的能力。当所使用的引物为甲基化特异性时，探针组是否包括导向目的核酸靶标的非甲基化形式的探针的问题不太显著。

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)的样品的DNA形式与以下物质接触：

(b)导向所述部分甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的至少两种不同甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一个实施方案中，所述目的靶标是DNA基因靶标，更优选BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2，优选IKZF1。

在另一个实施方案中，所述修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂是亚硫酸氢钠。

通过本发明的方法扩增的DNA区域的大小可以由本领域技术人员确定，并且将取决于以下因素，例如探针必须结合的区域的大小以及引物所导向的CpG二核苷酸簇沿DNA靶序列的分布等。为此，本发明的扩增方法被设计成使得探针针对引物之间的DNA序列区域(即，引物间序列)，并且因此将选择性地与作为扩增结果产生的扩增子杂交。

应当理解，提及“导向(directed to)”目的靶标的正向和反向引物应理解为是指引物杂交并扩增所讨论的靶标的完全或部分。例如，当目的靶标是基因靶标时，引物可以设计成与基因的较小部分亚区域(例如完全或部分启动子区)杂交并对其进行扩增。如本领域技术人员将理解的，一般期望产生并分析尺寸较小的扩增子，而不是大扩增子。

如上所详述，本发明的方法提供了定量(或定性)筛选其中存在部分甲基化的甲基化DNA靶标的可靠和准确的方法。这通过设计和应用被设计成检测给定目的区域的所有潜在的部分甲基化模式的探针或探针组而实现。已经进一步确定，使用这种类型的探针的异源库不能有效地与被筛选的DNA样品中存在的DNA的部分甲基化形式的整个范围杂交并使之能够检测。

因此，提及“探针”应理解为指包含核苷酸序列或其功能衍生物或类似物的任何分子，其功能包括使所述核苷酸序列的至少一个区域与靶核酸分子(特别是潜在的部分甲基化的区域)杂交。核酸探针可以包含非核酸组分。具体而言，核酸探针还包含检测手段，例如荧光标签或促进分子发挥功能的一些其他组分，例如分子的检测或固定。提及“检测手段”应当被理解为指能够检测探针的任何手段的并入。检测手段可以促进定性或定量检测，尽管定量特别有用。检测手段可以采取可检测部分或试剂的形式，例如荧光团或放射性同位素。或者，检测手段可以使探针与反应混合物物理分离以用于分析，例如通过磁珠或生物素-链霉亲和素系统。

不以任何方式限制本发明，各个探针组分可以全部用相同的检测试剂(例如荧光团)标记，或者每个探针组分可以用不同的试剂(例如不同发射波长的荧光团)标记。所公开的实例使用简并探针混合物，使得所有探针组分用相同的荧光团标记，因此结合的(8个)简并探针中的任何一个或更多个将在实时PCR中给出阳性信号。不探查跨目标区域的部分甲基化的确切水平。一种替代方法是将不同的荧光团连接到(8个)探针中的每一个，并且基于检测到的波长辨别被甲基化(或未被甲基化)的碱基。如果例如部分甲基化是早期癌症的特征并且完全甲基化是晚期癌症的特征，则该方法可以为癌症分期提供信息。目前的实时PCR仪器可以检测多达六种不同的荧光团，但是其他技术可用于探查一个样品中的多个特征(例如，基于珠的荧光分选)。在这种情况下，每个探针可以连接到可以独立分选的珠上。

例如，本发明涵盖使用实时定量形式的PCR，例如，TaqMan(Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，7276-7280，1991；Lee et al.，Nucleic Acid Res.21，3761-3766，1993)来进行该实施方案。例如，Eads等，Nucl.Acids Res.28：E32，2000中的MethyLight方法使用了修改的TaqMan水解-探针测定来检测CpG二核苷酸的甲基化。基本上，该方法包括用亚硫酸氢盐处理核酸样品，并使用扩增反应(例如PCR)扩增包含在肿瘤细胞中而不在对照样品中被甲基化的一个或更多个CpG二核苷酸的核酸。扩增反应在三种寡核苷酸的存在下进行：位于目的区域侧翼的正向和反向引物和在两种引物之间与一个或更多个甲基化CpG二核苷酸位点杂交的探针。探针用5’荧光报道分子和3’淬灭剂双标记(或反之亦然)。当探针完整时，淬灭剂染料由于与报道分子接近而吸收其荧光。在PCR产物退火后，探针通过例如Taq DNA聚合酶的5’至3’核酸外切酶活性被切割。切割从淬灭剂释放报道分子，从而导致荧光信号的增强，其可以用于估计初始模板甲基化水平。通过使用与未突变核酸(即甲基化核酸)选择性杂交的探针或引物，例如使用标准曲线测定甲基化水平。

或者，不使用需要切割的经标记探针，而是使用例如分子信标的探针(参见例如Mhlanga和Malmberg，Methods 25：463-471，2001)。分子信标是具有茎-环结构的单链核酸分子。环结构与围绕一个或更多个CpG二核苷酸的区域互补，CpG二核苷酸在肿瘤样品中而不在对照样品中被甲基化。茎结构通过使彼此互补的两个“臂”退火而形成，所述臂在探针(环)的任一侧上。当分子信标未与靶序列结合时，荧光部分结合至一个臂和抑制任何可检测的荧光的淬灭部分处。在环形区域与其靶核酸结合时，臂被分开并且荧光可检测。然而，即使单个碱基错配也会显著改变样品中所检测到的荧光水平。因此，特定碱基的存在或不存在由检测的荧光水平确定。这样的测定有助于检测核酸中的一个或更多个未突变位点(即甲基化核苷酸)。

荧光标记的锁核酸(locked nucleic acid，LNA)分子或荧光标记的蛋白质-核酸(protein-nucleic acid，PNA)分子可用于检测核苷酸差异(例如描述于Simeonov和Nikiforov,Nucleic Acids Research，30(17)：1-5，2002)。LNA和PNA分子以高亲和力结合核酸，特别是DNA。与LNA或PNA探针缀合的荧光团(特别是罗丹明(rhodomine)或六氯荧光素(hexachlorofluorescein))在探针与靶核酸杂交时以显著更高的水平发荧光。然而，当甚至仅发生单核苷酸错配时，荧光增加的水平也不会增强到相同水平。因此，样品中检测到的荧光度指示LNA或PNA探针与靶核酸之间存在错配，例如在CpG二核苷酸中存在甲基化胞嘧啶的情况下。优选地，使用荧光标记的LNA或PNA技术来检测先前已使用例如本领域已知和/或本文所述的扩增方法扩增的核酸中的至少单个碱基变化。

对于技术人员显而易见的是，LNA或PNA检测技术适合于通过将LNA或PNA探针固定在固体支持物上来高通量检测一种或更多种标志物，如Orum等，Clin.Chem.45：1898-1905，1999中所描述的。

优选地，通过基于荧光定量PCR(实时定量PCR，Heid等，Genome Res.6：986-994，1996；Gibson等，Genome Res.6：995-1001，1996)(例如

和

技术)的方法检测甲基化依赖性序列差异。对于

和

技术，序列鉴别可以发生在两个步骤中的一个或两个中：(1)扩增步骤，或(2)荧光检测步骤。在FRET杂交的情况下，在

上的探针形式，FRET寡核苷酸之一或两者均可以用于区分序列差异。最优选地，如本文所有发明实施方案中采用的扩增过程是基于荧光的实时定量PCR(Heid等，Genome Res.6：986-994，1996)并且使用双标记的荧光寡核苷酸探针(

PCR，使用ABI Prism 7700序列检测系统，Perkin ElmerApplied Biosystems，Foster City,California)。

在一个实施方案中，检测手段是荧光报道分子，更优选水解探针。提及“水解探针”应理解为是指双标记的

寡核苷酸。不将本发明限于任何一种理论或作用模式，寡核苷酸的5’末端用荧光报道分子标记，而3’末端用淬灭剂分子标记。探针的序列对扩增的靶分子中的目的区域是特异性的。如此设计水解探针使得序列的长度将5’荧光团和3’淬灭剂置于足够接近的程度从而抑制荧光。

设计水解探针以结合PCR扩增引物的结合位点之间的目的区域。在PCR循环的延伸期期间，Taq DNA聚合酶合成PCR引物下游的互补链。当延伸到达所结合的水解探针时，TaqDNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性使水解探针降解。探针的切割将荧光报道分子与探针的其余部分(因此与淬灭剂)分开，使报道分子发荧光。Taq DNA聚合酶继续合成剩余的新生链，因此探针的杂交不抑制PCR反应。随着随后的PCR循环，荧光报道的释放量以及因此荧光累积地增强。合适的报道分子和淬灭剂分子的实例是：5’荧光报道染料6FAM(“FAM”；2,7-二甲氧基-4,5-二氯-5-羧基-荧光素)，和TET(6-羧基-4,7,2’，7’-四氯荧光素)；和3’淬灭染料TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)(Livak等，PCR Methods Appl.4：357-362，1995；Gibson等，Genome Res.6：995-1001，1996；Heid等，Genome Res.6：986-994，1996)。

因此，提供了用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(ii)使步骤(i)的样品的DNA形式与以下接触：

(iii)扩增步骤(ii)所述的DNA样品，其中所述引物沿着所述目的靶标延伸实现所述经杂交探针的检测；和

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在一个实施方案中，所述核酸是DNA。

在另一个实施方案中，所述亚硫酸氢盐试剂是亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵。

在另一个实施方案中，所述DNA是IKZF1基因。

本发明的探针被设计成它们可以在单个反应中与表现出至少两种不同甲基化模式的DNA序列杂交。例如，探针可以与完全甲基化的序列和一个或更多个部分甲基化的序列杂交。在另一个实例中，探针可以检测DNA序列的至少两种不同的部分甲基化形式。应当理解，就本发明的方法涉及提供检测表现出完全和部分甲基化形式的DNA靶标之甲基化的精确和可重复的手段而言，这种检测方法被设计成将探针聚焦到DNA序列的一个离散区域，所述离散区域确实或被认为表现出部分甲基化形式。然而，本领域技术人员将理解，DNA靶标也可以在DNA序列的除探针靶向的区域之外的区域处显示部分甲基化模式。因此应当理解，本方法限于检测和评估探针所导向的DNA区域处的部分甲基化，而非DNA靶标的任何其他区域。因此，就筛选特定基因靶标而言，本发明的方法设计成检测该基因的所有部分甲基化形式，所述基因在探针所导向的位点处显示出部分甲基化。然而，就目标基因也可在沿着其序列的其他位点处显示部分甲基化的情况而言，如果探针不导向这些甲基化位点，则不会检测到这些部分甲基化形式。然而，本领域技术人员还应当理解，就对多于一个潜在部分甲基化区域感兴趣的情况而言，该方法可适用于包括使用导向多个这样的区域的探针，只要这些区域位于扩增引物对之间即可。

本文中提及与至少两种“所述区域处的不同的甲基化模式”杂交的一种或更多种目标探针应当被理解为意指在本发明的方法中所使用的探针都被设计成与相同的DNA序列区域杂交。然而，被甲基化的该DNA序列区域可以表现出完全甲基化或一系列部分甲基化形式，这被称为“不同的甲基化模式”或“差异甲基化”。随着存在于该区域中的甲基化CpG二核苷酸的数目增加，潜在不同的部分甲基化模式的数目也会增加。例如，如前所述，除了IKZF1在Chr7：50304323-50304349处的完全甲基化形式，在扩增引物之间有7个不同的甲基化模式，包括6个部分甲基化形式和完全未甲基化形式。已经将本发明的方法设计成能够检测目的DNA靶标的所有差异甲基化形式，尽管取决于具体情况，可以寻求仅筛选一些，而非全部的特定DNA靶标的部分甲基化形式。例如，如果已知存在两种主要的部分甲基化形式，则仅筛选这两种可以充分地提高诊断准确度。进行该评估并适当地设计探针组是在本领域技术人员的技术能力范围内的。

因此，在另一个实施方案中，本发明涉及用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述核酸靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(i)使核酸样品与修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂接触；

(ii)使步骤(i)的样品的DNA形式与以下接触：

(b)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的所有完全和部分甲基化模式杂交，并且其中所述探针并入有检测手段；

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在一个实施方案中，所述DNA靶标是基因靶标，优选BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2，优选IKZF1。

在另一个实施方案中，所述试剂是亚硫酸氢盐，例如亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵。

在另一个实施方案中，所述引物是甲基化特异性引物。

在另一个实施方案中，所述探针是水解探针。

因此，提供了检测基因靶标的胞嘧啶甲基化的方法，所述基因靶标的特征可在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述方法包括：

(ii)使步骤(i)的DNA样品与以下接触：

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在另一个实施方案中，所述基因是IKZF1，并且所述引物包含以下序列：

SEQ ID NO：3(正向引物)：

Chr7：50304271 GACGACGTAT TTTTTTCGTG TTTC 50304294

SEQ ID NO：4(反向引物)：

Chr7：50304365 GCGCACCTCT CGACCG 50304350

或实质相似的序列，并且所述探针包含以下序列：

或实质相似的序列。

在另一个实施方案中，所述引物包含序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4或实质相似的序列，并且所述探针包含序列SEQ ID NO：19或实质相似的序列。

在另一个实施方案中，所述引物包含序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4或实质相似的序列，并且所述探针包含序列SEQ ID NO：20或实质相似的序列。

在另一个实施方案中，所述甲基化特异性扩增测定针对作为SEQ ID NO：1之互补物的经亚硫酸氢盐转变的DNA链，并且所述探针包含序列SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或实质相似的序列。

在另一个实施方案中，所述引物包含序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4或实质相似的序列，并且探针组包含SEQ ID NO：23-30或实质相似的序列中的一种或更多种。

在另一个实施方案中，所述甲基化特异性扩增测定针对作为SEQ ID NO：1之互补物的经亚硫酸氢盐转变的DNA链，所述引物组包括包含序列SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48的引物，并且所述探针组包含序列SEQ ID NO：31-38和/或SEQ ID NO：39-46。

在另一个实施方案中，所述探针作为整体与所述区域处的所有完全和部分甲基化模式杂交。在另一个实施方案中，所述引物组包括包含SEQ ID NO：49-62和SEQ ID NO：63-76序列或实质相似的序列中的一种或更多种的引物。

在另一个实施方案中，所述引物组包括包含SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78序列或实质相似的序列中的一种或更多种的引物。

应当理解，本发明引物可以对应于上述公开的序列或可以是实质相似的。或者，这些序列或实质相似的序列可以代表较大引物分子内的子区域。提及“实质相似的序列”应当理解为指这样的序列，其可以在序列中表现出一些微小的差异，然而其功能与其实质相似之序列一样扩增相同DNA靶标。

不将本发明限于任何一种理论或作用模式，已经确定在以下IKZF1的DNA区域的情况中：

SEQ ID NO：1(IKZF1诊断区域-野生型DNA)：

以下胞嘧啶在结肠来源的肿瘤DNA(Chr 7，GRCh38/Hg38坐标)中以高频率甲基化：50304273、50304276、50304287、50304294、50304301、50304311、50304313、50304318、50304330、50304338、50304343、50304350、50304354、50304363、50304365。本发明的该实施方案涉及筛选胞嘧啶残基50304330、50304338和50304343上的部分甲基化。在回收的经亚硫酸氢盐转变的分离自血浆之DNA中检测IKZF1基因座中的这三个CpG位点的甲基化的任何组合可用于增加结直肠癌的诊断灵敏度。根据该实施方案，用亚硫酸氢钠处理DNA会将胞嘧啶转变为尿嘧啶，但留下未受影响的5’甲基胞嘧啶残基。设计特异性起始SEQ ID NO：2的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO 3和4)，SEQ ID NO：2中所有胞嘧啶残基50304273、50304276、50304287、50304294、50304350、50304354、50304363和50304365均需要疾病特异性甲基化。使用简并水解探针混合物(SEQ ID NO 5-12)(例如，TaqMan简并探针混合物)检测三个胞嘧啶残基50304330、50304338和50304343中的任何(或无)甲基化。

本发明的探针“作为整体”结合到试图检测的部分和完全甲基化序列的范围。“作为整体”是指被选择使用的探针组群能够单独地或借助单个探针杂交的混杂性而与所试图检测的DNA靶标的部分甲基化形式的范围相结合。不将本发明限于任何一种理论或作用模式，待通过探针探查的DNA区域的序列是本领域技术人员已知的，甲基化CpG二核苷酸的位置也是已知的。基于该序列信息，并且如早先关于IKZF1所示例的，可以预测可能的完全和部分甲基化模式的全部范围。然后可以设计探针使得其各自单独地结合一种独特的甲基化模式，或者显示混杂性并且可以结合多于一种的甲基化模式。如已经确定的，导向完全甲基化序列的探针不结合部分甲基化序列，即使完全甲基化序列和部分甲基化序列之间的差异小到一个胞嘧啶残基缺乏甲基化。然而，还已经确定，如果在扩增测定中使用甲基化特异性探针或设计成混杂地跨越甲基化和非甲基化胞嘧啶而结合之探针的异源库，则可以获得与目的靶标的甲基化有关的准确结果。

设计成与一种特定的完全或部分甲基化序列模式杂交的探针可以通过本领域技术人员公知的方法产生。关于表现出混杂性的探针，因为它们可以结合多于一个甲基化模式，该设计也可以通过本领域技术人员已知的几种方法实现。例如，探针中的一个或更多个碱基位置(例如在5’-水解探针中)不是唯一的，而是两个碱基的混合物，即胞嘧啶或胸苷。如果只有一个CpG位点被探查到甲基化(或没有甲基化)，那么这种简并寡核苷酸将是两种不同寡核苷酸序列的混合物，例如--atCGat--和--atTGat--。如果两个CpG位点被探查到，则简并寡核苷酸混合物(cocktail)将是四个不同序列的混合物。本文提供的IKZF1实例是这样的实例，其中通过使用由八种不同的寡核苷酸序列(SEQ ID NO 5-12)组成的简并5’-水解寡核苷酸探针混合物来探查三个CpG位点的部分甲基化。混合物可以检测位于Chr7坐标50304330、50304338和50304343中的三个CpG位点内的所有可能的甲基化组合。该实施例改进了IKZF1甲基化测定的诊断灵敏度。

如前所述，探针可以是检测探针的任何变异(variance)，例如TaqMan、Scorpions、Beacons等。探针混合物可以合成(在IKZF1实例的情况中)为：

(i)在一个合成中8倍冗余(通过在合成期间混合C和T)；

(ii)三种不同的二倍冗余探针并混合；

(iii)一种二倍和一种四倍冗余探针并混合；或

(iv)八种不同的独特探针并混合。

探针还可以是在每个所探查的C/T碱基处具有无碱基间隔物(abasic spacer)(例如5-硝基-吲哚或3-硝基-吡咯)或在每个探查的C/T碱基处具有肌苷的单一序列。含有一个或更多个无碱基间隔物的单一序列“混杂”探针将仅具有一个退火温度，但是包含无碱基间隔物的探针的解链温度将显著低于检测所有探查的CpG位点上的甲基化之探针的解链温度。因此，具有无碱基间隔物的混杂探针将需要显著长于仅靶向甲基化CpG位点的探针。肌苷将允许与任何碱基进行碱基配对，但是偏好次序为C＞A＞G＞T。由于该序列在与探针相反的链中，在这种情况下探针将与A(＝T，未甲基化)或G(＝C，甲基化)退火。这两个选项都比混杂探针更不具特异性。因为它们允许与3个位置的4种碱基之一配对，所以它们实际上是64倍简并(对比于8倍)，因此更依赖于引物的甲基化特异性。含有无碱基间隔物或含有肌苷的探针具有作为单一寡核苷酸组分而不是8种寡核苷酸组分的混合物的益处。

探针还可以在每个潜在的部分甲基化的C位置具有嘧啶(C或T)类似物。例如，类似物6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4，5-c][1,2]噁嗪-7-酮是将与G和A碱基二者(这是相反链中的两个选项)配对的单个“碱基”。在一个研究中，它对A(＝T＝未甲基化的)具有60％的偏好，且对于G(＝C＝甲基化的)具有40％的偏好。(Hill等，Proc Natl Acad Sci U S A.，95：4258-4263，1998)。这里的益处是该探针是将以大致相等的亲和力结合所有8种可能的甲基化组合的单一寡核苷酸。应当理解，由于一些独立探针序列将含有胸苷而不是胞嘧啶碱基(这降低了退火温度)，因此一些探针序列可能需要在长度上延伸以补偿较低的退火温度。替代方法是包括增加退火温度的化学修饰(例如大沟结合碱基)。还应当理解，探针的简并位置处的每个碱基的比例不一定必须为50/50。例如，鉴定到一个特定的C残基在80％的真实癌症病例中被甲基化，但在20％的真实癌症病例中没有甲基化，则可以制备在该位置具有80％C和20％T的探针以匹配甲基化的发生率。

如本领域技术人员将理解的，并且如上文详细描述的，探针序列也可以设计称与相反链杂交。在相反链上的这些探针序列设计在简并位置具有G或A(或如上所述的肌苷或无碱基间隔物)以探查部分甲基化。上述的嘧啶类似物现在将变成将结合T和C二者的嘌呤类似物N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤。

还评估本发明的探针和/或引物以确定它们不自我引发(self-prime)或形成引物二聚体(例如，与在检测测定中使用的另一探针或引物)。此外，通常评估探针或引物(或其序列)以确定其从靶核酸变性的温度(即探针或引物的解链温度，或Tm)。用于估计T m的方法是本领域已知的，并且描述于，例如，Santa Lucia，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：1460-1465，1995或Breslauer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3746-3750，1986。

用于产生/合成本发明的探针或引物的方法是本领域已知的。例如，寡核苷酸合成描述于Gait(Ed)(In：Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford，1984)。例如，可以通过生物合成(例如通过用限制性内切核酸酶消化核酸)或通过化学合成获得探针或引物。对于短序列(多达约100个核苷酸)，优选化学合成。

对于较长的序列，在分子生物学中使用的标准复制方法是有用的，例如，将M13用于单链DNA，如Messing，Methods Enzymol，101，20-78，1983描述的。寡核苷酸合成的其他方法包括例如磷酸三酯和磷酸二酯方法(Narang，等Meth.Enzymol 68：90，1979)和在支持物上的合成(Beaucage，等Tetrahedron Letters 22：1859-1862，1981)以及氨基磷酸酯(phosphoramidate)技术，Caruthers，M.H.，等，“Methods in Enzymology,”154卷，287-314页(1988)，其他方法描述于“Synthesis and Applications of DNA and RNA，”S.A.Narang，编辑，Academic Press，New York，1987，以及其中所引用的参考文献。包含锁核酸(LNA)的探针的合成描述于例如，Nielsen等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.，1：3423，1997；Singh和Wengel，Chem.Commun.1247，1998。而包含肽-核酸(PNA)的探针的合成描述于例如，Egholm等，Am.Chem.Soc.，114：1895，1992；Egholm等，Nature，365：566，1993；和Orum等，Nucl.Acids Res.，21：5332，1993。

使用位于目的甲基化区域侧翼的引物扩增本发明的DNA或RNA样品。如上文所详述，可以选择这种“区域”以涵盖基因长度的小部分或大部分。在后一种情况下，产生的扩增子将是相当长的。然而，在具体实施方案中，区域可以对应于其中一个或更多个CpG二核苷酸成簇之基因的短得多的区段。在这种情况下，产生的扩增子将显著较短。

可以通过任何合适的方法促进引物和探针与靶DNA的相互作用。这些方法是本领域技术人员已知的。为此，应当理解，引物和探针可以在任何合适的时间点并入反应管中。虽然并入通常在初始扩增循环开始之前，但是可以在初始扩增循环之后进行一个或多个另外的引物的并入。引物的并入模式将取决于技术人员如何寻求进行扩增反应，但是一般来说，为了易于使用和避免污染，通常希望能够在单个管中进行整个反应。然而，可以使用实现本发明的步骤的任何其他方法。因此，提及将样品与引物或反义寡核苷酸“接触”应理解为是指促使引物与样品混合，从而可发生相互作用(例如杂交)。实现这个目标的手段是本领域技术人员公知的。

如上文所详述，当多个甲基化DNA区域待扩增时，技术人员可设计多重扩增反应。或者，可以进行各自使用一个独特引物对的几个独立的扩增反应。当扩增两个或更多个单独的甲基化区域或当多于一个基因的甲基化待分析时，这些方法变得相关。在这种情况下，如果试图分析两个基因(例如BCAT1和IKZF1)，则可以例如在亚硫酸氢钠转变后将样品分成两个等分试样，然后使用导向该基因的相关甲基化序列区的一组或更多组正向和反向引物扩增每个等分试样。或者，可以对单个样品进行多重反应，其中在使用导向一个基因的选定甲基化序列区域的引物对和水解探针组以及使用导向另一基因的选定甲基化序列区域的另一组引物和水解探针组方面，反应是多重的。如技术人员所熟悉的，可以将多重反应设计成在两个或更多个甲基化序列区域和/或两个或更多个基因的情况中用两组、三组或更多组引物和水解探针进行。应当理解，适当设计多重或巢式扩增反应在本领域技术人员熟练掌握的技术范围内。

本发明的扩增步骤导致杂交引物沿着目的DNA靶标延伸。如上文所详述的，引物延伸分子的产生实现经杂交的双重标记的水解探针的检测。可以实现这一点的手段是本领域技术人员公知的，因为在扩增子产生时产生的检测手段输出可以被定性或定量地分析，而后者是特别优选的手段。为此，应当理解，仅在引物沿着与探针杂交的DNA序列延伸并且置换、切割或以其他方式影响探针的修饰时实现探针的检测，这使其检测手段变得有功能(例如活化或暴露)，从而可通过定性或定量手段检测。

尽管该方法的优选应用是为了诊断疾病发作(例如瘤形成(neoplasia)发展或其倾向性)的目的而评估甲基化水平，但在某些情况下可能期望检测所述甲基化水平的相反变化，例如，为了监测导向调节肿瘤病症(例如腺瘤或腺癌发展)的治疗性或预防性治疗的有效性。例如，在其中升高的甲基化水平指示个体已经形成以腺瘤或腺癌发展为特征的病症的情况下，在治疗性治疗方案开始后筛选出甲基化水平的降低可用于指示肿瘤细胞的成功清除。在另一个实例中，可以使用这种方法来测试肿瘤切除边缘处的组织，以便确定肿瘤的全部边缘是否已经被移除。

因此本方法可用于诊断、预后、分类、预测疾病风险、检测疾病的复发、选择对多种类型的肿瘤的治疗和监测肿瘤。可以检测任何进展阶段的癌症，例如原发性、转移性和复发性癌症。此外，该方法可应用于需要分析DNA和RNA甲基化的任何其他情况。

使用肿瘤发展作为非限制性实例，本发明提供了用于以下目的方法：确定哺乳动物(例如，人)是否具有瘤形成、取自哺乳动物的生物样品是否含有肿瘤细胞或源自肿瘤细胞的DNA、估计哺乳动物发展肿瘤的风险或可能性、监测抗癌治疗的功效，或在患有癌症的哺乳动物中选择适当的抗癌治疗。这样的方法基于确定许多肿瘤细胞具有与正常细胞不同的甲基化状态。因此，通过确定细胞是否含有差异甲基化序列，可以确定细胞是否为肿瘤的。

本发明的方法可用于评价已知或怀疑具有瘤形成的个体，或作为在未必怀疑具有瘤形成的个体中的常规临床试验。可以进行进一步的诊断测定以确认个体中瘤形成的状态。

此外，本发明的方法可以用于评价治疗过程的功效。例如，可以通过在患有癌症的哺乳动物中随时间监测DNA甲基化来评估抗癌治疗的功效。例如，与在治疗之前或更早从哺乳动物取得的样品中的水平相比，在治疗后取自哺乳动物的生物样品中的任何相关诊断序列中甲基化的降低或不存在指示治疗有效。

因此，本发明的方法可用作一次性测试(one-time test)或作为对那些被认为具有疾病发展风险的个体的持续监测(on-going monitor)，或作为治疗或预防性治疗方案的有效性的监测。在这些情况下，测绘任何一类或更多类生物样品中的甲基化水平的调节是个体状态或目前使用的治疗或预防方案的有效性的有价值的指示。因此，本发明的方法应当被理解为延伸到监测个体中甲基化水平相对于其正常水平或相对于从所述个体的生物样品确定的一个或更多个较早甲基化水平的提高或降低。

在相关方面，除了开发用于精确检测完全和部分甲基化的方法外，本发明人出乎意料地确定，在诊断方案的情况下，并且与所接受的教条相反，筛选患者或其他样品中所有形式的甲基化实际上可提供比如果仅筛选完全甲基化更敏感的结果。已经表明当使用本发明的方法时，以前关于筛选部分甲基化实际上会模糊诊断结果的顾虑不产生任何问题。事实上，诊断结果的灵敏度得到了提高。

因此，在另一个方面，本发明涉及用于诊断或监测患者中的病症的方法，所述病症的特征在于调节目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化，并且所述靶标的特征在于部分甲基化的区域，所述方法包括：

(ii)使步骤(i)的核酸样品的DNA形式与以下接触：

(iv)定性或定量分析步骤(iii)的检测输出。

在一个实施方案中，所述靶标是DNA或RNA，优选启动子区。

在另一个实施方案中，所述病症是肿瘤病症。

在另一个实施方案中，所述DNA或RNA靶标是诸如BCAT1、IKZF1、CAHM、GRASP、IRF4、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2的基因。

在另一个实施方案中，所述探针是水解探针。

在另一方面，提供了用于检测目的核酸靶区域的胞嘧啶甲基化的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)设计成扩增所述部分胞嘧啶甲基化的核酸区域的DNA形式的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物，其中未甲基化胞嘧啶残基已被修饰；

(ii)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种探针，所述探针能够作为整体与至少两种不同的甲基化模式杂交。

在一个实施方案中，所述引物是甲基化特异性引物。

在另一个实施方案中，所述探针是水解探针。

在另一个实施方案中，所述试剂是修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂。

在另一个实施方案中，所述试剂盒另外包含实现DNA扩增和/或检测的试剂。

就所述目的基因是IKZF1的情况而言，所述引物和探针导向检测IKZF1基因的一个或更多个Chr7：50304323050304349、Chr7：50303300-50304923或Chr7：50399869-50400702区域的甲基化。

在另一个实施方案中，引物组包括包含以下一种或更多种的引物：

(i)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列或实质相似的序列；

(ii)SEQ ID NO：49-62和SEQ ID NO：63-76序列或实质相似的序列；或

(iii)SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78序列或实质相似的序列。

在另一个实施方案中，探针组包括包含以下一种或更多种的探针：

(i)SEQ ID NO：5-12序列或实质相似的序列；

(ii)SEQ ID NO：19序列或实质相似的序列；

(iii)SEQ ID NO：20序列或实质相似的序列；或

(iv)SEQ ID NO：23-30序列或实质相似的序列。

在另一个实施方案中，在所述试剂盒涉及扩增作为SEQ ID NO：1区域之互补物的经亚硫酸氢盐转变的DNA链的情况下，所述引物组包括包含SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48序列之一或两者或实质相似序列的引物。

在另一个实施方案中，当所述试剂盒涉及扩增作为SEQ ID NO：1区域之互补物的经亚硫酸氢盐转变的DNA链的情况下，所述探针组包括包含以下的一种或更多种的探针：

(i)SEQ ID NO：21序列或实质相似的序列；

(ii)SEQ ID NO：22序列或实质相似的序列；

(iii)SEQ ID NO：31-38序列或实质相似的序列；和/或

SEQ ID NO：39-46序列或实质相似的序列。

通过参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例1

鉴定在结直肠癌症患者的循环系统中部分甲基化的IKZF1 DNA

从2,109个结肠镜检查术检查的对象(包括134个癌症病例)抽取血浆。按照制造商推荐的使用QS CNA 4mL血浆试剂盒(Qiagen)在QIASymphony上提取无细胞DNA。按照制造商(Qiagen)推荐的使用EpiTect Fast和EpiTect Plus试剂盒在QIACubes上对所得DNA进行亚硫酸氢盐转变和纯化。在按照制造商推荐的使用mastermix QuantiTect NoROX的多重实时PCR测定中将回收的经亚硫酸氢盐转变的DNA按照一式三份输入来分析，包括BCAT1亚硫酸氢盐转变之外的SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；甲基化特异性寡核苷酸(SEQID NO：13、14和15，靶向位于chr12：24949058-24949159上的102nt扩增子)；和亚硫酸氢盐转变特异性寡核苷酸SEQ ID NO：16、17、18，其靶向染色体7上的对照DNA基因ACTB。

使用以下LC480II循环条件在30μL的总PCR反应中对甲基化的BCAT1和IKZF1的进行检测：1×[95℃，15分钟]，50×[95℃，15秒；62℃，40秒(采集，FAM，HEX，TexRed)]，1×[40℃，10秒并保持]。

SEQ ID NO：1(IKZF1诊断区域-野生型DNA)：

SEQ ID NO：2(PCR扩增后SEQ ID NO：1的经亚硫酸氢盐转变的完全甲基化的版本)：

在134例癌症中，74例和62例分别为BCAT1和IKZF1甲基化阳性。将来自PCR反应的BCAT1甲基化阳性但IKZF1甲基化阴性的PCR产物稀释并使用仅包含SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4引物的SYBR-green IKZF1测定再扩增。将所产生的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳以显示约100bp的PCR产物是否已经产生，这将确认甲基化IKZF1 DNA的存在，然而，由于多重PCR测定需要包括“完全甲基化”IKZF1探针(SEQ ID NO：5)下三个CpG位点中完全甲基化的IKZF1靶标，因此原本不会被检测到。将实施例1中产生的经琼脂糖分离的PCR产物纯化并测序，其揭示了几种PCR产物中的部分甲基化的证据，包括CpG残基50304330、50304338和50304343的无甲基化的两个病例，这将解释为什么需要“完全甲基化”的IKZF1探针(SEQ IDNO：5)在结肠镜检查术证实的癌症中反而得到假阴性IKZF1结果。在IKZF1扩增子中的其他CpG位点也观察到部分甲基化，图1。

结论

对于三个扩增子进行测序，获得了IKZF1水解探针区域中部分甲基化的清楚证据。这些中的两个是结肠镜检查术证实并且在使用设计成检测完全甲基化的IKZF1 DNA的探针的原始IKZF1实时PCR测定中是阴性的的癌症。

实施例2

在结直肠癌患者中检测部分甲基化的IKZF1

随后为了检测嵌入靶向的IKZF1扩增子序列(SEQ ID NO：2)中的部分甲基化的CpG位点，我们生产了由8中不同的寡核苷酸序列(SEQ ID NO 5-12)组成的“简并”IKZFI 5’-水解探针混合物，所述寡核苷酸序列在对应于基因组坐标Chr7：50304330、Chr7：50304338和Chr7：50304343的三个残基位置的每一个处具有胞嘧啶或胸苷碱基。通过引入在每个位置两个碱基的等量混合物，在寡核苷酸探针生产期间获得寡核苷酸混合物。

从来自实施例1中描述的2,109位患者的亚群(n＝308)的另外4mL血浆中提取DNA。在多重实时PCR测定中按照制造商推荐的使用mastermix QuantiTect NoROX(包括寡核苷酸SEQ ID NO 3-18)将回收的亚硫酸氢盐DNA以一式三份输入进行分析。使用以下LC480II循环条件在30μL的总PCR反应中进行甲基化BCAT1和完全甲基化/部分甲基化IKZF1的检测：1×[95℃，15分钟]，50×[95℃，15秒；62℃，40秒(采集，FAM，HEX，TexRed)]，1×[40℃，10秒并保持]。将PCR结果与使用仅靶向完全甲基化的BCAT1和IKZF1扩增子的多重PCR的先前数据集进行比较。

表1

结论：

当在临床患者样品中测试8倍简并探针时，其在结肠镜检查术确认的癌症样品中给出与BCAT1相似的阳性率，表明由于部分甲基化导致的患者假阴性诱发的问题已经克服，表1。

实施例3

备选5’-水解探针

具有修饰的碱基/碱基类似物的“简并”探针

上述实施例2中使用的八个探针可以被设计成用于检测所有8个可变甲基化的IKZF1探针靶标区域的单个“混杂”寡核苷酸替代。SEQ ID NO：19将与SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4一起用作引物，并替换SEQ ID NO：5-12。SEQ ID NO：19将与SEQ ID NO：2的可变甲基化版本的互补链退火。SEQ ID NO：20也可以用于代替SEQ ID NO：5-12，并且将结合如SEQ IDNO：2所示的链的可变甲基化版本。本领域技术人员还将认识到，可以从经亚硫酸氢盐转变的作为SEQ ID NO：1所示之互补物的DNA链设计甲基化特异性PCR测定。这样的测定将需要不同的“混杂”寡核苷酸探针，并且这两个选项如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示。

其中Z是肌苷；无碱基间隔物；或6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c][1，2]噁嗪-7-酮(或其功能类似物)，并且其中X是肌苷；无碱基间隔物；或N6-甲氧基-2，6-二氢基嘌呤(或其功能类似物)。

用于检测SEQ ID 2的有义链的备选“简并”5’-水解探针

将实施例1(SEQ ID NO：5)或实施例2(SEQ ID NO：5-12)中使用的IKZF1探针设计成与SEQ ID NO：2的互补链退火。本领域技术人员还将认识到，可以设计与SEQ ID NO：2结合的类似探针。这些探针与SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4一起用于甲基化特异性PCR测定，并且在下文列为SEQ ID NO：23-30。

用于检测SEQ ID NO：1之互补链的经亚硫酸氢盐转变的版本的“简并”5’-水解探针

针对对应于SEQ ID NO：1的经亚硫酸氢盐转变的DNA链设计实施例1和实施例2中使用的甲基化特异性PCR测定。本领域技术人员还将认识到，可以从如作为SEQ ID NO：1所示的链之互补物的经亚硫酸氢盐转变的DNA链设计出甲基化特异性PCR测定。这不是SEQ IDNO：2的互补物。从如作为SEQ ID NO：1所示的链之互补物的经亚硫酸氢盐转变的DNA链设计的这种测定将需要不同的探针来检测IKZF1的所有8种可能的可变甲基化形式。这些可以是如上文SEQ ID NO：20和21中所示的单一“混杂”寡核苷酸探针，或可以是如下SEQ ID NO：31-38和SEQ ID NO：39-46所示的两组8个探针，这取决于检测扩增的DNA的哪条链。这种测定还需要另外的甲基化特异性PCR引物，其显示为SEQ ID NO：47和48。

设计成扩增部分甲基化的IKZF1的“简并”引物的实例

完全未甲基化的引物：

本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文描述的发明容易进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括单独地或作为整体在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。

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<120> 用于甲基化分析的方法

<130> P38974PCAU

<150> 2014902155

<151> 2014-06-05

<160> 86

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 95

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

gacgacgcac cctctccgtg tcccgctctg cgcccttctg cgcgccccgc tccctgtacc 60

ggagcagcga tccgggaggc ggccgagagg tgcgc 95

<210> 2

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 诊断性IKZF1扩增子的经亚硫酸氢盐转变且完全甲基化的形式

<400> 2

gacgacgtat ttttttcgtg tttcgttttg cgtttttttg cgcgtttcgc tttttgtatc 60

ggagtagcga ttcgggaggc ggtcgagagg tgcgcg 96

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的引物

<400> 3

gacgacgtat ttttttcgtg tttc 24

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的引物

<400> 4

gcgcacctct cgaccg 16

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 5

tttgtatcgg agtagcgatt cgggagg 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 6

tttgtatcgg agtagcgatt tgggagg 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 7

tttgtatcgg agtagtgatt cgggagg 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 8

tttgtattgg agtagcgatt cgggagg 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 9

tttgtatcgg agtagtgatt tgggagg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 10

tttgtattgg agtagcgatt tgggagg 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 11

tttgtattgg agtagtgatt cgggagg 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<400> 12

tttgtattgg agtagtgatt tgggagg 27

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向BCAT1的引物

<400> 13

gtttttttgt tgatgtaatt cgttaggtc 29

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向BCAT1的引物

<400> 14

caatacccga aacgacgacg 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向BCAT1的探针

<400> 15

ttcgtcgcga gagggtcggt t 21

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向ACTB1的引物

<400> 16

ggagtttttg ttttttggtt agttg 25

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向ACTB1的引物

<400> 17

caaaataaaa tacaaaacaa acctaatcc 29

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向ACTB1的探针

<400> 18

atggaggttt agtggtaata taggttttgt ttgg 34

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n是肌苷; 无碱基间隔物; 或6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c] [1,2]噁嗪-7-酮（或其功能类似物）

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<400> 19

tttgtatngg agtagngatt ngggagg 27

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n是肌苷; 无碱基间隔物; 或N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤（或其功能类似物）

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<400> 20

ctcccnaatc nctactccna tacaaaaag 29

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n是肌苷; 无碱基间隔物; 或6H，8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c] [1,2]噁嗪-7-酮（或其功能类似物）

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<400> 21

tttttnggat ngttgtttng gtataggg 28

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的诊断性IKZF1扩增子的探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<400> 22

ccctataccn aaacaacnat ccnaaaaa 28

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 23

ctcccgaatc gctactccga tacaaaaag 29

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 24

ctcccaaatc gctactccga tacaaaaag 29

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 25

ctcccgaatc actactccga tacaaaaag 29

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 26

ctcccgaatc gctactccaa tacaaaaag 29

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 27

ctcccaaatc actactccga tacaaaaag 29

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 28

ctcccaaatc gctactccaa tacaaaaag 29

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 29

ctcccgaatc actactccaa tacaaaaag 29

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：2之反义链的探针

<400> 30

ctcccaaatc actactccaa tacaaaaag 29

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于检测SEQ ID NO：1的互补链之经亚硫酸氢盐转变的形式的探针

<400> 31

tttttcggat cgttgtttcg gtataggg 28

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 32

tttttcggat cgttgttttg gtataggg 28

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 33

tttttcggat tgttgtttcg gtataggg 28

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 34

ttttttggat cgttgtttcg gtataggg 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 35

tttttcggat tgttgttttg gtataggg 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 36

ttttttggat cgttgttttg gtataggg 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 37

ttttttggat tgttgtttcg gtataggg 28

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 38

ttttttggat tgttgttttg gtataggg 28

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 39

ccctataccg aaacaacgat ccgaaaaa 28

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 40

ccctatacca aaacaacgat ccgaaaaa 28

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 41

ccctataccg aaacaacaat ccgaaaaa 28

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 42

ccctataccg aaacaacgat ccaaaaaa 28

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 43

ccctatacca aaacaacaat ccgaaaaa 28

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 44

ccctatacca aaacaacgat ccaaaaaa 28

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 45

ccctataccg aaacaacaat ccaaaaaa 28

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 46

ccctatacca aaacaacaat ccaaaaaa 28

<210> 47

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 47

cgcgtatttt tcggtc 16

<210> 48

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 48

cgacgcaccc tctccg 16

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 49

gatgacgtat ttttttcgtg tttc 24

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 50

gacgatgtat ttttttcgtg tttc 24

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 51

gacgacgtat tttttttgtg tttc 24

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 52

gacgacgtat ttttttcgtg tttt 24

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 53

gatgatgtat ttttttcgtg tttc 24

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 54

gacgatgtat tttttttgtg tttc 24

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 55

gacgacgtat tttttttgtg tttt 24

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 56

gatgacgtat tttttttgtg tttc 24

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 57

gacgatgtat ttttttcgtg tttt 24

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 58

gatgacgtat ttttttcgtg tttt 24

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 59

gatgatgtat tttttttgtg tttc 24

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 60

gatgatgtat ttttttcgtg tttt 24

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 61

gatgacgtat tttttttgtg tttt 24

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 62

gacgatgtat tttttttgtg tttt 24

<210> 63

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 63

acgcacctct cgaccg 16

<210> 64

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 64

gcacacctct cgaccg 16

<210> 65

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 65

gcgcacctct caaccg 16

<210> 66

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 66

gcgcacctct cgacca 16

<210> 67

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 67

acacacctct cgaccg 16

<210> 68

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 68

gcacacctct caaccg 16

<210> 69

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 69

gcacacctct caaccg 16

<210> 70

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 70

acgcacctct caaccg 16

<210> 71

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 71

acgcacctct cgacca 16

<210> 72

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 72

gcacacctct cgacca 16

<210> 73

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 73

acacacctct caaccg 16

<210> 74

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 74

acacacctct cgacca 16

<210> 75

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 75

acgcacctct caacca 16

<210> 76

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 导向部分甲基化的IKZF1的引物

<400> 76

gcacacctct caacca 16

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全未甲基化引物

<400> 77

gatgatgtat tttttttgtg tttt 24

<210> 78

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 完全未甲基化引物

<400> 78

acacacctct caacca 16

<210> 79

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<400> 79

cctgtacngg agcagngatc ngggagg 27

<210> 80

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<400> 80

cctgtaccgg agcagngatc ngggagg 27

<210> 81

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<400> 81

cctgtacngg agcagcgatc ngggagg 27

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<400> 82

cctgtacngg agcagngatc cgggagg 27

<210> 83

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<400> 83

cctgtaccgg agcagcgatc ngggagg 27

<210> 84

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<400> 84

cctgtaccgg agcagngatc cgggagg 27

<210> 85

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n表示甲基化胞嘧啶

<400> 85

cctgtacngg agcagcgatc cgggagg 27

<210> 86

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IKZF1

<400> 86

cctgtaccgg agcagcgatc cgggagg 27

Claims

1.设计成扩增目的核酸靶标的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物和导向胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种寡核苷酸探针在制备用于检测目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化的试剂盒中的用途，其中所述引物设计成与一个或更多个CpG序列重叠，并且特异性地区分经修饰的未甲基化DNA和完全或部分甲基化形式的DNA，并且其中所述一种或更多种探针能够作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，其中所述一种或更多种探针设计成无差别地与甲基化胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶二者结合，其中所述核酸靶标的特征在于部分胞嘧啶甲基化的区域，所述试剂盒包含：

(i)修饰核酸样品中未甲基化胞嘧啶残基的试剂；

(ii)包含设计成扩增目的核酸靶标的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物的引物组；和

(iii)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种寡核苷酸探针；

(iv)用于扩增核酸样品的试剂，其中所述引物沿着所述目的靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和

(v)用于定性或定量地分析(iv)的经扩增核酸的试剂。

2.设计成扩增核酸靶标的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物和导向胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种寡核苷酸探针在制备用于在患者中诊断或监测病症的试剂盒中的用途，其中所述引物设计成与一个或更多个CpG序列重叠，并且特异性地区分经修饰的未甲基化DNA和部分或完全甲基化形式的DNA，并且其中所述一种或更多种探针作为整体与所述区域处的至少两种不同的甲基化模式杂交，其中所述一种或更多种探针设计成无差别地与甲基化胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶二者结合，所述病症的特征在于调节目的核酸靶标的胞嘧啶甲基化，并且所述靶标的特征在于部分甲基化的区域，所述试剂盒包含：

(i)修饰核酸样品中未甲基化胞嘧啶残基的试剂；

(ii)包含设计成扩增核酸靶标的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物的引物组；和

(iv)用于扩增所述核酸样品的试剂，其中所述引物沿着所述目的靶标的延伸实现了所述经杂交探针的检测；和

(v)用于定性或定量分析(iv)的经扩增核酸的试剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述病症是肿瘤病症。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述目的核酸靶标是DNA或RNA分子。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述DNA是基因组DNA。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述目的核酸靶标包含启动子区。

7.根据权利要求4所述的用途，其中所述目的核酸靶标是哺乳动物基因。

8.根据权利要求4所述的用途，其中所述目的核酸靶标是大肠肿瘤标志物。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述大肠肿瘤标志物是基因BCAT1、IKZF1、IRF4、GRASP、CAHM、SOX21、SLC6A15、NPY、ST8SIA1、ZSCAN18、COL4A2、DLX5、FGF5、FOXF1、FOXI2或SDC2；其中所述目的核酸靶标包含转录起始位点上游5kb。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述目的核酸靶标是IKZF1。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述目的核酸靶标包括在如GRCh38/hg38所示的IKZF1基因中的Chr7:50304323-50304349、Chr7:50303300-50304923或Chr7:50399869-50400702区域。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述修饰核酸样品中未甲基化胞嘧啶残基的试剂将未甲基化胞嘧啶残基修饰为尿嘧啶残基。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述修饰核酸样品中未甲基化胞嘧啶残基的试剂是亚硫酸氢盐。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述亚硫酸氢盐是亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵。

15.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述引物是甲基化特异性引物。

16.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述引物是经亚硫酸氢盐转变的引物。

17.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述探针是水解探针。

18.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述探针作为整体与所述区域处的所有完全和部分甲基化模式杂交。

19.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述目的核酸靶标是IKZF1，并且所述引物组包括包含以下一种或更多种的引物：

(i)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4序列；

(ii)SEQ ID NO:49-62和SEQ ID NO:63-76序列；或者

(iii)SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78序列；并且

其中所述探针组包括包含以下一种或更多种的探针：

(i)SEQ ID NO:5-12序列；

(ii)SEQ ID NO:19序列；

(iii)SEQ ID NO:20序列；或者

(iv)SEQ ID NO:23-30序列。

20.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述目的核酸靶标是IKZF1，所述方法涉及扩增经亚硫酸氢盐转变的作为SEQ ID NO:1区域之互补物的DNA链，并且所述引物组包括包含SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48序列两者；并且

所述探针组包括包含以下的一种或更多种的探针：

(i)SEQ ID NO:21序列；

(ii)SEQ ID NO:22序列；

(iii)SEQ ID NO:31-38序列；和/或SEQ ID NO:39-46序列。

21.用于检测目的核酸靶标区域的胞嘧啶甲基化的诊断试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)包含设计成扩增DNA形式的所述部分胞嘧啶甲基化的核酸区域的一种或更多种完全或部分甲基化形式的正向和反向引物的引物组，其中未甲基化胞嘧啶残基已经被扩增，其中所述引物组包括含有如下所示序列的引物：

(a)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

(b)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；

(c)SEQ ID NOs:49-62和SEQ ID NOs:63-76；或者

(d)SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；和

(ii)导向所述部分胞嘧啶甲基化区域的一种或更多种寡核苷酸探针，所述探针能够作为整体与至少两种不同的甲基化模式杂交，其中所述一种或更多种寡核苷酸探针包括含有如下所示序列的探针：

(a)SEQ ID NO:5-12；

(b)SEQ ID NO:19；

(c)SEQ ID NO:20；

(d)SEQ ID NO:21；

(e)SEQ ID NO:22；

(f)SEQ ID NOs:23-30；

(g)SEQ ID NOs:31-38；或者

(h)SEQ ID NOs:39-46。

22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述引物是甲基化特异性引物。

23.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述引物是经亚硫酸氢盐转变的引物。

24.根据权利要求21或22中任一项所述的试剂盒，其中所述探针是水解探针。

25.根据权利要求21或22中任一项所述的试剂盒，其中所述探针作为整体与所述区域的所有完全和部分甲基化模式杂交。

26.根据权利要求21或22中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含修饰未甲基化胞嘧啶残基的试剂。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述试剂是亚硫酸氢盐。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述亚硫酸氢盐是亚硫酸氢钠或亚硫酸氢铵。

29.根据权利要求21或22中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含实现DNA扩增和/或检测的试剂。

30.根据权利要求21或22中任一项所述的试剂盒，其中所述目的核酸靶标是IKZF1。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述引物和探针导向在如GRCh38/hg38所示的IKZF1基因的Chr7:50304323-50304349、Chr7:50303300-50304923或Chr7:50399869-50400702区域的一个或更多个处检测甲基化，其中所述方法涉及扩增经亚硫酸氢盐转变的作为SEQ ID NO:1区域之互补物的DNA链，并且

所述引物组包括包含SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48序列两者，并且

所述探针组包括包含以下的一种或更多种的探针：

(i)SEQ ID NO:21序列；

(ii)SEQ ID NO:22序列；

(iii)SEQ ID NO:31-38序列；和/或

(iv)SEQ ID NO:39-46序列。